CC BY
31УДК 577.2:615.076:616-002.828:611.24
МОЛЕКУЛЯРНОЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ
ВЫЯВЛЕНИЕ И
ИДЕНТИФИКАЦИЯ
ПАТОГЕННЫХ
МИКРОМИЦЕТОВ
В МОКРОТЕ,
БРОНХОАЛЬВЕОЛЯРНОМ ЛАВАЖЕ И АУТОПСИЙНОМ МАТЕРИАЛЕ
Михайлова Ю.В. (н.с.), 1Белоцерковская Е.В. (н.с.), 1Богомолова Т.С. (зав. лаб.), 1Борзова Ю.В. (зав. клиникой), 2Волкова А.Г. (врач-эндоскопист), 3,4Михайлов В.И. (врач-патологоанатом), 1Полищук А.Г. (зав. лаб.)*
1 НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина СЗГМУ им. И.И. Мечникова; 2 Институт детской гематологии и трансплантологии им. Р.М. Горбачевой СПб ГМУ им. И.П. Павлова; 3 Александровская больница; 4 Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия
© Коллектив авторов, 2013
Успех лечения больных микозами лёгких во многом зависит от ранней этиологической диагностики, которая часто проблематична при использовании традиционных методов анализа. Цель работы заключалась в разработке/модификации и апробации молекулярно-генетических методов для выявления и идентификации Aspergillus spp. и Zygomycetes у пациентов с мико-тической инфекцией легких. В работе представлена новая мультиплексная ПЦР в режиме реального времени (РВ) с анализом кривых плавления ПЦР продуктов высокого разрешения (HRM) для выявления и идентификации аспергиллов и зигомицетов. Представлены результаты применения молекулярных (два типа ПЦР-РВ, включая указанный выше, и ДНК-сиквенирование, в том числе - на прямую из клинического материала), микробиологических (микроскопия и посев) и серологического методов для анализа клинических образцов. Из результатов работы следует, что молекулярно-генетический анализ может предоставить важную информацию о видовой принадлежности возбудителя микотиче-ской инфекции легких.
Ключевые слова: аспергиллы, зигомицеты, идентификация, микоз легких, молекулярное выявление, HRM
Контактное лицо: Полищук Анна Генриховна, Тел.: (812) 303-51-40
MOLECULAR AND MICROBIOLOGICAL DETECTION AND IDENTIFICATION OF PATHOGENIC MICROMYCETES IN SPUTUM, BRONCHOALVEOLAR LAVAGE AND AUTOPSY MATERIAL
1 Mikhaylova Y.V. (scientific collaborator), 1 Belotcerkovskaya E.V. (scientific collaborator), 1 Bogomolova T.S. (head of the laboratory), 1 Borzova Y.V. (head of the clinic), 2 Volkova A.G. (physician-endoscopist), 3,4Mikhaylov V.I. (physician -pathologoanatomist), 1 Polischouk A.G. (head of the laboratory)
1 Kashkin Research Institute of Medical Mycology of North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov; 2 R.M. Gorbacheva Institute of Children's Hematology and Transplantology of St. Petersburg State Medical University named after I.P. Pavlov; 3 Alexandrov's Hospital; 4 St. Petersburg State University, St. Petersburg, Russia
© Collective of authors, 2013
The success of treatment of fungal infection of the lungs depends to a large extent on early etiological diagnostics, which is often problematic when conventional methods of analysis are used. The aim of the study was to establish/modify and test the molecular genetic methods for detection and identification of Zygomycetes and Aspergillus spp. In this paper we present a new multiplex PCR with High Resolution Melt (HRM) analysis for the detection and identification of Zygomycetes and Aspergillus spp. and the results of the analysis of clinical samples obtainedfrom patients with mycotic infection of the lungs. Samples from the patients were analyzed using molecular (two kinds of real-time PCR, including one indicated above and DNA sequencing), microbiological (microscopy and culture), and serological methods. The results of the work indicate that the molecular genetic analysis can provide important information about species affiliation of the etiologic agent of mycotic infection of the lungs.
Key words: Aspergillus spp., HRM, identification, molecular detection, mycosis of lungs, Zygomycetes
ВВЕДЕНИЕ
Микозы легких (МЛ) - тяжелые заболевания, развивающиеся преимущественно у иммунокомпро-метированных больных [1]. Основными этиологическими агентами МЛ являются грибы рода Aspergillus и порядка Mucorales (Rhizopus, Mucor, Rhizomucor, Lichtheimia, Cunninghamella), значительно реже - из родов Fusarium, Scedosporium, Cryptococcus и др. Известны также легочные формы эндемичных мико-
зов, вызванных Blastomyces dermatitidis, Histoplasma capsulatum и Coccidioides spp. [2]. В последние 20 лет возросла частота заболеваемости мукорозом (зиго-микозом) среди онкологических больных и пациентов, перенесших трансплантацию органов. В 65% случаев мукороз вызывают Rhizopus spp. и Mucor spp. [3].
