CC BY
72
БИОМАРКЕРЫ В КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ
Аннотация. Рассмотрено применение флуоресцентных зондов с чувствительным к микровязкости свечением -флуоресцентных молекулярных роторов - в микроскопии и диагностике. Сделан обзор работ лаборатории молекулярной спектроскопии и оптики наноструктур Гродненского госуниверситета им. Я. Купалы по установлению механизма увеличения интенсивности свечения тиофлавина Ти его производных при встраивании в амилоидные фибриллы белков и при изменении вязкости микроокружения. Ключевые слова: флуоресцентные молекулярные роторы, тиофлавин Т, TICT, микровязкость, амилоидные фибриллы.
ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ
СЕНСОРЫ
МИКРОВЯЗКОСТИ
НА ОСНОВЕ
МОЛЕКУЛЯРНЫХ
РОТОРОВ
Виталий Степуро,
ведущий научный сотрудник физико-технического факультета Гродненского государственного университета им. Я. Купалы, кандидат физико-математических наук, доцент
Светлана Гоголева,
аспирант физико-технического факультета Гродненского государственного университета им. Я. Купалы
Александр Маскевич,
заведующий кафедрой общей физики физико-технического факультета Гродненского государственного университета им. Я. Купалы, доктор физико-математических наук, доцент
Флуоресцентная микроскопия широко применяется в биологии и медицине благодаря чувствительности данного метода, высокому пространственному разрешению, простоте использования и малой инвазивности, что позволяет проводить исследования на живых клетках и в некоторых случаях in vivo. Она произвела революцию, предоставив арсенал средств для изучения динамики биологических процессов на клеточном уровне. Появилась возможность визуализировать как внутриклеточные структуры, так и одиночные белковые молекулы, получать информацию о свойствах клетки, например о рН, вязкости микроокружения, мембранном потенциале; о локализации и количестве изучаемых молекулярных
объектов (например, белков), следить за динамикой химических реакций [1, 2]. В связи с тем, что у большинства биологически важных молекул отсутствуют хромофорные группы, которые позволили бы их визуализировать и идентифицировать по флуоресцентному сигналу, необходимо применение внешних экзогенных флуорофоров (органических красителей, флуоресцентных белков, полупроводниковых нанокристал-лов и др.) [1].
Флуоресцентные метки и зонды на основе малых органических молекул широко используются для контрастирования и визуализации тканей и внутриклеточных объектов, в качестве сенсоров свойств локального микроокружения и присутствия специфических объектов-мишеней в клетках, поскольку обладают малыми размерами, необходимыми
:194) | Апрель 2019 | НАУКА И ИННОВАЦИИ 13
и
9-дициановинил-юлолидин (DCVJ)
К ®,Н
* С
JI
1J о
и*
сн,
Аурамин О
Lllj
ЯЪ
s' uij
Тиофлавин Т (ThT)
Г? F
BODIPY производные
сн, Сн, N
СКз
H
1
СН,
Кристаллический фиолетовый
Производные стильбена
Рис. 1. Химические структуры некоторых флуоресцентных молекулярных роторов
хорошими флуоресцентными свойствами и фотостабильностью, позволяют проводить исследования без предварительной генетической модификации изучаемых объектов, в отличие от методик, основанных на использовании флуоресцентных белков [1, 2].
Разработка флуоресцентных зондов - флуоресцентных молекул, способных значительно менять свои излучательные свойства (интенсивность свечения, положение спектра возбуждения/флуоресценции и др.) в ответ на изменение параметров микроокружения или при селективном взаимодействии/ связывании с биологическими молекулами-мишенями, является динамично развивающейся областью исследований. Предложено большое количество флуоресцентных зондов, принцип действия и чувствительность которых основаны на использовании индуктивно-резонансного Ферстеровского переноса энергии (FRET), фотоинду-цированного переноса электрона и протона, сольватохромизма (зависимости положения спектра и интенсивности свечения от полярности микроокружения), спи-роциклизации и др.
