CC BY
36
Нацюнальний лкотехшчний ун1верситет Украши
1. Л1СОВЕ ТА САДОВО-ПАРКОВЕ ГОСПОДАРСТВО
УДК630*161.443.6:582.476 Проф. М.М. Гузь, д-р с.-г. наук;
доц. Р.М. Гречаник, канд. с.-г. наук; доц. М.М. Лковий, канд. с.-г. наук;
здобувач Ю.€. Синявський -НЛТУ Украти, м. Львiв
РОЗМНОЖЕННЯ METASEQUOIA GLYPTOSTROBOIDES HU & CHENG В УМОВАХ IN VITRO
Проан^зовано лггературш джерела щодо тематики проведених дослщжень. Наведено найбшьш щнш для садово-паркового господарства декоративш форми Metaseq-uoia glyptostroboides Hu & Cheng. Представлено результати дослщжень i3 розмноження Metasequoia glyptostroboides Hu & Cheng методом культури тканин. Встановлено опти-мальш термши заготiвлi вихiдного матерiалу. Експериментально пiдiбрано: схему сте-рилиаци експлантш; склад живильних середовищ для шшдацп, мультиплшацп та укорь нення in vitro; субстрат для адаптацп регенеранпв до грунтових умов. Отриманi результати подтвердили доцiльнiсть розмноження дослщжуваного виду запропонованим способом.
Ключовi слова: метасеквоя, клон, in vitro, стерилiзацiя, шщащя, мультиплiкацiя, укоршення, адаптацш.
Метасеквоя глiптостробоподiбна (розсiченошишкова, китайська або во-дяна ялиця) (Metasequoia glyptostroboides Hu & Cheng) вирiзняeться щнними 6i-олого-екологiчними, технологiчними, лiкарськими i декоративними властивос-тями та багатством генофонду, зокрема наявнктю кшькох десятк1в таксонiв виду: 'All Bronze'; 'Chubby'; 'Crackerjack'; 'Emerald Feathers'; 'Fastigiata'; 'Gold Rush'; 'Golden Dawn'; 'Goldrush'; 'Green Mantle'; 'Hamlet's Broom'; 'IFG'; 'Jack Frost'; 'Little Creamy'; 'Little Giant'; 'Matthaei Broom'; 'McCracken's White'; 'Miss Grace'; 'Moerheim'; 'National'; 'Nitschke Cream'; 'Ogon'; 'Prof Ching'; 'Prof Li'; 'Rowena'; 'Royal Air'; 'Rutgers Select'; 'Schirrmann's Nordlicht'; 'Sheridan Spire'; 'Shui San'; 'Spring Cream'; 'Vada'; 'Waasland'; 'White Spot'; var. caespitosa Y.H. Long & Y. Wu; var. Dawn Redwood; var. neopangaea; Metasequoia cf. glyptostroboides; Metasequoia cf. Metasequoia glyptostroboides тощо [2, 3, 5].
Тому сьогодт актуальним е масове продукування садивного матерiалу Metasequoia glyptostroboides Hu & Cheng для потреб фармацевтично! промисло-восп, лiсового i садово-паркового господарства. Проте розмноження дослвджу-ваного виду насшним способом за межами природного ареалу ускладнюеться партеноспермiею, а для вегетативного розмноження ввдсутня достатня кiлькiсть вихщного рослинного матерiалу [7-8]. На нашу думку, рацюнальним вирiшенням поставлено!' задачi е розмноження у штучних контрольованих умовах in vitro.
Огляд лггератури. Аналiз ретроспективи дослiджень з мшророзмно-ження in vitro Metasequoia glyptostroboides Hu & Cheng та li' таксошв показав на-явнiсть обмежено! кiлькостi експериментальних робiт з ще! проблематики
В УкраМ окремi аспекти мiкроклонального розмноження до^джувано-го виду дослвджував лише С.1. Слюсар. У сво!х працях вiн зазначае, що як
експланти для розмноження in vitro дослiджуваного виду дощльно застосовува-ти ювешльний MaTepi^ с1янцдв. Первиннi експланти деконтамiнували в кшька еташв: тpичi промивали пропчною водою з милом, 15-20 хв - пpотiчною водою, дистильованою водою, 30 сек обробляли 70 %-м водним розчином етано-лу i 15 хв - 30 %-м водним розчином гшохлориду натрда. Найкращий результат iндукцií органогенезу та намноження вiдnовiдно отримано iз ввдбраних на початку вeгeтaцiйного перюду бруньок 2-3-piчних сiянцiв на двох модифiкaцiях живильних середовищ: MS + 0,5 mg/l 6-BA + 0,5 mg/l IAA та MS + 0,3 mg/l 2,4D [4]. Розроблена методика у piзних вapiaнтaх дала змогу отримати пагони в 17,761,2 % та npидaтковi бруньки - в 10,8-49,0 % експлантав [7-8].
