CC BY
18УДК 582.282.123.4:611.24:599.323.4
ОСОБЕННОСТИ СТРОЕНИЯ ASPERGILLUS FUMIGATUS ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ АСПЕРГИЛЛЕЗЕ У МЫШЕЙ
Степанова А.А. (зав. лаб.)*, Васильева Н.В. (директор института, зав. кафедрой), Босак И.А. (с.н.с.), Авдеенко Ю.Л. (с.н.с.), Выборнова И.В. (н.с.), Десятик Е.А. (врач-миколог)
НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина, СевероЗападный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
© Коллектив авторов, 2016
Показано, что в опыте с гидрокортизоном степень развития гриба в легких мышей была низкой, наблюдали признаки, типичные для геморрагической пневмонии. Вокруг скоплений гиф гриба обнаружили хорошо выраженную воспалительную инфильтрацию. В эксперименте с циклофосфаном степень развития элементов гриба была довольно высокой. Однако признаки пневмонии и воспалительной реакции вокруг очагов некроза были слабо выражены. В первом случае из клеток иммунной системы доминировали нейтрофилы, во втором
- лимфоциты.
В экспериментах с гидрокортизоном отмечали двоякое влияние разных схем его введения на особенности микроморфологии, физиологии и ультраструктуру клеток гиф Aspergillus fumigatus. По толщине клеточной стенки клетки гиф сравниваемых вариантов не различались. Установили влияние разных концентраций конидий инокулюма на ширину гиф гриба. Зрелые клетки узких гиф синтезировали и аккумулировали умеренное количество темных глобул запасного белка, тогда как широких - крупные липидные включения. Внеклеточный матрикс в узких гифах был развит слабо, а в широких
- отсутствовал. Клетки гиф A. fumigatus на фоне гидрокортизона имели характерную искривленную форму, обусловленную слабым развитием снаружи клеточных стенок их внеклеточного матрикса. Другим морфологическим феноменом слабого развития внеклеточного матрикса в варианте с гидрокортизоном является формирование широких гиф. Наличие хорошо развитого внеклеточного матрикса усиливает адгезивные свойства гиф аспергилла, что важно для их активного координированного радиального роста в ткани легкого мышей. Гифы аспергилла при введении циклофосфана имели однотипную морфологию и ультраструктуру: они синтезировали умеренное количество запасных липидов и формировали хорошо развитый внеклеточный матрикс.
Результаты настоящей работы иллюстрируют наличие высокой пластичности морфологических и ультраструктурных особенностей изученного штамма A. fumigatus. Исключение составляют септы и поровый аппарат данного вида гриба.
Ключевые слова: Aspergillus fumigatus, гидрокортизон, клетки гиф, легкие мышей, световая и трансмиссионная электронная микроскопия, циклофосфан
THE STRUCTURAL PECULIARITY OF ASPERGILLUS FUMIGATUS DURING THE EXPERIMENTAL ASPERGILLOSIS IN THE MICE
Stepanova А.А. (head of the laboratory), Vasilyeva N.V. (director of the institute, head of the chair), Bosak I.A. (senior scientific collaborator), Avdeenko Y.L. (senior scientific collaborator), Vybornova I.V. (scientific collaborator), Desyatick E.A. (physician-mycologist)
* Контактное лицо: Степанова Амалия Аркадьевна, тел.: (812) 303-51-40
Kashkin Research Institute of Medical Mycology of NorthWestern State Medical University named after I.I. Mechnikov, St. Petersburg, Russia
© Collective of authors, 2016
It was shown that in variant with hydrocortisone, the level of fungal development in the murine lung of mice was low. We observed the signs typical of hemorrhagic pneumonia. Well-marked inflammatory infiltration was revealed around the fungal hyphal aggregations. In the variant with cyclophosphan the level of development of fungal elements was quite high. However symptoms of pneumonia and inflammatory reaction around the focuses of necrosis were feebly marked. In the first case neutrophils dominated in the cells of immune system, whereas lymphocytes - in the second case.
