CC BY
54DOI:10.24412/1999-6780-2020-2-3-11 УДК 582.281.21:576.3:612.017
ОСОБЕННОСТИ ВЗАИМОДЕЙ-
СТВИЯ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ С ГРИБАМИ ПОРЯДКА MU-CORALES (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
Фролова Е.В. (зав. лаб.)*, Филиппова Л.В. (с.н.с., ассистент кафедры), Учеваткина А.Е. (с.н.с.), Аак О.В. (в.н.с.), Соловьева Г.И. (в.н.с.), Тараскина А.Е. (зав. лаб.), Васильева Н.В. (директор института, зав. кафедрой)
НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина, СевероЗападный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
Мукормикоз - инвазивная грибковая инфекция, характеризующаяся агрессивным течением с разрушением тканевых барьеров, ангиоинвазией, гематогенной диссе-минацией и последующим развитием тромбозов и некроза тканей. Высокий уровень смертности больных мукорми-козом, достигающий 50% и более, связан не только с агрессивным характером инфекции и устойчивостью му-коромицетов к большинству используемых в настоящее время антифунгальных препаратов, но также с неспособностью иммунной системы человека успешно противостоять мукоромицетам. Вдыхаемые споры мукоромице-тов способны адгезировать к эпителиальным клеткам дыхательных путей и проникать в них, однако механизмы этого взаимодействия не вполне ясны. Особенности взаимодействия клеток иммунной системы с грибами порядка Mucorales определяются стадией развития микромице-тов. При попадании в организм находящиеся в покое споры устойчивы к фагоцитозу и киллингу. Напротив, макрофаги и нейтрофилы способны повреждать набухшие споры и гифы грибов. После преодоления эндотелиального барьера мукоромицеты контактируют с тромбоцитами, которые подавляют способность гиф к прорастанию. Особенностью грибов порядка Mucorales является их способность активировать дендритные клетки к избыточной продукции провоспалительных цитокинов, что усугубляет дисфункцию эпителиального барьера. Известно, что Mucorales-специфические T-клетки присутствуют как у здоровых лиц, так и у гематологических пациентов с инва-зивным мукормикозом легких. Однако необходимы новые знания об особенностях взаимодействия клеток иммунной системы с грибами порядка Mucorales для повышения эффективности терапевтической стратегии в борьбе с мукормикозом.
Ключевые слова: мукормикоз, споры, гифы, врожденный иммунитет, макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки, адаптивный иммунитет
* Контактное лицо: Фролова Екатерина Васильевна, e-mail: [email protected]
FEATURES OF INTERACTION OF CELLS IMMUNE SYSTEM WITH MUCORALES (LITERATURE REVIEW)
Frolova E.V. (head of the laboratory), Filippova L.V. (senior scientific collaborator), Uchevatkina A.E. (senior scientific collaborator), Aak O.V. (leading scientific collaborator), Solovjova G.I. (leading scientific collaborator), Taraskina A.E. (head of the laboratory), Vasilyeva N.V. (director of the institute, head of the department)
Kashkin Research Institute of Medical Mycology of NorthWestern State Medical University named after I.I. Mechnikov, St. Petersburg, Russia
Mucormycosis is an invasive fungal infection characterized by aggressive course with destruction of tissue barriers, angioinvasia, hematogenic dissemination and subsequent development of thrombosis and tissue necrosis. The high mortality rate of patients with mucormycosis, reaching 50% or more, is associated not only with the aggressive nature of the infection and the resistance of mucormycetes to most of the currently used antifungal drugs, but also with the inability of the human immune system to successfully resist mucoromycetes. Inhaled mucormycete spores are able to adhere to the epithelial cells of the respiratory tract and penetrate them, but the mechanisms of this interaction are not completely clear. The interaction of immune system cells with fungi of the order Mucorales is determined by the stage of micromycetes development. When ingested, dormant spores are resistant to phagocytosis and killing. On the contrary, macrophages and neutro-phils can damage swollen spores and hyphae of fungi. After overcoming the endothelial barrier, mucormycetes come into contact with platelets, which inhibit the ability of hyphae to germinate. A special feature offungi of the order Mucorales is their ability to activate dendritic cells to excess production of proinflammatory cytokines, which exacerbates the dysfunction of the epithelial barrier. Mucorales-specific T-cells are present in both healthy individuals and hematological patients with invasive lung mucormycosis. However, new knowledge about the interaction of immune system cells with fungi of the order Mucorales is needed to improve the effectiveness of the therapeutic strategy in the fight against mucormycosis.
Key words: mucormycosis, spores, hyphae, innate immunity, macrophages, neutrophils, dendritic cells, adaptive immunity
ВВЕДЕНИЕ
За последние два десятилетия значительно возросла распространенность инвазивных грибковых инфекций у различных категорий иммунокомпроме-тированных больных [1]. Одной из таких инфекций является мукормикоз, обусловленный грибами порядка Mucorales. Эти микромицеты относятся к са-профитам, широко распространены в природе и обычно обитают в почве, компосте, экскрементах животных, разлагающихся овощах и сельскохозяйственных отходах [2, 3]. Мелкий размер спор (~6,6 мкм) способствует аэрогенному распространению
микромицетов на большие расстояния. Инфицирование происходит при вдыхании спор грибов, также возможно их попадание в желудочно-кишечный тракт вместе с продуктами питания и поражение грибами кожных покровов вследствие травматических повреждений [4].
Мукормикоз у людей преимущественно вызывают микромицеты родов Rhizopus, Mucor и Lichtheimia. Наиболее распространенный возбудитель этого заболевания - Rhizopus oryzae, за ним следуют Mucor circinelloides и Lichtheimia corymbifera, на которые в совокупности приходится около 70% инфекций [5]. Грибы порядка Mucorales обладают тропно-стью к сосудам, способностью к ангиоинвазии, тромбозу и некрозу тканей, поэтому характерной особенностью инфекции является быстрое развитие гематогенной диссеминации [6].