Потpiбно зазначити про ввдсутнкть вiтчизняних джерел iнфоpмaцií щодо отримання in vitro укоpiнeних peгeнepaнтiв та 1х aдanтaцií до грунтових умов.
Матерiали та методи. Експерименти з розмноження in vitro Metaseq-uoia glyptostroboides Hu & Cheng проведено протягом 2009-2013 pp. у лаборато-pii культури тканин кафедри лкових культур i лiсовоí сeлeкцií НЛТУ Украши за загальноприйнятими в бютехнологп методиками в шiсть eтaniв: вибip росли-ни-донора та зaготiвля експланпв, стepилiзaцiя вих1дного рослинного матерь алу, iнiцiaцiя i намноження eксnлaнтiв, укоршення та aдanтaцiя отриманих рос-лин-регенеранпв до грунтових умов [6, 9].
Джерелом експлаштв слугували виpощeнi iз нaсiння в умовах вiдкpитого грунту на територц декоративного розсадника Державного боташчного саду НЛТУ Украши 5-6 piчнi рослини Metasequoia glyptostroboides Hu & Cheng. Як експланти використали pозiбpaнi вeгeтaтивнi бруньки iз заготовлених у люто-му-бepeзнi живцiв. Для деконгамшацп первинних eксnлaнтiв використано сте-pилiзуючi агенти: npотiчну Н2О з детергентом; 50, 70, 96 водш розчини С2Н5ОН; 30, 50, 70 воднi розчини NaClO; 0,1; 0,2; 0,3 %-вi водш розчини AgNO3 з piзною експозищею. Пiсля оброблення кожним агентом експлантати тpичi по 5 хв промивали стерильною дистильованою Н2О.
Експланти культивували на модифiковaних твердих живильних середо-вищах Murashige and Skoog (MS) та Litvay (LM) за таких умов [1, 4]: температура повиря 20-22 °С, вщносна волопсть nовiтpя 30-35 % та 16-годинний фотопе-piод (3 кЛК). Регенеранти адаптували в дерновому гpунтi з шском (1:1) i в дерновому грунта з niском та торфом (1:1:1). У кожному вapiaнтi дослщу використано по 50 експланпв.
Результати дослщжень та обговорення. Деконтамшацда первинних експлаштв проводили за послвдовшстю, наведеною в табл. 1. Отримаш результати свдаать, що нaйбiльш ефективними е вapiaнти дослiду № 4 та 5 - отрима-ли 78 та 80 % асептичних eксnлaнтiв ввдповщно. Високий вiдсоток заражених експлаштв отримано у вapiaнтaх № 1 та 2, що спричинено вiдсутнiстю першо-чергового обpобiтку рослинного мaтepiaлу розчином етанолу i наступною його контамшащею niд час видiлeння меристем. У вapiaнтaх дослiду № 3 та 6 спос-тepiгaлaсь значна кшьккть некротичних (почоршлих) eксnлaнтiв - 77 та 86 % вщповвдно, що доводить недощльнкть застосування високих концентрацш С2Н5ОН i AgNO3 при стepилiзaцií вже pозiбpaних експлантав та тривалих експо-зицiй оброблення бруньок етанолом.
г
Вар1ант
дослщу
*
к се к й г к
СТ
й о и о се к
ш >
л
СТ
чз
ст
о> л
СТ
чз
СТ
а\
&
I
а
а я а
а"
№
о
0
1 &
I
- Вар1ант дослщу
ю ю ю ■ 1 1 концентрация, % О К о к Застосований реагент (в послщовносп використання —>)
о о ■ 1 1 експозн-щя, сек.
