CC BY
42УДК 543.423.3: 57.083.18: 577.113.3
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ZYGOMYCETES ИЗ РОССИЙСКОЙ КОЛЛЕКЦИИ ПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ ПО НУКЛЕОТИДНЫМ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЯМ
рДнк
Михайлова Ю.В. (н.с.), Полищук А.Г. (зав. лаб)*
НИИ медицинской микологии им. П.Н.Кашки на Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И.Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
© Михайлова Ю.В., Полищук А.Г., 2012
С помощью ДНК секвенирования** ITS и D1/D2 районов гена рРНК были идентифицированы 22 изолята патогенных зигоми-цетов из Российской коллекции патогенных грибов НИИ меди-цинской микологии им. П.Н Кашкина. В 96% случаев генетическая (на основе секвенирования) и фенотипическая идентификация совпали на уровне рода, в 82% случаев - на уровне вида. В статье обсуждены возможные причины несовпадения фенотипической и молекулярной идентификации. Методом секвенирования уточнили видовую принадлежность тех представителей семейств Cunninghamellaceae и Syncephalastraceae, которые фенотипически были определены только до рода.
Ключевые слова: ДНК секвенирование, идентификация медицински значимых зигомицетов
MOLECULAR IDENTIFICATION OF ZYGOMYCETES FROM RUSSIAN COLLECTION OF PATHOGENIC FUNGI BASED ON FUNGAL RIBOSOMAL DNA SEQUENCE DATA
Mikhaylova Y.V. (scientific collaborator), Polischouk A.G. (head of the laboratory)
* Контактное лицо Полищук Анна Генриховна
Тел.: (812) 303-51-40
** Существует разночтение в написании слова «сиквени-рование» от англ. sequence [’sv.kwsns] и «секвенирование», из них первое правильное, второе - нет, но ряд исследователей в России и других странах предпочитают писать «секвенирование» (гл .редактор Н.П.Елинов).
Kashkin Research Institute of Medical Mycology of North-Western State Medical University named after I.I.Mechnikov, St. Petersburg, Russia
© Mikhaylova Y.V., Polischouk A.G.., 2012
Twenty two Zygomycetes isolates from Russian collection of pathogenic fungi of Kashkin Research Institute of Medical Mycology were identified by DNA sequence analysis of the ITS and D1/D2 regions of their rRNA gene. The results of molecular and phenotypic identifications were concordant at the genus level in 96% of cases and at the species level in 82 % of cases. Possible reasons for discrepancy between the results of phenotypic and molecular identifications are discussed. DNA sequence analysis enabled us to identify the isolates belonging to Cunninghamellaceae and Syncephalastraceae to the species level, while it was not achieved using phenotypic analysis.
Key words: DNA-sequencing, identification of clinically relevant
Zygomycetes
ВВЕДЕНИЕ
Мукормикоз (зигомикоз) - это тяжелая инвазивная инфекция, вызываемая грибами порядка Mucorales. Она стоит на третьем месте по распространённости среди инвазивных микозов после аспергиллёза и кандидоза. В группу риска попадают онкогематологические больные, пациенты с перси-стирующей нейтропенией, диабетическим кетоаци-дозом, подверженные длительной терапии кортикостероидами, дефероксамином, недоношенные новорожденные дети с очень низкой массой тела, люди с травмами и ожогами, а также лица, перенесшие операции по трансплантации [1,2]. Возбудители му-кормикоза, зигомицеты резистентны к большинству антифунгальных препаратов, причем степень резистентности варьирует в зависимости от их видовой принадлежности [3,4].