Успех лечения больных МЛ во многом зависит от ранней этиологической диагностики, для чего в настоящее время используют комплекс радиологических, микологических и серологических исследований [1]. Основным методом радиологической диагностики МЛ является компьютерная томография (КТ) в режиме высокого разрешения.
Традиционные микологические исследования состоят из микроскопии клинического материала и выделения культур при посеве на питательные среды. С помощью прямой микроскопии образцов можно быстро, в течение нескольких минут, выявить наличие возбудителей и дифференцировать их на основании морфологических признаков (септированный или несептированный мицелий, ветвление под прямым или острым углом, наличие псевдомицелия, дрожжевых клеток, цист). Наибольшей чувствительностью обладает люминесцентная микроскопия с применением флуоресцентных маркеров (калькофлюор белый). В случае диагностики аспергиллеза, при однократном исследовании, чувствительность микроскопии и посева составляет 30-80%, в зависимости от вида исследуемого образца - мокрота, промывные воды бронхов, биоптат (Brakhage A.A., et al. - Basel: Karger. - 1999).
Серологические тесты разработаны для диагностики аспергиллеза и эндемичных микозов, но отсутствуют для мукороза, фузариоза и сцедоспориоза [2, 4]. Аспергиллёз диагностируют по наличию галак-томаннана (компонента полисахаридной клеточной стенки Aspergillus spp.) в сыворотке крови и промывных водах бронхов. Европейской организацией по изучению и лечению рака для постановки диагноза инвазивного аспергиллеза у иммунокомпро-метированных больных рекомендован тест «Platelia Aspergillus» (BioRad, США), клиническая чувствительность которого составляет 71%, а специфичность - 89% [5, 6].
В последнее десятилетие происходит прогрессивное развитие новых технологий в области молекулярной диагностики микозов. За рубежом активно применяют ПЦР (полимеразная цепная реакция) и разрабатывают системы для обнаружения и идентификации возбудителей инвазивных микозов. Существенными преимуществами ПЦР, особенно ее варианта - ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ, англ. Real-time PCR, qPCR), являются: возможность напрямую, минуя этап культивирования, исследовать клинические образцы, высокая специфичность и скорость видовой идентификации возбудителей инфекции (5-12 часов с момента получения клинического образца).
Предложены научно-исследовательские тесты для П^^В диагностики инвазивного аспергиллёза [ссылки в 7], мукороза [8, 9], сцедоспориоза [10] и др. Клиническая чувствительность созданных в отдельных научно-исследовательских лабораториях ПЦГ тест-систем колеблется от 70 до 100%, а специфичность - от 90 до 100% [7]. Однако выбрать наиболее эффективную систему бывает проблематично из-за разнообразия применяемых видов П^, оборудования и методов выделения грибной ДНК [11].
Цель данной работы - разработка мультиплексного П^ в режиме реального времени (ПЦP-PВ) для обнаружения и идентификации аспергиллов и зигомицетов в клиническом материале и оценка возможностей данной ПЦP-PВ и других молекулярных методов для выявления и идентификации грибов у больных микозом лёгких.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали культуры грибов из Pос-сийской коллекции патогенных грибов, образцы мокроты, промывных вод бронхов и аутопсийный материал от пациентов с подозрением на микотическое поражение легких.
Выделение ДНК из культур микромицетов
осуществляли согласно ранее описанному протоколу [12].
Выделение тотальной ДНК из промывной жидкости бронхов и аутопсийного материала.
Аутопсийный материал промывали водой дважды. Промывную жидкость бронхов центрифугировали 15 минут при 6 000 g, надосадочную жидкость удаляли.
Очищенный материал (осадок из промывной жидкости, ткань) помещали в 500 мкл экстракционного буфера (Abbott, США) и измельчали в гомогенизаторе PreCellys (Bertin technologies, Франция) при 6200 обр/мин в течение 90 сек, 3 раза. Затем добавляли протеиназу К (конечная концентрация - 0,02 мг/ мл) (Fermentas, Литва) и инкубировали на шей-кере (BioSan, Латвия) при 400 об/мин 12 часов при +55 оС. Дальнейшие процедуры проводили по протоколу хлороформ-изоамиловой экстракции (Doyle J.J., Doyle J.L. Phytochem. Bull. - 1987. - Vol. 19). Количество ДНК определяли с помощью флуориметра Qubit (Invitrogen, США).