In the experiments with hydrocortisone dual influence of its different doses on the peculiarities of micromorphology, physiology and ultrastructure of A. fumigatus hyphal cells it was revealed. Regarding the thickness of the hyphal cell wall the compared variants didn't differ. Influence of different concentration of conidia of inoculum on width of fungal hyphae was revealed. Mature cells of narrow hyphae synthesized and accumulated moderate quantity of dark globules of storage protein whereas wide - large lipids inclusions. For the hyphal cells in variant with hydrocortisone was typical the curved form which determined by poor development outside of their cell wall of an extracellular matrix, whose presence in the normal state considerable strengthens the rigidity of the cell wall. Extracellular matrix in option with narrow hyphae has been developed poorly, and with wide was absent. Extracellular matrix in the narrow hyphae was poorly developed, whereas it was absent in wide once. We interpret the curved form of the hyphal cells which infected the murine lung tissue after injection of hydrocortisone by poor development outside of their cell walls of an extracellular matrix, whose presence in the normal state considerably strengthens the rigidity of the cell wall. Other morphological phenomenon of poor development of extracellular matrix in variants with a hydrocortisone was the formation of wide hyphal cells. The existence of well-developed extracellular matrix increased the adhesive properties of aspergillus hyphal cells which is important for their active coordinated radial growth in the murine lung tissue. In variants with a cyclophosphan hyphes of the A. fumigatus had the same morphology and ultrastructure: they synthesized moderate quantity of storage lipids and formed well developed extracellular matrix.
We have demonstrated the high plasticity of morphological and ultrastuctural features of the studied A. fumigatus strain except for septae and its pore apparatus.
Кеу words: Aspergillus fumigatus, hydrocortisone, hyphal cells, light-and transmission electron microscopy, murine lung, cyclophosphane
ВВЕДЕНИЕ
В научной литературе имеется небольшое число работ по экспериментальному моделированию аспергил-леза [1, Duong M., et al. // J. Infect. Des. - 1998. - Vol. 178] с целью изучения особенностей иммунного ответа на фоне иммуносупрессии. Основная цель настоящего исследования - сравнить с помощью методов световой и трансмиссионной электронной микроскопии особенности строения A. fumigatus, а также характера воспалительной реакции и изменений в ткани легкого мышей, инфицированных при введении им разных иммуносупрессоров - гидрокортизона и циклофосфа-на.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Штамм A. fumigatus РКПГБ-1384 был получен из Российской коллекции патогенных грибов НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина. Культура A. fumigatus была выделена из патологического материала пациента с инвазивным аспергиллезом легких. Для моделирования аспергиллеза на фоне иммуносу-прессии гидрокортизоном использовали метод, предложенный Duong М. [Duong M., et al. // J. Infect. Des. - 1998. - Vol. 178]. Заражение наркотизированных хлороформом животных проводили интраназально вве-
дением 50 мкл взвеси спор гриба в концентрации 1-104 и 1-10 7 КОЕ/мл. В качестве иммуносупрессоров были выбраны гидрокортизон и цитостатический препарат - циклофосфан. Экспериментальным животным (самцы линейных мышей Balb/C с массой тела 18-22 г) вну-трибрюшинно вводили гидрокортизон в дозе 2,56 мг в 0, 3, 4 и 5 дни эксперимента и циклофосфан в дозе 150 мг/кг соответственно в - 0, 4, 8 и 12 дни.
В экспериментах с гидрокортизоном животные, в соответствии с дозой конидий инокулюма, были разделены на следующие группы: 1 - 1 ■ 104 КОЕ/мл; 2 -
1-105 КОЕ/мл; 3 - 1-106 КОЕ/мл; 4 группа - 1-107 КОЕ/мл. В экспериментах с циклофосфаном концентрация конидий в инокулюме была постоянной -1-107 КОЕ/мл
Для проведения гистологических исследований кусочки легких мышей располагали в биопсийные кассеты и фиксировали 6 часов 10%-ым забуференным раствором формалина. Для описания характера воспалительной реакции, а также выявления и последующего описания элементов гриба срезы окрашивали гематоксилином-эозином (Г-Э) по методу Гомори-Грокотта. Препараты изучали и фотографировали в световом микроскопе Leica DM-4000B.