Главные факторы риска мукормикоза: декомпен-сированный сахарный диабет с кетоацидозом, трансплантация органов, химиотерапия, онкогематологи-ческие заболевания и повышенное содержание железа в сыворотке крови [7, 8]. При диссеминированной форме заболевания уровень смертности может достигать 95% [6]. Высокие показатели летальности, связанные с мукормикозом, отражают не только агрессивный характер инфекции, но и неспособность иммунной системы успешно противостоять грибковой атаке. В настоящее время эффективность противогрибковых препаратов, а именно липосомального амфотерицина В и изавуконазола, недостаточна (около 60-70%), что является поводом для углубленного изучения особенностей механизмов иммунного ответа к грибам порядка Mucorales и, в перспективе, разработки новых лекарственных препаратов и стратегий лечения [9].
В отличие от инвазивного аспергиллеза, знания о взаимодействии патогена с макроорганизмом при му-кормикозе все еще очень ограничены. Врожденный иммунитет включает в себя физические (естественные) барьеры, такие как кожные покровы, слизистые оболочки дыхательных путей и пищеварительного тракта. Кератиноциты и эпителиоциты слизистых оболочек совместно с иммунными клетками предотвращают проникновение микробов в организм хозяина. Мукоромицеты обладают способностью преодолевать физические барьеры, чаще всего при вдыхании через респираторный тракт, а также через поврежденные кожу и слизистые оболочки (травмы, ожоги) [10-12]. В случае проникновения патогена в организм человека действие факторов врожденного иммунитета направлено на ограничение распространения микромицетов и последующую активацию адаптивного иммунного ответа. Одними из наиболее важных клеток врожденного иммунитета являются макрофаги, нейтрофилы и дендритные клетки (DCs). Возникновение мукормикоза связано с неспособно-
стью фагоцитирующих клеток уничтожать грибковые споры и препятствовать прорастанию грибов [13].
Наряду с факторами врожденного иммунитета, клетки и медиаторы адаптивного иммунитета противостоят развитию инфекции. Известно, что иммуно-супрессивная терапия ослабляет эффекторные функции иммунных клеток и значительно увеличивает восприимчивость организма к инвазивным микозам [4, 13]. Для понимания патогенеза мукормикоза необходимо изучение механизмов врожденного и адаптивного иммуннитета, участвующих в уничтожении мукоромицетов, как у иммунокомпетентных людей, так и при ослабленном иммунном ответе.
1. Эпителиальные клетки
Люди ежедневно подвергаются воздействию тысяч спор плесени, находящихся в воздухе. Таким образом, альвеолярно-капиллярный барьер дыхательных путей толщиной около 0,5-2 мкм с общей поверхностью более 100 м2 представляет собой основной путь проникновения грибов в организм человека [4]. Вдыхаемые споры мукоромицетов способны к адгезии к эпителиальным клеткам дыхательных путей и последующему проникновению в них, однако механизмы этого взаимодействия не вполне ясны.
Транскриптомный анализ результатов взаимодействия таких мукоромицетов, как L. corymbifera, R. oryzae, R. delemar и C. bertholletiae, с клеточными культурами человеческих эпителиальных клеток (A-549) показал, что все исследованные грибы активировали клеточный рецептор тромбоцитарного фактора роста B (PDGFRB). Блокирование PDGFRB уменьшало повреждение клеточных культур эпителиоцитов A-549, вызванное грибами порядка Mucorales [5]. Watkins T. N. с соавт. провели секвенирование тран-скриптома (RNA-seq) эпителиальных клеток дыхательных путей на ранних стадиях инфекции, вызванной Rhizopus arrhizus var. delemar (R. delemar), используя мышиную модель легочного мукормикоза, и инфицированных in vitro человеческих альвеолярных эпителиальных клеток. В результате RNA-seq установлено, что споры R. delemar активировали внутриклеточные сигнальные пути эпителиальных клеток посредством взаимодействия с рецепторами эпи-дермального фактора роста (EGFR). Специфические ингибиторы EGFR (цетуксимаб или гефитиниб) значительно снижали способность R. delemar проникать и повреждать эпителиальные клетки дыхательных путей. Введение гефитиниба существенно повышало выживаемость мышей с легочным мукормикозом, снижало проникновение грибов в ткани и ослабляло активацию EGFR. Эти результаты показывают, что PDGFRB и EGFR представляет собой новую мишень, блокирующую инвазию грибов порядка Mucorales в альвеолярные эпителиальные клетки [14].
2. Макрофаги
Одну из основных ролей в инициации и развитии воспалительных реакций в легких играют макрофаги.
Активированные макрофаги благодаря продукции свободных радикалов, NO, цитокинов, хемокинов и других медиаторов воспаления обезвреживают патогенные микроорганизмы и запускают механизмы врожденного и адаптивного иммунного ответа [15]. Способность вдыхаемых спорангиоспор мукоро-мицетов прорастать и образовывать гифы в брон-хоальвеолярном пространстве имеет решающее значение для развития инфекции, поэтому фагоцитарная активность макрофагов является ключевым событием в локализации инфекции на ранних стадиях заболевания. Существует ограниченное число работ, посвященных изучению роли фагоцитарных клеток в борьбе с мукоромицетами. Установлено, что перед началом роста спорангиоспоры грибов порядка Mucorales выходят из фазы покоя, набухают и увеличиваются в размерах [16]. При изучении способности мышиных макрофагов фагоцитировать покоящиеся, набухшие и опсонизированные споры вирулентных и аттенуированных штаммов Lichtheimia corymbifera выявили, что споры вирулентного штамма фагоцитируются легче, чем аттенуированный штамм во всех трех состояниях [17]. По мнению авторов, вирулентные споры грибов способны использовать макрофаги для распространения в организме хозяина. Эти выводы согласуются с данными о том, что альвеолярные макрофаги мышей не способны успешно уничтожать споры R. oryzae, хотя и сдерживают прорастание гиф [13]. По-видимому, Rhizopus spp. подавляют созревание фагосом альвеолярных макрофагов мышей за счет присутствия меланина в поверхностном слое клеточной стенки и изменения метаболизма железа, играющего важную роль в регуляции иммунной защиты [18]. В другом исследовании установлено, что макрофаги Drosophila melanogaster слабее фагоцитировали споры и повреждали гифы R. oryzae по сравнению с конидиями Aspergillus fumigatus [19]. Особенностью R. oryzae была способность подавлять экспрессию генов, ответственных за паттерн-распознающие рецепторы (PPRs), взаимодействующие с патоген-ассоциированными молекулярными паттернами (PAMPs) патогенных микроорганизмов, и кодирующих провоспалительные цитокины [19]. Большой интерес представляют данные о способности M. circinelloides вызывать апоптоз макрофагов, рекрутированных в очаг инфекции, что приводило к значительному истощению фагоцитарных клеток [20]. Вероятно, индукция апоптоза макрофагов может представлять собой важный механизм вирулентности мукоромицетов и, следовательно, обеспечивать новую цель для таргетной терапии. В совокупности результаты этих исследований свидетельствуют, что хотя случаи мукормикоза у иммунокомпетентных хозяев редки, они могут быть обусловлены тем, что макрофаги здорового человека не достаточно эффективны в уничтожении покоящихся спор мукоромице-тов [21].
