CC BY
47
фузионное отношение составило Ул /Q = 1. Уменьшение толщины стенки альвеолы в результате лечения, когда эта толщина в 1,2 раза больше, чем для здоровых легких, приводит к результатам, представленным на рис. 1, ^(кривая 4) для покоя (при физической нагрузке повторяет кривую 2, накладываясь на нее). При выполнении физической нагрузки пациентом частота/= 35 дыханий в минуту, объем вдоха VT = 0,5 л воздуха. Напряжение кислорода в артериальной крови составило 86 мм рт. ст. в состоянии покоя и 85 мм рт. ст. при нагрузке , что примерно соответствуют данным таблицы (5-я и 6-я строки соответственно).
Как и в первом случае, программные расчеты показали, при каких параметрах, характеризующих легкие, обеспечивается данное состояние больного. Выявлены возможные причины: нарушение диффузионной способности легких вследствие увеличения толщины мембраны и недостаточного увеличения площади поверхности газообмена при нагрузке. В данном случае при незапущенной болезни лечение привело к нормализации состояния пациента в условиях
СПИСОК }
1. Хрущенко, A.A. Математическое моделирование газообмена в легких человека |Текст| / A.A. Хрущенко, K.M. Арефьев//Деп. В ВИНИТИ 01.06.06.— 2006 -№ 739- 20 с.
2. Хрущенко, A.A. Моделирование нестационарного газообмена в легких человека |Текст|/A.A. Хрущенко // Научно-технические ведомости СПбГПУ,-2006,- №6-1 (48).- С. 183—188.
3. Гриппи. М.А. Патофизиология легких |Текст|: Пер с англ. / М.А. Гриппи.— М.: Бином, 2008.— 325 с.
4. Вейбель, Э.Р. Морфометрия легких человека |Текст|: Пер с англ. / Э.Р. Вейбель.— М.: Медицина, 1970,- 176 с.
выполнения физической нагрузки. Улучшения же свойств мембраны, соответствующей полностью здоровому легкому, не произошло.
Таким образом, подобный анализ позволяет при задании входных параметров (измеряются в результате обследования человека) получать изменения давления кислорода в альвеолах и его напряжение в артериальной крови. Изменяя в некоторых пределах величины, характеризующие респираторную систему, мы имеем возможность сопоставить результаты расчетов с измерениями до и после лечения. Результаты могут быть значительно уточнены, если проводить их анализ совместно с пульмонологом в процессе лечения пациента. Моделирование является достаточно простым с вычислительной стороны, и поэтому может использоваться при обучении студентов, так как позволят в главных чертах получить наглядные результаты течения болезни и лечения. В дальнейшем предполагается использовать не только модель усредненного легкого, но и более сложные модели.
5. Самойлов В.О. Медицинская биофизика |Текст| : Учебник для вузов / В.О. Самойлов.— СПб.: СпецЛит, 2004,- 496 с. "
6. Бреелав, И.С. Паттерны дыхания: Физиология, экстремальные состояния, патология |Текст| / И.С. Бреелав,- Л.: Наука, 1984,- 206 с.
7. Баранов, В.И. Коэффициент диффузии кислорода в мышечном волокне и факторы, на него влияющие |Текст| / В.И. Баранов, В.М. Беличенко, C.B. Новосельцев, К.А. Шошенко // Физиология мышечной деятельности: Тез. докл. междунар. конф. Москва, 21 — 24 ноября 2000 г.- М.: Физкультура, образование и наука, 2000,- С. 25-26.
УДК 577.32
А.И. Сулацкая
ОСОБЕННОСТИ ВЗАИМОДЕИСТВИЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО КРАСИТЕЛЯ ТИОФЛАВИНА Т С АМИЛОИДНЫМИ ФИБРИЛЛАМИ
Амилоидные фибриллы — особое компактное состояние белка, которому отвечает глубокий минимум свободной энергии, обусловленный межмолекулярными взаимодействиями макромолекул
белка, обогащенных р-структурами. Первоначально амилоидные фибриллы были обнаружены во внеклеточных депозитах при ряде тяжелых заболеваний человека и животных (болезни Альц-
геймера и Паркинсона, диабет второго рода, при-онные заболевания и т. п.), связанных с нарушением фолдинга белков [1].