После проведения гистологических исследований и определения общей картины распространения инфекции, мы вторично использовали для трансмиссионной электронной микроскопии (ТЕМ) парафиновые блоки
2-ой (мыши №12, 16, 19), 3-ей (№4, 5, 6) и 4-ой групп (№3, 4, 5, 6, 7) в варианте с гидрокортизоном, а также мышей №14, 15, 23, 24 и 25 - в варианте с циклофосфа-ном. В ходе изучения световых препаратов определяли зону наибольшей концентрации гиф гриба, которую отмечали маркером на блоке и вырезали для после-дующией депарафинизации ксилолом, после чего образцы фиксировали 3 часа в 3% растворе глутарового альдегида по методике, описанной нами ранее [3, 4]. Ультратонкие срезы получали с помощью стеклянных ножей на ультратоме LKB-V, собирали на медные сетки и окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца. Ультратонкие срезы изучали в электронном микроскопе просвечивающего типа JEM 100 CX-2.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Гистологическая картина (окраска Г-Э и по Гомори-Грокотту) в легких мышей (контроль) была идентичной после введения гидрокортизона и циклофосфана. Элементы гриба и признаки воспаления в тканях легких мышей отсутствовали.
После введения гидрокортизона (окраска Г-Э) в тканях легких мышей 1-ой группы гистологически в 83% случаев (в 5-ти из 6-ти исследованных образцов) наблюдали обширную геморрагическую пневмонию (Табл. 1), бронхопневмонию с инфильтрацией многочисленными нейтрофилами (Рис. 1 а), лимфоцитами и макрофагами, с доминированием первых.
Таблица 1
Номера и группы животных, дата гибели после заражения, наличие элементов гриба, высева, пневмонии и воспалительной реакции в тканях легких мышей после введения гидрокортизона
№ животного Группы живот- Сутки гибели мышей после заражения Диаметр гиф гриба (мкм) Частота встречаемости гиф гриба в тканях Высев из ткани легкого мышей Наличие пневмонии в легких Наличие воспалительной реакции в легких мышей
ных легких мышей
мышеи
10 1 2 4,3 3 2900 + +
11 1 2 7,8 5 9000 + +
14 1 3 6,0 3 8000 + +
15 1 3 - 0 100 - -
17 1 3 3,7 4 8000 + +
18 1 5 3,0 1 10 + +
Средние значения: 4,96±1,94 2,67±1,9 4668±4146
7 2 2 5,8 2 13000 + +
8 2 2 5,5 2 4000 + +
9 2 2 5,6 2 6000 + +
12 2 2 7,4 4 2400 - +
16 2 3 7, 6 1 20 - +
19 2 5 7,9 4 20 + +
20 2 5 0 60 - -
21 2 5 - 0 2600 - +
22 2 5 5,1 1 2100 - +
Средние значения: 6,41±1,17 1,78±1,5 3356±4132
1 3 1 - 0 4000 - -
2 3 1 7,0 1 5000 + +
3 3 1 0 12000 + +
4 3 2 7,7 5 7000 - +
5 3 2 7,0 5 18000 + +
6 3 2 7,2 3 1000 + +
13 3 2 0 2400 + +
Средние значения: 7,2±0,33 2±2,3 7057±6002
1 4 1 3,9 2 100000 + +
2 4 1 4,1 3 120000 + +
3 4 1 4,3 3 - + +
4 4 1 4,6 3 49000 + +
5 4 1 4,8 2 38000 - +
6 4 1 4,6 2 14000 + +
7 4 1 4,4 2 53000 + +
8 4 1 0 - + +
9 4 2 4,2 2 13000 + +
10 4 3 4,3 2 1500000 + +
11 4 3 4,1 3 11000 + +
Средние значения: 4,33±0,28 2,18±0,9 210889± 484932
Примечание: 1 группа - 1104 КОЕ/мл; 2 группа - 1105 КОЕ/мл; 3 группа - 1106 КОЕ/мл; 4 группа - 1107 КоЕ/мл . Частота встречаемости гиф гриба: 0 - нет; 1 - редко в ткани легкого; 2 - мало в ткани легкого; 3 - умеренное в ткани легкого; 4 - много только в просвете бронхов; 5 - много в бронхах и мало в ткани легкого .