В экспериментальных исследованиях показано, что иммуносупрессивные препараты значительно увеличивают риск летального исхода от мукормико-за. Это может быть связано с тем, что фагоцитарная способность макрофагов на фоне иммуносупрессии значительно снижена по сравнению с их активностью в нормальном состоянии. Так, глюкокортикостерои-ды подавляли фагоцитоз спор и повреждение гиф R. oryzae макрофагами D. melanogaster [19]. При введении кортизона экспериментальным мышам выявили не только снижение способности макрофагов убивать споры R. oryzae, но и неспособность ингибировать прорастание спор [13]. Эти наблюдения явно демонстрируют важность фагоцитов в борьбе с мукоро-мицетами, однако молекулярные механизмы их взаимодействия достоверно неизвестны.
3. Нейтрофилы
Нейтрофилы являются важными клетками врожденной иммунной системы и наиболее многочисленными лейкоцитами крови. В ответ на внедрение патогена нейтрофилы рекрутируются из крови в инфицированную ткань, поглощают и переваривают захваченные микроорганизмы с использованием кислород-зависимых и кислороднезависимых механизмов, что приводит к элиминации инфекционного агента. Нейтрофилы проявляют фунгицидную активность, опосредованную продукцией антимикробных пептидов, образованием нейтрофильных внеклеточных ловушек и выработкой широкого спектра цитокинов, хемокинов и других воспалительных медиаторов [22].
Известным фактором риска возникновения му-кормикоза у онкогематологических больных является длительный агранулоцитоз, поэтому важно знать особенности взаимодействия грибов с нейтрофилами [23-25]. В экспериментальных исследованиях при интраназальном инфицировании мышей показано, что только прорастающие, а не покоящиеся споры R. oryzae способны рекрутировать нейтрофилы и инициировать воспаление в очаге инфекции. Гифы грибов индуцируют экспрессию TLR2 мРНК в нейтро-филах, что подтверждает участие TLR2 в распознавании R. oryzae, а также вызывают экспрессию генов провоспалительных цитокинов TNF-а и IL-1-ß. Таким образом, нейтрофилы обладают неодинаковой активностью в отношении различных морфотипов грибов порядка Mucorales. Кроме того, установлено, что степень разрушения гиф R. oryzae нейтрофилами значительно ниже по сравнению с действием фагоцитов на гифы A. fumigatus, что может быть связано с более выраженным подавлением окислительного взрыва вследствие снижения генерации супероксиданиона [26]. Эти данные согласуются с результатами Gil-Lamaignere C. и соавторов, которые отметили, что гифы R. oryzae и R. microsporus более устойчивы к противогрибковой активности полиморфноядерных лейкоцитов человека по сравнению с Absidia
corymbifera. Интерферон-гамма (IFN-y) и гранулоци-тарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) по отдельности или совместно стимулировали нейтрофилы к высвобождению TNF-a, что приводило к повреждению гиф и эрадикации грибов. На основании этих данных предполагают возможность использования IFN-y и GM-CSF в лечении му-кормикоза [27].
Моделирование диабета с кетоацидозом при введении экспериментальным животным аллоксана привело к подавлению хемотаксиса нейтрофилов в участки кожи, инфицированные R. oryzae, более раннему прорастанию грибковых спор и быстрому распространению инфекции [13]. В недавних исследованиях Gebremariam T. с соавторами установили, что гипергликемия и кетоацидоз нарушают способность нейтрофилов уничтожать грибы порядка Mucorales [28]. Таким образом, необходимо дальнейшее изучение механизмов, позволяющих грибам порядка Mucorales уклоняться от нейтрофильных атак. В то же время поиск новых препаратов, усиливающих антимикробную активность нейтрофилов, рассматривают как перспективное направление в условиях формирующейся резистентности микромицетов к ан-тимикотикам.
4. Естественные киллеры
Естественные киллеры (NK) играют регулятор-ную и цитотоксическую роль во врожденном иммунном ответе. NK-клетки опосредуют уничтожение инфицированных и опухолевых клеток посредством нескольких эффекторных механизмов: за счет перфо-рин / гранзимсодержащих гранул, рецепторов апоптоза и антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности. NK-клетки способны убивать не только опухолевые клетки, но и патогенные микроорганизмы. Помимо способности к непосредственному уничтожению, NK-клетки продуцируют различные цитокины, такие как TNF-a, GM-CSF или RANTES (Regulated on Activation, Normal T-cell Expressed and Secreted - хемокины, регулируемые, экспрессируемые и секретируемые при активации нормальными Т-клетками). Кроме того, NK-клетки высвобождают IFN-y, который повышает фагоцитарную активность нейтрофилов и макрофагов и стимулирует созревание DCs. В свою очередь, IL-12, интерфероны 1-го типа (IFN) и IFN-y являются сильными активаторами NK-клеток и опосредуют взаимодействие между макрофагами и NK-клетками, которые часто совместно локализуются в очагах инфек-
R. oryzae обладают иммуносупрессивным действием за счет подавления секреции NK-клетками таких иммунных молекул, как RANTES и IFN-y [30-32]. В последующих исследованиях следует оценить возможность использования NK-клеток как потенциального инструмента адаптивной иммунотерапии при трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК). Необходимо дальнейшее изучение механизмов, посредством которых NK-клетки повреждают различные грибы, что в конечном итоге может помочь в разработке новых терапевтических стратегий.
