Об устранении квадратичной по импульсу расходимости нелинейной сигма-модели в формализме фонового поля

Багаев Алексей Анатольевич

ВЕСТНИК

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

Серия 4 2011 ФИЗИКА

Выпуск 4 Декабрь ХИМИЯ

НАУЧНО-ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. ИЗДАЁТСЯ С АВГУСТА 1946 ГОДА

СОДЕРЖАНИЕ

ФИЗИКА

Багаев А. А. Об устранении квадратичной по импульсу расходимости нелинейной

сигма-модели в формализме фонового поля.................................. 4

ГридневК. А., МальцевН. А. Изучение реакции 16 О + 12С в фолдинг-модели, моделях передачи кластера и отталкивающего кора............................. 8

ХИМИЯ

Мягкова-Романова М. А., Тимофеев С. А. Компьютерное моделирование радиометрического метода экстракционного разделения радиоактивных изотопов 24 ЮдовичВ. М, ЮдовичМ. Е., Пономарёв А. Н., ТойккаА.М. Эффекты синергизма при модификации эпоксиноволачных композитов фуллероидными наноча-

стицами тороидальной формы................................................ 36

ЛетенкоД.Г, Никитин В. А., Семёнов К. Н., Чарыков Н. А., Золотарёв А. А., Иванов А. С. Механизм переноса электричества и кластеризации в водных растворах фуллеренола^......................................................... 43

Молчанов А. П., Костиков Р. Р. О взаимодействии а-хлор-, а, а-дихлор- и а, а, а-трихлортолуолов с этилмагнийбромидом в присутствии тетраизопропоксида

титана......................................................................... 52

Москвин А. Л., Мельниченко А. Н., Диченко О. Ю. Фотометрическое определение

аммиака в воздухе рабочей зоны с хроматомембранным концентрированием 55 Морозова Т. Е., Зенкевич И. Г. Новые варианты метода стандартной добавки. Га-зохроматографическое определение камфоры в фармацевтических препаратах............................................................................. 61

Санкт-Петербургского университета, 2011

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ОСНОВАН В 1724 ГОДУ 1824 - ГОД ВЫХОДА В СВЕТ ПЕРВОГО ИЗДАНИЯ УНИВЕРСИТЕТА

Пакальнис В. В., Зерова И. В., Алексеев В. В., Якимович С. И. Взаимодействие

этиловых эфиров 4-гетарил-2,4-диоксобутановых кислот с гидразидами..... 69

ПоваровВ. Г., ЛисовенкоГ. Б., ФалькА. А. Кислоторастворимые сорбенты в обзорном хроматографическом анализе органических примесей воды и воздуха 76

КРАТКИЕ НАУЧНЫЕ СООБЩЕНИЯ

Маркин В. Н. Дифракционное повышение симметрии и гомометрические структуры ........................................................................... 83

Бобрышева Н. П., Козин А. О., Селютин А. А. Магнитное разбавление сложных

оксидов Sr2MnSbOe и S^CrSbOe.............................................. 87

Земцова Е. Г., Кириченко С. О., Абдрашитов Г. О., Смирнов В. М. Синтез и исследование устойчивости водных суспензий аэросила с поверхностными ти-

танкислородными группами................................................... 89

Родинков О. В., Журавлёва Г. А. Повышение эффективности адсорбционного концентрирования полярных органических веществ при анализе влажного воздуха ........................................................................... 93

Кочурова Н. Н., АбдулинН.Г, Тихомиров И. А., Гермашева И. И. Влияние концентрации водных растворов алкилсульфатов натрия на их трибологические свойства....................................................................... 97

МАТЕРИАЛЫ III МЕЖДУНАРОДНОЙ КОНФЕРЕНЦИИ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОФИЗИКИ»

Касьяненко Н. А. Вклад Э. В. Фрисман в науку о полимерах и молекулярную

биофизику..................................................................... 103

Морошкина Е. Б. Интеркаляция как способ связывания биологически активных

соединений с двуспиральной ДНК............................................ 114

Дадиванян А. К., ПашининаЮ. М., НоаО.В., Чаусов Д. Н., Королёв Б. А. Ближний ориентационный порядок и гидрофобные взаимодействия в растворах

