CC BY
28
ФИЗИКА МОЛЕКУЛ
УДК 57.086.2
Г.Е. Побегалов, А.Н. Арсениев , А.Д. Ведяйкин, М.Л. Соколова, Я.В. Федорова, А.В. Сабанцев
ИЗМЕНЕНИЕ МЕХАНИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МОЛЕКУЛЫ ДНК ПРИ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С ИНТЕРКАЛИРУЮЩИМ КРАСИТЕЛЕМ YOYO-1
G.E. Pobegalov, A.N. Arseniev, A.D. Vedyaykin, M.L. Sokolova, Ya.V. Fedorova, A.V. Sabantsev
St. Petersburg State Polytechnical University, 29 Politekhnicheskaya St., St. Petersburg, 195251, Russia
CHANGING OF DNA MOLECULE MECHANICAL PROPERTIES DURING INTERACTION WITH YOYO-1 INTERCALATING DYE
Предложена методика регистрации динамики изменения длины одиночной молекулы ДНК в ходе взаимодействия с лигандом. Данная методика опробована для случая взаимодействия молекулы ДНК с интеркалирующим красителем YOYO-1. Получены экспериментальные данные, свидетельствующие об изменении длины и механических свойств молекулы ДНК при взаимодействии с красителем.
Предложенная методика может быть рекомендована для исследования взаимодействия одиночной молекулы ДНК с различными лигандами, такими как красители и ДНК-связывающие белки, а также для исследования других биополимеров, в том числе амилоидных фибрилл.
ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ. ОПТИЧЕСКИЙ ЗАХВАТ. УСТАНОВКА «ЛАЗЕРНЫЙ ПИНЦЕТ». ДНК. YOYO-1. ИНТЕРКАЛЯЦИЯ.
The method for registration of a single DNA molecule length change during interaction with a ligand is proposed. The method is tested in the case of DNA molecule interaction with intercalating YOYO-1 dye. The experimental data obtained signifies both DNA elongation and mechanical properties alteration upon YOYO-1 binding.
The proposed method can be used to study single DNA molecule interaction with different ligands, including dyes and DNA-binding proteins. Also this method can be used to study other biopolymers, including amyloid fibrils.
FLUORESCENCE MICROSCOPY. OPTICAL TRAPPING. LASER TWEEZERS SET-UP. DNA. YOYO-1. INTERCALATION.
Интеркалирующий краситель УОУО-1 применяется в различных методах, требующих визуализации ДНК; таких например, как гель-электрофорез, проточная цитометрия, создание геномных карт [1]. Тот же краситель широко используется при исследовании структурных изменений ДНК в ходе различных клеточных про-
цессов [2] и для построения изображений ДНК субдифракционного разрешения [3]. УОУО-1 представляет собой гомодимер оксазола желтого (УО)—красителя нуклеиновых кислот, имеющий химическую формулу 1,1'-(4,4,7,7-тетраметил-4,7-диазаундекаметилен)-бис-4-[3-метил-2,3-дигидро-(бензо-1,3-оксазол)-2-метилиден]-
хинолиниум тетраиодид) [4]. УОУО-1 обладает высокой афинностью к нуклеиновым кислотам с константой связывания порядка 1010 — 1012 л/моль [2]. Квантовый выход флуоресценции УОУО-1 возрастает более, чем в 1000 раз при взаимодействии с ДНК за счет снижения вероятности безызлучательной релаксации возбужденных молекул [4] и, как следствие, увеличения соотношения сигнал/шум при наблюдении флуоресценции.
При помощи одномолекулярных методов оптического пинцета [5 — 9], магнитного пинцета [10] и атомно-силовой микроскопии [11] было показано, что при связывании ДНК с УОУО-1 контурная длина ДНК увеличивается в среднем на 30 %. Особый интерес представляет кинетика связывания УОУО-1 с ДНК при различных условиях. В работе [12] была предпринята попытка исследовать динамику этого процесса при помощи флуоресцентной микроскопии посредством регистрации изображений молекул ДНК, закрепленных одним концом за поверхность покровного стекла и выпрямляемых потоком жидкости в ходе окрашивания красителем УОУО-1. Однако качество результатов, получаемых таким методом, оставляет желать лучшего в связи с тем, что невелика точность определения длины молекулы ДНК по ее флуоресцентному изображению. Кроме того, в таком эксперименте невозможно определить длину молекулы до окрашивания, а фотообесцвечивание красителя и фотоиндуцированные разрывы ДНК накладывают на процесс наблюдения существенные ограничения.