ПЦР-РВ.
«Taq-Asp»-^^ основана на технологии TaqMan. В работе использовали протокол ПЦГ для обнаружения аспергиллов, рекомендованный EAPCRI (European Aspergillus PCR Initiative) [13] и модифицированный нами. В реакции, помимо аспергилл-специфичных праймеров ASF1 (5'-GCACGTGAAATTGTTGAAAGG-3') и ADR1 (5'- CAGGCTGGCCGCATTG - 3'), применяли гибридизационный зонд ASP28P (FAM-5'-CATTCGTGCCGGTGTACTTCCCCG-3' -BHQ1). Амплификацию выполняли в объеме 25 мкл с помощью набора реагентов для проведения П^^В
(«Синтол», Россия). ПЦР-смесь содержала компоненты набора (250 мкМ нуклеотидов; ПЦР-буфер; 2,5 мМ MgCl2; 0,9 ед. Taq-ДНК-полимеразы), 10 пмоль каждого праймера, 5 пмоль гибридизационной пробы и ДНК. Амплификацию осуществляли при следующем режиме: начальная денатурация - 95 оС, 5 мин; 40 двухстадийных циклов, включающих денатурацию, - 95 оС, 15 сек; отжиг и элонгацию - 60 оС, 40 сек. В качестве отрицательного контроля использовали реакционную смесь без добавления матрицы.
«HRM-Zygo-Asp»^^ была разработана в НИЛ молекулярно-генетической микробиологии НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина. Это ПЦР-РВ с анализом кривых плавления ПЦР продуктов высокого разрешения (HRM от англ. high-resolution meltingj. С помощью этого метода можно детектировать зигомицеты и/или аспергиллы в образце, а также идентифицировать зигомицеты до рода или вида.
Амплификацию фрагментов ДНК осуществляли на приборе Rotor-GeneTM 6000 (Corbett Life Science, Австралия).
Сиквенирование ДНК. Молекулярную идентификацию с использованием сиквенирования ДНК проводили согласно ранее описанному протоколу [12]. Для сиквенирования ДНК микромицетов, выделенных из клинических образцов, применяли прай-меры ITS1F и ITS4 - к региону ITS1-5.8S рРНК-Ж2 или ZM1 и ZM2 - к фрагменту гена 18S рРНК, а ми-кромицетов, выделенных из культур, праймеры ITS5 и ITS4 - к региону ITS1-5.8S рРНК -ITS2 (Gardes M., Bruns T.D. // Molecular ecology. - 1993. - Vol. 2, №2; White T.J., et al. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. - 1990; [14]).
Микроскопия клинического материала. Из мокроты, осадка промывных вод бронхов, измельченной ткани органов, взятых при аутопсии, готовили препараты, используя в качестве просветляющей жидкости 10% раствор КОН в 10%-ном водном растворе глицерина, и добавляли каплю раствора флуоресцирующего красителя - калькофлюора белого. Препараты просматривали в белом свете и ультрафиолетовых лучах при увеличениях микроскопа х100, х200, х400.
Культуральное исследование. Исследуемые образцы засевали в чашки Петри с агаризованной средой Сабуро с добавлением левомицитина и инкубировали при 35 оС и 28 оС в течение 14 суток. Выделенные культуры грибов идентифицировали по морфологическим и физиологическим признакам согласно определителю [15].
Галактоманнановый антиген аспергиллов выявляли с помощью коммерческой иммунофермент-ной тест-системы «Platelia-Aspergillus EIA» (Bio-Rad, США) в соответствии с инструкцией производителя.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
ПЦР-РВ для выявления и идентификации аспергиллов и зигомицетов. Тестирование на культурах грибов.
В работе были использованы две ПЦР-РВ-системы. Одна из них - «Taq-Asp» предназначена для обнаружения аспергиллов. Для модификации применяли ранее предложенный протокол [13]. Вторая - мультиплексная «HRM-Zygo-Asp» предназначена для обнаружения и идентификации аспергил-лов и зигомицетов (одновременно) и представляет собой вариант ПЦР в режиме реального времени с анализом кривых плавления ПЦР продуктов высокого разрешения. Она разработана нами с использованием праймеров, нуклеотидные последовательности которых были опубликованы ранее [14, 16]. «HRM-Zygo-Asp» ПЦР-РВ идентифицирует до рода представителей Aspergillus и Absidia (без Lichtheimia corymbifera, ранее называвшейся Absidia corymbifera), до вида - микромицеты Rhizomucorpusillus, Rhizopus microsporus, Mucor circinelloides, Cunninghamella echinulata, Syncephalastrum racemosum, Lichtheimia corymbifera, до пары видов - Rhizopus arrhizus/ Rhizopus stolonifer и Mucor racemosus/ Mucor plumbeus (таблица).