биологических и синтетических полимеров................................... 124

Евлампиева Н. П., Добродумов А. В, ОкатоваО.В., КоттэЭ. Молекулярные

свойства полилизинов дендритной архитектуры .............................. 131

Конькова Е. П., ЗатрудинаР. Ш. Уширение и сдвиг длинноволновой полосы поглощения аминокислот в полярном растворителе............................. 139

Конькова Е. П., Затрудина Р. Ш. Влияние воды на проявления внутримолекулярных взаимодействий в молекуле NADH................................... 145

Сулацкая А. И., Кузнецова И. М., Туроверов К. К. Использование флуоресцентного красителя тиофлавина Т для изучения структуры амилоидных фибрилл 152 Степаненко Олеся В., Степаненко Ольга В., Кузнецова И. М, ВерхушаВ.В., Туроверов К. К. Структурные переходы зелёного флуоресцентного белка (sfGFP)

под действием гуанидинтиоцианата ........................................... 161

Степаненко ОльгаВ., Степаненко ОлесяВ., Фонин А. В., Щербакова Д. М., ВерхушаВ.В., Кузнецова И. М, Туроверов К. К. D-Галактоза/D-глюкоза-связыва-ющий белок как чувствительный элемент социально значимой биосенсорной

системы. Взаимодействие белка с глюкозой................................... 171

Фонин А. В., Степаненко ОльгаВ., ВерхушаВ.В., Щербакова Д. М., Кузнецова И. М, Туроверов К. К. Перспективы создания чувствительного элемента флуоресцентного биосенсора на глюкозу.......................................... 180

Коженков П. В., Рамазанов Р. Р., Шишилов О. Н., Ефименко И. А., Касьянен-

коН. А. Взаимодействие ДНК с ^[PdHGluCh] in vitro.......................... 186

Рамазанов Р. Р., Щёголев Б. Ф., Касьяненко Н. А. Неэмпирическое исследование свойств электронного и пространственного строения урациловых производных комплексов платины...................................................... 193

Белостоцкая Г. Б., Елдашев И. С., Сурма С. В., Щёголев Б. Ф. Ыолекулярные механизмы воздействия магнитных полей разной интенсивности на регуляцию

уровня кальция в культивируемых мышечных клеткаx....................... 198

Космотынская Ю. В., Иманбаев Р. Т., Богданов А. А., Касьяненко Н. А. Анализ совместного действия радиации и противоопухолевых препаратов платины

на структуру и свойства молекулы ДНК в растворе.......................... 205

Силантьева И. А., Воронцов-Вельяминов П. Н. Исследование решёточных моделей полимерных цепей и звёзд методом Монте-Карло с использованием алгоритма Ванга—Ландау......................................................... 212

СтруцА. В., Браун М. Ф. Структурная динамика ретиналя в процессе активации

родопсина...................................................................... 220

Титов А. В., Варшавский М. С., Лопатько К. Г, Касьяненко Н. А. Изучение взаимодействия наночастиц серебра с молекулой ДНК в водно-солевом растворе 229 Титов Е. В., Лысякова Л. А., Закревский Ю., ЛомадзеН., Зырянова И. М., Бож-коваЕ. А., Сантер С., КасьяненкоН. А. Изучение взаимодействия ДНК с триме-

тиламмониум бромидом, содержащим азобензольную группу................ 234

Аннотации................................................................................................................................................243

Abstract......................................................................................................................................................251

Сведения об авторах............................................................................................................................257

Перечень статей....................................................................................................................................262

Contents......................................................................................................................................................267

2011 ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА Сер. 4. Вып. 4

ФИЗИКА

УДК 53:51, 530.145.1, 517.9 А. А. Багаев

ОБ УСТРАНЕНИИ КВАДРАТИЧНОЙ ПО ИМПУЛЬСУ РАСХОДИМОСТИ НЕЛИНЕЙНОЙ СИГМА-МОДЕЛИ В ФОРМАЛИЗМЕ ФОНОВОГО ПОЛЯ

Замечание о неинвариантных регуляризациях. Использование неинвариантных регуляризаций является причиной возникновения вкладов в квантово-полевые объекты, не обладающих симметриями исходных моделей. Так, ультрафиолетовое обрезание импульса нарушает калибровочную инвариантность полей Янга—Миллса или нелинейной сигма-модели.