Эпидемиологическая обстановка по возбудителям зигомикоза различается в разных странах. Во Франции преобладают Rhizopus oryzae (49%) и Lichtheimia spp. (29%), за которыми следуют Rhizomucor pusillus и Cunninghamella spp. (по 7%), Saksenaea vasiformis (3%), Mucor circillenoides (3%) и Apophysomyces elegans (2%) [5]. В США на первом месте среди возбудителей зигомикоза находятся также грибы рода Rhizopus (67%), за ним следуют Мисог spp. (16%), Cunninghamella (6%) и Lichtheimia (5%), Rhizomucor (4%) и Apophysomyces (3%) [6]. Среди он-когематологических пациентов в Санкт-Петербурге также преобладали случаи зигомикоза, вызванные Rhizopus (50%), на втором месте - Rhizomucor (30%), на третьем - Lichtheimia corymbifera (20%) [7].
Классическим методом идентификации зигомицетов в культуре является их фенотипическая характеристика по морфологическим признакам. Однако точная морфологическая характеристика трудна и часто требует экспертизы опытного миколога [8]. По данным недавнего исследования, частота неверных видовых фенотипических идентификаций достигает 20% [9].
Преодолеть ограничения, связанные с морфологическим определением зигомицетов, помогает использование молекулярных методов идентификации
и, в особенности, ДНК секвенирование. Для надежной молекулярной идентификации, ДНК штрихко-дирования необходимо использовать те фрагменты геномной ДНК микромицетов (ДНК-мишени), варьирование нуклеотидных последовательностей которых минимальное внутри вида и максимальное
- между видами. Различными исследовательскими группами были оценены результаты штрихкодиро-вания зигомицетов с использованием фрагментов генов, кодирующих 18S- и 28S- субъединицы рибосо-мальной РНК, гена актина, гена фактора элонгации 1-альфа, гена лактат дегидрогеназы, гена цитохрома b и некоторых других [10-14]. Институтом клинических и лабораторных стандартов США (англ. The Clinical and Laboratory Standard Institute, CLSI) для идентификации зигомицетов до рода и в некоторых случаях до вида (например, в случае с Rhizopus spp.) рекомендовано использование последовательности внутреннего транскрибируемого спейсера (англ. internal transcribed spacer, ITS) рибосомальной ДНК. D1/D2 фрагмент 28S субъединицы рибосомальной ДНК предлагают использовать в качестве альтернативной ДНК-мишени для идентификации зигомицетов до вида [15].
Цель нашего исследования - молекулярно-генетическая характеристика чистых культур зигомицетов из Российской коллекции патогенных грибов НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина методом ДНК секвенирования и сравнение полученных данных с результатами морфологического анализа микромицетов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Культуры микромицетов
В работе были использованы штаммы микромицетов из Российской коллекции патогенных грибов НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина (табл. 1). Грибы фенотипически идентифицировали с помощью микроскопии, при необходимости, проводили посев при разных температурах. Микромицеты выращивали на агаре Сабуро.
В ыделение ДНК
Для выделения ДНК использовали десятидневные культуры. Для выделения геномной ДНК было протестировано несколько методов: реагент PrepManUltra (Applied Bisystems, США), наборы «Сорб-С» (Амплисенс, Москва), «DiamondDNA» (DiamondDNA, Барнаул) и модифицированная методика Дойла и Дойла [16]. Фрагменты мицелия измельчали с помощью интенсивного встряхивания на вортексе со стеклянными шариками 5 мм (Sigma, США). Далее ДНК выделяли с помощью коммерческих наборов, согласно инструкциям производителя, или методом Дойла и Дойла. Для выделения ДНК по методу Дойла и Дойла измельчённый мицелий инкубировали с экстракционным буфером (2% це-тилтриметиламмонийбромид, 1.4 М NaCl, 20 mM ЭДТА, 100 шМ Трис-НС1, pH 8,0) в течение ночи при 65 °С. Далее проводили экстракцию хлороформ-изо-
Таблица 1.