м експозн-щя, год. Н20 + детергент
О о О О о ^ о концен-тращя, % ЫаСЮ
о о о експозн-щя, хв.
1 1 1 Ю о о концен-тращя, % О к о к
1 1 1 о о о експозн-щя, сек.
о о "(О о о о "(О о концен-тращя, % > ста О
о о о експози-щя, хв.
1 1 м о м м 00 00 м контамь новаш Отримано експлантн, %
ас о —1 ас м 00 асептичш
00 м о 00 1 некротич-ш
У
&
я
а
а
а §
а
в" я ^ §
^ а
5 а
1Г а 2. §
аз 8
а х
л к«
а о
Рис. 1. Шщащя органогенезу Metasequoia glyptostroboides Hu & Cheng (20 доба) in vitro
Табл. 3. Показники намноження експлантш i
Рис. 2. Шщащя органогенезу Metasequoia glyptostroboides Hu & Cheng (40 доба) in vitro
1 % Л О <Й о И ч Живильне середови-ще Доповнення Показники намноження експлантав
NAA, mg/l 2,4-D, mg/l 6-BA, mg/l R, % S^ шт. SE, шт.
1 MS 0,5 0,5 0,1 12 2,2 -
2 0,5 0,5 0,5 18 2,3 -
3 0,5 0,5 1,0 28 3,0 1,4
4 0,5 0,5 2,0 12 1,9 -
5 0,5 - 0,5 18 1,3 -
6 - 0,5 1,0 32 3,6 0,9
7 LM 0,5 0,5 0,1 54 3,3 0,9
8 0,5 0,5 0,5 42 5,8 1,3
9 0,5 0,5 1,0 96 6,9 3,0
10 0,5 0,5 2,0 68 7,4 2,4
11 0,5 - 0,5 56 6,9 1,2
12 - 0,5 1,0 92 7,2 2,5
Приштка: R - частка експланпв, яю утворили адвентивш мкропагони; SH - кшь-юсть нових мiкропагонiв на експлант; SE - кшьюсть нових сегменпв на мiкропагiн.
Найвищу частку експланпв, яш утворили адвентивнi мiкропагони; найбшьшу кiлькiсть нових мiкропагонiв на експлант i нових сегментiв на мшро-nariH отримали у варiантi дослщу № 9-96 %; 6,9 шт.; 3,0 шт. вщповщно i у варь антi дослiду № 12-92 %; 7,2 шт.; 2,5 шт. вщповщно (рис. 3). Варто зазначити, що на середовишд LM спостеркили поодинокi випадки ризогенезу намножених експланпв.
Укорiнення роздiлених пiсля фази намноження експланпв здiйснювали протягом 20-30 дiб на живильних середовищах MS та LM iз зменшеною у двiчi кiлькiстю мiнеральних солей i доповнених виключно ауксинами (табл. 4).
HaiioHa.tHHH .icoTexmnHHH yHÏBepcHTeT YKpamn
BapiaHT gocmgy ^HBH^bHe cepe-goBHm,e ^onoBHeHHa YKopiHH^ocb eKcnnaHTÏB, %
NAA, mg/l 2,4-D, mg/l nepe3 20 gi6 nepe3 30 gi6
1 0,5 MS 0,5 - 12 22
2 0,5 MS 0,25 0,25 28 36
3 0,5 MS - 0,5 26 50
4 0,5 MS 0,25 - 12 18
5 0,5 MS 0,1 0,1 18 44
6 0,5 MS - 0,25 24 42
7 0,5 LM 0,5 - 18 28
8 0,5 LM 0,25 0,25 48 56
9 0,5 LM - 0,5 48 70
10 0,5 LM 0,25 - 22 24
11 0,5 LM 0,1 0,1 28 32
12 0,5 LM 0,25 64 82
,0,am Ta6n. 4 cBigqaTt, ^o HaËKpa^e yxopmeHra cnocTepiranu y BapiaHTi gocnigy № 9 (70 %) Ha cepegoBH^i 0,5 LM, gonoBHeHoMy 0,5 mg/l 2,4-D, Ta y BapiaHTi № 12 (82 %) Ha cepegoBH^i 0,5 LM, gonoBHeHoMy 0,25 mg/l 2,4-D (puc. 4, 5). Hanripme KopeHeyTBopeHHA cnocTepira^oct y eKcnnarnÎB, flKi KyntTHByBa^HCt Ha ^HBH^tHOMy cepegoBH^i 0,5 MS a6o 6e3 gonoBHeHHA cepegoBH^a 2,4-D.
