CC BY
14
НЛТУ
ы КРАЖИ
»mutet*
Науковий в!сн и к Н/1ТУ УкраТни Scientific Bulletin of UNFU http://nv.nltu.edu.ua https://doi.org/10.15421/40270411
Article received 10.05.2017 р. Article accepted 24.05.2017 р. УДК 630*165:181:631.544
ISSN 1994-7836 (print) ISSN 2519-2477 (online)
1 EE3 Correspondence author M. М. Lisoviy [email protected]
М. М. Лковий
Нацюнальний лкотехшчний ушверситет Украши, м. Львiв, Украша
ОСОБЛИВОСТ1 ОТРИМАННЯ АСЕПТИЧНО1 КУЛЬТУРИ LARIXDECIDUA MILL.
В УМОВАХ IN VITRO
Проведено огляд та amni3 лиературних джерел, як стосуються розмноження Larix decidua Mill. в умовах in vitro. Охарактеризовано господарську цшшсть дослiджуваного виду та обгрунтовано доцiльнiсть проведения запланованих досл^ джень. Наведено перелiк найпоширешших в озелененнi декоративних форм модрини европейськоТ. Детально висвiтлено застосовану методику проведення експериментальних дослiджень з отримання асептичноТ культури Larix decidua Mill. шд час розмноження in vitro: способи стерилiзацiТ лабораторних примщень та iнструментiв; хiмiчнi реактиви, Тх концентрацiТ та комбiнацiТ, якими виконували деконтамiнацiю вихiдних експлаитiв. Протестовано низку схем стерилiзацiТ експлантiв модрини европейськоТ iз застосуванням як одного хiмiчного агента, так i рiзних Тх комбшацш. Встановлено необхiднiсть першочергового обробику дослiджуваиих експлантiв розчином етанолу, що значно знижуе кiлькiсть контамiнованого рос-линного матерiалу. Визначено оптимальну схему проведення стушнчасто'Т стерилiзацiТ вихiдних емшанов Larix decidua Mill. для розмноження in vitro, яка полягае у почерговому обробику такими агентами: С2Н5ОН (70 %, 10 с); пропчна вода з детергентом - 3 год; NaClO (50 %, 5 с); С2Н5ОН (70 %, 5 с); AgNO3 (0,2 %, 10 секунд). Узагальнено та проаналiзовано отри-манi результати.
Kni040ei слова: Larix decidua Mill.; in vitro; експлант; деконтамшащя; живильне середовище.
Вступ. Модрина европейська (Larix decidua Mill.) -це дерево заввишки 30-45 (50) м i3 середньозбiжистим, прямим стовбуром (100-150 см у дiаметрi) та вузькою конiчною формою крони (Shovhan, 2002). Дослщжува-ний вид е об'ектом лкокультурно! справи Укра1ни вже понад 200 роюв, який у разi штучного введення у лiсовi культури здатен швидше формувати значнi запаси дере-вини та, у перспектив^ може бути вагомим резервом тдвищення продуктивностi наших лкгв (Debryniuk, 1993; 2010). Варто ввдзначити цiннiсть модрини евро-пейсько! для садово-паркового господарства, завдяки и стiйкостi до урбанiзованих умов та наявносп числен-них декоративних форм: 'Barabits'; 'Cerviconis'; 'Cherry Valley'; 'Conica'; 'Compacta'; 'Corley'; 'Darling Susie'; 'Fas-tigiata'; 'Globosa'; 'Himmel Broom'; 'Julian's Weeper'; 'Kel-lermanii'; 'Kralovstvi'; 'Karsten'; 'Kornik'; 'Krejci'; 'Lakatos Gömb'; 'Lanarck'; 'Liliput'; 'Multicaulis'; 'Paper Lanterns'; 'Pendula'; 'Pendulina'; 'Pit van Geet'; 'Puli'; 'Pyramidalis'; 'Repens'; 'Spacek'; 'Virgata'; 'Breburda'; 'Glauca'; 'Laxa'; 'Little Bogle'; 'Lombarts'; 'Nukmitz'; 'Paula'; 'Pesek'; 'Autumn Gold Weeping'; 'Curvifolia'; 'Deborah Waxman'; 'Horstmann Recurved'; 'Jabkenice-Pospisil'; 'Lucek'; 'Nana'; 'Pelesany'; 'Varied Directions'; 'Alba'; 'Rosiflora'; 'Rubra'; 'Viridiflora'; 'Sulphurea'; 'Almrauschhütte', 'Balatka', 'Bingman', 'Cizkov', 'Compact Gem', 'CroxbyBroom', 'Cyclone Ridge No.1 та No.2', 'Dablice', 'Dunkeld', 'Elefant', 'Feldschlösschen', 'Fredstejn', 'Georgengarten', 'Gita', 'Globosa Poplze', 'Gossard Broom', 'Grossglockner', 'Grott', 'Horstmann Wäest', 'Janous', 'Kadan', 'Kadlecüv Mlyn', 'Ko-zin', 'Maly', 'Marta Radek', 'Mercedes', 'Minipendula', 'Ni-
ederthail', 'Pecha Krivoklad', 'Pine Glenn', 'Procumbens', 'Pruhonice', 'Pulkrabek', 'Recan', 'Repens Fritsche', 'Roman', 'Roubicek', 'Rotzen', 'Sazava', 'Schwarzenburg', 'Selajoch' (Havrylyuk, Guz & Lisoviy, 2013a, 2013b).