Список использованных в работе штаммов Zygomycetes
№пп Штамм Вид Информация о культуре
Штаммы, полученные РКПГ из зарубежных коллекций
1 РКПГГ60 Absidia coerulea Bainier Поступил из Японии в 1967 г., IF, Осака
2 РКПГГ63 Absidia coerulea Поступил из Японии в 1967 г., IF, Осака
3 РКПГГ62 Absidia cylindrospora Hagem Поступил из Японии в 1967 г., IF, Осака
4 РКПГГ61 Lichtheimia corymbifera (Cohn) Vuill. {=Absidia lichtheimii (Lucet & Costantin) Lendn.) Поступил из Японии в 1967 г., IF, Осака
5 РКПГГ30 Rhizomucorpusillus (Lindt) Schipper Поступил из США в 1967 г., штамм В115
6 PKfirF 1048 Rhizopus o/yzae Went & Prins. Geerl. Поступил из Belgian Coordinated Collection of Microorganisms Institute of Hygiene and Epidemiology, Mycology
Штаммы, полученные РКПГ из российских коллекций
7 PKnrF 29 Mucor racemosus Bull. Поступил изЛХФИ в 1960 г.
8 PKnTF 31 Mucor racemosus f. chibi-nensis (Neophyt.) Schipper Поступил изЛХФИ в 1960 г.
9 PKnrF35 Mucor racemosus Поступил из ВИЗР в 1961 г.
10 PKnrF72 Mucorplumbeus Bonord. Поступил с кафедры низших растений ЛГУ в 1977 г.
11 PKnrF845 Rhizopus stolonifer (Ehrenb.) Vuill. (=Rhizopus nigricans EhrenbJ Штамм поступил из ГИСК им. Тарасевича, (Москва) в 1990 г.
Штаммы, выделенные в НИИ Медицинской микологии им. П. Н. Кашкина
12 PKnrF 158 Rhizomucor pusillus Пациент, культура высеяна из тромба легочной артерии, 1986 г.
13 PKnrF154 Rhizopus stolonifer (=R. nigricans) Культура высеяна из воздуха, НИИ гидролиза, 1986 г.
14 РКПГГ178 Cunninghamella elegans Lendn. Пациент с хроническим бронхитом, Культура получена из образца мокроты
15 РКПГГ 37 Syncephalastrum J. Schrot. sp. Культура выделена из циновок, 1992 г.
16 PKnrF1380 Syncephalastrum sp. Пациент 19 лет, с лейкозом, культура из промывных вод бронхов
17 PKnrF1341 Rhizomucor pusillus Пациент 21 г, острый лимфобластный лейкоз, культура получена из мокроты 2010 г.
18 РКПГГ1379 Rhizopus microsporus var. oligosporus (Saito) Schipper & Stalpers Пациент с нейробластомой
19 РКПГГ1456 Lichtheimia corymbifera [=Absidia lichtheimii) Пациент (11 лет), с апластиче-ской анемией, культура получена из образца легкого, 2011 г.
20 РКПГГ1493 Lichtheimia corymbifera (=Absidia lichtheimii) Пациент, 2012 г.
21 РКПГГ1507 Lichtheimia corymbifera {=Absidia lichtheimii) Пациент, культура высеяна из носовой полости, 2012 г.
22 РКПГГ1497 Rhizopus microsporus Tieg h. Пациент, культура высеяна из бронхоальвеолярного лаважа, 2012 г.
амиловой (24:1) смесью в течение 15 мин., после чего центрифугировали 10 мин. при 12 000 об/мин. на микроцентрифуге МШ5рт (Eppendorf). ДНК осаждали изопропанолом при +4 °С, после чего концентрировали центрифугированием в течение 10 мин. при 12 000 об/мин. Полученный осадок дважды промывали 70% этанолом, высушивали и растворяли
в буфере ТЕ (Амплисенс, Москва). Концентрацию выделенной ДНК измеряли на флуориметре Qubit (Invitrogen, США).