Часто отмечали картины прорастания гиф гриба через стенку бронха и картины грибкового бронхи-олита. В тканях легких мышей 1-ой группы (табл. 1, рис. 1 б) гифы гриба (окраска по методу Гомори-Гро-котта) были обнаружены в 5-ти из 6-ти исследованных образцов. Из 5-ти животных 1-ой группы с наличием микотической инфекции в легких только в одном случае (животное 17) наблюдали обильные скопления хаотично расположенных сильно ветвящихся гиф гриба в просвете бронхов (Рис. 1 ж). Во всех остальных случаях гифы грибов не формировали очагов радиального роста в тканях легких, встречались редко, располагались хаотично, одиночно или в небольших группах. Гифы гриба часто были сильно искривлены. Средние значения диаметра гиф данного варианта эксперимента составляли 4,96 мкм.
Рис. 1. Световая микроскопия фрагментов ткани легких мышей в варианте с гидрокортизоном (а, б). ж, з, л - 1-ая группа животных; м, в-е - 2-ая группа животных, к, л, м - 3-я группа животных, а, з - Г-Э, б, ж, к, л, м - Гомори-Грокотт. Ув.: а - д, р-o, р-т: x 400; e: x 500. Масштабные линейки: п, у, ф - 1 мкм, ж, з, x, ч, ш - 0, 2 мкм, к-м, к-м - 4 мкм, e, y - 3 мкм, ц - 1 мкм.
Рис. 2. Особенности тонкого строения гиф гриба и клеток иммунной системы в легких мышей после введения им гидрокортизона (а - г, и, д, к-м, н) и циклофосфана (г, о, е, и, р, у). Масштабные линейки: а, е, ж - и, к, л, о-р, у, т - 2 мкм, б, в, г, д -3 мкм.
При окраске Г-Э для мышей 2-й группы также было характерно венозное полнокровие. В 44% случаев (у 4-х животных из 9-ти) случаев имели место обширная геморрагическая пневмония (табл. 1, рис. 1 з), бронхопневмония с инфильтрацией многочисленными нейтрофилами, лимфоцитами и макрофагами, причем первые доминировали. Воспалительную реакцию наблюдали в легких 8-ми из 9-ти изученных животных. Часто отмечали прорастание гиф гриба через стенку бронха и картины грибкового бронхиолита (окраска по методу Гомори-Грокотта). В тканях легких мышей 2-ой группы (табл. 1) гифы гриба обнаружили у 7-ми из 9-ти исследованных животных. Только в 2-х случаях (мыши №12 и 19) гифы гриба были локализованы в просвете бронхов и сосудов (Рис. 1 д), тогда как во всех остальных случаях - еще и в тканях легких (Рис. 1 е). Несмотря на сходство в частоте встречаемости и морфологии гиф гриба данного варианта с предыдущим, значения их диаметра были значительно выше (в среднем, 6,41 мкм).
В 3-ей группе у 5-ти из 7-ми (71%) изученных животных имела место обширная геморрагическая пневмония (табл. 1), бронхопневмония с инфильтрацией многочисленными нейтрофилами, лимфоцитами и макрофагами. Нейтрофилы доминировали. При окраске Г-Э гистологические изменения в тканях легких были сходными с описанными с двумя предыдущими вариантами эксперимента. Воспалительную реакцию в легких мышей анализируемой группы выявили в 6-ти из 7-ми случаев (86%) (табл. 1). Элементы гриба наблюдали у 4-х из 7-ми исследованных животных. Несмотря на варьирование числа гиф гриба в тканях легких мышей, среднее значение диаметра гиф было выше (7,2 мкм, Рис. 1 к). Гифы имели высокий контраст (хорошо окрашивались по методу Гомори-Грокотта). В ткани легкого мышей картины радиального роста гиф гриба отсутствовали. Гифы располагались одиночно или в небольших группах, рыхло, хаотично либо параллельно относительно друг друга.