Исследования последних лет показали, что при определенных условиях и другие белки, никак не связанные с возникновением болезней (а возможно, что все белки), могут образовывать амилоидоподобные фибриллы. Причем несмотря на большое разнообразие амилоидогенных белков, различающихся по массе и структуре, архитектура всех амилоидных и амилоидоподоб-ных фибрилл оказалась сходной. Они представляют собой образования диаметром 10—20 нм и длиной до 1000 нм, состоящие из протофиб-рилл, в которых р-слои ориентированы перпендикулярно оси волокна [2]. В связи с этим долгое время считалось, что структура амилоидных фибрилл, полученных на основе разных белков, полностью идентична. Однако исследования последних лет, в ходе которых была расшифрована структура нескольких амилоидоподобных фибрилл с высоким разрешением, показали различия в их структуре.
Поскольку фибриллярное состояние белков является одним из основных термодинамически стабильных состояний белковой молекулы, изучение структуры амилоидных фибрилл имеет существенное значение для понимания фундаментальных основ фолдинга и организации белков. Разработка фундаментальной проблемы фолдинга белков имеет и большое практическое значение для медицины в связи с необходимостью выяснения причин так называемых «конформа-ционных болезней», сопровождающихся образованием амилоидных фибрилл.
Для диагностики возникновения амилоидных фибрилл in vivo и in vitro широко и эффек-
Рис. 1. Структура молекулы красителя ТЬТ: 1 — бензтиазольное кольцо, 2— аминобензольное кольцо, 3 — диметиламиногруппа;
N. Б — атомы азота и серы, соответственно; Ф1 V — углы вращения фрагментов красителя друг относительно друга
тивно используется бензтиазольный краситель тиофлавин Т (ТЬТ) (рис. 1).
Этот факт обусловлен тем, что связывание ТЬТ с амилоидными фибриллами сопровождается существенным возрастанием квантового выхода его флуоресценции (нередко в тысячи раз), тогда как свободный краситель в водном растворе имеет очень низкий квантовый выход (по нашим данным — порядка Ю-4). Причем это взаимодействие очень специфично: краситель не взаимодействует с глобулярными белками в нативном состоянии (за исключением ацетилхолинэстеразы и сывороточных альбуминов), с белками в развернутом и промежуточных частично-свернутых состояниях, а также с аморфными агрегатами белков [3]. В связи с этим первоначально флуоресценция красителя использовалась как тест на возникновение амилоидных фибрилл при ряде тяжких заболеваний. Настоящая работа направлена на расширение среды применения красителя, так как особенности взаимодействия ТЬТ с амилоидными фибриллами можно использовать не только для диагностики их возникновения, но и для изучения их структуры. Для решения задачи необходимо выяснить, в какой форме ТЬТ взаимодействует с фибриллами, а также определить спектральные свойства связанного красителя и параметры связывания ТЬТ с амилоидными фибриллами.
Модель встраивания красителя в амилоидные фибриллы
Существуют различные модели встраивания ТЬТ в амилоидные фибриллы. В ранних работах, посвященных изучению спектральных свойств ТЬТ, было показано, что спектры возбуждения флуоресценции, а также флуоресценции красителя, инкорпорированного в амилоидные фибриллы, существенно сдвинуты в длинноволновую сторону по сравнению с аналогичными спектрами для свободного красителя в водном растворе. В связи с этим рядом авторов были выдвинуты предположения о том, что флуоресценция красителя ТЬТ (длинноволновый сдвиг ее спектров и возрастание ее квантового выхода), инкорпорированного в амилоидные фибриллы, обусловлена димерами [4], эксимерами [5] или даже мицеллами [6] молекул красителя. Измерение оптических спектров поглощения и интенсивности флуоресценции красителя в широком диапазоне его концентраций, а также времен
жизни возбужденного состояния позволили экспериментально показать необоснованность гипотез об образовании димеров, эксимеров и мицелл красителя ТЬТ (рис. 2, а, б).
Нужно заметить, что спектр возбуждения флуоресценции красителя, инкорпорированного в амилоидные фибриллы, спектрально совпадает с длинноволновой полосой спектра поглощения, как это и должно быть. Поэтому специального объяснения требует не длинноволновое положение спектров возбуждения флуоресценции и спектров флуоресценции ТЬТ в фибриллах, а коротковолновые спектры возбуждения флуоресценции и флуоресценции ТЬТ в водном растворе. Мы полагаем, что существование этих спектров обусловлено наличием в растворе молекул красителя с нарушенной системой л-сопряженых связей бензтиазольного и аминобензольного колец.