В данной работе предлагается метод регистрации изменения длины одиночной молекулы ДНК при взаимодействии с различными лигандами, лишенный указанных недостатков.
Предлагаемый метод сочетает оптический захват, флуоресцентную микроскопию и систему микрофлюидных ламинарных потоков. Эксперимент проводится в четырехканальной проточной камере, внутри которой путем перемещения оптических ловушек между различными потоками осуществляется захват микросфер, покрытых стрептавидином, закрепление на них единичной молекулы ДНК посредством взаимодействия биотин-стрептавидин, а также осуществляется быстрая смена внешних условий инкубации ДНК.
Такая конфигурация позволяет измерять зависимость длины ДНК от приложенной силы в различных условиях, а также регистрировать динамику изменения этой длины в ходе взаимодействия с лигандом при постоянной приложенной силе. Для этого одна из микросфер удерживается в ловушке, а вторая отпускается, после чего вся конструкция (молекула ДНК, растянутая между двумя микросферами) перемещается в канал, содержащий лиганд. Анализ серии изображений такой конструкции, растягиваемой потоком жидкости с постоянной силой, позволяет зарегистрировать изменение длины молекулы ДНК в ходе взаимодействия с лигандом. Работоспособность предлагаемой методики продемонстрирована на примере взаимодействия молекулы ДНК бактериофага X с красителем УОУО-1.
Материалы и методы
Экспериментальная установка с двойной оптической ловушкой. Схема экспериментальной установки, частично описанная ранее [3], представлена на рис. 1. Установка с двойной
Рис. 1. Оптическая схема установки с двойной оптической ловушкой: 1, 6 — двухлинзовые телескопы; 2 — полуволновая пластинка; 3, 5 — поляризационные светоделительные кубы; 4 — пьезо-зеркало; 7— дихроическое зеркало; 8 — объектив микроскопа; 9 — пьезостолик; 10 — конденсор; 11, 15 — линзы; 12 — галоге-новая лампа; 13 — тубусная линза; 14— инфракрасный фильтр; 16 — ксеноновая лампа; 17 — набор фильтров для регистрации флуоресценции; 18 — ПЗС-камера; 19 — лазер
оптической ловушкой создана на базе инфракрасного лазера 19 (Spectra-Physics BL-106C, рабочая длина волны — 1064 нм, максимальная мощность — 5 Вт, работа в непрерывном режиме). Диаметр лазерного луча увеличивается при помощи расширителя пучка 1 (Melles Griot CWBX-7.0-2X). Луч, падая на поляризационный светоделительный куб 3, разделяется на две ортогональные составляющие, одна из которых модулируется при помощи пьезозеркала 4 (Physik Instrumente S-334 FSM). При помощи второго поляризационного куба 5 лучи сводятся вместе и, отражаясь от дихроического зеркала 7, заводятся в объектив микроскопа 8. При создании оптической ловушки диаметр лазерного пучка на входе в объектив должен быть слегка меньше входного зрачка объектива для оптимального использования мощности лазерного излучения [13]. В экспериментах с оптическими ловушками используется масляный иммерсионный объектив с числовой апертурой 1,46 («Plan-Apochromat» 100x/1.46 Oil DIC) производства фирмы Carl Zeiss. Проходя через объектив, оба луча фокусируются, образуя две оптические ловушки. Задняя фокальная плоскость объектива сопряжена с поверхностью пьезозеркала за счет установки телескопа 6, составленного из двух линз в 4/-конфигурации. Это позволяет изменять положение одной ловушки в фокальной плоскости объектива при повороте пьезозеркала. Поворотом полуволновой пластины 2 осуществляется настройка распределения оптической мощности между двумя ловушками.
Для регистрации изображений используется охлаждаемая ПЗС-камера 18 (Photometries Cascade II 1024). С целью предотвращения попадания в камеру отраженных лучей лазера на входе камеры установлен ИК фильтр 14. Для возбуждения молекул флуоресцентного красителя YOYO-1 образец облучается ксеноновой лампой 16. Для регистрации флуоресценции используется стандартный набор фильтров 17 (Filter Set 10) фирмы Carl Zeiss .