В тканях легких мышей 4-ой группы (окраска Г-Э) имело место венозное полнокровие. В 90% (у 10 из 11 исследованных животных) случаев отмечали обширную геморрагическую пневмонию (табл. 1) с инфильтрацией многочисленными нейтрофилами, лимфоцитами и макрофагами. Значительное число нейтрофи-лов в инфильтрате обнаружили в 9 из 11 изученных случаев. Довольно часто наблюдали картины инвазии гиф гриба через стенку бронха и картины грибкового бронхиолита. Только в одном случае (мышь №3) элементы гриба были микроскопически выявлены в ткани легкого, при этом высеять гриб не удалось. В ткани легких у 54% мышей элементы гриба встречали в малом количестве, тогда как у 36,3% животных число грибов оценивали как умеренное. При окраске по методу Гомори-Грокотта очаги радиального роста гриба отсутствовали. Гифы гриба, как правило, были расположены рыхло (Рис. 1 л), хаотично и довольно равномерно на площади среза легкого в области их локализации. Наблюдали одиночные или в небольших группах, короткие, сильно искривленные гифы; в основном, их обнаруживали в участках воспаления, а также внутри и вблизи бронхов. Часто наблюдали картины прорастания гиф гриба в сосуды и ткань легкого. Среднее значение диаметра гиф гриба - 4,33 мкм. Для
гиф гриба данного варианта было характерно слабое окрашивание по методу Гомори-Грокотта.
Мы выбрали для ТЕМ мышей 2-ой, 3-ей и 4-ой групп, в легких которых мы обнаружили гифы аспер-гилла, значительно различающиеся по диаметру. Частота встречаемости гиф гриба и особенности воспалительной реакции в этих вариантах были сходными.
В первом варианте (животные 4-ой группы) в ткани легких мышей встречали более узкие (4,3-4,8 мкм) гифы. В основном это были интактные клетки гиф. Гифы, как правило, были одиночные, короткие, сильно изогнутые (Рис. 1 п), с интерфазными ядрами, расположенными в центральной части клетки или вблизи клеточной стенки. Они были одиночными или попарно сближенными (Рис. 1 п), сферической (2,5 мкм) или эллипсоидной (2,0 х 2,5 мкм, Рис. 5 а) форм, слабо хро-матизированными, с одним крупным (0,5 мкм) эксцентричным плотным ядрышком неправильной формы. Вакуоли в молодых гифах - мелкие или средних размеров (Рис. 1 п, у), равномерно распределены по площади клетки, одиночные или в небольших группах, светлые; в более зрелых гифах - крупные, занимают весь просвет клетки (Рис. 1 ц). Митохондрии многочисленные, равномерно распределены по площади среза клетки, одиночные, округлой (0,2-0,3 мкм) или эллипсоидной (0,2-0,3 х 0,3-0,4, Рис. 1 п, ц) форм. Матрикс органелл - довольно плотный, с большим числом крист и небольшой светлой зоной. Компоненты эндомембранной системы не выявлены. В умеренном количестве запасные вещества наблюдали в форме темных белковых глобул варьирующего диаметра (Рис. 1 ч), расположенных в небольших группах (от 2 до 5) вблизи клеточной стенки. Клеточная стенка - тонкая (0,2 мкм, Рис. 1 ш), однослойная, светлая, окруженная тонким (0,2-0,3 мкм) электронно-плотным матриксом. Крайне редко наблюдали гифы на разных стадиях деструкции (Рис. 1 ф), без содержимого или с плотным зернистым содержимым, лишенным органелл. В описываемом варианте эксперимента клетки иммунной системы в виде многочисленных нейтрофилов, обычно расположенных в тесных группах, реже - одиночных, были локализованы вблизи гиф гриба (Рис. 1 ц, стрелка). Из атрибутов секреторной активности в содержимом нейтрофилов как исключение обнаружены микровакуоли (Рис. 2 в) и пузырьки с темным содержимым.