5. Эндотелиальные клетки
Ангиоинвазия является отличительной чертой мукоромицетов. Их способность к преодолению эн-дотелиальной выстилки сосудистой сети приводит к тромбозу и некрозу тканей и гематогенному распространению. Установлено, что R. oryzae адгезируется непосредственно на эндотелиальных клетках сосудистой стенки и вызывает повреждение в результате интернализации. Проникновение опосредуется поверхностными рецепторами эндотелиальных клеток GRP78, экспрессия которых значительно усиливается при кетоацидозе и гипергликемическом состоянии [33]. В последующих исследованиях было показано, что экспериментальные животные с кетоацидозом чрезвычайно восприимчивы к интратрахеальному заражению мукоромицетами. Впервые было установлено, что R. oryzae проникает в эндотелиальные клетки посредством связывания грибковых белков CotH с рецептором GRP78 эндотелиальных клеток. При этом кетоацидоз оказывал прямое влияние как на экспрессию GRP78, так и на CotH [28]. Авторы сделали вывод о возможном терапевтическом потенциале блока-торов GRP78 в лечении или предотвращении мукор-микоза.
6. Тромбоциты
Тромбоциты активно участвуют в поддержании гемостаза организма и процессах тромбообразования. Активированные тромбоциты взаимодействуют с эн-дотелиальными клетками сосудистой стенки и циркулирующими лейкоцитами, высвобождая растворимые медиаторы, которые могут действовать как на местном, так и на системном уровне. Секреция цито-кинов и хемокинов тромбоцитами позволяет расценивать их активацию как неотъемлемый фактор воспаления. Тромбоциты обладают антимикробными свойствами посредством высвобождения из гранул антимикробных катионных белков (например, тром-боцитарного фактора 4 — PF-4), а также проявляют хемотаксические свойства в отношении рекрутирования фагоцитов, опосредуя высвобождение таких ци-токинов как IL-1P [34, 35].
Поскольку развитие тромбоза является отличительной чертой мукормикоза, то роль тромбоцитов во врожденном иммунном ответе к грибам порядка Mu-corales представляет большой интерес. В исследованиях in vitro установлено, что адгезия тромбоцитов к
ции [29].
Роль NK-клеток в патогенезе мукормикоза является недостаточно изученной. Schmidt S. с соавторами показали, что споры R. oryzae не активируют NK-клетки и устойчивы к их фунгицидной активности. Напротив, гифы грибов способны активировать NK-клетки, что приводит к их повреждению в результате высвобождения перфорина. Установлено, что гифы
спорам и гифам грибов вызывает их активацию и высвобождение из гранул растворимых медиаторов с микробицидной активностью. Показано, что совместная инкубация микромицетов с тромбоцитами в значительной степени подавляет прорастание гиф Rhizopus, Mucor, Lichtheimia, Rhizomucor и вызывает их повреждение [36].
Способность тромбоцитов ингибировать прорастание мукоромицетов предусматривает, что эти «непрофессиональные» иммунные клетки играют важную роль в предотвращении инвазии патогена. Однако выраженный тромбоз приводит к тромбоци-топении, поэтому у таких пациентов не всегда возможно выполнение хирургического вмешательства/биопсии для получения материала и последующего гистологического исследования, что значительно затрудняет диагностику [36]. Несмотря на то, что в предварительных исследованиях показана важная роль тромбоцитов в иммунитете против мукоромице-тов, основные механизмы еще предстоит определить. Кроме того, необходимо изучение влияния иммуно-супрессии на взаимодействие тромбоцитов и грибов порядка Mucorales.
7. Дендритные клетки
Дендритные клетки (DCs) локализованы по всему эпителию дыхательных путей, пищеварительного тракта и в кожных покровах. Различные популяции DCs располагаются как выше, так и ниже базальной мембраны эпителия дыхательных путей, что позволяет им одними из первых реагировать на поступающие антигены [37]. DCs считаются высокоспециализированными антиген-презентирующими клетками и являются связующим звеном, обеспечивающим взаимодействие клеток врожденного и адаптивного иммунитета. Распознавание и поглощение микроорганизмов DCs происходит за счет многочисленных пат-терн-распознающих рецепторов (PRRs), которые могут обнаруживать грибковые патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMPs). Активация PRRs DCs приводит к синтезу и высвобождению цитокинов и хемокинов, которые привлекают и активируют клетки врожденного иммунного ответа и управляют направленностью адаптивного иммунного ответа [38]. Первоначально DCs представляют антиген наивным CD4+Т-хелперам (Th) и инициируют их дифференцировку в различные типы эффекторных клеток. Активация ТЬ определяется связыванием Т-клеточного рецептора (ТCR) с антигенным эпитопом, встроенным в молекулу главного комплекса гистосовместимости (МНС) II класса с последующим взаимодействием ко-стимулирующих молекул: CD28 на поверхности Т-клеток с лигандами CD80 (B7-1)/CD86 (B7-2) на антиген-представляющих клетках. После презентации антигена и ко-стимуляции аутокринная продукция IL-2 позволяет Т-хелперам пролиферировать, а особенности
цитокинового микроокружения определяют их диф-ференцировку в различные клоны Т-хелперов [38].
