CC BY
136D0I:10.24412/1999-6780-2020-1-3-14 УДК 582.281.21:577.214.3
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ И ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ГРИБОВ ПОРЯДКА МиСОЯЛЬЕ8 В СООТВЕТСТВИИ С ГЛОБАЛЬНЫМИ РЕКОМЕНДАЦИЯМИ ПО ДИАГНОСТИКЕ И ТЕРАПИИ МУКОРМИКОЗА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
Тараскина А.Е. (зав. лаб.)*, Пчелин И.М. (н.с.), Игнатьева С.М. (в.н.с.), Спиридонова В.А. (н.с.), Учеваткина А.Е. (с.н.с.), Филиппова Л.В. (с.н.с., ассистент кафедры), Фролова Е.В. (зав. лаб.), Васильева Н.В. (директор НИИ, зав. кафедрой)
Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова: НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина и кафедра медицинской микробиологии, Санкт-Петербург, Россия
В обзоре приведен анализ молекулярно-генетических методов, используемых для прямой диагностики в биологическом материале и видовой идентификации грибов порядка Mucorales в соответствии с Глобальными Рекомендациями по диагностике и терапии мукормикоза, созданные под эгидой Европейской конфедерации медицинской микологии. Дана оценка современного состояния и перспектив развития.
Ключевые слова: грибы порядка Mucorales, му-кормикоз, глобальные рекомендации, диагностика, идентификация, методы на основе ПЦР, секвениро-вание, комплекс рибосомальных генов
MOLECULAR GENETIC METHODS FOR DETECTION AND SPECIES IDENTIFICATION OF FUNGAL ORDER
* Контактное лицо: Тараскина Анастасия Евгеньевна, e-mail: [email protected]
MUCORALES IN ACCORDANCE WITH THE GLOBAL GUIDELINE FOR THE DIAGNOSIS AND MANAGEMENT OF MUCORMYCOSIS (LITERATURE REVIEW)
Taraskina A.E. (head of the laboratory), Pchelin I.M. (scientific collaborator), Ignatieva S.M. (leading scientific collaborator), Spiridonova V.A. (scientific collaborator), Uchevatkina A.E. (senior scientific collaborator), Filippova L.V. (senior scientific collaborator, assistant of the department), Frolova E.V. (head of the laboratory), Vasilyeva N.V. (director of the institute, head of the department)
North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov: Kashkin Research Institute of Medical Mycology and Department of Medical Microbiology, St. Petersburg, Russia
The review provides an analysis of molecular genetic methods used for direct detection in biological material and species identification of fungi of the order Mucorales in accordance with the Global guideline for the diagnosis and management of mucormycosis, created under the auspices of the European Confederation of Medical Mycology. Assessment of the current state and development prospects is given.
Key words: fungi of order Mucorales, mucormycosis, global guideline, diagnosis, identification, PCR-based methods, sequencing, ribosomal RNA genes
Зигомицеты как систематическая единица Zygomycota (des Zygomycetes) впервые были описаны Уиттакером в 1969 г. (Whittaker R.H. New concepts of kingdoms of organisms. Science. 1969. 163: 150-160). C внедрением молекулярно-генетических методов, способствующих революционному перевороту в систематике грибов, фила Zygomycota распалась на пять субфил: En-tonophthoromycotina, Kickxellomycotina, Mucoro-mycotina, Zoopagomycotina и Mortierellomycotina, поднятых в дальнейшем до уровня фил. Среди зигомицетов выделяют два порядка, представители которых могут вызывать инфекционные поражения у человека: Entomophthorales и Mucorales - энтомофторомикоз и мукормикоз соответственно. С систематической точки зрения
микромицеты порядка Mucorales представляют собой клинически самый значимый порядок среди зигоспорических грибов. Среди типичных возбудителей мукормикоза выделяют 25 видов родов Actinomucor, Apophysomyces, Cokeromyces, Cunninghamella, Lichtheimia, Mucor, Mycotypha, Rhizomucor, Rhizopus, Saksenaea и Syncephalas-trum, что охватывает половину ветвей порядка [1, 2].
С экологической точки зрения грибы порядка Mucorales представляют собой гетерогенную группу нитевидных грибов - сапробионтов или факультативных паразитов, обычно встречающихся в почве, компосте, экскрементах животных, сельскохозяйственном мусоре или других органических веществах, которые часто себя ведут как оппортунистические патогены. Многие представители порядка являются космополитами биосферы, встречаясь повсеместно во всех климатических зонах Земного шара [1].
Широкое использование в современной медицине иммуносупрессивных препаратов, пандемия СПИД, возрастающая частота онкогема-тологических заболеваний и применение для их лечения высокодозной цитостатической химиотерапии, а также современные методы лечения бактериальных инфекций, привели к увеличению популяции иммунокомпрометированных пациентов с высоким риском развития инвазив-ных микозов. За последние два десятилетия на фоне достижений в области иммунносупрессив-ного лечения и трансплантаций резко возросло число инвазивных грибковых инфекций. Му-кормикоз считают третьей по распространенности грибковой инфекцией у онкогематологиче-ских пациентов. Rhizopus oryzae, Mucor ЫгЫш1-loides и Lichthemia corymbifera - наиболее часто встречаемые возбудители мукормикоза, на которые в совокупности приходится около 70% инфекционных случаев. Основной фактор риска развития микоза, вызванного мукоровыми грибами, - нарушение работы иммунной системы, ассоциированное с нейтропенией и лечением кортикостероидами [3]. Тем не менее иммуно-компетентные пациенты с дополнительными факторами риска, такими как сахарный диабет с кетоацидозом, тяжелой травмой и ожогами также подвержены риску развития мукормикоза. Однако в этом случае заболевание развивается чаще всего как кожная патология, а не инвазив-ный процесс. Кроме того, вспышки мукормико-за были связаны со стихийными бедствиями,
такими как цунами в Индийском океане 2004 г. и торнадо Джоплин, или с боевыми действиями (раны, полученные при взрывах).