Враховуючи наведенi особливостi та цшшсть досль джуваного виду, можна зробити висновок про актуаль-шсть удосконалення сучасних методик його ввдтворен-ня, до яких належить i мжроклонування. Цей метод мае низку переваг перед традицшними способами розмноження: отримання оздоровленого, безвiрусного садив-ного матерiалу, можливiсть намножити потребу кшь-кiсть рослин i3 одного вихвдного експланта тощо (Mik-roklonalnoe razmnozhenie, 2016; Polishchuk, 2015).
Огляд лггератури. Мжроклонування дослвджувано-го виду здшснювала низка вчених, але варто виокреми-ти тих, якi провели повний цикл мжророзмноження. Зокрема, J. Ziauka та S. Kuusiene (2006) для мкрокло-нального розмноження модрини европейсько! у ролi експлант1в використовували невелик сегменти моло-дих пагон1в iз пазушними бруньками, як1 заготовленi iз 40-рiчних дерев. 1х стерилiзували 75 %-м етанолом (3 хв) та 0,1 %-м розчином нгграту срiбла. Культивуван-ня проводили на живильному середовищi MS, модифь кованому такими фиогормонами: абсцисова кислота; ауксини (1ОК; 2,4-D); цитокiнiни (кiнетин; 6-БАП); ri-берилiни (гiберилiнова кислота). Встановлено, що аб-сцисова кислота негативно впливала на органогенез ве-гетативних бруньок. Ауксини також пригшчували рiст експлант1в на 25 день спостережень, але на 75-й день виявлено тенденцию до розвитку пагошв. Найпозитив-
^îyBaHHA 3a flCTy: /Iîcobhm M. M. Ocoô^mboctî OTpmwaHHfl acenTH^HOÏ Ky^bïypw Larix Decidua Mill. b yMOBax in vitro. HayKOBMM
BÏCHHK H^Ty yKpaÏHM. 2017. Bun. 27(4). C. 52-55. Citation APA: Lisoviy, M. M. (2017). Some Features of Obtaining Aseptic Culture of Larix Decidua Mill. in vitro. Scientific Bulletin of UNFU, 27(4), 52-55. https://doi.org/10.15421/40270411
шший ефект цитокшшв встановлено у експлантГв, якi культивували у TeMHOTi (Ziauka & Kuusienë, 2006). V. Chalupa (2004) дослщив вплив джерела експлантГв, вiку материнського дерева, складу живильного середо-вища та фiтогормонiв на розмноження модрини евро-пейськот в умовах in vitrо. Сегменти пагошв стеритазу-вали 7,5 %-м гшохлоридом натргю (20 хв) та 0,1 %-м хлоридом ртуп (20-30 хв). Насшини стeрилiзували тшьки хлоридом ртуп (20-40 хв), пiсля чого з них добу-вали зародки i пасажували на живильне середовище. У ролi середовищ застосовано там типи: WPM, BTM, MS, QL та GD, як модифкували кглькома фiтогормонами: BAP, BPA, TDZ, IBA, NAA. Культивування проводили за стандартною методикою. Вкоршення рослин-регене-рантiв змiнювалось серед клонiв у межах 47-83 % (Chalupa, 2004). A.M. Diner та ш. (1986) у ролi експланпв застосовували ювeнiльнi тканини з молодих сiянцiв та насшня. Стeрилiзацiю виконували з допомогою 30 %-го пероксиду водню в два етапи тривалiстю 6 год, шсля чого експланти висаджували на агаризоване (2 %) жи-вильне середовище у чашки Петрг Iнiцiацiю проводили протягом двох тижшв на сeрeдовищi BLG iз додаван-ням цитокiнiну (ВА). Пiсля цього отриманi пагони пасажували на три рiзнi живильнi середовища: LP, LMG та GD 1/2. Через 16 тижшв культивування утворюва-лись пагони (понад 1 см завдовжки), частина iз яких укорiнювались (Diner, Strickler, Karnovsky, 1986).