Сведения о взаимодействии DCs и грибов порядка Mucorales очень ограничены. Wurster S. с соавт. изучали in vitro взаимодействие moDCs, полученных из моноцитов здоровых доноров, с различными мор-фотипами грибов порядка Mucorales и Ascomycota. Инактивированные зародышевые трубки и покоящиеся споры R. arrhizus и других патогенных грибов порядка Mucorales, в отличие от конидий A. fumigatus, стимулировали moDCs к синтезу мРНК ILlß и TNFa и секреции провоспалительных цитокинов TNF-a, IL-lß, IL-6, IL-8, GM-CSF и MCP-1. Более того, споры R. arrhizus индуцировали активацию ко-стимулирующих молекул на moDCs, необходимых для инициации дифференцировки специфических Th
[39]. В другом исследовании установлено, что в отличие от патогенных грибов (Histoplasma capsulatum), условно-патогенные микромицеты (Aspergillus и Rhizopus) активируют IL-23-продуцирующие DCs человека, что является необходимым условием дифференцировки Th17. Выявлено, что после прорастания спор грибов в гифы в составе клеточной поверхности появляется ß-глюкан, связывающийся с dectin-1 DCs, что приводит к продукции IL-23. IL-17 определяет активность нейтрофилов, действуя в качестве хемоаттрактанта и индуцируя выработку противогрибковых дефензинов. Таким образом, появление ß-глюкана в наружном слое клеточной стенки гриба значимо для индукции оси IL-23/Th17 и может представлять собой важный фактор, который регулирует защитный иммунитет к условно-патогенным грибам [19].
Для мониторинга врожденного иммунного ответа Belic S. с соавт. использовали модель, состоящую из монослоя эпителиальных клеток аденокарциномы легкого человека (A549) и эндотелиальных клеток легочной артерии человека (HPAEC), культивируемых на разных сторонах мембраны Transwell. Данная модель позволяет проводить анализ клеточного ответа (транскрипционных профилей) или растворимых маркеров (концентрации цитокинов) в каждой камере, при определенных условиях, дополненных moDCs. Как и в предыдущем исследовании, было установлено, что конидии и проросшие гифы R. arrhizus, в отличие от A. fumigatus, в большей степени стимулировали эпителиальные клетки к секреции IL-1ß и TNF-a, особенно в присутствии moDCs. Незначительные межвидовые различия в характере продукции цитокинов и хемокинов эпителиальными клетками и moDCs наблюдали между изученными видами грибов порядка Mucorales. В то время как R. pusillus индуцировали заметное высвобождение IL-6 и IL-12p70, Cunninghamella bertholletiae вызывали повышенную секрецию CCL2, CCL3 и CCL5 moDCs
[40]. Это наблюдение может быть связано с различ-
ным набором PAMPs в составе клеточной стенки грибов [41, 42].
Для оценки степени повреждения эпителиальных клеток, вызванных грибами, определяли лактатдегид-рогеназу (ЛДГ) в культуральных супернатантах альвеолярной камеры. Установлено, что R. arrhizus и C. bertholletiae вызывали значительное повышение концентрации ЛДГ в отсутствии moDC. A. fumigatus обусловливал минимальное высвобождение ЛДГ. Важно, что добавление moDCs приводило к существенному повышению уровня ЛДГ и усилению проницаемости эпителиального барьера, что указывает на усиление клеточного стресса из-за воспалительных цитокинов и метаболитов мононуклеарных клеток. Наиболее сильный цитотоксический эффект выявлен при добавлении moDC к эпителиальному слою, инфицированному R. pusillus (увеличение в 2,2 раза). В проведенных экспериментах подтверждена связь между секрецией цитокинов moDC и усилением разрушения эпителиального барьера, вызванным R. arrhizus, по сравнению с A. fumigatus. Установлены разительные отличия в реакции человеческих moDC на споры грибов Ascomycota и Mucorales, что может быть объяснено отсутствием иммунопротективного гидрофобного слоя в спорах последних. Таким образом, особенностью грибов порядка Mucorales является их способность индуцировать быстрый и сильный про-воспалительный ответ DCs, который усугубляет дисфункцию эпителиального барьера.
Необходимо учитывать, что репертуар DCs легких неоднороден, и его состав претерпевает динамические изменения в зависимости от степени воспаления. При развитии инфекции moDCs генерируются в легких и имеют ключевое значение для провоспали-тельного цитокинового ответа, фагоцитоза спор грибов и праймирования Th, в то время как обычные DCs и плазмоцитоидные DCs являются доминирующими подмножествами в состоянии покоя [43]. Поэтому будущие исследования иммунопатологических процессов, обусловленных грибами порядка Mucorales, должны быть направлены на выяснение роли различных подмножеств DCs в инфекционном процессе.
8. Т-клетки
Гомеостаз различных клонов CD4+Т-клеток, включая Th1/Th2/Th17/Treg, различающихся специфическими профилями цитокинов и внутриклеточными маркерами, играет ключевую роль в организации сбалансированного иммунного ответа, опосредующего толерантность к комменсалам при одновременном устранении инвазивных патогенов. Традиционно считают, что Th1, продуцирующие IFN-y, играют ключевую роль в клиренсе патогенных микроорганизмов и обеспечивают защитный иммунитет против микроскопических грибов. Напротив, Th2, секре-тирующие IL-4, связаны с повышенной восприимчивостью к грибковым инфекциям. Th17 обладают
мощной продукцией IL-17, который играет центральную роль в инициации острого воспалительного ответа посредством привлечения нейтрофилов и индукции эпителиальных антимикробных пептидов [38, 44].
Помимо механизмов врожденного иммунитета, которые могут оказаться недостаточно эффективными против грибов порядка Mucorales, клетки адаптивного иммунитета также способствуют защите от грибковой инфекции [45]. Однако пока крайне мало данных о Mucorales-специфических T-клетках и их количественном различии у здоровых лиц и гематологических пациентов с мукормикозом [39, 46-48].
Так, у здоровых доноров и гематологических пациентов без инвазивного мукормикоза при стимуляции человеческих мононуклеарных клеток периферической крови лизатами грибов порядка Mucorales установлено преимущественное высвобождение про-воспалительных цитокинов IFN-y и TNF-a. Это является признаком ТЫ-поляризованного иммунного ответа, усиливающего фагоцитарную активность и экспрессию маркеров созревания дендритных клеток. Кроме того, Т-клетки, продуцирующие IFN-y, были способны непосредственно вызывать повреждение гиф грибов порядка Mucorales [39, 47, 49].