Инфекционный процесс начинается при нитевидном росте гриба и ангиоинвазии (отличительный признак мукормикоза - гематогенное распространение патогена), что приводит к тромбозу и некрозу тканей. Уровень летальности при мукормикозе в целом (все формы) составляет примерно 50%. Но в определенных случаях, прежде всего, при диссеминированной патологии или поражении головного мозга на фоне нейтропении показатель возрастает почти до 100%. Быстрое прогрессирование заболевания, низкая эффективность противогрибковых препаратов и отсутствие ранних эффективных методов диагностики в настоящее время способствуют высокой частоте летальных случаев [3,
4].
Диагностика мукормикоза опирается в основном на микологическое культуральное и ги-стопатологическое исследования. Тесты на основе иммуноферментного анализа, наиболее широко используемые сегодня для диагностики инвазивного аспергиллеза и кандидоза, связанные с определением галактоманнана и Р-О-глюкана в сыворотке крови, не применимы для диагностики мукормикоза. Культуральное исследование характеризуется чувствительностью (в 40% случаев, подтвержденных микроскопическим исследованием, грибы не вырастают) и специфичностью из-за возможной контаминации (мукоромицеты являются частью сапрофитной биоты помещений). Кроме того, из-за медленного роста нитчатых грибов необходимо большее количество времени (от 10-15 дней до 3-4 недель) и дополнительных тестов. Гистологические исследования обладают высокой чувствительностью и специфичностью, но требуют также больше времени, что приводит к диагнозу микоза на поздней стадии и мешает своевременному терапевтическому вмешательству. Серьезным ограничением гистопатологических исследований является невозможность дифференциации вида возбудителя, что зачастую имеет решающее значение для выбора тактики терапии. Несвоевременное лечение амфотерици-ном В ассоциировано с двух кратным увеличением летальности от мукормикоза [4]. Таким образом, появление в клинической практике надежных, быстрых диагностических возможностей будет способствовать своевременному
назначению оптимальной противомикотической терапии.
В ноябре 2019 г. были опубликованы Глобальные Рекомендации по диагностике и терапии мукормикоза, созданные под эгидой Европейской конфедерации медицинской микологии (ECMM) (далее - Рекомендации), подготовленные авторами из 33 стран, основаны на собственном опыте исследователей и анализе опубликованных данных по эпидемиологии, диагностике и лечению мукормикоза [5]. Отдельный раздел Рекомендаций посвящен потенциально перспективным подходам для точной диагностики мукормикоза на ранних стадиях заболевания - молекулярно-генетическим на основе по-лимеразной цепной реакции (ПЦР).
Цель представляемого исследования - оценка современного состояния и перспектив развития молекулярно-генетических методов, исполь-
_Молекулярно-генетические методы определения
зуемых для диагностики мукормикоза и видовой идентификации грибов порядка Mucorales в соответствии с Глобальными Рекомендациями.
Прямое определение грибов порядка Mucorales в биологическом материале (диагностика мукормикоза).
В соответствии с Рекомендациями определение ДНК грибов порядка Mucorales молекулярными методами в различных биологических субстратах (в свежих и в парафинированных, фиксированных в формалине образцах тканей; периферической крови; бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ) и спинномозговой жидкости) имеет клиническое значение: с установленной силой рекомендации (SoR) В и качеством доказательства (QuE) для большинства исследуемых биоматериалов II (табл. 1).
Таблица 1
овых грибов в различном биологическом материале_
Цель Исследуемый биологический материал Сила рекомендации (SoR) Качество доказательства (QuE) Кол-во ссылок Недостатки
диагностика свежие ткани В II 12 Отсутствуют коммерческие тесты, ограниченная стандартизация, различные мишени ДНК, методы и подходы
диагностика фиксированные парафиновые блоки в формалине В II 16 Отсутствуют коммерческие тесты, ограниченность стандартизации, неоднородность ДНК мишеней и методов, переменная чувствительность
диагностика сыворотка, плазма, цельная кровь В II 9 Малые объемы анализируемых выборок
диагностика БАЛ, спинномозговая жидкость В II 4 Проанализированы преимущественно БАЛ онкогема-тологических пациентов, 1 случай церебрального мукормикоза
диагностика моча В III 1 Апробация на модели мукормикоза на лабораторных животных
Невысокий уровень показателей представленных диагностических возможностей объясняется, прежде всего, отсутствием как коммерческих тест-систем (применением «домашних» технологий, не прошедших внешнюю валида-цию), так и обширных многоцентровых клинических испытаний (малые объемы выборок), использованием различных ДНК мишеней, технологий и подходов [5]. Рабочая группа «Грибковая ПЦР Инициатива» (Fungal PCR Initiative (FPCRI)) Международного общества по медицинской и ветеринарной микологии (ISHAM) в настоящее время работает над решением данной проблемы.
Ключевым моментом при разработке диагностических тест систем для определения инфекционных агентов в биологическом материа-
ле на основе молекулярно-генетических подходов является подбор оптимальной «мишени» (фрагмента гена) для анализа. Традиционно ри-босомальные гены, включающие 18S и 28S субъединицы, локусы и Г^2 (внутренние транскрибируемые спейсеры) являются молекулами, наиболее часто используемыми в молекулярных исследованиях [6]. Высокое число копий рДНК в грибковом геноме обеспечивает высокую чувствительность амплификации этого региона. Из-за сочетания в рибосомальной ДНК консервативных и высоко вариабельных участков, комплекс рибосомальных генов широко используют для молекулярной систематики на видовом и внутривидовом уровне, идентификации и прямого определения в биологическом мате-
риале с привлечением различных молекулярно-генетических подходов.
Изначально при разработке молекулярных подходов на основе ПЦР для определения грибов порядка Mucorales в биологическом материале исследователи двигались по двум независи-
мым направлениям: разработке методик узкоспецифического анализа (табл. 2) и использованию пан-грибковых праймеров с последующим секвенированием намноженного фрагмента (табл. 3).