Секвенирование
Молекулярно-генетическую идентификацию с помощью секвенирования ДНК проводили согласно рекомендациям Института Клинических и Лабораторных стандартов США (CLSI, 2008). Идентификация основывалась на определении нуклеотидной последовательности ITS и D1/D2 фрагментов рибо-сомальной ДНК. Для амплификации района ITS в качестве прямого праймера использовали ITS-1 или ITS-5, обратного - праймер ITS-4 [17]. Для амплификации района D1/D2 применяли прямой праймер NL-1 и обратный - NL-4 [18]. ПЦР проводили в 50 мкл смеси, содержащей 0,2 мМ дНТФ (СибЭн-зим, Новосибирск), 20 пкмоль каждого праймера (Синтол, Москва), 2,5 е.а. Taq-полимеразы (Синтол, Москва), 2.5 мМ MgC12 (Синтол, Москва) и 2 нг геномной ДНК, если не оговорено иначе. Протокол амплификации: стартовая денатурация 3 мин. - 95 °С, 30 циклов (30 сек. - 95 °С, 30 сек. - 50 °С, 1 мин. 10 сек. - 72 °С), финальная элонгация 10 мин. - 72 °С. Полученные фрагменты разделяли с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле в трис-борат-ЭДТА буфере в присутствии бромистого этидия и визуализировали в УФ-свете. ПЦР-продукты очищали с помощью набора для очистки ДНК «Омникс» (Омникс, Санкт-Петербург)
Секвенирование ДНК выполняли по методу Сэн-джера на генетическом анализаторе ABI Prizm 3500 (Applied Bisystems, США). Реакцию проводили с использованием набора BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) в объеме 10 мкл, согласно рекомендациям производителя. Очистку от терминирующих аналогов нуклеотидов осуществляли набором BigDye XTerminator Purification Kit (Applied Biosystems, США). Секвенирование выполняли в обоих направлениях. Идентификацию проводили в соответствии с критериями CLSI (2008). Все несоответствия между фенотипической и молекулярно-генетической идентификациями были проверены повторным секвенированием.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для установления видовой принадлежности коллекционных изолятов зигомицетов была проведена амплификация регионов рДНК, включающих следующие последовательности: ITS-ген 5,8S pPHK-ITS2 (далее - ITS) и домены D1/D2 гена 28S рРНК (далее
- D1/D2). Амплифицированные последовательности были секвенированы. Из проанализированных 22 чистых культур ITS последовательности были получены для 21. Не удалось амплифицировать ITS последовательность культуры R. stolonifer PKIIIT 845, несмотря на то, что ПЦР была повторена несколько раз с разными пассажами микромицета и разными методами выделения ДНК. Так как амплификация D1/D2 с этой культурой проходила успешно, то при-
чин сомневаться в качестве ДНК нет. Отсутствие амплификации можно объяснить либо мутациями в месте «посадки» праймеров, либо образованием вторичных структур, которые мешают работе ДНК-полимеразы. Решить проблему с секвенированием ITS R. stolonifer может помочь использование двух дополнительных пар праймеров к данной последовательности [20]. D1/D2 амплифицированные последовательности были получены для всех 22 культур. Нуклеотидные последовательности ITS депонированы в базе данных Genbank Национального Центра Биотехнологической Информации США {англ. National Center for Biotechnology Information [NCBI]) (номера в базе данных с JX661042 по JX661057).
Все секвенированные последовательности были сравнены с ITS и D1/D2 последовательностями базы GenBanK с помощью алгоритма BLAST. Результаты этого анализа приведены в таблице 2.
Таблица 2.
Сравнение результатов молекулярной (секвенирование) и фенотипической идентификации Zygomycetes
Фенотипическая иденти- ДНК секвенирование
фикация ITS I D1/D2
Mucoraceae Dumort.
Absidia coerulea РКП1Т63 РКП1Т60 + + + +
Absidia cylyndrospora РКП1Т62 + Absidia sp.