У гематологических больных с риском развития мукормикоза определяли специфичные для плесневых грибов Т-клетки как вспомогательный биомаркер заболевания. Potenza L. с соавт. выявили Mucorales-специфичные Т-клетки у гематологических пациентов как при заражении, так и на протяжении всего инфекционного процесса, но не после разрешения инфекции. Антиген (Ag)-специфические Т-клетки преимущественно секретировали IL-4 и IL-10, в меньшей степени — IL-17, что является показателем непротективного №2-поляризованного иммунного ответа. Эти данные свидетельствуют о том, что присутствие Mucorales-специфических Т-клеток тесно связано с развитием мукормикоза и может быть использовано для улучшения диагностики заболевания [47, 48].
В других исследованиях у гематологических больных с риском развития мукормикоза или гистологически подтвержденным диагнозом методом проточной цитометрии определяли пул Ag-активированных CD4 T-клеток с повышенной экспрессией CD154 (CD40L). Считают, что CD154 является надежным функциональным маркером активации, так как специфически экспрессируется всеми Ag-активированными CD4 T-клетками вскоре после стимуляции клеток крови грибковыми антигенами in vitro. Количество Ag-активированных Т-клеток было достоверно выше у пациентов с доказанным мукор-микозом, чем у лиц без грибковой инфекции, (чувствительность — 90%, специфичность — 80%). Это может быть основанием для назначения антифун-гальной терапии у больных группы риска в случаях,
когда проведение биопсии невозможно и/или результаты микробиологического исследования отрицательны [46, 50].
Так как Mucora/es-специфические T-клетки идентифицированы у инфицированных пациентов, то индукция противогрибкового иммунитета за счет активации Th1 является привлекательной стратегией для борьбы с ИМЛ. Было показано, что Т-клетки, отобранные на основании антиген-зависимой экспрессии CD154, являются перспективными кандидатами для адаптивной терапии. Schmidt S. с соавт. использовали экстракты R. oryzae для стимуляции мо-нонуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров в присутствии различных комбинаций цитокинов [49]. После выделения и культивирования Mucora/es-специфичные Th1 демонстрируют перекрестную реактивность к антигенам некоторых грибов, повышают противогрибковую активность фагоцитов и обладают значительно меньшей аллореак-тивностью, чем исходная клеточная фракция.
Castillo P. с соавт. попытались выделить, культивировать и охарактеризовать Т-клетки, специфичные для R. oryzae, - наиболее распространенного гриба, обнаруженного у пациентов с мукормикозом. Предложенный метод, по мнению авторов, является надежным и воспроизводимым, и его можно применять для генерирования достаточного количества активированных R. oryzae-специфических Т-клеток и использования в качестве адаптивной иммунотерапии у реципиентов ТГСК [51]. Введение донорских Т-клеток, специфичных к R. oryzae, может быть перспективным направлением в терапии пациентов с лимфопенией после восстановления числа нейтрофи-лов с целью поддержания эффекторных функций
нейтрофилов и макрофагов для предотвращения или лечения ИМЛ.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Инвазивные грибковые инфекции с высокой летальностью все чаще становятся проблемой современного здравоохранения. Рост заболеваемости мукормикозом отмечен во всем мире, в связи с этим понимание механизмов патогенеза инвазивной грибковой инфекции, вызванной мукоромицетами, имеет первостепенное значение в борьбе с высокой смертностью, связанной с грибами этого порядка. Мукоро-мицеты способны противостоять механизмам врожденного иммунитета, в результате чего быстрое образование гиф позволяет грибам проникать в сосудистую сеть, распространяться и наносить непоправимый ущерб макроорганизму. Кроме того, неспособность иммунокомпрометированной иммунной системы хозяина предотвращать инвазию патогена имеет большое значение в возникновении угрожающей жизни инфекции.
Особенностью грибов порядка Мисога1еъ является способность к невероятно эффективному преодолению эпителиальных и эндотелиальных клеток, к выживанию в фагоцитарных клетках и стимуляции дендритных клеток к продукции провоспалительных цитокинов, что приводит к повреждению эпителиального пласта. Определение молекулярных основ взаимодействия клеток иммунной системы и грибов порядка Mucorales будет способствовать разработке новых стратегий таргетной терапии и повышению эффективности лечения инфекций, вызванных муко-ромицетами.
ЛИТЕРАТУРА
1. Васильева Н.В., Климко Н.Н., Цинзерлинг В.А. Диагностика и лечение инвазивных микозов: современные рекомендации. Вестник Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования. 2010; 2 (4): 5-18. [Vasil'eva N.V., Klimko N.N., Cinzerling V.A. Diagnosis and treatment of invasive mycoses: current recommendations. Bulletin of the Saint Petersburg Medical Academy of Postgraduate Education. 2010; 2 (4): 5-18 (In Russ)].
2. Richardson M. The ecology of the zygomycetes and its impact on environmental exposure. Clin. Microbiol. Infect. 2009; 15: 2-9. doi: 10.1111/j.1469-0691.2009.02972.x.
3. Petrikkos G., Skiada A., Lortholary O., et al. Epidemiology and clinical manifestations of mucormycosis. Clin. Infect. Dis. 2012; 54 (1): 23-34. doi: 10.1093/cid/cir866.
4. Hassan M.I.A., Voigt K. Pathogenicity patterns of mucormycosis: epidemiology, interaction with immune cells and virulence factors. Medical Mycology. 2019; 57 (Suppl 2): S245-S256. doi:10.1093/mmy/myz011.
5. Chibucos M.C., Soliman S., Gebremariam T., et al. An integrated genomic and transcriptomic survey of mucormyco-sis-causing fungi. Nat. Commun. 2016; 7, 12218. doi: 10.1038/ncomms12218.
6. Nam Y., Jung, J., Park S.S., et al. Disseminated mucormycosis with myocardial involvement in a renal transplant recipient. Transpl. Infect. Dis. 2015; 17 (6): 890-896.doi:10.1111/tid.12452.
7. Ibrahim A.S., Spellberg B., Walsh T.J., Kontoyiannis D.P. Pathogenesis of mucormycosis. Clin. Infect. Dis. 2012; 54: S16-S22. doi:10.1093/cid/cir865.