Таблица 2
Методы диагностики мукормикоза с использованием специфичных праймеров к грибам порядка Миеога1ез_
Мишень Метод (детекция) Диагностические возможности Праймер Последовательность праймеров (5'-3') [оригинальный источник] Источник
18S Полу-гнездовая Комплекс из 9 клинически 18S-1 ZM1 ДТТДССДТСДССДДДТСДСД [9] ориги-
ПЦР (электро- значимых видов Mucorаles 18S-2 ZM2 ТОССТСААТТССТТТАДСТТТС нал
форез) ZM3 СДДТССДДСДДТТТСДССТСТДС
18S Полу-гнездовая ПЦР (электрофорез) + сиквенс Комплекс из 9 клинически значимых видов Mucorales Точная видовая идентификация -//- -//- по В1а!ек е1 а1., 2005 [9] [15]
18S Гнездовая ПЦР Расширение комплекса 18S-1 Mucor1 WTTДCCRTGДGCДДДTCДGД [16]
электрофорез клинически значимых видов Mucorales 18S-2 Mucor2 Mucor3 Mucor4 СДДТСУДДСДДТТТСДССТСТДС AGCATGGAATAATRAAAYA ДGCДTGGGДTДДCGGДДTД Модификация В1а!ек е1 а!., 2005 [9]
18S ПЦР-РВ ЗУВРСгееп +анализ ИРМ1 6 клинически значимых видов Mucorales -//- -//- по В1а!ек е1 а!., 2005 [9] [18]
18S ПЦР-РВ ТадМап Широкий комплекс клини- 18S-1 Zm1mod TTДCCRTGДGCДДДTCДGДRTG [17]
+ чески значимые виды 18S-2 ZM3mod ДДTCУДДGДДTTTCДCCTCTДGCG
сиквенс Mucorales Точная видовая идентификация p-ZM/LNA TУRR(G)G(G)B(Д)T(T)T(G)T(Д)TTT Модификация В1а!ек е1 а!., 2005 [9]
18S ПЦР + КПР Rhizopus ер. 18S-3 RpL1 TGДTCTДCGTGДCДAATTCT [10]
(электрофорез) Rhizomucor ер., Mucor ер., Absidia (=Lichtheimia) corymbifera 18S-3 RmL1 18S-3 MucL1 18S-3 AbsL1 18S-4 MR1 TGДTCTДCGCGAGCGAACAA TGДTCTДCGTGДCДTATTCT TGДTCTДCA CCGCA TCAAAT AGTAGTTTGTCTTCGGKCAA оригинал
18S ПЦР + КПР (электрофорез) -//+ схема внутривидового типирования -//- -//- По МаоИоиаК е1 а!., 2006 [10] [19]
18S ПЦР-РВ ТадМап Absidia (=Lichtheimia) corymbifera Mucor и Rhizopus комплекс видов Rhizomucor meihei / pusillus/variabilis 18S-5 NS92F 18S-6 AcoryR1 AcoryP1 18S-5 NS92F 18S-6 MucR1-1 MucP1 18S-5 NS92F 18S-6 RmucR1 RmucP1 CДCCGCCCGTCGCTДC GCДДДGCGTTCCGДДGGДCД ATGGCACGAGCAAGCATTAGGGACG CДCCGCCCGTCGCTДC CCTДGTTTGCCДTДGTTCTCTGCДG CCGДTTGДДTGGTTДTДGTGДGCДT- ДTGGGДTC CДCCGCCCGTCGCTДC GTДGTTTGCCДTДGTTCGGCTД TTGДДTGGCTДTДGTGДGCДTДTGG-GДGGCT https://www.epa.gov/ [11] [20]
ITS1 ПЦР-РВ ТадМап Rhizopus о^ае Oli Ror1 TCTGGGGTAAGTGATTGC [12]
ITS2 Rhizopus microsporus Oli Ror2 Ror-MBI Oli Rmic1 Oli Rmic2 Rmic-MBI GCGДGДДCCДДGДGДTCC CGCGДTДДCCДGGДGTGG- CДTCGДTCДДДTCGCG CTTCTCДGTДTTGTTTGC ДTGGTДTДTGGTДДДGGG CGCGДTCCTCTGGCGДTGДДGGTCG- оригинал
Mucor spp. Oli Mucorl Oli Mucor2 Mucor-MBI TATCGCG GCCTGGTGCAAAAATTGCTTATC CTAAGACAAGTGTGTTTATGGTATTG CGCGATGCTGTTCTTCCGCCAC-TTCCAATCGCG
ITS1 ПЦР-РВ Molecular beacons Все зигомицеты (pan-zygomycetes) ITS5 ITS2 PFM3 GGAAGTAAAAGTGGTAACAAGG GCTGCGTTCTTCATCGATGC gcgcgcTCGCATCCAGGGGTCGTAC-CTTAGGGTTTCCTCTGGGgcgcgc ITS по White et al., 1990 [8] Proba оригинал [27]
28S ПЦР-РВ FRET Rhizopus spp., Mucor spp., Rhizomucor spp. Cunninghamella spp. Zygo F Zygo R Zygo FITC Zygo RD640 CU F CU R CU FITC CU RD640 TTCAAAGAGTCAGGTTGTTTGG CAGTCTGGCTCCAAACGGTTC GGCGAGAAACCGATAGCGAAC GTACCGTGAGGGAAAGATGAAAA- GAACTTTGAAA TAGTCAGCCAGGTAAATAAGT TCGTCAATATTTAGCTTTAGG GCTTGGAAACGAAGAGTCAGGTTG TGGGAATGCAGCCTAAAATGGGAGTGA [15] оригинал
28S ПЦР-РВ TaqMan Клинически значимые виды Mucorales WB28-1m WB28-2 p-WB28 TTTGGGAATGCAGCCT TCARAGTTCIIIICAWCTTTCCCT CGARARACCGATGCRAACAAGTACCGT Модификация Khot et al., 2009 [14] Springer et al., 2016
Таблица 3
Методы диагностики мукормикоза с использованием пан-грибковых праймеров_
Мишень Метод Диагностические возможности Праймер Последовательность праймеров (5-3) Источник
ITS1 ПЦР-РВ SYBR Green + сиквенс Широкий спектр грибов (pan-fungal) Точная видовая идентификация ITS1 ITS2 TCCGTAGGTGAACCTGCGG GCTGCGTTCTTCATCGATGC White et al., 1990 Bultrago et al., 2012
ITS1 ПЦР-РВ SYBR Green + сиквенс Широкий спектр грибов (pan-fungal) Точная видовая идентификация -//- White et al., 1990 Lau et al., 2007
ITS1 ITS2 ПЦР + сиквенс Широкий спектр грибов (pan-fungal) Точная видовая идентификация TT со со -t* СЛ GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG TCCTCCGCTTATTGATATGC White et al., 1990 Pamidimukkala et al., 2019
28S ПЦР_РВ TaqMan + сиквенс 56 видов грибов (из них 13 видов мукоровых грибов) Точная видовая идентификация FwI FwII RevI ProbeII GGGTGGTRARYTCCWTCTAARGCTAA GGGWGGTAAATCYCWCCTAAAGCTAA CTCT[T]TYCAAAGTKCIIII CA[T]C A[C]TT[G]T[T]C[G][C]TA[T]CG Оригинал Land-linger et al., 2010
28S ПЦР-РВ SYBR Green + сиквенс Широкий спектр грибов (pan-fungal) Точная видовая идентификация 28S-10F 28S-12R 28S-12F 28S-13R GACATGGGTTAGTCGATCCTA CCTTATCTACATTYTTCTATCAAC GTTGATAGAAYAATGTAGATAAGG GACAGTCAGATTCCCCTTG Модификация Khot et al., 2009 Springer et al., 2019