Mucor racemosus РКП1Т29 + +
РКП1Т35 M. circinelloides M. circinelloides
Mucor racemosus f. chibinensis РКП1Т31 + M. racemosus + M. racemosus
Mucor plumbeus РКП1Т72 + M. plumbeus, + M. plumbeus,
M.racemosus M.racemosus
Rhizomucor pusillus РКП1Т30 + +
РКП IT 1341 + +
РКП1Т158 R. microsporus R. microsporus
Rhizopus microsporus РКП IT 1379 R. oryzae R. oryzae
РКП IT 1497 + +
Rhizopus oryzae РКП IT 1046 + +
Rhizopus stolonifer (=nigricans) РКП1Т154 + +
РКП1Т 845 - +
Lichtheimiaceae Kerst. Hoffm., Walther & К. Voiqt
Lichtheimia corymbifera (=Absidia Uchtheimii) РКП IT 1456 + L. corymbifera, +
РКП IT 1493 L. ramosa + +
РКП IT 1507 + +
РКП1Т61 A. coerulea A. coerulea
Cunninqhamellaceae Naumov ex R.K. Beni.
Cunninghamella sp.
РКП1Т178 + C. echinulata + C. echinulata
Syncephalastraceae Naumov ex R.K. Beni.
Syncephalastrum sp.
РКП1Т37 + Syncephalastrum sp. +5. racemosum
РКП IT 1380 + S. racemosum +5. racemosum
«+» - совпадение результатов секвенирования и фенотипической идентификации
ПРОБЛЕМЫ МЕДИЦИНСКОЙ МИКОЛОГИИ. 2012. Т.14. №3
В 96 % случаев идентификация на основе секве-нирования и фенотипическая идентификация совпали до уровня рода, в 82 % - до уровня вида. Из 16 проанализированных представителей семейства Мисогасеае результаты морфологической и фенотипической идентификации совпали для 13, что согласуется с литературным данными о совпадении морфологической и молекулярной идентификации по локусам ITS для М. racemosus, М. circinelloides, R. microsporus, R. oryzae, R. pusillus [13,21,22]. Исследований по локусу D1/D2 выполнено меньше, тем не менее, известно, что результаты идентификации, выполненной методом секвенирования, согласуются с фенотипическим определением R. stolonifera и М. racemosus [11,21].
Штамм PKI II I 35 был определён фенотипически, как М. racemosus, а секвенированием - как М. circinelloides. Известно, что определение видов Мисог spp. с помощью традиционных фенотипических методов затруднено, однако это возможно сделать с помощью мультилокусного секвенирования рДНК [22]. В рассматриваемом случае идентификация Мисог circinelloides особенно важна, т.к. этот вид отличается значительной устойчивостью к действию анти-микотических препаратов [23,24]. Штамм PKI ПТ 72 морфологически был определён как Ж plumbeus, тогда как по результатам секвенирования было дано два равновозможных ответа - М. plumbeus и М. racemosus. Ранее в филогенетическом исследовании была показана высокая степень генетического родства между этими двумя видами [12].
Штамм РКПГР 1379 морфологически был определён как R. microsporus, но с помощью секвенирования он идентифицирован как R. oryzae. Корректность молекулярной идентификации позднее была подтверждена отсутствием роста микромицета при 42 °С. Штамм PKI IIT 158 при поступлении в коллекцию фенотипически был определен как Rhizomucor pusillus, но с помощью секвенирования он идентифицирован как Rhizopus microsporus. Это единственный случай несогласования фенотипической и молекулярной идентификации на уровне рода в нашем исследовании
Проблемы возникли при идентификации штамма A. cylindrospora PKI II I 62. В базе данных Genbank не оказалось близкой нуклеотидной последовательности D1/D2, а идентичность по ITS достигала лишь 97%. Результат можно объяснить либо тем, что мы имеем дело с новым видом или разновидностью Absidia, либо недостаточной наполненностью базы
данных в связи с редкой встречаемостью данного вида. Для ответа на данный вопрос требуется молекулярный анализ дополнительных локусов, а также тщательное фенотипическое изучение данного изолята и оценка внутривидовой изменчивости A. cylindrospora.