Система ламинарных потоков в четырехка-нальной проточной камере. Четырехканальная проточная камера представляет собой микро-флуидное устройство с четырьмя входными каналами шириной 1 мм, сходящимися в общий канал шириной 4 мм. Каналы формиру-
ются в слое двухстороннего скотча (толщина 110 мкм), заключенном между предметным и покровным стеклами микроскопа. К входным каналам при помощи прозрачного эпоксидного клея (POXIPOL) герметично крепятся полиэтиленовые трубки Warner Instruments PE-10 (внутренний диаметр 280 мкм). К общему каналу крепится трубка Warner Instruments PE-10 (внутренний диаметр 500 мкм), через которую отводится жидкость.
К входным трубкам подсоединяются пластиковые шприцы BD MicroFine U-100 объемом 300 мкл, поршни которых предварительно смазываются глицерином для обеспечения плавности хода. Равномерная подача жидкостей в каналы камеры и регулировка скорости потока осуществляются при помощи шприцево-го насоса Harvard Apparatus Pump 11 Pico Plus, модернизированного для крепления четырех шприцев.
Подготовка микросфер. В эксперименте с молекулами ДНК используются микросферы из полистирола диаметром 3 мкм, покрытые стрептавидином (CP01N, Bangs Laboratories). Перед использованием микросферы разводятся до концентрации 0,1 мг/л в буфере Tris-HCl (pH = 8,2) 50 ммоль/л и дважды промываются посредством центрифугирования (11400g, 5 мин) и ресуспендирования осадка в том же буфере.
Приготовление ДНК-субстрата. Двунитевая ДНК бактериофага X (New England Biolabs) модифицируется биотином с обоих концов путем лигации с двумя биотинилированными олиго-нуклеотидами, комплиментарными «липким» концам ДНК бактериофага X, согласно следующему протоколу:
1. 81 мкл Tris-Hcl 10 мМ (pH = 7,5) смешивается с 6,75 мкл раствора ДНК бактериофага X (0,3 мг/мл) и с 0,45 мкл 150 мкМ раствора 3'-биотинилированных олигонуклеотидов
(5'-AGGTCGCCGCCC-Biotin),
фосфорилированных с 5'-конца, и 1,8 мкл 5М раствора NaCl.
2. Раствор инкубируется в термошейкере при 75 °C в течение 20 мин для расплавления замкнутых «липких» концов ДНК бактериофага X.
3. В течение 2 ч температура постепенно снижается до комнатной для отжига олигону-клеотидов.
4. Олигонуклеотиды лигируются с ДНК бактериофага X путем добавления 10 мкл 10x T4 ДНК лигазного буфера (10 мМ АТФ, 100 мМ DTT, 100 мМ MgCl2, 500 мМ Tris-Hcl (pH = 7,5) и 0,4 мкл T4 ДНК-лигазы (Fermentas Life Science).
5. Реакционная смесь инкубируется при комнатной температуре в течение одного часа.
6. Реакционная смесь инкубируется при 65 °C в течение 10 мин для инактивации T4 ДНК-лигазы.
7. Избыточные олигонуклеотиды и АТФ выводятся из раствора путем фильтрации через спин-колонку MicroSpin S-400 HR, GE Healthcare (центрифугирование 850g, 5 мин).
8. К раствору добавляется 0,5 мкл 100 мкМ раствора 3'-биотинилированных олигонуклео-тидов
(5'-GGGCGGCGACCT-Biotin),
фосфорилированных с 5'-конца, 0,4 мкл T4 ли-газы (1000 ед.) и 10 мкл 10x T4 ДНК лигазного буфера.
9. Реакционная смесь инкубируется при комнатной температуре в течение одного часа.
10. Реакционная смесь инкубируется при 65 °C в течение 10 мин для инактивации T4 ДНК-лигазы.
11. Избыточные олигонуклеотиды и АТФ выводятся из раствора путем фильтрации через спин-колонку MicroSpin S-400 HR, GE Healthcare (центрифугирование 850g, 5 мин).
Протокол эксперимента. Непосредственно перед проведением эксперимента внутренняя поверхность камеры и трубок подвергается очистке путем последовательного вмывания в каждый канал 100 мкл этанола, 300 мкл дистиллированной воды и 200 мкл 15%-го раствора сахарозы в Tris-Hd 50 мМ (pH = 8,2).
В ходе эксперимента в каждом канале формируется ламинарный поток, скорость которого поддерживается на уровне порядка 100 мкм/c. В данных условиях объединение потоков в общем канале приводит к их незначительному смешению [14]. Путем сдвига пьезостолика может осуществляться быстрое перемещение между потоками объектов, удерживаемых в оптических ловушках.