Во втором варианте (животные 2-ой и 3-ей групп) в тканях легких мышей отмечали более широкие гифы аспергилла (7,0-7,9 мкм). По размерам и строению ядер, а также других компонентов цитозоля, клетки этих гиф не отличались от описанных выше. В клетках зрелых гиф присутствовали крупные (0,5-0,6 мкм) липидные включения (Рис. 2 г) умеренной электронной плотности. По строению клеточных стенок зрелые клетки гиф были сходны с аналогичными вышеописанного варианта, однако, они не несли внеклеточный матрикс. Клетки иммунной системы встречались часто и были представлены нейтрофилами (Рис. 2 к), макрофагами (Рис. 2 л) и лимфоцитами (Рис. 2 м) без цитологических признаков функциональной активности. Картины контакта или поглощения гиф гриба клетками иммунной системы отсутствовали.
В варианте с циклофосфаном в тканях легких мышей при окраске Г-Э наблюдали множественные очаги деструкции в бронхах, бронхиолах и альвеолах (Рис.
1 с, т). Зоны некроза с участками геморрагической пневмонии обнаружили только в тканях легких двух животных (№24 и 25). Очаги бронхопневмонии с наличием нейтрофилов были выявлены только у одного животного (№27).
Отмечали преимущественно лимфоцитарно-ма-крофагальную инфильтрацию с единичными нейтро-филами. При окраске по методу Гомори-Грокотта очаги микотической инфекции непосредственно в ткани легкого отмечали в 8 из 18 изученных случаев. Они многочисленные (от 6 до 16 на срезе, составляющие от 25 до 50% площади среза легкого), варьирующего диаметра (Рис. 1 н, о), чаще всего, крупные, округлой формы, с элементами радиального роста гиф аспергилла. Только у одного животного (№21) гифы гриба были сконцентрированы, в основном, в просвете бронхов, тогда как в ткани легкого они формировали редкие и мелкие очаги радиального роста. Морфометрические особенности и микроморфология гиф гриба анализируемого варианта (табл. 2) были сходны с выше приведенными для варианта с гидрокортизоном. Гифы в тканях легких мышей в данном опыте отчетливо окрашивались по Гомори-Грокотту и хорошо импрегнировались серебром (Рис. 1 н, о, р).
Таблица 2
Номера и группы животных, дата гибели после заражения, наличие элементов гриба, высевы, пневмонии и воспалительные реакции в тканях легких мышей после
введения циклос юсфана
№ животного Сутки гибели животного после заражения Диаметр гиф гриба (мкм) Частота встречаемости гиф гриба в тканях легких мышей Наличие высева из легких мышей Наличие пневмонии в легких мышей Наличие воспалительной реакции в легких мышей
12 2 5,0 5 19000 - -
13 3 4,9 5 25000 - -
14 3 4,7 5 900000 - -
15 4 4,9 5 30000 - -
16 4 - - - -
17 4 - - - - -
18 4 - - - - -
19 4 4,6 5 23000 - -
20 4 - 10000 - -
21 4 4,8 5 17000 - -
22 5 5,1 5 8000 - -
23 5 4,8 5 7000 - -
24 6 4,7 5 2900 + -
25 9 4,6 5 2600 + -
26 9 - 2600 - -
27 9 - - - -
28 9 - - 80 - -
29 9 - - 100 - -
Средние значения 4,81 5±0 74806± 23771,3
Примечание . Концентрация конидий 1-107 КОЕ/мл . Частота встречаемости гиф гриба: 0 - нет; 1 - редко в ткани легкого; 2 -мало в ткани легкого; 3 - умеренное в ткани легкого; 4 - много только в просвете бронхов; 5 - много в бронхах и мало в ткани легкого .