Матерiали та методи дослщження. Усi дослщжен-ня з отримання стерильно!' культури модрини евро-пейськот проведено у лаборатори культури тканин ка-федри люових культур i люовот селекци НЛТУ УкраТни (2012-2016 рр.) за загальноприйнятими методиками (Kalinin, Kushnir & Sarnackaja, 1992). У ролi маточних обрано молодi рослини дослщжуваних видiв, вирощен-нi iз насiння у вщкритому грунп (вiком 5-7 рокiв). У ро-лi eксплантiв використано бiчнi та вeрхiвковi вегетатив-нi бруньки, як заготовляли навeснi у перюд активно!' вегетацГТ.
Отримання асептично'Т культури е першим i вкрай важливим етапом мкроклонального розмноження рос-лин, тому вш роботи потрiбно виконувати у максимально стерильних умовах. Поверхш та стацiонарнe облад-нання лаборатори обробляли 96 %-м етанолом та перед кожним проведенням робГт виконували стeрилiзацiю ультрафiолeтовими бактерицидними лампами упро-довж 1,5-2,0 год. Дезшфекцш iнструмeнтiв виконували сухим жаром у сушильнш шафi за температури 160180 оС (1,0-1,5 год), а перед кожною маншулящею Гз пасажу експланпв обробляли 'Тх 96 %-м етанолом, фламбували над спиртГвкою та промивали стерильною дистильованою водою.
Для деконтамшаци вихщних експлантГв модрини европейсько'Т застосовано стушнчасту схему стеритаза-цГТ, яка полягала у почерговому обробГтку рослинного матерГалу такими стерилГзацГйними агентами рГзно'Т концентраци та у рГзних 'Тх комбшацгях: протГчна вода (Н2О) з детергентом (для пщвищення ефективностГ дГ'' яко'Т додавали емульгатор "Твш 80" (Debryniuk, 2010; Kalinin, Kushnir & Sarnackaja, 1992)); медичний етило-вий спирт (С2Н5ОН); гГпохлорид натргю (NaClO); та
штрат срiбла (AgNO3). Пiсля кожного реактиву експланти Tpmi промивали стерильною дистильованою водою у Bcix варiантах дослiдiв упродовж 4-5 хв. Для подолання внутрiшнiх iнфекцiй, застосовували 0,1 %-й водний розчин антибiотика "1манш" (Imaninum), яким обробляли вихiдний експлант безпосередньо перед па-сажем.
Простеритазоваш експланти пасажували на живильне середовище за рецептом MS (Murashige and Skoog) без фгтогормошв та проводили спостереження упродовж 10-15 дiб. Шсля цього, експланти класифкували на три групи: асептичнi (стерильнi), заражен патогенами (iнфiкованi) та некротичш (пошкодженнi хiмiчними агентами високо! концентраци).
Результати дослщження. Для достовiрностi отри-маних результатiв, кожен варiант дослщу проводили у трикратнiй повторностi. За перюд проведення досль джень протестовано низку схем стеришзаци експлантiв модрини европейсько! iз застосуванням як одного xi-м1чного агента, так i i'x рппомапппих поеднань. Встановлено, що найдоцшьшше, для досягнення поставлено!' мети, використовувати стушнчасту стернлвацпо. Результати деконтамшаци вихщного рослинного мате-piajiy дослщжуваного виду були досить вар1абельними, що, на нашу думку, залежало вщ застосованих стершп-зацшних реагент iB та i'x концентраци (рис., табл.).