Особый интерес в качестве зондов микроокружения представляют органические красители, получившие название флуоресцентных молекулярных роторов (ФМР). Их свойства сильно зависят от вязкости микроокружения вследствие сопряжения структурных перестроек в возбужденном электронном состоянии данных органических красителей (цис-транс изомеризация, внутримолекулярные повороты и изгибы, и т.д.) с эффективным процессом безызлу-чательной дезактивации. Подобные свойства характерны для ди-и трифенилметановых красителей
(аурамин О, кристаллический фиолетовый), производных BODIPY, стильбена, DCVJ, диметилами-нобензонитрила, тиофлавина Т (ThT), цианиновых красителей и др. (рис. 1) [3-5].
ФМР предложены в качестве сенсоров для измерения вязкости (в том числе внутри живых клеток и в клеточных мембранах), мониторинга полимеризации, детектирования амилоидных фибрилл белков и ДНК, как зонд для изучения бимолекулярных взаимодействий (в частности, белок-пептид) [6]. С использованием молекулярных роторов на основе порфири-на показано существенное изменение вязкости в живых клетках, подвергнутых фотодинамической терапии, перед их гибелью [7]. Для некоторых молекул этого класса установлен механизм влияния микровязкости на флуоресцентные свойства, заключающийся, например, для тиофлавина Т (ThT) в сопряжении безызлучательно-го процесса внутримолекулярного переноса заряда и взаимного поворота фрагментов молекулы (twisted intramolecular charge transfer, TICT) [3-5].
Интерес к исследованию фотофизических свойств ThT определен широким использованием данного флуоресцентного зонда (рис. 1) для обнаружения амилоидных фибрилл [8] - нерастворимых упорядоченных агрегатов белков (рис. 2) - появление которых и накопление в организме сопряжено с рядом нейродегене-ративных заболеваний (болезнь Альцгеймера, Паркинсона, катаракта и др.) [9, 10].
Молекула ThT является очень удобной в качестве контрастного агента для обнаружения амилоидных фибрилл, поскольку его квантовый выход увеличивается
http://innosfera.by
в
БИОМАРКЕРЫ В КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ
Рлпгтгип-пнто^л*
vr! ш
^Лл,
| С|М91№)||1»фН
3
Рис. 2. Схема образования и структура амилоидных фибрилл
А - схема образования амилоидных фибрилл [9]
(а - нативный белок, Ь - белок в форме расплавленной глобулы, с -денатурированный белок, й - внутрибелковая ассоциация фрагментов с р-складчатой структурой, е - межбелковая ассоциация с образованием амилоидных фибрилл;
Б - бета-амилоидный пептид ДЬеГа (1-42) в составе амилоидных фибрилл. Трехмерная структура визуализирована на основе файла 2ЫД0.рй Ь из банка данных белковых структур Ю РОВ. Отдельные пептиды указаны разным цветом
на ~3 порядка величины при встраивании в фибриллы [3], а свечение свободного зонда либо ThT, связанного с нативными или денатурированными белками, - слабоинтенсивно и оказывает малое влияние на результаты.
Вследствие этих фотофизических свойств ThT предоставляется возможность быстрой и надежной диагностики присутствия амилоидных фибрилл в патологически измененных тканях и органах. Более того, при проведении исследований in vitro появление специфической флуоресценции ThT рассматривается как свидетельство образования амилоидных фибрилл. Данный подход получил широкое распространение, и число научных исследований, основывающихся на диагностике фибриллообразования с помощью ThT, стремительно растет.