Анализируя вышеуказанные данные отметим, что при использовании молекулярно-генетической технологии каждый подход имеет как достоинства, так и недостатки. Применение низкоспецифичных пан-грибковых праймеров к консервативным участкам рДНК позволяет за один этап лабораторных исследований диагностировать микоз, однако для точной видовой идентификации этиологического агента, которая
зачастую необходима для назначения оптимального противогрибкого препарата, требуется проведение дополнительного анализа - секве-нирования полученного в ходе реакции фрагмента. Тогда как применение специфичных праймеров (уровень специфичности устанавливает исследователь - родо- / видоспецифичные) ограничивает спектр определяемых микромице-тов изначально заданными параметрами, но дает
возможность проводить сразу точную видовую идентификацию инфекционного агента в биологическом материале. Кроме того, узкоспецифичные праймеры применимы при более чувствительных методах молекулярно-генетического анализа, таких как ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) с использованием флуо-рогенного зонда TaqMan. При сравнении двух подходов ПЦР-РВ Спрингер с соавторами (Springer et al.) показали, что использование специфичных к грибам порядка Mucorales праймеров в сочетании с зондом TaqMan обладает большей чувствительностью в сравнении с пан-грибковыми праймерами и интеркалирую-щим красителем SYBR Green [7]. При этом тест-системы с низкоспецифичными праймерами к консервативным участкам рДНК позволяют определять микс-грибковые инфекции.
Несмотря на большое количество работ, посвященных детекции мукоровых грибов в биологическом материале и их видовой идентификации, можно выделить несколько ключевых публикаций с оригинальным дизайном прайме-ров [8-14], которые послужили основой для дальнейшего развития молекулярно-
генетических подходов.
Один из наиболее удачных дизайнов праймеров, мишенью которых была молекула 18S субъединицы РНК, был предложен Bialek et al в 2005 г. в реализации полугнездовой (вложенной) ПЦР с электрофоретической детекцией результатов (табл. 2). Предложенная схема позволяла определять в клиническом материале комплекс из 9 клинически значимых видов Mucorales (Ab-sidia (=Lichtheimia) corymbifera, Rhizomucor pu-sillus, Cokeromyces recurvafus, Apophysomyces elegans, Saksenaea vasiformis, Mucor hiemalis, Rhizopus oryzae, Cunninghamella bertholletiae, Syncephalastrum racemosum) [9]. В дальнейшем этот подход получил широкое использование, некоторые исследователи дополняли его секве-нированием намноженного в ходе реакции фрагмента с целью точной видовой идентификации возбудителя [15]. С целью расширения диагностических возможностей разработанной схемы детекции было предложено использование вырожденных праймеров, что позволяло увеличить перечень определяемых видов (Lichtheimia spp., Rhizomucor pusillus, Mucor spp., Actinomucor elegans, Cokeromyces recurva-tus, Saksenaea spp., Apophysomyces spp., Rhizopus spp., Syncephalastrum racemosum, Cunning-
hamella spp.) [16]. Оптимальное решение совершенствования данного подхода - перевод схемы типирования в формат ПЦР-РВ Было предложено два независимых решения: применение вырожденных праймеров и зонда TaqMan [17], допускающее быструю детекцию в биологическом материале широкого спектра клинически значимых представителей порядка Mucorales, или использование красителя SYBR Green с анализом кривых плавления ПЦР-продуктов высокого разрешения, позволяющее определять по температуре плавления 6 видов: Rhizopus microsporus - 76,46 °C, Rhizopus oryzae - 76,59 °C, Mucor racemosus - 76,78 °C, Mucor circinelloides - 76,98 °C, Rhizomucor pusillus -77,87 °C, Lichtheimia corymbifera - 78,56 °C) [18].
В 2006 г. Мачоуарт (Machouart) с соавторами предложил схему идентификации трех родов мукоровых грибов (Rhizopus spp., Rhizomucor spp., Mucor spp.) и вида Absidia (=Lichtheimia) corymbifera с использованием родо- /видо-специфичных прямых праймеров к 18S субъединицы (модифицированных по 3' концу) и одного обратного праймера с вырожденной структурой [10] (табл. 2). Схема была дополнена анализом длин рестрикционных фрагментов (RFLP) с использованием двух эндонуклеаз (ClaI и Asel), позволяющих определять следующие виды Rhizopus spp.: R. stolonifer - при наличии сайта для ClaI I; R.microsporus/ R azigospo-rus - при наличии сайта для AseI и R. oryzae - в случае отсутствия сайта рестрикции. Данный набор праймеров в дальнейшем был эффективно использован в схеме внутривидового типирова-ния с дополнением коротких малоспецифичных праймеров для фингерпритинга [19].