Во всех каналах присутствует SM-буфер (Tris-Hd 50 мМ, pH = 8,2, MgCl2 1 мМ, 2-мер-каптоэтиламин 100 мМ). Помимо него в первом
канале содержатся микросферы (0,01%), во втором — 25 пМ биотинилированных молекул ДНК и 200 нМ УОУО-1, в третьем - 10 мМ М£С12, в четвертом - 50 нМ УОУО-1.
Схема проведения эксперимента в четы-рехканальной проточной камере представлена на рис. 2. Эксперимент состоит из следующих этапов:
в первом канале происходит оптический захват двух микросфер;
сдвигом пьезостолика микросферы переносятся во второй канал для прикрепления к одной из микросфер молекулы ДНК, окрашенной УОУО-1 за счет биотин-стрептавидинового взаимодействия. Прикрепление молекулы ДНК фиксируется посредством наблюдения ее изображения во флуоресцентном режиме;
микросферы переносятся в третий канал, где путем перемещения подвижной ловушки свободный конец ДНК прикрепляется ко второй микросфере;
в течение 2 — 3 мин осуществляется обесцвечивание ДНК (вымывание УОУО-1) в силу наличия в третьем канале 10 мМ М£С12;
ДНК растягивается путем увеличения расстояния между микросферами с шагом 10 нм и средней скоростью 50 нм/с. На каждом шаге с помощью ПЗС-камеры фиксируется изображение микросфер в режиме дифференциального интерференционного контраста;
стационарная ловушка выключается путем перекрывания соответствующего пучка света, в результате чего одна микросфера удерживается подвижной ловушкой, а вторая растягивает ДНК за счет гидродинамической силы, действующей на микросферу со стороны потока;
микросферы с закрепленной ДНК переносятся в четвертый канал, содержащий 50 нМ УОУО-1. За счет постоянства скорости потока обеспечивается постоянство силы растяжения ДНК. Удлинение ДНК приводит к увеличению расстояния между микросферами. Динамика удлинения регистрируется с помощью ПЗС-камеры;
после завершения процесса удлинения ДНК стационарная ловушка снова включается и осуществляется растягивание ДНК между ловушками с шагом 10 нм и средней скоростью 50 нм/с.
Рис. 2. Схема проведения эксперимента в четырехканальной проточной камере: 1 — захват двух микросфер; 2 — закрепление ДНК на одной из микросфер; 3 — прикрепление свободного конца ДНК ко второй микросфере, обесцвечивание ДНК; 4 — инкубация в 50 нМ растворе УОУО-1
Обработка экспериментальных данных.
Указанные данные обрабатывались при помощи программного пакета с открытым кодом ImageJ [15] (сборка Fiji [16]). Для определения положения микросфер по их изображениям в режиме дифференциального интерференционного контраста использовался специально созданный плагин для ImageJ, осуществляющий определение максимума нормированной кросс-корреляции изображения с шаблоном. В качестве шаблона при исследовании динамики встраивания YOYO-1 в молекулу ДНК выбирались изображения микросфер в первый момент времени. При построении зависимости силы растяжения от длины ДНК в качестве шаблона использовалась предварительно полученная
серия изображений микросферы, закрепленной на поверхности стекла, при различном ее положении относительно фокуса микроскопа. Такой подход позволяет определять положение объекта с точностью до 1 пикселя (в данном случае до 135 нм). Для дальнейшего уточнения положения микросферы использовалась нелинейная регрессия нормированной кросс-корреляции при помощи двумерной функции Гаусса.