При электронно-микроскопическом изучении тканей легкого мышей (№ 14, 15, 23, 24, 25) в данном опыте были выявлены обильные скопления гиф гриба (Рис. 2 о, с), по их периферии обнаруживали концевые, апикально растущие сегменты гиф, для которых характерно наличие плотного цитозоля, митохондрий и многочисленных свободных рибосом. Вакуоли - редкие, мелкие, сосредоточенные у септ или вблизи скоплений митохондрий и небольшого числа ядер. Клеточные стенки - тонкие (0,15 мкм), однослойные,
светлые, со слаборазвитым наружным внеклеточным матриксом. За апикальными сегментами гиф расположены слабо вакуолизированные (Рис. 2 о), а за ними
- сильно вакуолизированные клетки (Рис. 1 с). В составе септального порового аппарата наблюдали мелкие темные тельца Воронина (Рис. 2 т), в зрелых клетках гиф - запасные вещества в виде скоплений светлых ли-пидных капель (0,2-0,3 мкм, Рис. 2 т). В таких клетках гиф клеточные стенки были тонкими (0,2 мкм, рис. 2 т), однослойными, светлыми. Внеклеточный матрикс -хорошо развит, в 5-6 раз толще клеточной стенки. Из клеток иммунной системы в зонах скопления гиф грибов наиболее часто отмечали лимфоциты (Рис. 2 п, р), реже - одиночные или в группах макрофаги (Рис. 2 y). Клетки иммунной системы не содержали гиф гриба и не находились с ними в контакте.
Выявленное в световом микроскопе обилие клеток иммунной системы в легких мышей после введения им гидрокортизона не коррелировало с признаками их внутренней (активизация секреторных процессов) и внешней (поглощение элементов гриба) активности. Совершенно неожиданным был тот факт, что при видимой «количественной» активности клеток иммунной системы они не принимали участия в элиминации гиф патогенного гриба. Только в опыте с гидрокортизоном, где гриб формировал более узкие гифы, мы отмечали частые контакты клеток иммунной системы (лимфоцитов и нейтрофилов) с гифами гриба. Важным наблюдением в настоящем исследовании был тот факт, что введение мышам обоих иммуносупрессоров оказывало ингибирующее действие на количество и активность макрофагов, являющихся важными клетками иммунной системы, подавляющими развитие аспергилла в ткани хозяина.
В данной работе выявлены четкие различия в морфологии (топография, частота встречаемости гиф, их форма и средние значения диаметра) тканевых форм гриба одного вида и штамма аспергилла (A. fumigatus) на фоне введения мышам гидрокортизона и циклофос-фана. Средние значения диаметров гиф гриба в тканях легких мышей первой группы при введении гидрокортизона и циклофосфана были минимальными, что соответствовало таковым, характерным для этого вида гриба в условиях культуры [2]. Средние значения диаметров гиф гриба у части 2-ой и всей 3-ей групп животных после введения конидий A. fumigatus в количестве 1-105 КОЕ/мл и 1-106 КОЕ/мл были максимальными. Это являлется показателем высокой пластичности гиф аспергилла и, в целом, мицелия гриба.
Проведенными исследованиями подтверждена общеизвестная [1; Duong M., et al. // J. Infect. Des. - 1998.
- Vol. 178; Елинов Н.П., Громова Э.Г. Современные лекарственные препараты, 2000] роль клеток иммунной системы хозяина в развитии инвазивной формы аспергиллеза. Наличие в тканях легких мышей хорошо выраженной во всех вариантах эксперимента воспалительной реакции коррелировало со слабым развитием гиф гриба, имеющих морфологические признаки угнетенного состояния, тогда как отсутствие воспалительной реакции в варианте с циклофосфаном, создавало позитивный фон для активного развития микотиче-ской инфекции. Несмотря на то, что в опыте с гидрокортизоном воспалительную реакцию тканей легких мышей представляли всевозможные клетки иммунной
системы, среди них доминировали нейтрофилы. В то же время в эксперименте с циклофосфаном клетки иммунной системы наблюдали в меньшем количестве, и они были представлены, в основном, лимфоцитами. В целом, согласно полученным данным, циклофосфан, по сравнению с гидрокортизоном, оказывал более выраженное супрессивное действие на клетки иммунной системы. Результаты проведенных исследований согласуются с мнением Ва11оу V. с соавторами [1] в том, что степень и характер воспалительной реакции со стороны тканей хозяина играют значительную роль в патогенезе инвазивного аспергиллеза.