На официальном сайте Американского Агентства по защите окружающей среды (US Environmental Protection Agency (EPA)) были опубликованы три схемы детекции ПЦР-РВ с одним стандартным прямым праймером и специфичными TaqMan зондами и обратными праймерами, позволяющие выделять либо отдельный вид, либо комплексы видов: (1) Lichtheimia corymbifera (assay name: Acory); (2) Mucor amphibiorum / circinelloides / hiemalis / indicus / mucedo / racemosus / ramosissimus и Rhi-zopus azygosporus / homothalicus / microspores / oligosporus / oryzae (assay name: Muc1); (3) Rhi-zomucor meihei / pusillus / variabilis (assay name: Rmuc) [20] (табл. 2). Представленные схемы эффективно используют для определения мукоро-
вых грибов в разных биологических материалах (сыворотке, БАЛ) различными авторами [21, 22].
Внимание исследователей было сосредоточено на оптимизации подходов молекулярно-генетического определения в формате ПЦР-РВ, в качестве мишени которых была выбрана 28S субъединица [14], дальнейшая модификация которых была использована как для разработки тест-системы для детекции широкого спектра клинически значимых видов Mucorales [17] (табл. 2), так и для постановки пан-грибковой реакции с дальнейшим секвенированием фрагмента [7, 23] (табл. 3). Параллельно Касаи с соавторами (Kasai) были разработаны два количественных ПЦР теста на 28 S субъединицу: один из которых охватывал определяемые другими схемами ПЦР-анализа роды мукоровых (Rhizo-pus, Mucor Rhizomucor), другой был уникальный, специфичный к роду Cunninghamella, не диагностируемому ранее молекулярно-генетическими методами [13]. При апробации данных ПЦР-тестов на модели экспериментального мукормикоза на кроликах подтверждено, что детекция ДНК грибов в сыворотке инфицированных животных может быть независимым методом диагностики мукормикоза.
В 1990 г. вышла публикация, предлагающая в качестве универсального баркода для микро-мицетов последовательность рибосомальной ДНК (на настоящий момент публикация имеет более 15000 цитирования), в которой было предложено несколько вариаций праймеров, комплементарных к участку ITS, в качестве универсальных для идентификации всех микро-мицетов и построения их филогенетических отношений [8]. Различные вариации схем молеку-лярно-генетического анализа в формате ПЦР-РВ в настоящее время составляют основу большинства подходов для детекции грибов порядка Mu-corales с использованием пан-грибковых прай-меров с дальнейшим секвенированием региона [24-26] (табл. 3). Для специфичного анализа в биоматериале мукоровых грибов участок ITS используют крайне редко [12, 27] (табл. 2).
Достаточно новым, перспективным направлением диагностики мукормикоза молекулярно-генетическими методами является определение в биоматериале уникальных генов, присущих исключительно грибам порядка Mucorales. В качестве генов «мишеней» рассматривают гены, кодирующие факторы вирулентности мукоро-
вых грибов: FTR1, CotH, Arp, ArF, CaN и др [1], по которым можно судить не только о присутствии микромицета в исследованном материале, но и о развитии инфекционного процесса (инвазии гриба). Одни из генов - узковидо-специфичны и могут быть использованы для диагностики мукормикоза, вызванного определенными представителями порядка, другие универсальны - присутствуют в геноме всех грибов порядка Mucorales, как, например CotH, который вызывает наибольший интерес у исследователей [4]. CotH белок покрывает споры микро-мицета и позволяет проникать в ткани макроорганизма, преодолевая иммунную защиту «хозяина». На двух клинически релевантных моделях мукормикоза на мышах и тестировании ограниченного числа образцов от пациентов была показана целесообразность использования CotH в качестве «мишени» для ранней диагностики инфекционного процесса. Предварительные результаты апробации разработанной авторами ПЦР тест-системы на различном биологическом материале показали высокую эффективность данного подхода: при проведении анализа через 24 часа после экспериментального заражения чувствительность метода составляла 90% и специфичность - 100% [4].
Наиболее эффективной технологией определения грибов порядка Mucorales (как и всех других микромицетов) зарекомендовала себя система ПЦР/ электроспрей - ионизационная (ЭСИ) масс-спектрометрия (PCR/ESI-MS), коммерциализированная как система IRIDICA, ранее - PLEX-ID (Ibis Biosciences, Abbott, Des Plaines, США). Данная технология сочетает амплификацию нуклеиновых кислот с использованием 16 широкодиапазонных и специфических ПЦР-анализов (мишени 18S рибосомальная субъединица, митохондриальный цитохром b) с детекцией ЭСИ-масс-спектрометрией. IRIDICA Fungal позволяет тестировать биологические материалы (кровь, БАЛ) на более чем 200 видов клинически значимых микромицетов за 8 часов [28, 29]. Однако в апреле 2017 г., когда технология была на утверждении в Управлении по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA, США), Abbott останавливает ее обслуживание и отзывает приборы. Упадок системы IRIDICA произошел не из-за проблем с производительностью и качеством продукции, а был основан, главным образом, на финансовых, логистических и норматив-
ных соображениях. Практические проблемы с реализацией, которые способствовали малому количеству пользователей, включали в себя высокие затраты на оборудование и реагенты. Кроме того, не было клинических результатов исследований, показывающих явную выгоду использования технологии. Хотя система IRIDICA была коммерчески доступна в Европе более двух лет, она была внедрена в качестве диагностического теста только в трех европейских больницах. Этот поворот событий представляет собой не только потерю потенциально диагностического инструмента для инфекционных заболеваний, но и может быть предвестником подобных ситуаций с другими новыми и дорогостоящими диагностиками, особенно геномными технологиями [30].
Одним из недостатков, упомянутых в Рекомендациях, который необходимо учесть для повышения показателей диагностических возможностей методов прямого определения в биоматериале грибов порядка Mucorales, является стандартизация методики экстракции ДНК из биосубстратов. Отдельные исследовательские группы используют различные методики: «домашние» алгоритмы, построенные на классических подходах выделения ДНК (фенольная экстракция, использование сорбентов, солевой метод), и разнообразные коммерчески доступные платформы QiAmp Tissue DNA Mini Kit (Qiagen, Германия), MagNA Pure LC DNA Isolation Kit или High Pure Template Preparation Kit (Roche Diagnostics, Германия).