«HRM-Zygo-Asp» ПЦР-РВ была протестирована на 64 культурах клинически значимых патогенных микромицетов. При разработке «HRM-Zygo-Asp» ПЦР-РВ использовали культуры 22 штаммов зигомицетов и 22 штаммов аспергиллов. Для проверки специфичности ПЦР-система была протестирована на 20 штаммах других микромицетов (табл. 1).
Таблица 1.
Культуры микромицетов, использованные для
разработки I тестирования ПЦР-РВ
Микромицет Код штамма в РКПГ* Результат HRM-Zygo-Asp /TaqMan
Зигомицет ы
Absidia coerulea P№F60/4011, 63, 61/4009 Положительные на Ш&а spp. / отрицательный
Absidia cylindrospora P№F 62/4000 Положительный на Ш&а spp. / отрицательный
Rhizomucor pusillus РКП^ 30, 1341 Положительные на Н. ризНЫ отрицательный
Rhizopus arrhizus РКП^ 1048/ ÍHEM1164.1379 Положительный на Н апЬ'ит и Н. stolonifer/ отрицательный
Rhizopus stolonifer РКП^ 845, 154 Положительные на Н аггЫгт и Н. stolonifer/ отрицательный
Rhizopus microsporus P№F 158/3848, 1497 Положительные на Н. microsporus/ отрицательный
Mucor racemosus M. racemosus f. chibinensis M. plumbeus РКП^ 29 РКП^ 31 РКП^ 72 Положительные на М. racemosus и М. plumbeus /отрицательный
Mucor circinelloides P№F 35/283 Положительный на М. circinelloides /отрицательный
Cunninghamella echinulata РКП^ 178/4103 Положительный на С. echinulata/ отрицательный
Syncephalastrum racemosum РКП^ 37 Положительный на 5. racemosum/ отрицательный
Lichtheimia corymbifera PWF 1456, 1493, 1507, Клинический изолятА-2013 Положительные на 1. corymbiferal отрицательный
Аспергиллы*
Aspergillus fumigatus PWF 1327, 1377, 1384 Положительные на аспергиллы
Aspergillus flavus РКПП247/1094, 1375,1388 Положительные на аспергиллы
Aspergillus niger РКП^ 1249/800, 1329, 1345 Положительные на аспергиллы
Aspergillus tubinaensis РКП^ 1337, 1376 Положительные на аспергиллы
Aspergillus terreus РКПти/67, 109/65, 850 Положительные на аспергиллы
Aspergillus sydowii РКП^ 1115, 1287/50, 1241 Положительные на аспергиллы
Aspergillus repens РКПГ 2 Положительный на аспергиллы
Aspergillus calidoustus РКП^ 11 Положительный на аспергиллы
Aspergillus amstelodami РКП^ 1250 Положительный на аспергиллы
Aspergillus sclerotiorum РКП^ 1062 Положительный на аспергиллы
Aspergillus ochraceus РКП^ 10 Положительный на аспергиллы
Другие филаментирующие грибы*
Fusarium proliferatum РКП^ 1083 Отрицательный
Fusarium oxysporum РКП^ 1391/566 Отрицательный
Trichophyton tonsurans РКП^ 212/122 Отрицательный
Trichophyton interdigitale РКП^ 1229 Отрицательный
Trichophyton rubrum РКП^ 974 Отрицательный
Trichophyton mentagrophytes РКП^ 1207 Отрицательный
Pseudallescheria boydii ИзолятSc-65(2012) Отрицательный
Дрожжеподобные грибы*
Candida albicans РКПГF1353/1277 Отрицательный
Candida guilliermondii РКПГF593/871 Отрицательный
Candida krusei РКП^ 1258/170 Отрицательный
Candida dubliniensis РКПГF1207 Отрицательный
Candida parapsilosis РКПГF1206 Отрицательный
Candida utilis РКПГF1371 Отрицательный
Candida tropicalis РКПГF1351/17 Отрицательный
Trichosporon asachii РКП^ 1367/52 Отрицательный
Trichosporon mucoides РКПГF1364 Отрицательный
Cryptococcus neoformans Изолят 53 (2012) Отрицательный
Exophiala dermatitis Изолят Ex-66 (2012) Отрицательный
Malassezia sp. Изолят124-11 Отрицательный
Debaryomyces sp. РКПГ 1374/5 Отрицательный
РКПГ - Российская Коллекция Патогенных грибов; *-одинаковые результаты для тест-систем «HRM-Zygo-Asp» и «Taq-Asp»
Как видно из таблицы, «HRM-Zygo-Asp» ПЦР-РВ специфична для аспергиллов и зигомицетов, поскольку кросс-реактивность с другими филамен-тирующими и дрожжевыми грибами отсутствует. Специфичность «Taq-Asp» ПЦР-РВ для выявления грибов рода Aspergillus также была подтверждена с использованием коллекционных культур грибов.