Измерение квантового выхода q в широком диапазоне температур Ти вязкости растворителя -л (рис. 2, в) подтвердило выдвинутое ранее предположение о том, что увеличение квантово-
го выхода флуоресценции красителя при его встраивании красителя в амилоидные фибриллы обусловлено ограничением торсионных колебаний бензтиазольного и аминобензольного колец друг относительно друга. Наряду с торсионными колебаниями фрагментов молекулы ТНТ друг относительно друга существует по крайней мере еще одна причина безызлучательной дезактивации возбужденного состояния красителя, приводящая к тому, что даже в условиях твердого раствора, не допускающего существование крутильных колебаний колец друг относительно друга, квантовый выход этого красителя существенно меньше единицы. На наш взгляд, причиной этого может быть неплоскостность молекулы ТНТ в основном состоянии, обусловленная наличием массивной метальной группы в положении N5 бензтиазольного кольца.
На основе вышеизложенного можно заключить, что наши представления о встраивании красителя в фибриллы хорошо согласуются с моделью, предложенной Кребсом [2], согласно
77т|, К-(сП) 1
Рис. 2. Обоснование модели встраивания красителя ТЬТ в амилоидные фибриллы; а — спектры поглощения ТИТ в воде для разных концентраций красителя: от 10 6 до 10 4 М (кривые I — 5); б — зависимость интенсивности флуоресценции ТИТ от концентрации красителя; в — зависимость квантового выхода флуоресценции ТИТ от температуры и вязкости растворителя (на вставке показан участок зависимости, соответствующий низким температурам и высокой вязкости растворителя)
которой ТНТ в мономерной форме встраивается в бороздки, образованные боковыми цепями аминокислот, ориентированные вдоль оси волокна амилоидных фибрилл перпендикулярно р-листам.
Определение спектральных свойств связанного красителя и параметров его связывания с амилоидными фибриллами
В литературе можно найти около десятка работ, в которых предпринимались попытки определения стехиометрии и констант связывания ТЬТ с амилоидными фибриллами. В большинстве из них использовался подход, основанный на измерении зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации красителя и (или) амилоидных фибрилл. Однако этот метод в принципе не может давать информацию о концентрации свободного и связанного с фибриллами ТЬТ, а значит, он не может быть использован для определения параметров связывания красителя с амилоидными фибриллами. Для этих целей мы предлагаем подход, основанный на использовании метода абсорбционной спектрофотометрии растворов, полученных с помощью метода равновесного микродиализа. Удивительно, что этот метод, который был разработан для определения стехиометрии связывания красителей с рецепторами, никогда не использовался для определения параметров связывания ТЬТ или его аналогов с амилоидными фибриллами. Использование этого подхода позволило нам впервые определить спектр поглощения ТЬТ, инкорпорированного в амилоидные фибриллы на основе инсулина. Фибриллы получали путем инкубации раствора инсулина в 20 % уксусной кислоте в присутствии 100 мМ №<31 {рН = 2,0) при температуре 37 "С и интенсивном перемешивании в течение 24 часов [7]. На рис. 3, а показан спектр поглощения ТЬТ, инкорпорированного в амилоидные фибриллы (концентрация белка, из которого они были получены, Ср— 0,4 мг/мл), а также спектр поглощения свободного красителя в концентрации Ср равной концентрации Сь связанного красителя.
Полученные данные свидетельствуют о том, что встраивание красителя в фибриллы сопровождается длинноволновым сдвигом спектра поглощения и возрастанием коэффициента молярной экстинкции. Коротковолновое положение спектра поглощения свободного ТЬТ в вод-
ном растворе есть проявление существенного ориентационного диполь-дипольного взаимодействия молекул красителя с молекулами полярного растворителя в основном состоянии.
Предложенный нами подход для каждого эксперимента по микродиализу позволил определить концентрацию (^свободного и концентрацию Сь связанного с фибриллами красителя. Для того, чтобы получить наглядное представление о количестве мод связывания красителя с фибриллами, экспериментальные результаты были представлены в координатах Скетчарда (рис. 3, б). Нелинейность полученной зависимости свидетельствует о существовании двух или более мод связывания /с различными значениями констант связывания Кы и числа мест я,- связывания (в то время как ее линейность могла бы свидетельствовать об идентичности центров связывания и существовании одной моды). Величины констант связывания и числа мест связывания, адекватно описывающие экспериментальные данные, были определены с использованием уравнения
ж—г П;СпС г
еь=х р 1,
I Км + С/
где Кси = 1/Кы — константа диссоциации в предположении существования двух мод связывания методом множественной нелинейной регрессии.