Особую сложность выделение ДНК представляет при работе с фиксированными в формалине (формальдегиде) тканями, заключенными в парафиновые блоки (FFPE ткани). Во-первых, формалин негативно влияет на качество ДНК для последующего анализа: происходит денатурация нуклеиновых кислот вследствие разрыва межцепочечных водородных связей, сильная фрагментация, образование перекрестных сшивок азотистых оснований с гистонами. Во-вторых, парафинирование тканей затрудняет саму экстракцию ДНК. Поэтому при работе с фиксированными формалином парафиновыми блоками перед исследователем стоит решение двух задач: добиться максимального выхода ДНК из исследуемого фрагмента и нейтрализация освобождающегося формальдегида и его производных. Поэтому первым необходимым этапом при работе с таким материалом является
депарафинизация образцов: наиболее распространенная стандартная методика - инкубация с 100% ксилолом с последующей обработкой в этиловом спирте [7, 9, 18]. Затем следует этап обработки депарафинированного образца денатурирующим буферным раствором (существуют коммерчески доступные реагенты, такие как, например, набор для восстановления поврежденной ДНК PreCR или смесь ферментов NEBNext для восстановления ДНК из фиксированных тканей (New England Biolabs, Англия)). Более стандартизованное, но дорогое решение (поэтому многие исследователи используют «домашние» методики) - воспользоваться готовыми коммерческими решениями для выделения ДНК из FFPE тканей - ISOLATE II (Bioline, Англия), Agencourt FormaPure DNA (Beckman Coulter, США), «ДНК-Ткань-Ф» (ООО «Тест Ген», Россия) и др.
Определение ДНК грибов порядка Mu-corales в крови (сыворотке) и других жидкостях (спинномозговая жидкость, БАЛ) в настоящее время рассматривают как неинвазивный метод ранней диагностики и упреждающей терапии [5]. Одна из первых попыток определить ДНК Mucorales в сыворотке была выполнена на пациенте с легочной инфекцией C. bertholletiaae. Ретроспективный анализ образцов сыворотки с использованием пан-фунгальной ПЦР показал, что ДНК детектируется позитивно за два дня до появления инфильтратов в легких [31]. В дальнейшем факт, что циркулирующая ДНК муко-ровых грибов может быть определена за несколько дней до постановки диагноза классическими методами, был подтвержден рядом независимых исследований как на экспериментальной животной модели мукормикоза [13], так и при диссеминированных формах у иммуноком-прометированных пациентов [20, 22] и у имму-нокомпетентных лиц с ожогами при мукормико-зе кожи [32].
Видовая идентификация грибов порядка Mucorales
Несмотря на то, что определение мукоровых грибов в биосубстратах имеет ряд недостатков, которые сказываются на силе рекомендаций методов и качестве доказательств, видовая идентификация грибов порядка Mucorales молеку-лярно-генетическими методами имеет более высокие показатели диагностических возможностей (табл. 4). Авторы Глобальных Рекомендаций подчеркивают актуальность (лучшая эффек-
тивность) молекулярных методов для определении вида микромицета в сравнении со стандартными (классическими) микологическими методами, при использовании которых возникает ряд сложностей при видовой идентификации из-за неспособности некоторых видов спорулировать на стандартных средах, сходных морфологических черт меж близкородственными видами, особых трудностей описания криптических видов. Высокий уровень соответствия (>90%)
_Молекулярно-генетические методы для в1
между морфологической и молекулярной идентификацией отмечено только для референтных лабораторий [5]. В настоящее время для определения вида патогена и эпидемиологических исследований показана наивысшая сила рекомендаций А. Тогда как качество доказательств остается на уровне II, что требует дополнительных многоуровневых эпидемиологических исследований.
Таблица 4
идентификации грибов порядка Миеога1ез_
Цель Подход Сила рекомендации (SoR) Качество доказательства (QuE) Кол-во ссылок Комментарии
Эпидемиологические исследования Молекулярная идентификация до вида по секвенированию ITS А II 6 ITS секвенирование - золотой стандарт идентификации
Определение вида Молекулярно-генетический анализ vs морфология А II 4 Молекулярная идентификация превосходит морфологическую
Эпидемиологические исследования вспышек Полногеномное секвенирование А II 2 Раневые инфекции Блок ожогов
Эпидемиологические исследования Молекулярная идентификация до вида (использование других ДНК «мишеней») С II 5 28S, цитохром B, FTR1
Описанные в первом разделе обзора ПЦР-анализы для грибов порядка Mucorales имеют ограниченное применение для идентификации вида, так как разработанные подходы в подавляющем большинстве случаев предназначены для детекции представителей мукоровых грибов в целом или отдельных родов, но не для определения видовой принадлежности. В 2008 г. опубликованы рекомендации Института Клинических и Лабораторных Стандартов (CLSI) США, согласно которым «золотым стандартом» видовой идентификации микромицетов является се-квенирование ITS региона рибосомальных генов [33]. Основываясь на опубликованных результатах и мнениях экспертов, рабочая группа ISHAM также предложила секвенирование ITS в качестве метода первой линии для видовой идентификации Mucorales, а в качестве референтных Баз данных для определения последовательностей - использование Баз CBS (http://www.westerdijkinstitute.nl/Collections/Biolo MIC SSequences.aspx) или ISHAM
(http://its.mycologylab.org). Полногеномное се-квенирование рекомендуют для изучения эпидемиологии вспышек мукормикоза [34, 35], однако в настоящее время существует ограниченное количество подобных исследований.
В работе Валтера (Walther) при оценке биоразнообразия грибов порядка Mucorales (в исследование было включено 668 штаммов 203 таксонов) на основе нуклеотидного полиморфизма ITS и 28S (LSU) регионов установлено, что межвидовая изменчивость ITS достаточна для подтверждения видовой идентификации большинства видов, только для видовых комплексов Mucor circinelloides, M. flavus, M. piriformis и Zygorhynchus moelleri разрешающей способности ITS региона недостаточно, и требуется использование альтернативных «мишеней» (бар-кода) для анализа [2]. Внутривидовая изменчивость ITS региона была различной среди видов мукоровых грибов и колебалась в диапазоне от 0% (Backusella circina) до 13,3% для Cunninghamella echinulata. В результате проведенного филогенетического анализа внесены изменения в таксономию и номенклатуру: все виды Mucor, обладающие спорангиофорами, были перенесены в Backusella; род Zygorhynchus оказался полифилетическим, и все его виды были переклассифицированы в Mucor; Rhizomucor endophyticus был перенесен в Mucor, а Rhizo-mucor chlamydosporus оказался синонимом Mu-cor indicus [2].