Анализ клинических образцов.
Пациент 1 (75 лет)
Больной находился на стационарном лечении с 02.10.12 г. с диагнозом «острый гнойный медиастенит с поражением всех отделов средостения». 10.10.12 г. на контрольной рентгенографии отмечали появление полости распада в левом лёгком и инфильтрации - в нижней доли правого лёгкого. При микроскопии мокроты от 16.10.12 г. обнаружили нить (единичную) широкого несептированного мицелия, ветвящуюся под прямым углом, морфологически сходную с мицелием мукоровых грибов (Рис. 1А). Роста грибов при посеве не наблюдали.
В
* -.
V
У.г • '-л
t и
г
-
5
ш М
г
ЛфгрШя
/ijM^ppWJ
л
/
Absidia coeralea Л !\ i i 1 \
llnwr^tmaw I """f"
ТЗ п
I fViii;L'|iji>[!;i IL 1,1 II. U li II и, - t
S"
Алршxfibi} Jbmltdhit /
Порсгсшц.ичиц
Рис. 1. Исследование клинического материала пациента 1. Световая микроскопия, х400. А) Нить несептированного мицелия в мокроте. Стрелками указаны нить и точка ветвления. Б) Септированный мицелий в промывных водах бронхов. В) ПЦР-РВ «НРМ^удо-ДБр» ДНК из промывных вод бронхов. Видны пики плавления ПЦР-продуктов положительных контролей. Кривая плавления образца совпадает с линией отрицательного контроля, что свидетельствует об отсутствии ДНК аспергиллов и зигомицетов. Г) ПЦР-РВ <Л^-ДБр» ДНК из ткани легкого. Рост флуоресценции свидетельствует о наличии в ткани ДНК аспергилла. Пунктирные линии - положительные контроли
В образцах промывных вод бронхов от 19.10.12 г. отмечали несептированный мицелий (единичные нити в одном поле зрения) и септированный мицелий (единичные нити в нескольких полях зрения).
При посеве промывных вод бронхов роста грибов не было.
Результаты ПЦР-РВ «HRM-Zygo-Asp» промывных вод бронхов от 19.10.12 г. были отрицательными при всех использованных концентрациях ДНК (Рис. 1В). Возможным объяснением отрицательного результата посева и ПЦР-РВ является недостаточное количество мицелия (отдельные нити) в образце. Случаи отрицательного результата посева при положительной микроскопии, в том числе - для аспер-гиллов и зигомицетов, неоднократно описаны в научной литературе [9, 17, 18].
Аутопсийный материал. При микроскопии образца ткани правого легкого грибы не выявили. Методами ПЦР-РВ «Taq-Asp» и посева обнаружили аспергилл (Рис. 1Г). «HRM-Zygo-Asp» ПЦР не проводили.
Таким образом, в данном случае методом «Taq-Asp» ПЦР подтвержден результат посева, что может служить дополнительной информацией при постановке посмертного диагноза.
Пациент 2 (65 лет)
Больная находилась в стационаре с 12.10.12 г. с диагнозом «острый миелобластный лейкоз, М1 вариант». На рентгенограмме органов грудной клетки от 14.11.12 г. наблюдали инфильтрацию ткани лёгких и округлое образование диаметром 0,25 см.
В промывных водах бронхов от 14.11.12 г. при микроскопии обнаружили септированный мицелий, дихотомически ветвящийся под острым углом, морфологически сходный с мицелием грибов рода Aspergillus (рис. 2А). В посеве был получен рост трех видов Aspergillus: A. flavus, A. fumigatus, A. niger. В материале также выявили галактоманнан. ПЦР анализ пробы не проводили.
Аутопсийный материал. При микроскопическом исследовании ткани левого легкого отмечали обилие нитей септированного мицелия, дихотомически ветвящихся под острым углом (рис. 2Б и В), что доказывало наличие грибов рода Aspergillus. При посеве ткани легкого был выделен A. flavus. При сиквени-ровании ДНК из полученной культуры подтвержден вид аспергилла. Методами ПЦР-РВ - «HRM-Zygo-Asp» и «Taq-Asp» установили наличие ДНК аспер-гилла в ткани легкого (Рис. 2 Г и Д).
Таким образом, результаты, полученные всеми методами, согласовывались и дополняли друг друга.