Существуют задачи, для которых подобная регуляризация предпочтительнее размерной регуляризации, сохраняющей калибровочную симметрию. Благодаря физическому смыслу регуляризации по импульсу она удобна при изучении вопросов математического обоснования квантовой теории поля. Тем не менее неинвариантность данной схемы усложняет вычисления и может вызывать их неоднозначность. Поэтому очень важен выбор однозначной процедуры вычислений — он должен обеспечить разделение расходимостей, вызванных отсутствием симметрии и прочих расходимостей модели (которые использует теория ренорм-группы).

Расходимости, обусловленные неинвариантными вкладами, можно попытаться устранить введением новых вершин. Но следует иметь в виду, что эти вершины могут дать дополнительный инвариантный вклад, что влечёт, например, изменение в-функции теории в порядках петлевого разложения (теории возмущений), а следовательно, физики.

Квадратичные расходимости матричной о-модели. В работе [1] представлены двухпетлевые вычисления эффективного действия Ш двумерной матричной сигма-модели (главного кирального поля [2, 3]):

где ео — малая константа связи; д(х) € Я, Я — произвольная простая группа Ли; интегрирование по двумерному псевдоевклидову или евклидову пространству-времени. Использовался альтернативный вариант [4-6] формализма фонового поля [7, 8], которое вводилось мультипликативным образом:

(1)

д = ЬдрЪ.

(2)

Эффективное действие имело вид

И^рь) = ~2 + ]¥0(дрЬ) + е^Ш^д^) + ...

е0

Регуляризованный введением импульса обрезания Л двухпетлевой вклад содержит слагаемое, пропорциональное Л2. Но было показано (подробнее см. [9]), что

+ ± | С»°{х, х)К%С™{х, у) \у=х*х = 1п (3)

т. е. двухпетлевое эффективное действие, дополненное указанным слагаемым, не имеет квадратичной расходимости. Логарифмически расходящееся выражение (3) и , регуляризованное по размерности, совпадают. (Здесь /Авс — структурные константы алгебры Ли д группы 0 в присоединённом представлении; С(0) — собственное значение оператора Казимира д; оператор К9рЬ = д2 — [Д^, д^ • ], а Д = д^дрЬд-Ь1 — правая форма Картана [10, 11], в терминах которой выражается зависимость от фонового поля; С(х, у) — интегральное ядро оператора К— (пропагатор, нелокальный функционал поля дрь); Ц — точка нормировки.)

Введение второго слагаемого (3) устраняет квадратичную расходимость эффективного действия в двухпетлевом приближении и не добавляет логарифмических расхо-димостей. Для полей Янга—Миллса такой «минимальный» контрчлен не находится (данный вопрос изучался Л. Д. Фаддеевым и Т. А. Болоховым).

Явное вычисление дополнительной вершины. Выражение Ш1 получается из теоремы Вика для объекта

+

2

+ (/^РШ^ФМФК)) , (4)

где Яр — форма Киллинга на алгебре д, т. е. х •);

Н = ехр{воф}, ф € д. (5)

Выясним, какое слагаемое нужно добавить к действию (4), чтобы в двухпетлевом приближении получить (3). Это можно сделать несколькими способами, самый простой из них —

^1 ¿2х8р(ф2)8р(ф^3рЬф) = Щ ! ^х8р(1п2 1г)^{\п1гКд^\п1г). (6)

Константа а(0) подбирается так, чтобы (6) после применения теоремы Вика давало второе слагаемое (3). Она может зависеть от используемого представления алгебры д (результаты [1, 9] получены в присоединённом представлении). Логарифм в правой части (6) понимается как формальное обращение представления (5). Если говорить строго, логарифмическое отображение 1п : 0 ^ д определено в некоторой окрестности единичного элемента группы [12].