В качестве альтернативных ДНК мишеней для видовой идентификации мукоровых грибов
предложены следующие: 188, 288, БТЮи цито-хром Ь. Однако они менее универсальны для видовой идентификации грибов порядка Mucorales
[5].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Количество случаев мукормикоза прогрессивно растет во всем мире, но эффективность терапевтического лечения остается неприемлемо низким (на уровне 60-70%). В первую очередь, это связывают с недостатком методов ранней диагностики микоза. Среди перспективных подходов для быстрой эффективной диагностики заболевания выделяют молекулярно-генетические технологии. Сравнительный анализ современных методов на основе ПЦР определения грибов порядка Mucorales в различных биосубстратах и видовой идентификации показал, что:
1) ПЦР - оптимальный метод для определения грибов порядка Mucorales в биологических образцах;
2) 18S - оптимальная мишень, позволяющая определять Mucor, Rhizopus, Lichthemia Rhizo-mucor;
3) ПЦР амплификация целевого гена CotH, специфичного для Mucorales, - перспективный подход;
4) при работе с образцами тканей предпочтительно использование свежего материала (по сравнению с парафиновыми блоками);
5) обнаружение ДНК Mucorales в крови -дополнительный неинвазивный метод ранней диагностики (обнаружение ДНК гриба за два дня до появления легочных инфильтратов) для проведения превентивной терапии;
6) секвенирование ITS региона - «золотой» стандарт видовой идентификации для большинства представителей мукоровых грибов. Исключение составляют видовые комплексы M. cir-cinelloides, M. flavus, M. piriformis и Zygorhyn-chus moelleri, для которых необходимо применение дополнительного бар-кода.
ЛИТЕРАТУРА
1. Hassan M.I.A., Voigt K. Pathogenicity patterns of mu^rmycosis: epidemiology, interaction with immune cells and virulence factors. Medical Mycology. 2019; 57: S245-S256. doi: 10.1093/mmy/myz011
2. Walther G., Pawlowska J., Alastruey-Izquierdo A., et al. DNA barcoding in Mucorales: an inventory of biodiversity. Persoonia. 2013; 30: 11-47. doi: 10.3767/003158513X665070
3. Ghuman H., Voelz K. Innate and adaptive immunity to Mucorales. J. Fungi. 2017; 48 (3): 1-11. doi: 10.3390/jof3030048
4. Baldin C., Soliman S.S.M., Jeon H.H., et al. PCR-Based approach targeting mucorales-specific gene family for diagnosis of mucormycosis. J. Clin. Microbiol. 2018; 56 (Is.10): e00746-18. doi: 10.1128/JCM00746-18
5. Cornely O.A., Alastruey-Izquierdo A., Arenz D., et al. Mucormycosis ECMM MSG Global Guideline Writing Group. Global guideline for diagnosis and management of mucormycosis: an initiative of the European Confederation of Medical Mycology in cooperation with the Mycoses Study Group Education and Research Consortium. Lancet Infect. Dis. 2019; 19 (12): e405-e421. doi: 10.1016/S1473-3099(19)30312-3.
6. Fundamental Medical Mycology. 2010. Edited by Reiss E., Shadomy H.J., Lyon G.M. III Chapter 2. Laboratory diagnostic methods in medical mycology. Genetic identification of fungi. P. 64-69
7. Springer J., McCormick Smith I., et al. Identification of Aspergillus and Mucorales in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue samples: Comparison of specific and broad-range fungal qPCR assays. Med. Mycology. 2019; 57: 308-313. doi: 10.1093/mmy/myy041
8. White T.J., Bruns S., Lee S., Taylor J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal genes for phylogenetics. In: Innis M.A., Gelfand J., Sninsky J., White T.J., eds. PCR protocols. a guide to methods and applications. San Diego, CA: Academic Press, 1990; 315-324.