Ji
а
I учи- |м Г- !■ ■ П.Т.1^11 ¡Ш 'I
I lOJJUiOi™ l][l!llf
Рис. 2. Исследование клинического материала пациента 2. Люминесцентная микроскопия с калькофлуором белым, Х400. Септированный мицелий в промывных водах бронхов (А) и в ткани легкого (Б, В). Г) ПЦР-РВ «НКМ^удо-ДБр» ДНК из ткани легкого. Кривая плавления ПЦР-продукта образца (две линии - две концентрации ДНК - 5 и 20 нг) имеет характерный для аспергиллов пик в районе 77 °С. Д) ПЦР-РВ <Л^-ДБр» ДНК из ткани легкого (две концентрации ДНК - 5 и 20 нг). Рост флуоресценции свидетельствует о наличии в ткани ДНК аспергилла. Пунктирные линии - положительные контроли
Пациент 3 (10 лет)
Больная находилась в стационаре с 31.10.12 по 18.12.10 гг. В ноябре 2011 г. был установлен диагноз «острый миелобластный лейкоз, М4 вариант». 10.11.12 г. на рентгенограмме грудной клетки выявили диффузное усиление легочного рисунка преимущественно в прикорневых отделах обоих лёгких.
В промывных водах бронхов от 14.12.12 г. обнаружили обильный широкий несептированный мицелий, ветвящийся под прямым углом (Рис. 3А). При посеве получен рост Rhizopus arrhizus. Методами ПЦР анализа и сиквенирования ДНК установили наличие Rhizopus sp. в пробе. В результате ПЦР-РВ «HRM-Zygo-Asp» была получена кривая плавления, соответствующая таковой для видов R. arrhizus и R. nigricans (Рис. 3Б). Сиквенированием ДНК, выделенной напрямую из промывных вод бронхов, микро-мицет идентифицировали как R. arrhizus. В пробе от 12.12.12 г. обнаружили галактоманнановый антиген.
} \Х ' t w
111 г» . Ja rti{fatits RftlZOptt* Httcmspafm A
г ' : __ , 5» А M Oüjnjíii ; i Lkhíheitmü } jrjoorjmbifsrtt ■ i \
г т ? 1 ■ / \ iß ti 5 i í i fi :
1 1 = [ ОтрпцпкльлмП : I ; Кйщроль / ir I \
; i г l{ífoWft,ll[MHÍ //А ,7 - ;-"-
г Li h v
Jj 1 /
с hi P !i
ToiJiujiímjiJ гшвлеиин,'('
Рис. 3. Исследование промывных вод бронхов пациента 3. А) Люминесцентная микроскопия с калькофлуором белым, Х400. Несептированный мицелий. Б) ПЦР-РВ «HRM-Zygo-Asp». Кривая плавления ПЦР-продукта образца имеет характерные для R. arrhizus и R. nigricans пики в районе 84°С и 81,5°С. Пунктирные линии - положительные контроли
Таким образом, полученные микробиологическими и молекулярными методами результаты согласовывались друг с другом, тем самым подтверждая наличие R. arrhizus в пробе. Однако при выполнении теста на галактоманнан из промывных вод с бронхов от 14.12.12 г. были выявлены аспергиллы. Поскольку с помощью других четырех методов аспергиллы не
обнаружили, то его наличие в пробе маловероятно. Возможно, в пробе присутствовали другие грибы - фузариум и пеницилл, к которым тест на галлак-томаннан обладает кросс-реактивностью. Отметим также, что ложноположительные результаты теста на галактоманнан наблюдают у детей гораздо чаще, чем в других группах пациентов [19].
Пациент 4 (24 года)
Из анамнеза известно, что в декабре 2010 г. пациенту диагностировали острый лимфобластный лейкоз. На КТ органов грудной полости от 02.11.12 г. отмечали интерстициальные и деструктивные очаговые изменения и ателектаз S4 правого лёгкого. При посеве мокроты от 25.10.12 г. и 06.11.12 г. роста ми-кромицетов не было. 28.11.12 г. была констатирована смерть.
Аутопсийный материал. Провели микроскопию образцов ткани легкого, тромба легкого, селезенки, печени, полученных при аутопсии 30.11.12 г. В ткани тромба обнаружили дрожжевые почкующиеся клетки, в других органах грибы не выявили. При посеве из ткани тромба были выделены Candida glabrata, из печени - Candida sp. В образцах из остальных органов роста грибов не наблюдали.
ПЦР-РВ проводили с образцами двух участков легкого, тромба легкого и печени. При исследовании методом ПЦР-РВ «Taq-Asp» образцов легкого и тромба был положительный результат на аспергиллы (Рис.4), а печени - отрицательный. Сиквенированием выявили в материале ДНК Rhodotorula mucilaginosa. Этот гриб мог оказаться в материале в результате контаминации при подготовке аутопсийного материала. В то же время, в научной литературе имеются данные о роли Rhodotorula в развитии микозов у им-мунокомпрометированных пациентов [20].