OcTaTOHHHH pe3y.rn.TaT MiKpoK^OHa^tHoro p03MH0^eHHa 3a^e^HTt Big yc-nimHOCTi npoBegeHHa aganTaaiï oTpuMaHHx KromB go rpymoBHx yMOB. YKopiHeHi eKcn^aHTH, 3a gonoMororo niHaeTa, BHHMa^u 3 npoôipoK Ta gHcrantoBaHoro Bogoro 3MHBa^H 3artHfflKH arapy, ^o 3ano6irae 3arHHBaHHro KopiHHa Ta cagH^H y 3aBnacHo npHroTOBneHHH npocTepum3oBaHHH cyôcTpaT. YKopiHeHi pocnHHH-pereHepaHTH ne-pecag^yBa^H y gBa Tunu rpyrnoBoro cyôcTpaTy 3 Hempa^tHoro a6o cnaôoKHcnoro peaKaiero: gepHoBHH rpyHT 3 nicKoM (1:1) Ta gepHoBHH rpyHT 3 nicKoM Ta Top^oM (1:1:1). AganTaairo npoBogunu b yMoBax Ky^tTypa^tHoï KiMHaTH (puc. 6). Bracni-goK Ha 60 go6y KyntTHByBaHHa oTpuMa^u 48 Ta 82 % ^hbhx poc^HH BignoBigHo.
Pue. 3. HaMHOweHHH in vitro Metaseq- Pue. 4. Ризогенез in vitro Metasequoia uoia glyptostroboides Hu & Cheng glyptostroboides Hu & Cheng
Ш
Рис. 5. Вкортений регенерант Metasequoia glyptostroboides Hu et Cheng
Рис. 6. Адаптащя регенеранта Metasequoia glyptostroboides Hu et Cheng у субстратi
Висновки. Проведет експерименти з культури тканин Metasequoia glyptostroboides Hu & Cheng засвщчили ефектившсть розмноження in vitro дос-лщжуваного виду. При цьому оптимальною е така схема клонування.
1. Деконтамшащю вихiдних експлантiв доцiльно проводити в такш послщов-ност: 96 %-м водним розчином етанолу протягом 15 сек; пропчною Н2О з детергентом - 16 год; 50 %-м водним розчином NaClO - 10 хв; 0,2 %-м водним розчином AgNO3-10 хв; i3 триразовим промиванням видшених меристем дистильованою водою пiсля кожного реактиву. Отримано 80 % асеп-тичних експланив.
2. Використання для шщацп дослiджуваних експлантiв живильного середо-вища MS, доповненого 0,5 mg/l NAA + 0,3 mg/l 2,4-D + 0,5 mg/l 6-BA забез-печуе отримання найбшьшо!" кiлькостi шщшованих експлантiв (78 % пiсля 40 дiб культивування).
3. Для намноження шщшованих експланлв доцiльно використовувати тверде живильне середовище LM, доповнене 0,5 mg/l NAA + 0,5 mg/l 2,4-D + 1,0 mg/l 6-BA. Використання цього середовища забезпечуе отримання не менше 96 % експланлв з адвентивними мшропагонами; 6,9 нових мшропа-гонiв на експлант i 3,0 нових сегментiв на мкропагш.
4. Для укорiнення мiкроживцiв дослщжуваного виду найбiльш придатним живильним середовищем е 0,5 LM, доповнене 0,25 mg/l 2,4-D.
5. Адаптащю регенеранлв до Грунтових умов доцiльно проводити в умовах культурально!' кiмнати в дерновому Труни з пiском та торфом (1:1:1), що забезпечуе тсля 60 дiб культивування отримання 82 % адаптованих рослин.
Лггература
1. Litvay J.D. Influence of a loblolly pine (Pinus taeda L.). Culture medium and its components on growth and somatic embryogenesis of the wild carrot (Daucus carota L.) / John D. Litvay, Devi
Нащональний лкотехшчний ун1верситет Украши
C. Verma, Morris A. Johnson // Plant cell reports. - Springer Verlag. - 1985. - Vol. 4, Issue 6. - Pp. 325-328.
2. Metasequoia (Genus) - ZipcodeZoo. [Electronic resource]. - Mode of access http://zipcodezoo. com/Key/Plantae/Metasequoia_Genus.asp.