Результаты и их обсуждение
Длина молекулы ДНК бактериофага X составляет 16,4 мкм (48500 пар оснований) [7]. Длина ДНК увеличилась на 37 % и составила 22,6 мкм при инкубации в 50 нМ растворе УОУО-1. При этом стандартное отклонение ин-
а)
23-
22-
X
Е 21-1
и
Я 194
Я
^ 184
17
50 1 00 1 50 200 250 300
б)
30-
20-
«10-с;
О -
о-
Время, с
1
«г
11
13
15
17
19
21
23
25
Длина ДНК. мкм
Рис. 3. Результаты применения предлагаемого метода: а — динамика удлинения молекулы ДНК в присутствии 50 нМ красителя УОУО-1; б — зависимости силы растяжения ДНК от ее длины до (1) и после (2) встраивания молекул красителя
дивидуальных измерений длины ДНК составило 27 нм. На рис. 3,а приведена зависимость длины молекулы ДНК от времени в присутствии УОУО-1. В начальный момент регистрации молекула ДНК уже является удлиненной. Данный факт указывает на то, что встраивание УОУО-1 начинается мгновенно при внесении ДНК в четвертый канал. Перемещение молекулы ДНК в середину канала, где осуществляется наблюдение, занимает примерно 20 с. За это время длина молекулы ДНК успевает увеличиться на 1,1 мкм (6,7 %). В течение 150 с длина ДНК линейно возрастает, после чего процесс интеркаляции УОУО-1 в ДНК выходит на насыщение и длина ДНК остается постоянной. Линейная регрессия первого участка зависимости позволила определить скорость удлинения молекулы ДНК за счет интеркаляции; она составила 44 ± 4 нм/с. На рис. 3,б приведена зависимость силы рас-
тяжения молекулы ДНК от ее длины до и после встраивания YOYO-1. В присутствии 50 нМ YOYO-1 данная зависимость существенно отличается от случая неокрашенной молекулы ДНК. Помимо очевидного удлинения ДНК следует отметить увеличение наклона кривой, что свидетельствует об изменении механических свойств ДНК при связывании с YOYO-1.
Предложен новый метод регистрации динамики изменения длины одиночной молекулы ДНК, основанный на использовании системы микрофлуидных ламинарных потоков в комбинации с методами оптической ловушки и флуоресцентной микроскопии. Этот метод позволил успешно охарактеризовать процесс связывания красителя YOYO-1 с молекулой ДНК бактериофага X. Было зарегистрировано увеличение длины молекулы ДНК в присутствии YOYO -1 на 37 %, так что измеренная длина комплекса ДНК-YOYO-l составила 22,6 мкм. Кроме того, была измерена зависимость длины молекулы ДНК от времени в присутствии 50 нМ красителя YOYO-1. При этом погрешность индивидуальных измерений длины молекулы ДНК составила менее 30 нм. Установлено, что присутствие в растворе красителя YOYO-1 в концентрации 50 нМ приводит к линейному росту длины молекулы ДНК со скоростью 44 ± 4 нм/с, при этом равновестное состояние комплекса ДНК -YOYO-1 достигается за 150 с.
Проведенные эксперименты продемонстрировали работоспособность предложенного метода. Есть все основания полагать, что данный метод может найти широкое применение при исследовании процессов взаимодействия молекул ДНК с различными лигандами, в том числе красителями, ДНК-связывающими белками и другими веществами. Кроме того, представляется возможным использование этого метода для исследования других биологических полимеров, в том числе представляющих большой практический интерес амилоидных фибрилл. Данные о влиянии различных агентов на механические свойства амилоидных фибрилл могут оказаться чрезвычайно ценными для терапии нейродегенеративных заболеваний.
Работа проведена с использованием уникальной установки «Лазерный пинцет» при финансовой поддержке Минобрнауки России (ГК № 16.518.11.7045), РФФИ (гранты №12-04-31536 и №12-04-32060) и Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере «УМНИК».
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Nyberg, L.K. A single-step competitive binding assay for mapping of single DNA molecules [Text] / L.K. Nyberg, F. Persson, J. Berg [et al.] // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 2012.- Vol. 417.- Iss. 1.-P. 404 - 408.
2. Wong, M. Oxazole yellow homodimer YOYO-1-labeled DNA: a fluorescent complex that can be used to assess structural changes in DNA following formation and cellular delivery of cationic lipid DNA complexes [Text] / M. Wong, S. Kong, W.H. Dragowska, M.B. Bally // Biochim. Biophys. Acta.- 2001.- Vol. 1527.- Iss. 1-2.-P. 61 - 72.
3. Сабанцев, А.В. Модернизация флуоресцентного микроскопа для исследования биологических структур с субдифракционным разрешением [Текст] / А.В. Сабанцев, Г.Е. Побегалов, С.В. Мурашов, А.С. Мельников, М.А. Ходорковский // Научно-технические ведомости СПбГПУ. Физико-математические науки.- 2012.- № 2 (146).- С. 94 - 99.
4. Rye, H.S. Stable fluorescent complexes of double-stranded DNA with bis-intercalating asymmetric cyanine dyes: Properties and applications / H.S. Rye, S. Yue, D.E. Wemmer [et al.] // Nucleic Acids Res.- 1992.-Vol. 20.- Iss. 11.- P. 2803 - 2812.