Из четырёх проанализированных представителей семейства Lichtheimiaceae результаты морфологической и фенотипической идентификации совпадали для трёх: Lichtheimia corymbifera PKI H I- 1456, 1493 и 1507. Полученные результаты согласуются с литературным данными о совпадении морфологической и молекулярной идентификации по локусам ITS для L. corymbifera [13,23]. Штамм PKI ПТ 61 при поступлении в коллекцию фенотипически был определен как L. corymbifera, но с помощью секвенирования он идентифицирован как A. coerulea. Это несогласование можно объяснить морфологическим сходством представителей рода Absidia, что могло привести к ошибке при микроскопическом исследовании.
Представители минорных среди патогенных зигомицегов семейств Cunninghamellaceae и Syncephalastraceae были идентифицированы до видового уровня только молекулярно. Единственным патогенным видом рода Cuninghamella считают С. elegans (=С. bertholrtidae), поэтому только он присутствует в определителе патогенных грибов [25]. Возможно, число медицински значимых штаммов в этом роде недооценено. Например, коллекционный штамм РКПГР 178 был получен из клинического материала (мокроты) и идентифицирован как С. echinulata. Поскольку С. elegans считают единственным патогенным видом рода Cuninghamella, то существует значительная вероятность некорректного морфологического определения [25]. В этом случае молекулярные методы могут значительно прояснить ситуацию. Согласованность видового определения S. racemosum по морфологическим и молекулярным критериям была показана в литературе для локуса D1/D2 [11].
ВЫВОДЫ
Секвенирование ITS И D1/D2 локусов рДНК можно успешно использовать для видовой идентификации Zygomycetes. Молекулярная идентификация позволяет уточнить их видовую принадлежность, когда фенотипически изолят определяется только до рода.
ЛИТЕРАТУРА
1. Хостелиди С.Н. Главное о зигомикозе II Проблемы медицинской микологии. - 2006. - Т. 8, №4. - С. 8-18.
2. Severe С.Б., Guazzelli L.S., Severn L.Ct Zygomyqosis # J. Bras. Pneumol. - 2010. - Vol. 36, №1. - P. 134-414.
3. Dannaoui E., Meletiadis J., Mouton J.W., etal. In vitro susceptibilities of zygomycetes to conventional and new antifungals // J. Antimicrob. Chemother. - 2003. - Vol. 51. - P. 45-52.
4. Kontoyiannis D.P, Lewis R.E. How I treat mucormycosis // Blood. - 2011. - Vol. 118, №5. - P. 1216-1224.
5. Lanternier F., Dannaoui E., Morixot Gt, et al. A global analysis of mucormycosis in Trance: the RetroZygo Study (20052007) H Clin. Infect. Dis. - 2012. - Vol.54, S.l. - P. S35-S43.
6. Alvarez E,, Sutton D.A., Cano J.? etal. Spectrum of Zygomycetes species identified in clinically significant specimens in the
United States II}. Clin. Microbiol. - 2009. - Vol. 47, №6. - P. 1650-1656.
7. Klimko N, Khostelidi S., Bogomolova T. et al. Invasive mucormycosis in oncohaematological patients in Saint Petersburg, Russia // Mycoses. - 2012. - Vol. 55, S.4. - P. 200-201.
8. Iwen P.C., Thapa I., Bastola D. Review of methods for the identification of Zygomycetes with an emphasis on advances in
molecular diagnostics // Lab medicine. - 2011. - Vol. 42, № 5. - P. 260-266.
9. Kontoyiannis D.P., Lionakis M.S., Lewis R.E., et al. Zygomycosis in a tertiary care cancer centre in the era of aspergillus-active antifungal therapy: a case-control observational study of 27 recent cases // J. Infect. Dis. - 2005. - Vol. 191. - P. 1350-1360.