3. Metasequoia glyptostroboides plant named 'Shirrmann's nordlicht': Plant Patent US PP20,820 P2 United States, PLT/213 A01H7/00/Kools Cornelius. - US 12/316,958; Filed: Dec. 18, 2008; Date of Patent: Mar. 9, 2010, US. Patent. - 6 p.
4. Murashige T. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures / T. Murashige, F. Skoog // Physiol. Pl. - Copenhagen. - 1962. - № 15. - Pp. 493-497.
5. Nugue C. Cultivars of Metasequoia glyptostroboides / C. Nugue // The Geobiology and Ecology of Metasequoia. Series: Topics in Geobiology. Netherlands: Springer. - 2005. - Vol. 22. - Pp. 361-366.
6. Мельничук М.Д. Бютехнолопя рослин : шдручник [для студ. ВНЗ] / М.Д. Мельничук, Т.В. Новак, В.А. Кунах. - К. : Вид-во "Полкраф-Консалтинг", 2003. - 520 с.
7. Слюсар С.1. Бюлопчш особливост вцщв родини Taxodiaceae F.W. Neger у зв'язку з ш-тродукщею в Лiсостепу Украши : автореф. дис. на здобуття наук. ступеня канд. бiол. наук: спец. 03.00.05 - "Ботанжа" / Сташслав 1горович Слюсар; НАН Украши. Нац. ботан. сад iM. М.М. Гришка. - К., 2005. - 18 с.
8. Слюсар С.1. 1нтродукцш таксодieвих (Taxodiaceae F.W. Neger) в Люостепу Украши / С.1. Слюсар, С.1. Кузнецов / за ред. проф. М.А. Кохна. - К. : Вид. центр НАУ, 2008. - 154 с.
9. Пат. 90219 Украхна, МПК А01Н 4/00. Споаб розмноження in vitro Metasequoia glyptostroboides Hu & Cheng / М.М. Гузь, P.M. Гречаник, М.М. Люовий, Ю.Е. Синявський; заяв-ник i власник пат. НЛТУ Украши. - Заявл. 30.01.2014, опубл. 12.05.2014, Бюл. № 9. - 4 с.
Гузь Н.М., Гречанык Р.М., Лисовый Н.Н., Синявский Ю.Е. Размножение Metasequoia glyptostroboides Hu & Cheng в условиях in vitro
Проанализированы литературные источники по тематике проведённых исследований. Приведен перечень наиболее ценных для садово-паркового хозяйства декоративных форм Metasequoia glyptostroboides Hu & Cheng. Представлены результаты исследований по размножению Metasequoia glyptostroboides Hu & Cheng методом культуры тканей. Установлены оптимальные сроки заготовки исходного материала. Экспериментально подобраны: схема стерилизации эксплантов; состав питательной среды для инициации, мультипликации и укоренения in vitro; субстрат для адаптации регенерантов к почвенным условиям. Полученные результаты подтвердили целесообразность размножения исследуемого вида предложенным способом.
Ключевые слова: метасеквойя, клон, in vitro, стерилизация, инициация, мультипликация, укоренение, адаптация.
Guz M.M., Grechanyk R.M., Lisoviy MM., Sinjavskiy Y.E. The Reproduction of Metasequoia Glyptostroboides Hu & Cheng under In Vitro Conditions
The analysis of the literature on the research subject is done. A brief description of the most valuable for Landscape Architecture decorative forms of Metasequoia glyptostroboides Hu & Cheng is provided. Some results of the investigation of Metasequoia glyptostroboides Hu & Cheng reproduction by using tissue culture are presented. Optimum conditions of procurement of starting material are determined. As the result of the experiments conducted the following issues are selected: a diagram of explants sterilization; composition of culture media for initiation, multiplication and rooting in vitro; substrate for regenerates' adaptation to ground waters. Obtained results confirmed expediency of reproduction of investigated species using recommended method.
Keywords: Metasequoia, clone, in vitro, sterilization, initiation, multiplication, rooting, adaptation.