Анализ полученного результата. В формализме фонового поля (2) действие (1) может быть дополнено выражением (6). Если вычислить функциональный интеграл

П2

ni

Пз

n4

(2)

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Вершина (а) и диаграмма первого порядка теории возмущений (б) модели ф4: свободная линия обозначает поле ф, числа п., П2, пз,П4 ^ 0 — производные соответствующего экземпляра ф; замкнутая линия обозначает пропагатор полей ф, числа m(1) ,m(2) ^ 0 — его производные, причём выполнено m(1) = ni + n2,m(2) = пз + П4, либо m(1) = ni + пз,т(2) = П2 + П4, либо m(1) = = n1 + n4, m(2) = n2 + пз

по «квантовым» полям Н (учитывая надлежащие граничные условия [4-6, 13]) с новым действием

S'(9ph, h)

1

2^

tr + <я) Sp(ln2 h) Sp(ln hK9ph ln h)

то результат совпадёт с [1] (где использовалось S = S(hgph)) вплоть до двух петель. Квадратично-расходящиеся вклады отсутствуют.

Вычисление эффективного действия старше двух петель в формализме фонового поля не проводилось. Очевидно, S'(gph,h) и S(hgph) порождают различные трёхпет-левой и старшие вклады — слагаемое (6) производит новые квадратичные расходимости. Тем не менее существуют задачи математического обоснования квантовой теории поля, когда знание двухпетлевой ультрафиолетовой в-функции, т. е. перенормировки логарифмически расходящейся части эффективного действия (в старших петлях связь между ними более сложна [4, 14]), позволяет получить глобальный непертурбативный результат. Таким образом, например, показана независимость в-функции модели (1) от выбора схемы регуляризации [1, 9, 13]. Достаточность первых двух коэффициентов обусловлена их инвариантностью как коэффициентов разложения решения обыкновенного дифференциального уравнения первого порядка («бегущая константа связи», по которой строится в-функция, удовлетворяет уравнению Гелл-Манна—Лоу [15, 16]) в окрестности особой точки (нуля) [17-19].

Свободное от квадратичных расходимостей действие S'(g), по-видимому, не может быть построено описанным выше способом вне формализма фонового поля.

Заметим также, что удалось de facto решить задачу «обратной теоремы Вика»1: по данной диаграмме (второе слагаемое (3)) предъявить вершину (выражение (6)), которая даёт в результате вычисления функционального интеграла эту и только эту диаграмму в трёх интересующих нас порядках петлевого разложения — нулевом, первом и втором. Известно, что эта задача не имеет решения в общем случае. Но, например, для модели ф4 в первом порядке теории возмущений по константе связи2 (см. рисунок) возможно восстановление вершины по диаграмме. Задача сводится к решению невырожденной системы Nn линейных неоднородных уравнений относительно Nn неизвестных, где

Nn =

n

2 + 1' n +1

~2~'

n — четное;

n — нечетное,

1 Здесь теорема Вика [20] понимается как способ вычисления функционального интеграла от монома чётной степени полевых переменных [15, 16, 21].

2Действие теории ф4 похоже на структуру левой части (6).

а

а n = u\ + П2 + пз + П4. В старших порядках решение такой задачи невозможно, поскольку число неизвестных (диаграмм) растёт быстрее числа уравнений (независимых вершин).

Автор благодарит академика Людвига Дмитриевича Фаддеева за многолетнее научное руководство и профессора Юрия Михайловича Письмака за ценные консультации.

Литература

1. Багаев А. А. Двухпетлевые вычисления эффективного действия матричной 0-модели в формализме фонового поля // Теор. мат. физика. 2008. Т. 154. № 2. С. 354-362.

2. Поляков А. М. Калибровочные поля и струны / пер. с англ. Ижевск, 1999. 312 с.

3. Цвелик А. М. Квантовая теория поля в физике конденсированного состояния / пер. с англ. М., 2004. 320 с.

4. Фаддеев Л. Д. Замечания о расходимостях и размерной трансмутации в теории Ян-га—Миллса // Теор. мат. физика. 2006. Т. 148. № 1. С. 133-142.

5. Faddeev L. Mass in quantum Yang—Mills theory (comment on Clay Millennium problem) // Bull. Braz. Math. Soc. 2004. Vol. 33. N 2. P. 1-12.

6. Faddeev L. D. Separation of scattering and selfaction revisited // arXiv: 1003.4854v1 [hep-th].

6 p.