Таким образом, обнаружить аспергиллы в аутоп-сийном материале возможно только методом ПЦР. Получение отрицательного ответа при посеве и микроскопии, вероятно, можно объяснить малым количеством грибного материала в образце ткани или повреждением гифальных элементом при взятии и хранении аутопсийного материала [18]. Предположение согласовывается с тем, как выглядит график накопления флуоресцентного сигнала на рисунке 4. Высокое значение порогового цикла Ct (Cicle of threshold) обычно связано с малым количеством целевой последовательности в образце.
' Л vT
\ х / н
Рис. 4. Исследование образцов ткани лёгкого пациента 4 методом ПЦР-РВ «Taq-Asp». Видны кривые накопления флуоресценции в положительном контроле (Л. fumigatus) и образцах ткани абсцесса и тромба легкого. Рост флуоресценции свидетельствует о наличии в тканях ДНК аспергил-ла. О: -пороговый цикл
Пациент 5 (31 год)
В анамнезе у больного в 2005 г. установлен диагноз лимфомы Ходжкина IV A (с лимфоидным преобладанием) с поражением паховых лимфоузлов, лимфоузлов брюшной полости, селезёнки, мягких тканей правого бедра. 22.11.12 г. при КТ органов грудной клетки выявили единичный низкоплотност-ный очаг 0,4 см в диаметре в S5 верхней доли правого лёгкого.
В промывных водах бронхов от 28.02.13 г. обнаружили мицелий мукора (широкие несептированные гифы, ветвящиеся под прямым углом) (Рис. 5А). В посеве был выделен Rhizopus arrhizus. Методом «HRM-Zyg-Asp» установили ДНК двух грибов - R. arrhizus / nigricans и Aspergillus sp. (Рис. 5Б). Наличие гриба и видовая идентификация R. arrhizus были подтверждены сиквенированием грибной ДНК напрямую из промывных вод бронхов. ПЦР-РВ «Taq-Asp» и тест на наличие галактоманнанового антигена были положительными (Рис. 5В).
Таким образом, в данном случае с помощью микроскопии и посева в пробе выявили только зиго-мицет, с помощью HRM-Zygo-Asp ПЦР обнаружили микст-инфекцию зигомицетом и аспергиллом, с помощью Taq-Asp ПЦР подтвердили наличие аспер-гилла, а тест на галактоманнан согласовывался с результатами двух типов ПЦР. Интересно, что большая чувствительность ПЦР, по сравнению с посевом для выявления микст-инфекций, уже была замечена авторами других исследований [18].
Рис. 5. Исследование промывных вод бронхов пациента 5. А) Люминесцентная микроскопия с калькофлуором белым, Х400. Несептированный мицелий. Б) ПЦР-РВ «HRM-Zygo-
Asp». Кривая плавления ПЦР-продукта образца имеет характерные пики для R.arrhizus и R. nigricans в районе 84 °С и 81,5 °С и для аспергиллов - в районе 77 °С. В) ПЦР-РВ «Taq-Asp». Рост флуоресценции в образце свидетельствует о наличии в образце ДНК аспергилла. Пунктирные линии -положительные контроли
ВЫВОДЫ
Методы молекулярной диагностики, основанные на ПЦР-РВ и сиквенировании ДНК гриба непосредственно из клинического материала, обеспечивают не только важные дополнительные сведения, но могут быть единственным методом выявления возбудителя микоза легких. Методом разработанной нами «HRM-Zygo-Asp» ПЦР-РВ можно выявлять одновременно аспергиллы и зигомицеты, при этом идентифицируя зигомицеты до рода или вида. Она может оказаться очень полезной для обнаружения случаев смешанной инфекции. Для внедрения в клиническую практику представленных в работе моле-кулярно-генетических методов необходимо продолжить их тестирование на клиническом материале.
БЛАГОДАРНОСТИ
Выражаем благодарность сотрудникам НИЛ
молекулярно-генетической микробиологии Игнатьевой С.М. и Спиридоновой В.А. за выполнение теста на галактоманнановый антиген аспергиллов.
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Васильева Н.В., Климко Н.Н., Цинзерлинг В.А. Диагностика и лечение инвазивных микозов: современные рекомендации // Вестник СПб МАПО. - 2010. - Т. 2, №4. - С. 5-18.