Исследователи Гродненского государственного университета им. Я. Купалы в сотрудничестве с учеными БГУ, Института физики НАН Беларуси, Университета гражданской защиты МЧС Республики Беларусь, Института цитологии РАН показали, что
фотофизические свойства ThT хорошо описываются с использованием модели флуоресцентного молекулярного ротора [4, 5]. В соответствии с ней (рис. 3) существуют два главных канала дезактивации возбужденного состояния ThT: 1 -излучательный переход из локально-возбужденного (LE) состояния, отвечающий за флуоресценцию с константой скорости Г, 2 - безыз-лучательный переход, сопряженный с процессом внутримолекулярного переноса заряда TICT c константой скорости kLE-TICT.
TICT-процесс включает внутреннее вращение бензтиазольно-го (BTZ) фрагмента относительно диметиланилинового (DMA) цикла (рис. 3), и его скорость определяется вязкостью микроокружения ThT (рис. 4). В невязких средах скорость TICT-процесса намного выше, чем константа скорости из-лучательного перехода, и фотовозбужденный ThT дезактивируется главным образом посредством безызлучательного пути, что приводит к низкому квантовому выходу флуоресценции.
Однако для ThT в высоковязких средах или при встраивании
в амилоидные фибриллы скорость внутреннего поворота значительно снижается, и излучательный переход становится главным каналом дезактивации возбужденного состояния, что и объясняет значительное увеличение интенсивности флуоресценции ThT.
В содружестве с исследователями из БГУ (Луговский А. А., Воро-пай Е. С.), Института физики НАН Беларуси (Тихомиров С. А., Буга-нов О. В.) и сотрудниками индийского университета Шив-Надар (Шарма Б. К., Госвами М.), помимо фундаментальных исследований, направленных на выяснение влияния структуры красителей на динамику фотоиндуциро-ванного переноса заряда в ФМР,
LE<S,)
ей
_ л
и
чС
ист (s;)
■С
Рис. 3. Структура ThT и модель дезактивации возбужденного состояния
A - пространственная модель катиона Th T. Атомы S, C, и N показаны желтым, голубым, и синим цветами соответственно; Б - схема дезактивации возбужденного состояния ThT, где иллюстрируется внутримолекулярный перенос заряда, сопровождаемый торсионным вращением фрагментов молекулы и приводящий к нефлуоресцирующему TICT-состоянию
Источник: [5] © American Chemical Society, получено официальное разрешение на цитирование
Рис. 4. Зависимость квантового выхода флуоресценции Ф бензотиазоловых красителей ThT (А) и 6-Me-BTA-2C (В) от отношения (вязкость/ температура) в полярных растворителях. Источник:
[11] © American Chemical Society,
[12] © Elsevier; получено официальное разрешение на цитирование
проводится разработка новых флуоресцентных зондов на основе ШТ и иных соединений, чувствительных к вязкости микроокружения и присутствию амилоидных фибрилл. С помощью молекулярного моделирования отбираются наиболее перспективные производные для последующего химического синтеза.
Получены и охарактеризованы новые зонды для детекции амилоидных фибрилл, позволяющие проводить измерения при низких значениях рН [12], а также с улучшенными спектральными свойствами (в красном и ближнем ИК-диапазоне спектра в области «окна прозрачности» тканей) [13].
Производится синтез ФМР с внедренными линкерными группами для обеспечения возможности ковалентной привязки к объектам-мишеням, что позволит изучать белок-лигандные взаимодействия [14] в фиксированных и в живых клетках, а также для получения ратиометриче-ских сенсоров.
Совместно с учеными Международного государственного экологического института им. Сахарова БГУ разрабатываются методы контроля агрегации препаратов инсулина с использованием ^ Т.
Ведутся работы по созданию устройств и систем для проведения оптических измерений
с ультрамалыми количествами образцов с использованием ФМР. Необходимо отметить, что зачастую это является нетривиальной задачей и требует адаптации либо разработки специальных методов. С этой точки зрения подходы, основанные на использовании флуоресцентных репортерных меток либо зондов, представляются многообещающими вследствие высокой их чувствительности и возможности проведения измерений в объемах вплоть до пико- и фемтолитров. Они могут найти применение при создании устройств микрофлуидики [15] и систем ЬаЬ-ои-а-сЫр (лаборатория на чипе).