9. Bialek R., Konrad F., Kern J., et al. PCR based identification and discrimination of agents of mucormycosis and aspergillosis in paraffin wax embedded tissue. J. Clin. Pathol. 2005; 58: 1180-1184. doi: 10.1136/jcp.2004.024703
10. Machouart M., Larche J., Burton K., et al. Genetic identification of the main opportunistic Mucorales by PCR-restriction fragment length polymorphism. J. Clin. Microbiol. 2006; 44 (3): 805-810. doi: 10.1128/JCM.44.3.805-810.2006
11. Сайт Американского Агентства по защите окружающей среды (EPA) https://www.epa.gov/ [Website of the American Environmental Protection Agency (EPA) https://www.epa.gov/]
12. Bernal-Martinez L., Buitrago M.J., Castelli M.V., et al. Development of a single tube multiplex-time PCR to detect the most clinically relevant Mucormycetes species. Clin. Microbiol. Infect. 2013; 19 (1): E1-E7. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03976.x
13. Kasai M., Harrington S.M., Francesconi A., et al. Detection of a molecular biomarker for Zygomycetes by quantitative PCR assay of plasma, bronchoalveolar lavage, and lung tissue in a rabbit model of experimental pulmonary Zygomycosis. J. Clin. Microbiol. 2008; 46 (11): 3690-3702. doi: 10.1128/JCM.00917-08
14. Khot P.D., Ko D.L., Fredricks D.N. Sequencing and analysis of fungal rRNA operons for development of broad-range fungal PCR assays. Appl. Environ. Microbiol. 2009; 75 (6): 1559-1565. doi: 10.1128/AEM.02383-08
15. Hammond S.P., BialekR., Milner D.A., et al. Molecular methods to improve diagnosis and identification of mucormycosis. J. Clin. Microbiol. 2011; 49 (6): 2151-2153. doi: 10.1128/JCM.00256-11
16. Hirano M., Ota Y., Koibuchi T., et al. Nested polymerase chain reaction with specific primers for Mucorales in the serum of patients with hematological malignancies. Jpn. J. Infect. Dis. 2019; 72 (3): 196-198. doi: 10.7883/yoken.JJID.2018.379
17. Springer J., Goldenberger D., Schmidt F., et al. Development and application of two independent real-time PCR assays to detect clinically relevant Mucorales species. J. Med. Microbiol. 2016; 65: 227-234. doi: 10.1099/jmm.0.000218
18. Hrncirova K., Lengerova M., Kocmanova I., et al. Rapid detection and identification of Mucormycetes from culture and tissue samples by use of high-resolution melt analysis. J. Clin. Microbiol. 2010; 48 (9): 3392-3394. doi: 10.1128/JCM.01109-10
19. Gamarra S., Chaves M.S., Cabeza M.S., et al. Mucormycosis outbreak due to Rhizopus microsporus after arthroscopic anterior cruciate ligament reconstruction surgery evaluated by RAPD and MALDI-TOF Mass spectrometry. J. Mycol. Med. 2018; 28 (4): 617-622. doi: 10.1016/j.mycmed.2018.09.002
20. Millon L., Larosa F., Lepiller Q., et al. Quantitative polymerase chain reaction detection of circulating DNA in serum for early diagnosis of mucormycosis in immunocompromised patients. Clin. Infect. Dis. 2013; 56 (10): e95-e101. doi: 10.1093/cid/cit094
21. Millon L., Herbrecht R., Grenouillet F., et al. Early diagnosis and monitoring of mucormycosis by detection of circulating DNA in serum: retrospective analysis of 44 cases collected through the French Surveillance Network of Invasive Fungal Infections (RESSIF). Clin. Microbiol. Infect. 2016; 22: 810.e1-810.e8. doi: 10.1016/j.cmi.2015.12.006.
22. Scherer E., Iriart X., Bellanger A.P., et al. Quantitative PCR (qPCR) detection of Mucorales DNA in bronchoalveolar lavage fluid to diagnose pulmonary mucormycosis. J. Clin. Microbiol. 2018; 56 (Is.8): e00289-18. doi: 10.1128/JCM.00289-18
23. Landlinger C., Preuner S., Baskova L., et al. Diagnosis of invasive fungal infections by a real-time panfun-gal PCR assay in immunocompromised pediatric patients. Leukemia. 2010; 24 (12): 2032-2038. doi: 10.1038/leu.2010.209
24. Buitrago M.J., Aguado J.M., Ballen A., et al. Efficacy of DNA amplification in tissue biopsy samples to improve the detection of invasive fungal disease. Clin Microbiol. Infect. 2013; 19 (6): E271-7. doi: 10.1111/1469-0691.12110
25. Lau A., Chen S., Sorrell T., et al. Development and clinical application of a panfungal PCR assay to detect and identify fungal DNA in tissue specimens. J. Clin. Microbiol. 2007; 45 (2): 380-385. doi: 10.1128/JCM.01862-06
26. Pamidimukkala U., Sudhaharan S., Kancharla A., et al. Mucormycosis due to Apophysomyces species complex- 25 years' experience at a tertiary care hospital in southern India. Med. Mycol. 2019; Jul 25. pii: myz081. doi: 10.1093/mmy/myz081
27. Kumar C.M., Mugunthan M., Kapoor C.R., Pandalanghat C.S. Speciation of fungi using real time PCR with molecular beacons: Can we solve the enigma of diagnosis of invasive fungal disease. Med. J. Armed. Forces. India. 2019; 75: 41-49. doi: 10.1016/j.mjafi.2017.12.003
28. Alanio A., Garcia-Hermoso D., Mercier-Delarue S., et al. Molecular identification of Mucorales in human tissues: contribution of PCR electrospray-ionization mass spectrometry. Clin. Microbiol. Infect. 2015; 21 (6): 594.eI-594.e5. doi: 10.1016/j.cmi.2015.01.017
29. Krifors A., Ozenci V., Ullberg M., et al. PCR with electrospray ionization-mass spectrometry on bron-choalveolar lavage for detection of invasive mold infections in hematological patients. PlosOne. 2019; 14 (2): e0212812. doi: 10.1371/journal.pone.0212812
30. Ozenci V., Patel R., Ullberg M., et al. Demise of polymerase chain reaction/electrospay ionization-mass spectrometry as an infectious diseases diagnostic tool. Clin. Infect. Dis. 2018; 66 (3): 452-5. doi: 10.1093/cid/cix743
31. Kobayashi M., Togitani K., Machida H., et al. Molecular polymerase chain reaction diagnosis of pulmonary mucormycosis caused by Cunninghamella bertholletiae. Respirology. 2004. 9 (3): 397-401. doi: 10.1111/j.1440-1843.2004.00582.x
32. Legrand M., Gits-Muselli M., Boutin L., et al. Detection of Circulating Mucorales DNA in Critically III Burn Patients: Preliminary Report of a Screening Strategy for Early Diagnosis and Treatment. Clin. Infect. Dis. 2016; 63 (10): 1312-1317. doi: 10.1093/cid/ciw563
33. CLSI. Interpretive criteria for identification of bacteria and fungi by DNA target sequencing; approved guideline. CLSI document MM18-A. - Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2008; - 76 p.
34. Garcia-Hermoso D., Criscuolo A., Lee S.C., et al. Outbreak of Invasive Wound Mucormycosis in a Burn Unit Due to Multiple Strains of Mucor circinelloides f. circinelloides Resolved by Whole-Genome Sequencing. mBio. 2018; 9 (2): pii: e00573-18. doi: 10.1128/mBio.00573-18.
35. Etienne K.A., Gillece J., Hilsabeek R., et al. Whole genome sequence typing to investigate the Apophyso-myces outbreak following a tornado in Joplin, Missouri, 2011. PlosOne. 2012; 7 (11): e49989. doi: 10.1371/journal.pone.0049989
Поступила в редакцию журнала 10.03.2020 Рецензент: Т.С. Богомолова