7. Abbott L. F. The background field method beyond one loop // Nucl. Phys. (B). 1982. Vol. 185. N 1. P. 189-203.

8. Jack I., Osborn H. Two-loop background field calculations for arbitrary background fields // Nucl. Phys. (B). 1982. Vol. 207. N 3. P. 474-504.

9. Багаев А. А. Приложение метода фонового поля к перенормировке нелинейной сигма-модели: дис. ... канд. физ.-мат. наук. СПб., 2008. 135 с.

10. Постников М. М. Группы и алгебры Ли: лекции по геометрии, семестр V. М., 1982. 448 с.

11. ДубровинБ. А., Новиков С. П., Фоменко А. Т. Современная геометрия: методы и приложения. Т. 2. Геометрия и топология многообразий. М., 1998. 280 с.

12. Кириллов А. А. Элементы теории представлений. М., 1978. 360 с.

13. Багаев А. А. Применение метода собственного времени Фока к исследованию нелинейной сигма-модели в формализме фонового поля // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4: Физика, химия. 2009. Вып. 4. С. 183-204.

14. Börnsen J.-P., van de VenA.E.M. Three-loop Yang—Mills ß-function via the covariant background field method // Nucl. Phys. (B). 2003. Vol. 657. P. 257-303.

15. Ициксон К., Зюбер Ж.-Б. Квантовая теория поля: в 2 т. Т. 1 / пер. с англ. М., 1984. 448 c.

16. РамонП. Теория поля. Современный вводный курс / пер. с англ. М., 1984. 330 c.

17. Арнольд В. И. Обыкновенные дифференциальные уравнения. М., 1971. 240 c.

18. Арнольд В. И. Дополнительные главы теории обыкновенных дифференциальных уравнений. М., 1978. 304 c.

19. Смирнов В. И. Курс высшей математики: в 5 т. Т. 2. М., 1974. 656 c.

20. WickG. C. The evaluation of the collision matrix // Phys. Rev. 1950. Vol. 80. N 2. P. 268-272.

21. Васильев А. Н. Функциональные методы в квантовой теории поля и статистике. Л., 1976. 295 с.

Статья поступила в редакцию 14 июня 2011 г.

УДК 539.17.01

Вестник СПбГУ. Сер. 4. 2011. Вып. 4

К. А. Гриднев, Н. А. Мальцев

ИЗУЧЕНИЕ РЕАКЦИИ 1бО + 12С В ФОЛДИНГ-МОДЕЛИ, МОДЕЛЯХ ПЕРЕДАЧИ КЛАСТЕРА И ОТТАЛКИВАЮЩЕГО КОРА*

Введение. Описание взаимодействия составных частиц является неочевидной задачей, и в ситуациях, когда решение весьма сложно, на первый план выступают приближённые методы, для которых основным является знание ядро-ядерных оптических потенциалов.

Интерес к изучению упругого рассеяния тяжёлых ионов связан с тем, что для них характерно отклонение от модели сильного поглощения, что позволяет изучать взаимодействие на малых расстояниях и свойства ядерной материи. Для таких ионов во многих реакциях наблюдается также подъём дифференциального сечения на большие углы в широком интервале энергий (аномальное рассеяние назад). Этот эффект находит объяснение в модели слабого поглощения, в которой появляется возможность орбитирования, что означает вращение сталкивающихся ядер относительно друг друга при сохранении индивидуальности. В результате возникает квазимолекулярное состояние [1]. Для его описания целесообразно введение в оптический потенциал отталкивающего кора, существование которого следует из принципа Паули, при этом значение отталкивающего кора можно связать с коэффициентом сжимаемости ядерной материи. Рост сечения рассеяния на больших углах для ядер сравнимой массы может быть также следствием передачи кластера, что является инструментом для изучения кластерных эффектов в основных состояниях ядер.

В представляемой работе рассматривалась реакция упругого рассеяния 160 + 12С в рамках оптической модели с /-зависимым кором и с потенциалом двойной свёртки, зависящим от плотности перекрывающихся ядер, которая даёт экспериментальные значения равновесной плотности и энергию связи насыщенной ядерной материи и позволяет извлечь коэффициент сжимаемости ядерной материи. Изучено влияние канала упругой и неупругой передачи а-кластера на сечение упругого рассеяния в области больших углов. Экспериментальные данные брались из различных публикаций.