а)
Рис. Експланти модрини европейськоТ: а) контамшований; б) асептичний
№ з/п Застосований стерилянт (у послщовносп використання) Отримано експланти, %
С2Н5ОН* Н2О + детергент NaClO С2Н5ОН AgNO3
концентращя, % експо-зищя, сек. експозищя, год. концентращя, % експозищя, хв. концентращя, % експози-щя, сек. концентращя, % експозищя, хв. контамь новаш асептич-ш некро-тичш
1 - - 3 30 5 50 5 0,1 10 64 36 -
2 - 50 70 0,2 57 43 -
3 - 70 96 0,3 52 40 8
4 50 5 30 - - 0,1 42 58 -
5 10 50 - 0,2 34 65 1
6 15 70 - 0,3 25 44 31
7 70 5 30 50 5 0,1 23 77 -
8 10 50 70 0,2 4 96 -
9 15 70 96 0,3 5 87 8
10 96 5 30 50 0,1 6 65 29
11 10 50 70 0,2 3 50 47
12 15 70 96 0,3 - 43 57
* Застосовували до початку видшення меристем (розбирання бруньок).
Отриманi результати сввдчать, що вiдсутнiсть пер-шочергового o6po6ÍTKy експлант1в етанолом (варiанти дослвду № 1-3) забезпечила найб1льшу кшькють конта-мiнованих експлантiв - 52-64 %. Також важливе значения мае концентращя С2Н5ОН на цьому етапi, зокре-ма у ваpiантах № 10-12 (96 %) спостерпали найб1льшу частку некротичних експлант1в - 29-57 %, проте зара-женого рослинного матеpiалy тут було найменше. Найбшьшу кiлькiсть стерильних експлантiв отримано у ваpiантах дослiдy № 8 та 9-96 i 87 % вщповщно.
Висновки. Унаслвдок проведених дослвджень мож-на зробити висновок про пряму залежнiсть застосова-них хiмiчних агент1в та 1х концентpацiй на результати стеришзаци вихiдного рослинного матеpiалy Larix decidua Mill. тд час розмноження in vitro. Найбшьшу кшьюсть асептичних експлантiв (96 %) забезпечила та-ка схема деконтамшаци: С2Н5ОН (70 %, 10 с); пропчна вода з детергентом - 3 год; NaClO (50 %, 5 с); С2Н5ОН (70 %, 5 с); AgNO3 (0,2 %, 10 секунд).
Перелiк використаних джерел
Chalupa, V. (2004). in vitro propagation of European larch (Larix decidua Mill.). Journal of Forestry Science, 50(12), 553-558. Debryniuk, Yu. M. (1993). Perspektyvy vykorystannia modryny yev-ropeiskoi dlia pidvyshchennia produktyvnosti lisiv Ukrainy. Ukra-inskyi lis, 2, 36-37. [in Ukrainian]. Debryniuk, Yu. M. (2010). Tekhnolohichni aspekty stvorennia i vyroshchuvannia plantatsiinykh lisovykh kultur za uchastiu modryny ta yalyny u Zakhidnomu rehioni Ukrainy. Naukovi pratsi
Lisivnychoi akademii nauk Ukrainy: zb. nauk. prats, 8, 5964. Lviv: NLTU Ukrainy. [in Ukrainian].
Diner, A. M., Strickler, A., & Karnovsky, D. F. (1986). Ininiation, elongation, and remultiplication of Larix decidua micropropagules. New Zealand Journal of Forestry Science, 16(3), 306-318.
Havrylyuk, V. M., Guz, M. M., & Lisoviy, M. M. (2013a). Polymorphic of larch European and the prospects for its use in landscaping, Scientific Bulletin of UNFU, 25(13), 15-20. Retrieved from: http://nltu.edu.ua/nv/Archive/2013/23 13/15 Gaw.pdf. [in Ukrainian].
Havrylyuk, V. M., Guz, M. M., & Lisoviy, M. M. (2013b). Features of an vaccination of morphological form of larch European. Scientific Bulletin of UNFU, 23(12), 53-58. Retrieved from: http://nltu.edu.ua/nv/Archive/2013/23_12/53_Gaw.pdf. [in
Ukrainian].
Kalinin, F. L., Kushnir, G. P., & Sarnackaja, V. V. (1992). Tehnologi-ja mikroklonalnogo razmnozhenija rastenij: monografija. Kyiv: Nauk. dumka, 232 p. [in Russian].
Mikroklonalnoe razmnozhenie. (2016). Mikroklonalnoe razmnozhe-nie i ozdorovlenie rastenij. Retrieved from: http://www.biotechnolog.ru/pcell/pcell6_1.htm. [in Russian].
Polishchuk, I. V. (2015). Robotyzovana systema dlia mikroklonalno-ho rozmnozhennia roslyn in vitro. Retrieved from: http://www.iconfs.net/infocom2015/robotizovana-sistema-dlya--mlkroklonalnogo-rozmnozhennya-roslin-in-vitro. [in Ukrainian].