Установили, что при инфицировании иммуносу-прессированных мышей в очагах воспаления появлялись клетки иммунной системы, количество и состав которых зависели от типа иммуносупрессора. Методами электронной микроскопии выявили отсутствие в таких клетках секреторной активности и картин поглощения гиф гриба.
Таким образом, гидрокортизон и циклофосфан оказывают существенное противоположное влияние и на ультраструктуру гиф клеток гиф A. fumigatus. В то же время нам удалось выявить влияние разных концентраций конидий инокулюма на тонкое строение клеток гриба, что пока трудно объяснить. Агрессивное влияние гидрокортизона на распространение грибной инфекции вызывало и угнетающее действие на развитие внеклеточного матрикса на поверхности зрелых гиф гриба. Напротив, на фоне циклофосфана бурное развитие грибной инфекции сопровождалось
формированием снаружи гиф хорошо развитого внеклеточного матрикса. Отметим, что внеклеточный ма-трикс начинает закладываться и формироваться уже с момента прорастания конидий A. fumigatus [3]. Его наличие характерно для культуральных [Степанова А.А. и др. // Пробл. мед. микологии. - 2004. - Т.6, №3] и тканевых форм этого вида гриба [4-5]. В тканях легких мышей и человека внеклеточный матрикс обычно достигает максимального развития, что связано с его протективной функцией. Интересен тот факт, что при хорошо выраженной воспалительной реакции (данные световой микроскопии) в опыте с гидрокортизоном взаимодействия между клетками иммунной системы и гифами аспергилла были выражены исключительно в форме межклеточных контактов.
В результате настоящей работы установили существенные различия между особенностями макро- и микроморфологии клеток гиф изученного вида и штамма патогенного гриба A. fumigatus при введении мышам разных иммуносупрессоров - гидрокортизона и циклофосфана.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведенными исследованиями показана высокая пластичность морфологических и ультраструктурных особенностей строения клеток гиф изученного штамма A. fumigatus, за исключением септ и порового аппарата, под влиянием гидрокортизона и циклофосфана, которые вызывали совершенно противоположное действие на эти признаки.
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Balloy V., Huerre M., Latge J.P., Chignard M. Differences in patterns of infection and inflammation for corticosteroid treatment and chemotherapy in experimental invasive pulmonary aspergillosis // Infect. Immunol. - 2005. - Vol. 73, №1 - P. 1-15.
2. Степанова А.А., Васильева Н.В., Борзова Ю.В. и др. Электронно-микроскопическое изучение аспергиллеза легких человека на примере архивного материала// Пробл. мед. микологии. - 2014. - Vol. 16, №3. - С. 70-79.
3. Stepanova A.A., Sinitskaya I.A. Cytological investigations of Aspergillus fumigatus Fres. germinating conidia // Пробл. мед. микологии. - 2012. - Т. 14, №2. - С. 43-53.
4. Степанова А.А., Босак И.А., Синицкая И.А. Цитологическое исследование Aspergillus fumigatus Fres. в легких мышей // Пробл. мед. микологии. - 2013. - Т. 15, №1. - С. 52-58.
5. Stepanova А.А., Vasilyeva N.V., Zhang F., et al. Electron-microscopic investigations of invasive aspergillosis, caused with Aspergillus fumigatus // Пробл. мед. микологии. - 2015. - Т. 17, №3 - С. 38-41.
Поступила в редакцию журнала:25.11.2016
Рецензент: Н.П. Елинов