8. Sarvestani A.S., Pishdad G., Bolandparvaz S. Predisposing factors for mucormycosis in patients with diabetes melli-tus; an experience of 21 years in Southern Iran. Bull Emerg. Trauma 2013; 1(4): 164-170.
9. Natesan S.K., Chandrasekar P.H. Isavuconazole for the treatment of invasive aspergillosis andmucormycosis: Current evidence, safety, efficacy, and clinical recommendations. Infect. Drug Resist. 2016; 9: 291-300. doi: 10.2147/IDR.S102207.
10. Fanfair R. N., Benedict K., Bos J., et al. Necrotizing cutaneous mucormycosis after a tornado in Joplin, Missouri, in 2011. N. Engl. J. Med. 2012; 367 (23): 2214-2225. doi: 10.1056/NEJMoa1204781.
11. SpellbergB. Gastrointestinal mucormycosis an evolving disease. Gastroenterol. Hepatol. 2012; 8 (2): 140-142.
12. Lee S.C., Watkins B.R.B., Li A., et al. Analysis of a food-borne fungal pathogen outbreak: virulence and genome of a mucor circinelloides isolate from yogurt. mBio. 2014; 5 (4): e01390-14. doi: 10.1128/mBio.01390-14.
13. Ghuman H., Voelz K. Innate and adaptive immunity to mucorales. J. Fungi. 2017; 3 (3): 48. doi: 10.3390/jof3030048.
14. Watkins T., Gebremariam T., SwidergallM., et al. Inhibition of EGFR signaling protects from mucormycosis. MBio. 2018; 9 (4): e01384-18. doi:10.1128/mBio.01384-18.
15. Лямина С.В., Монастырская Е.А., Малышев И.Ю. Эффекторные функции альвеолярных макрофагов при заболеваниях легких: роль сурфактантного белка D (SP-D). Патогенез. 2008; 6 (1): 9-15. [Lyamina S.V., Monas-tyrskaya E.A., Malyshev I.YU. Effector functions of alveolar macrophages in lung diseases: the role of surfactant protein D (SP-D). Pathogenesis. 2008; 6 (1): 9-15 (In Russ)].
16. Thanh N.V., Rombouts F.M., Nout M.J. Effect of individual amino acids and glucose on activation and germination of Rhizopus oligosporus sporangiospores in tempe starter. J. Appl. Microbiol. 2005; 99: 1204-1214. doi: 10.1111/j.1365-2672.2005.02692.x.
17. Kraibooj K., Park H.R., Dahse H.M., et al. Virulent strain of Lichtheimia corymbifera shows increased phagocytosis by macrophages as revealed by automated microscopy image anaylsis. Mycoses. 2014; 57: 56-66. doi: 10.1111/myc.12237.
18. Andrianaki A.M., Kyrmizi I., Thanopoulou K., et al. Iron restriction inside macrophages regulates pulmonary host defense against Rhizopus species. 2018; 9 (1): 3333. doi: 10.1038/s41467-018-05820-2.
19. Chamilos G., Lewis R.E., Hu J., et al. Drosophila melanogaster as a model host to dissect the immunopathogenesis of zygomycosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008; 105: 9367-9372. doi: 10.1073/pnas.0709578105.
20. López-Muñoz A., Nicolás F.E., García-Moreno D., et al. An adult zebrafish model reveals that mucormycosis induces apoptosis of infected macrophages. Sci Rep. 2018; 8: 12802. doi: 10.1038/s41598-018-30754-6.
21. Khiste J.A., Bolde S.A., Pandit G.A., Tamboli N.A.S. Mucormycosis of maxillary sinus in immunocompetent patient masquerading as neoplasm: a case report. Int. J. Oral Maxillofac. Pathol. 2013; 4: 50-53.
22. Desai J.V., LionakisM.S. The role of neutrophils in host defense against invasive fungal infections Curr. Clin. Microbiol. Rep. 2018; 5 (3): 181-189. doi: 10.1007/s40588-018-0098-6.
23. Климко Н.Н., Хостелиди С.Н., Бойченко Э.Г. и др. Мукормикоз у детей с гематологическими и онкологическими заболеваниями в Санкт-Петербурге. Журнал инфектологии. 2016; 8 (3): 75-82. [Klimko N.N., Khostelidi S.N., Bojchenko E.G., et al. Mucormycosis in children with hematological and oncological diseases in Saint Petersburg. Journal of Infectology. 2016; 8(3): 75-82 (In Russ)].
24. Солопова Г.Г., Мякова Н.В., Шелихова Л.Н. и др. Мукормикоз у онкогематологических пациентов детского возраста: результаты одноцентрового исследования. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2019; 21 (1): 39-45. [Solopova G.G., Myakova N.V., Shelihova L.N., et al. Mucormycosis in children's oncohemato-logical patients: results of a single-center study. Clinical Microbiology and antimicrobial chemotherapy. 2019; 21 (1): 3945 (In Russ)].
25. NoorifardM., Sekhavati E., Jalaei Khoo Н., et al. Epidemiology and clinical manifestation of fungal infection related to Mucormycosis in hematologic malignancies. J. Med. Life. 2015; 8 (Spec Iss 2): 32-37.
26. Chamilos G., Lewis R.E., Lamaris G., et al. Zygomycetes hyphae trigger an early, robust proinflammatory response in human polymorphonuclear neutrophils through toll-like receptor 2 induction but display relative resistance to oxidative damage. Antimicrob. Agents Chemother. 2008; 52: 722-724. doi:10.1128/AAC.01136-07.
27. Gil-Lamaignere C., Simitsopoulou M., Roilides E., et al. Interferon-gamma and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor augment the activity of polymorphonuclear leukocytes against medically important zygomycetes. J Infect Dis. 2005; 191 (7): 1180-1187. doi: 10.1086/428503.
28. Gebremariam T., Lin L., Liu M. et al. Bicarbonate correction of ketoacidosis alters host-pathogen interactions and alleviates mucormycosis. J. Clin. Invest. 2016; 126(6): 2280-94. doi: 10.1172/JCI82744.
29. Vivier E., Tomasello E., Baratin M., et al. Functions of natural killer cells. Nat. Immunol. 2008; 9 (5): 503-510. doi: 10.1038/ni1582.