2. Smith J.A., Kaufmann C.A. Pulmonary fungal infections // Respirology. - 2012. - Vol. 17. - P. 913-926.
3. Roden M.M., Zaoutis T.E., Buchanan W.L., et al. Epidemiology and outcome of zygomycosis: a review of 929 reported cases // Clin. Infect. Dis. - 2005. - Vol. 41, №5. - P. 634-653.
4. Walsh T.J., Gamaletsou M.N., Hayden R.T., Kontoyiannis P. Early clinical and laboratory diagnosis of invasive pulmonary, extrapulmonary, and disseminated mucormycosis (zygomycosis) // Clin. Infect. Dis. - 2012. - Vol. 54, №1. - P. S55-60.
5. Pfeiffer C.D., Fine J.P., Safdar N. Diagnosis of invasive aspergillosis using a galactomannan assay: a meta-analysis // Clin. Infect. Dis. - 2006. -Vol. 42. - P. 1417-1427.
6. de Pauw B., Walsh T.J., Donnelly J.P., et al. Revised definitions of invasive fungal disease from the European Organization for Research and Treatment of Cancer/Invasive Fungal Infections Cooperative Group and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycoses Study Group (EORTC/MSG) Consensus group // Clin. Infect. Dis. - 2008. - Vol. 46. -P. 1813-1821.
7. WengenackN.L., Binnicker M.J. Fungal molecular diagnostics // Clinics in Chest Medicine. - 2009. - Vol. 30. - P. 391-408.
8. Hata D.J., Buckwalter S.P., Pritt B.S., et al. Real-time PCR method for detection of Zygomycetes // J.of Clin. Microbiol. -2008. - Vol. 46, №7. - P. 2353-2358.
9. Hrncirova K., Lengerova M., Kosmanova I. et al. Rapid detection and identification of Mucormycetes from culture and tissue samples by use of High-Resolution Melt analysis // J. of Clin. Microbiology. - 2010. - Vol. 48, № 9. - P.3392-3394
10. CastelliM.V., Buitrago M.J., Bernal-Martinez L. et al. Development and validation of a quantitative PCR assay for diagnosis of scedosporiosis // J. Clin. Microbiol. - 2008. - Vol. 46. - P. 3412-3416.
11. White P. L., Linton C. J., Perry M. D., et al. Aspergillus PCR: One Step Closer to Standartization // J. of Clin. Microbiol. -2010. - Vol. 48, №4. - P.1231-1240.
12. Михайлова Ю.В., Чилина Г.А., Полищук А.Г. Молекулярная идентификация представителей Aspergillus spp. из Российской коллекции патогенных грибов по нуклеотидным последовательностям рДНК // Проблемы медицинской микологии. - 2012. - Т. 4. - С. 46-49.
13. White P.L., Bretagne S., Klingspor L., et al. The evolution and evaluation of whole blood polymerase chain reaction assay for the detection of invasive aspergillosis in hematology patients in a routine clinical setting // Clin. Infect. Dis. - 2006. - Vol. 42. - P.479-486.
14. Bialek R., Konrad F., Kern J., et al. PCR based identification and discrimination of agents of mucormycosis and aspergillosis in paraffin wax embedded tissue // J. of Clin. Pathol. - 2005. - Vol. 58, №11. - P. 1180-1184.
15. de Hoog G.S., Guarro J., Gene J., Figueras M.J. Atlas of Clinical Fungi. G.S. Elecronic version3.1. - CBS, The Netherlands. - 2011.
16. Gu Z., Hall T.A., Frinder M., et al. Evaluation of repetitive sequence PCR and PCR-mass spectrometry for the identification of clinically relevant Candida species // Medical Mycology. - 2012. - Vol. 20, №3. - P. 259-265.
17. Torelli R., Sanguinetti M., Moody A. et al. Diagnosis of invasive aspergillosis by a commercial real-time PCR assay for Aspergillus DNA in bronchoalveolar lavage fluid samples from high-risk patients compared to a galactomannan enzyme immunoassay // J. of Clin. Microbiol. - 2011. - Vol. 49, №12. - P. 4273-4278.
18. Richets V., Mousset S., Lambrecht E., et al. Comparison of histopathological analysis, culture, and polymerase chain reaction assays to detect invasive mold infections from biopsy specimens // Clin. Infect. Dis. - 2007. - Vol. 44. - P. 1078-1083.
19. Hope WW., Walsh T.J., Denning D.W. Laboratory diagnosis of invasive aspergillosis // The Lancet Infect. Dis. - 2005. -Vol. 5, №10. - P. 609-622.
20. Tuon F.F., Costa S.F. Rhodotorula infection. A systematic review of 128 cases from literature // Revista Iberoamericana de Micología. - 2008. - Vol. 25. - P. 135-14.
Поступила в редакцию журнала 16.10.2013
Рецензент:И.О. Сучкова