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
1. GiepmansB. N. [et al.] The fluorescent toolbox for assessing protein location and function / B. N. Glepmans [et al.] // Science. 2006. Vol. 312, N5771. P. 217-224.
2. Terai T., Nagano T. Fluorescent probes for bioimaging applications / T. Terai, T. Nagano // Curr. Opin. Chem. Biol. 2008. Vol. 12, N5. P. 515-521.
3. Amdursky N., Erez Y., Huppert D.. Molecular rotors: what lies behind the high sensitivity of the thioflavin-T fluorescent marker / N. Amdursky,Y. Erez, D. Huppert // Acc. Chem. Res. 2012. Vol. 45, N9. P. 1548-1557.
4. StsiapuraV.I. [et al.] Thioflavin T as a Molecular Rotor: Fluorescent Properties of Thioflavin T in Solvents with Different Viscosity / V. I. Stsiapura [et al.] // J. Phys. Chem. B. 2008. Vol. 112, N49. P. 15893-15902.
5. StsiapuraV. I. [et al.] Charge transfer process determines ultrafast excited state deactivation of thioflavin T in low-viscosity solvents / V. I. Stsiapura [et al.] // J. Phys Chem A. 2010. Aug 19. Vol. 114, N32. P. 8345-8350.
6. Goh W. L. [et al.] Molecular rotors as conditionally fluorescent labels for rapid detection of biomolecular interactions / Goh W. L. [et al.] // JACS. 2014. Vol. 136, N17. P. 6159-6162.
7. Kuimova M. K. [et al.] Imaging intracellular viscosity of a single cell during photoinduced cell death / Kuimova M. K. [et al.] // Nature Chemistry. 2009. Vol. 1, N1. P. 69-73.
8. Wolfe L. S. [et al.] Protein-induced photophysical changes to the amyloid indicator dye thioflavin T / Wolfe L. S. [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. Vol. 107, N39. P. 16863-16868.
9. Selkoe. D. J. Folding proteins in fatal ways / Selkoe D. J. // Nature. 2003. Dec 18. Vol. 426, N6968. P. 900-904.
10. Knowles, T. P. Vendruscolo M. , Dobson C. M . The amyloid state and its association with protein misfolding diseases / T. P. Knowles, M. Vendruscolo, C. M. Dobson // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2014. Vol. 15, N6. P. 384-396.
11. Stsiapura V. I. [et al.] Solvent Polarity Effect on Nonradiative Decay Rate of Thioflavin T / V. I. Stsiapura [et al.] // J. Phys. Chem. A. 2016. 2016/07/21. Vol. 120, N28. P. 5481-5496.
12. Gogoleva S. D. [et al.] Neutral derivatives of Thioflavin T do not exhibit viscosity-dependent fluorescence / S. D. Gogoleva [et al.] // J. Photochem. Photobiol. A: Chem. 2018. Vol. 358. P. 76-91.
13. Lavysh A. [et al.] Photophysical properties of trans-2-[4-(dimethylamino) styry l]-3-ethy l -1, 3-benzothiazolium perchlorate, a new structural analog of thioflavin T / A. Lavysh [et al.] // J. Appl. Spectrosc. 2014. Vol. 81, N2. P. 205-213.
14. Yu W.-T. [et al.] Protein sensing in living cells by molecular rotor-based fluorescence-switchable chemical probes / W.-T. Yu [et al.] // Chemical science. 2016. Vol. 7, N1. P. 301-307.
15. Mustafic A. [et al.] Imaging of Flow Patterns with Fluorescent Molecular Rotors / A. Mustafic [et al.] // Journal of Fluorescence. 2010. Vol. 20. N5.
http://innosfera.by/2019/04/sensor
http://innosfera.by 1