30. Schmidt S., Tramsen L., Perkhofer S., et al. Rhizopus oryzae hyphae are damaged by human natural killer (NK) cells, but suppress NK cell mediated immunity. Immunobiology 2013; 218, 939-944. doi: 10.1016/j.imbio.2012.10.013.
31. Schmidt S., Schneider A., Demir A., et al. Natural killer cell-mediated damage of clinical isolates of mucormycetes. Mycoses. 2016; 59 (1): 34-38. doi: 10.1111/myc.12431.
32. Schmidt S., Tramsen L., Lehrnbecher T. Natural killer cells in antifungal immunity. Front Immunol. 2017; 8: 1623. doi: 10.3389/fimmu.2017.01623. eCollection 2017.
33. Liu M., Spellberg B., Phan Q.T., et al. The endothelial cell receptor GRP78 is required for mucormycosis pathogenesis in diabetic mice. J. Clin. Investig. 2010; 120(6): 1914-24. doi: 10.1172/JCI42164.
34. Серебряная Н.Б., Шанин С.Н., Фомичева Е.Е., Якуцени П.П. Тромбоциты как активаторы и регуляторы воспалительных и иммунных реакций. Часть 2. Тромбоциты как участники иммунных реакций. Медицинская иммунология. 2019; 21 (1): 9-20. doi: 10.15789/1563-0625-2019-1-9-20.[Serebryanaya N.B., Shanin S.N., Fomicheva E.E., Jakuceni P.P. Platelets as activators and regulators of inflammatory and immune responses. Part 2. Platelets as participants in immune responses. Medical immunology. 2019; 21(1): 9-20. doi: 10.15789/1563-0625-2019-1-9-20 ( In Russ)].
35. Morrell C.N., Aggrey A.A., Chapman L.M., Modejski K.L. Emerging roles for platelet as immune and inflammatory cells. Blood. 2014; 123: 2759-2767. doi: 10.1182/blood-2013-11-462432.
36. Perkhofer S., Kainzner B., Kehrel B.E., et al. Potential antifungal effects of human platelets against Zygomycetes in vitro. J. Infect. Dis. 2009; 200, 1176-1179. doi:10.1086/605607.
37. Грищенко Е.А. Дендритные клетки дыхательных путей и аллергические заболевания Аллергология и иммунология в педиатрии. 2015; 3 (42): 19-28. [Grishchenko E.A. Respiratory dendritic cells and allergic diseases. Allergology and immunology in Pediatrics 2015; 3 (42): 19-28 (In Russ)].
38. Dewi I.M.W., Van de Veerdonk F.L., Gresnigt M.S. The multifaceted role of t-helper responses in host defense against Aspergillus fumigatus. J Fungi (Basel). 2017; 3 (4): 55. doi: 10.3390/jof3040055.
39. Wurster S., Thielen V., Weis P., et al. Mucorales spores induce a proinflammatory cytokine response in human mononuclear phagocytes and harbor no rodlet hydrophobins. Virulence. 2017; 8 (8): 1708-1718. doi: 10.1080/21505594.2017.1342920.
40. Belic S., Page L., Lazariotou M., et al. Comparative Analysis of Inflammatory Cytokine Release and Alveolar Epithelial Barrier Invasion in a Transwell Bilayer Model of Mucormycosis. Front Microbiol. 2019; 8(9): 3204. doi: 10.3389/fmicb.2018.03204.
41. Roilides E., Antachopoulos C., Simitsopoulou M. Pathogenesis and host defense against Mucorales: the role of cytokines and interaction with antifungal drugs. Mycoses. 2014; 57 (Suppl. 3): 40-47. doi:10.1111/myc.12236.
42. Lecointe K., Cornu M., Leroy J. Disclaimer polysaccharides cell wall architecture of Mucorales. Front Microbiol. 2019; 10: 469. doi: 10.3389/fmicb.2019.00469.
43. Kim T. H., Lee H.K. Differential roles of lung dendritic cell subsets against respiratory virus infection. Immune Netw. 2014; 14(3): 128-37. doi: 10.4110/in.2014.14.3.128.
44. Li Z., Lu G., Meng G. Pathogenic fungal infection in the lung. Front Immunol. 2019; 3 (10): 1524. doi.org/10.3389/fimmu.2019.01524.
45. Roilides E., Simitsopoulou M. Immune responses to Mucorales growth forms: do we know everything? Virulence. 2017; 8 (8): 1489-491. doi.:10.1080/21505594.2017.1368942.
46. Bacher P., Steinbach A., Kniemeyer O., et al. Fungus-specific CD4(+) T cells for rapid identification of invasive pulmonary mold infection. Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 2015; 191: 348-352. doi: 10.1164/rccm.201407-1235LE.
47. Potenza L., Vallerini D., Barozzi P., et al. Mucorales-specific T cells in patients with hematologic malignancies. PLoS ONE. 2016; 11:e0149108. doi.org/10.1371/journal.pone.0149108
48. Potenza L., Vallerini D., Barozzi P., et al. Mucorales-specific T cells emerge in the course of invasive mucormycosis and may be used as a surrogate diagnostic in high risk patients. Blood. 2011; 118: 5416-5419. DOI: 10.1182/blood-2011-07-366526
49. Schmidt S., Tramsen L., Perkhofer S., et al. Characterization of the cellular immune responses to Rhizopus oryzae with potential impact on immunotherapeutic strategies in hematopoietic stem cell transplantation. J. Infect. 2012; 206: 135-139. doi: 10.1093/infdis/jis308.
50. Steinbach A., Cornely O.A., Wisplinghoff H. et al. Mould-reactive T cells for the diagnosis of invasive mould infec-tion-A prospective study. Mycoses. 2019; 62: 562-569. doi: 1.1111/myc.12919.
51. Castillo P., Wright K.E., Kontoyiannis D.P., et al. A new method for reactivating and expanding T cells specific for Rhizopus oryzae. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2018; 14 (9): 305-312. doi: 10.1016/j.omtm.2018.03.003.
Поступила в редакцию журнала 03.07.2020 Рецензент: Шадривова О.В.