Полученные значения КЬ1, КЬ2, л, и «2приведены в подписи к рис. 3, б.
Таким образом, разработка специальной методики, позволяющей получать информацию о стехиометрии связывания красителя ТЬТ с амилоидными фибриллами, а также о спектральных свойствах и характеристиках связанного красителя, — это важный шаг на пути изучения амилоидных фибрилл и сравнения их структуры. Исследование структуры белков в состоянии амилоидных фибрилл может дать важнейшую информацию для выяснения факторов, способствующих их образованию. Кроме того, изучение взаимодействия ТЬТ с амилоидными фибриллами может рассматриваться как перспективный подход для создания биосенсорных систем для ранней диагностики заболеваний; последние проявляются амилоидозами различного рода. Разработка методов раннего выявления таких заболеваний — чрезвычайно актуальная задача, поскольку в настоящее время диагноз заболевания удается поставить, когда его течение уже необратимо.
Рис. 3. Встраивание красителя ТЬТ в амилоидные фибриллы; спектры поглощения свободного (/) и связанного с фибриллами (2) красителя (С,- = Сь)\ б- зависимость Скетчарда: А'ы = 2,0-Ю7 М Км = 1,2-105 М п{ = 0,01; и2 = 0,08
Необходимо отметить, что предлагаемый подход универсален — он может быть использован для нейтральных аналогов красителя ТЬТ, которые могут проникать через гематоэнцефаличе-ский барьер, что может найти свое применение в диагностике и терапии нейродегенеративных заболеваний. Кроме того, этот метод может быть использован для анализа взаимодействия хими-
ческих веществ (в том числе нефлуоресцирую-щих), которые способны подавлять процесс образования амилоидных фибрилл.
Работа выполнена при финансовой поддержке Программы РАН «Молекулярная и клеточная биология». Фонда Дмитрия Зимина «Династия» и Российского фонда фундаментальных исследований (проект 10-04-90038-Бел.).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Carrell, R. Conformational changes and disease-serpins, prions and Alzheimer's |Text| / R. Carrell, B.Gooptu // Curr. Opin. Struct. Biol.- 1998,- Vol. 8,- P. 799-809.
2. Krebs, M. The binding of thioflavin-T to amyloid fibrils: localisation and implications [Text] / M. Krebs, E. Bromley, A. Donald // J. Struct. Biol.— 2005.— Vol. 149,- P. 30-37.
3. Turoverov, K. ThT as an instrument for testing and investigation of amyloid and amyloid-like fibrils | Text | / K. Turoverov, 1. Kuznetsova, A. Maskevich |et al.| // Proc. of SP1E.- 2007,- P. 6733.
4. Schirra, R. Dye aggregation in freezing aqueous
solutions I Text I / R. Schirra // Chem. Phys. Letters.— 1985,- Vol. 119,- P. 229-238.
5. Raj, C. g-Cyclodextrin inducted intermoleculareximer formation of thioflavin T |Text| / C. Raj, R. Ramaraj // Chem. Phys. Letters.- 1997,- Vol. 273,- P. 285-290.
6. Khurana, R. Mechanism of thioflavin T binding to amyloid fibrils [Text] / R. Khurana, C. Coleman, C. lonescu-Zanetti |et al.j // J. Struct. Biol.— 2005.— Vol. 151,- P. 229-238.
7. Goers, J. Conformational prerequisites for alpha-lactalbumin fibrillation [Text] / J. Goers, S.E. Permyakov, E.A. Permyakov |et al.| // Biochemistry.— 2002,- Vol. 41,- P. 12546-12551.
УДК 541.(64+1 83.12)
М.А. Захарова, И.В. Полякова, А.Р. Грошикова,
O.A. Писарев, Е.Ф.Панарин
МОЛЕКУЛЯРНОЕ УЗНАВАНИЕ ГЛЮКОЗЫ ИСКУССТВЕННЫМИ РЕЦЕПТОРАМИ ИМПРИНТИРОВАННОЙ
ПОЛИМЕРНОЙ СЕТКИ
Молекулярный импринтинг — это метод со- к целевому веществу, которые способны имити-здания сорбционных материалов со свойствами ровать аффинное связывание, характерное для искусственных высокоспецифичных рецепторов природных компонентов, таких как фермент-