10. Voigt K., Cigelnik E., O’Donnel K. Phylogeny and PCR identification of clinically important Zygomycetes based on nuclear ribosomal-DNA sequence data // J. Clin. Microbiol. - 1999. - Vol. 37, №12. - P. 3957-3964.
11. Hall L., Wohlfiel S., Roberts G.D. Experience with the MicroSeq D2 large-subunit ribosomal DNA Sequencing Kit for identification of filamentous fungi encountered in the clinical laboratory // J. Clin. Microbiol. - 2004. - Vol. 42. - P. 622626.
12. Kwasna H., Ward E., Bateman G.L. Phylogenetic relationships among Zygomycetes from soil based on ITS1/2 rDNA sequences // Mycological research. - 2006. - Vol. 110. - P. 501-510.
13. Schwarz P., Bretagne S., Gantier J.-C., et al. Molecular identification of Zygomycetes from culture and experimentally
infected tissues // J. Clin. Microbiol. - 2006. - Vol. 44, №2. - P. 340-349.
14. Nyilasi I., Papp Т., Csernetics A., et al. High-affinity iron permease (FTR1) gene sequence-based molecular identification of clinically important Zygomycetes II Clin. Microbiol. Infect. - 2008. - Vol. 14. - P. 393-397.
15. CLSI. Interpretive criteria for identification of bacteria and fungi by DNA target sequencing; approved guideline. CLSI document MM14-A. - Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2008. - 76 p.
16. Doyle, J.J., Doyle J.L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities offresh leaf tissue II Phytochem. Bull. - 1987. -Vol. 19.-P. 11-15.
17. White T.J., Bruns Т., Lee S., Taylor JW. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. // PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. - 1990. - P. 315-322.
18. Kurtzman C.P., Robnett C.J. Identification of clinically important Ascomycetous yeasts based on nucleotide divergence in the 59 end of the large-subunit (26S) ribosomal DNA gene // J. Clin. Microbiol. - 1997. - Vol. 35, №5. - P. 1216-1223.
19. Tamura K., Peterson D., Peterson N, et al. MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods // Mol. Biol. Evol. - 2011. - Vol. 28. - P. 2731-2739.
20. Abe A., Oda Y., Asano K, Sone T. The molecular phylogeny of the genus Rhizopus based on rDNA sequences // Biosci. Biotechnol. Biochem. - 2006. - Vol. 70, №10. - P. 2387-2393.
21. Rakeman J.L., Bui U., LaFe K, et al. Multilocus DNA sequencing comparisons rapidly identify pathogenic molds // J. Clin. Microbiol. - 2005. - Vol. 43, №7. - P. 3324-3333.
22. Zhao Z., Li L., Wan Z., et al. Sumultaneous detection and identification of Aspergillus and Mucorales species in tissues collected from patients with fungal rhinosinusitis // J. Clin. Microbiol. - 2011. - Vol. 49, № 4. - P. 1501-1507.
23. Almyroudis N. G., Sutton D. A., Fothergill A.W., et al. In vitro susceptibilities of 217 clinical isolates of Zygomycetes to conventional and new antifungal agents // Antimicrob. Agents and Chemother. - 2007. - Vol. 51, № 7. - P. 2587-2590.
24. Khan Z. U., Ahmad S., Brazda A., Chandy R. Mucor circinelloides as a cause of invasive maxillofacial zygomycosis: an emerging dimorphic pathogen with reduced susceptibility to posaconazole // J. Clin. Microbiol. - 2009. - Vol. 47, №4. -P. 1244-1248.
25. Jang J.-H., Lee J. H., Ki С.-S., Lee NY. Identification of clinical mold isolates by sequence analysis of internal transcribed spacer region, ribosomal large-subunit D1/D2, and (3-tubulin // Ann. Lab. Med. - 2012. - Vol. 32. - P. 126-132.
Поступила в редакцию журнала 20.09.2012
Рецензент: Е.И. Якубович