Shovhan, A. D. (2002). Holonasinni: praktykum z dendrolohii. Lviv: UkrDLTU, 122 p. [in Ukrainian].
Ziauka, J., & Kuusiene, S. (2006). Changes in Development of European Larch (Larix decidua Mill.) Vegetative Buds Induced by Plant Hormones. Baltic Forestry, 12(2), 141-150.
Н. Н. Лисовый
Национальный лесотехнический университет Украины, г. Львов, Украина
ОСОБЕННОСТИ ПОЛУЧЕНИЯ АСЕПТИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЫ LARIX DECIDUA MILL.
В УСЛОВИЯХ IN VITRO
Проведен обзор и анализ литературных источников, касающихся размножения Larix decidua Mill. в условиях in vitro. Представлена характеристика хозяйственной ценности исследуемого вида и обоснована целесообразность проведения запланированных исследований. Приведен перечень наиболее распространенных в озеленении декоративных форм лиственницы европейской. Подробно описана примененная методика проведения экспериментальных исследований по получению асептической культуры Larix decidua Mill. при размножении in vitro: способы стерилизации лабораторных помещений и инструментов; химические реактивы, их концентрации и комбинации, которыми выполняли деконтаминацию исходных эксплантов. Протестировано ряд схем проведения стерилизации эксплантов лиственницы европейской с применением как одного химического агента, так и различных их комбинаций. Установлена необходимость первоочередной обработки эксплантов раствором этанола, что значительно снижает количество контаминированного растительного материала. Определена оптимальная схема проведения ступенчатой стерилизации эксплантов Larix decidua Mill. для размножения in vitro, которая заключается в постепенной обработке следующими химическими агентами: С2Н5ОН (70 %, 10 с) проточная вода с моющим средством - 3 ч; NaClO (50 %, 5 с) С2Н5ОН (70 %, 5 с) AgNO3 (0,2 %, 10 с). Обобщены и проанализированы полученные результаты.
Ключееые слова: Larix decidua Mill.; in vitro; эксплант; деконтаминация; питательная среда.
M. М. Lisoviy
Ukrainian National Forestry University, Lviv, Ukraine
SOME FEATURES OF OBTAINING ASEPTIC CULTURE OF LARIXDECIDUA MILL. IN VITRO
Larix decidua Mill. is the subject of forestry in Ukraine for more than 200 years, which is administered in artificial forest plantations able to generate more quickly large timber reserves and in the future can be a significant reserve to increase productivity of our forests. For reproduction of larch we used micropropagation because this method has several advantages over traditional breeding methods. To conduct the research the authors used conventional methods in biotechnology. As explants we used lateral and apical vegetative buds that are harvested in the spring during the active growing season of the young plants. For decontamination of explants of Larix decidua step scheme of sterilization was applied using these agents in various combinations and concentrations: H2O + detergent + "Tween 80"; C2H5OH; NaClO; AgNO3. In order to overcome internal infections we used 0.1 % aqueous solution of antibiotic Imaninum. Sterilized explants were placed on a nutrient medium Murashige and Skoog without phytohormones. For the reliability of the results of experiments were conducted in the triple repetition. The results of the research are as follows. Firstly we revealed that no priority dipping of explants in ethanol had provided the largest number of infected explants - 52-64 %. Then, in embodiments where C2H5OH (concentration 96 %) was used, we observed the greatest number of necrotic explants - 29-57 %, but the infected plant material, there was the least. Finally, the largest numbers of sterile explants were obtained in variants experiment with average concentrations of sterilizing agents. Thus, we can conclude that there is a direct relationship between applied chemical agents and their concentration on results of sterilization of plant material Larix decidua in reproduction in vitro. The largest number of aseptic explants (96 %) provided a decontamination of following scheme: C2H5OH (70 %, 10 seconds); water with detergent - 3 hours; NaClO (50 %, 5 seconds); C2H5OH (70 %, 5 seconds); AgNO3 (0.2 %, 10 seconds).
Keywords: Larix decidua Mill.; in vitro; explants; decontamination; the nutritious environment.
1нформащя про автора:
Лковий Микола Миколайович, канд. с.-г. наук, доцент, докторант, Нацюнальний лкотехшчний ушверситет Укра'ши, м. Львiв, Укра'ша. Email: [email protected]