5. Ashkin, A. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles [Text] / A. Ashkin, J.M. Dziedzic, J.E. Bjorkholm, S. Chu // Opt. Lett.-1986.- Vol. 11.- Iss. 5.- P. 288.
6. Bennink, M. Single-molecule manipulation of double-stranded DNA using optical tweezers: interaction studies of DNA with RecA and YOYO-1 [Text] / M.L. Bennink, O.D. Scharer, R. Kanaar, [et al.] // Cytometry. -1999.- Vol. 36.- Iss. 3.- P. 200 - 208.
7. Murade, C.U. Interaction of oxazole yellow dyes with DNA studied with hybrid optical tweezers and fluorescence microscopy [Text] / C.U. Murade, V. Subramaniam, C. Otto, M.L. Bennink // Biophys. J.-2009.- Vol. 97.- Iss. 3.- P. 835 - 843.
8. Paik, D.H. Dynamics and multiple stable binding modes of DNA intercalators revealed by single-molecule force spectroscopy [Text] / D.H. Paik, T.T. Perkins // Angew. Chem. Int. Ed. Engl.- 2012.- Vol. 51.- Iss. 8.-P. 1811 -1815.
9. Sischka, A. Molecular mechanisms and kinetics between DNA and DNA binding ligands [Text] / A. Sischka, K. Toensing, R. Eckel [et al.] // Biophys. J.-2005.- Vol. 88.- Iss. 1.- P. 404 - 411.
10. Gunther, K. Mechanical and structural properties of YOYO-1 complexed DNA [Text] / K. Gunther, M. Mertig, R. Seidel // Nucleic Acids Res.- 2010.- Vol. 38.- Iss. 19.- P. 6526 - 6532.
11. Eckel, R. Identification of binding mechanisms in single molecule-DNA complexes [Text] / R. Eckel, R. Ros, A. Ros [et al.] // Biophys. J.- 2003.- Vol. 85.-Iss. 3.- P. 1968 - 1973.
12. Reuter, M. The kinetics of YOYO-1 intercalation into single molecules of double-stranded DNA [Text] / M. Reuter, D.T. Dryden // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 2010.- Vol. 403.- Iss. 2.- P. 225 - 229.
13. Mahamdeh, M. Under-filling trapping objectives optimizes the use of the available laser power in optical tweezers [Text] / M. Mahamdeh, C.P. Campos, E. Schaffer. // Opt. Express.- 2011.- Vol. 19.- Iss. 12.-P. 11759 - 11768.
14. Brewer, L.R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions [Text] / L.R. Brewer, P.R. Bianco // Nat. Methods.- 2008.-Vol. 5.- Iss. 6.- P. 517 - 525.
15. Schneider, C.A. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis [Text] / C.A. Schneider, W.S. Rasband, K.W. Eliceiri // Nat. Methods.- 2012.- Vol. 9.- Iss. 7.-P. 671 - 675.
16. Schindelin, J. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis [Text] / J. Schindelin, I. Arganda-Carreras, E. Frise [et al.] // Nat. Methods.-2012.- Vol. 9. - Iss. 7.- P. 676 - 682.
ПОБЕГАЛОВ Георгий Евгеньевич — аспирант кафедры биофизики Санкт-Петербургского государственного политехнического университета.
195251, г. Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29 lwdrums@gmail.com
АРСЕНИЕВ Анатолий Николаевич — инженер НОЦ«Нанобиотехнологии» Санкт-Петербургского государственного политехнического университета.
195251, г. Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29 arsenievanatoly@gmail.com
ВЕДЯЙКИН Алексей Дмитриевич — студент радиофизического факультета Санкт-Петербургского государственного политехнического университета.
195251, г. Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29 god-fish@mail.ru
СОКОЛОВА Мария Леонидовна — студентка физико-механического факультета Санкт-Петербургского государственного политехнического университета.
195251, г. Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29 arimiora@gmail.com
ФЕДОРОВА Яна Витальевна — студентка физико-механического факультета Санкт-Петербургского государственного политехнического университета.
195251, г. Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29 kedrovka126@rambler.ru
САБАНЦЕВ Антон Владимирович — аспирант кафедры биофизики Санкт-Петербургского государственного политехнического университета.
195251, г. Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29 sabantsev.a.v@gmail.com
© Санкт-Петербургский государственный политехнический университет, 2013