Теоретическое описание. Полную амплитуду рассеяния можно записать в виде суммы

/(6) = /в (6) + //(6),

где /в (6), //(6) — соответственно амплитуды, полученные при отражении парциальных волн от внешней поверхности ядра и внутренней области ядра (центробежного барьера и отталкивающего остова). При этом /в (6) характеризует область передних углов, тогда как //(6) даёт вклад в основном в область больших углов, а их интерференция определяет область промежуточных углов, т. е. внутренняя область потенциала влияет на поведение сечения на больших углах.

Одним из способов описания потенциала взаимодействия является модель двойной свёртки. Рассмотрим реакцию А + В ^ А + В. Запишем оптический потенциал в виде

и (г) = Уоси1 (г) + МУ (г) — гШ (г), (1)

* Работа была выполнена на средства федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009—2013 годы, контракт № П 793.

здесь Усои1 (г) — кулоновский потенциал равномерно заряженной сферы; V(г) — вещественный потенциал, рассчитанный в модели двойной свёртки; N — произвольный параметр; Ш(г) = /(1 + ехр((г — Rw)/aw) — мнимая часть потенциала в форме Вудса—Саксона. В приближении двойной свёртки [2] вещественная часть потенциала взаимодействия между ядрами есть сумма эффективных двухчастичных нуклон-нуклонных взаимодействий иц между нуклонами ядер, участвующих в столкновении:

V = Е ^ • (2)

Если внутренние волновые функции основного состояния снаряда и мишени антисимметричны, то согласно принципу Паули необходимо, чтобы полная волновая функция системы была антисимметричной при перестановке координатных, спиновых и изоспи-новых переменных нуклонов между двумя ядрами. Если ограничиться обменом только одним нуклоном, то эффективное нуклон-нуклонное взаимодействие иц в уравнении (2) можно записать

Уц (1 — Рц ) = ив + иЕХР%,

где ив = иц; иЕХ = —ицР^ РЦ, а Рх, Рц, РЦ — соответственно операторы перестановки пространственной, спиновой и изоспиновой координат пары нуклонов. В результате потенциал двойной свёртки может быть записан в виде суммы прямой

(V(в)) и обменной

(V(ЕХ)) частей

V = V(в) + V(ЕХ). (3)

Прямая часть выражается через интеграл двойной свёртки:

V(в) (^) = i ра (га ) Рв (гв) ив (з) сРгасРгв , з = г в — га + R, (4)

где ра (га) , Рв (гв) — соответственно распределения плотностей основных состояний ядер А и В, которые находятся из экспериментов по рассеянию электронов на ядрах; ив — эффективный прямой нуклон-нуклонный потенциал.

В квазиклассическом приближении волновую функцию относительного движения при перестановке пространственных координат пары нуклонов можно представить в виде

(гК ^) зч

х (Д + з) « ехр ( м' ) X (Д):

где М = АаАв/{Аа + Ав), К (Я) = у/2ц/П2 [Е - Vе (Я) - Vе* (Я) - УСои1 (Д)] - локальный импульс относительного движения. В итоге обменный потенциал принимает вид

у(ЕХ)^ = I рА(гА,ГА + з)Рв(гв,гв + з)уЕХ(з)ехр(?Щ^^<РгА<Ргв, (5)

здесь ра (га,га + з) — смешанная одночастичная матрица плотности нуклонов ядра. В общем виде нуклон-нуклонное взаимодействие

ив(ЕХ)(Р, з) = д(Е)Е(Р)ив(ЕХ)(з), (6)

где д(Е) — функция энергии, зависящая от конкретной параметризации ив(ЕХ)(з); Е(р) — функция, зависящая от плотности ядер Р = Ра(га) + Рв(гв). Необходимость

введения зависимости от плотности связана с тем, что взаимодействие, не зависящее от плотности, не воспроизводит найденные в эксперименте равновесную плотность (ро « ~ 0,17 фм~3) и энергию связи на нуклон в точке равновесия (E/A « 16 МэВ). Функция F(р) берётся в форме:

F(р) = C [1 + аexp(-ßp) - ур"]. (7)

В этом выражении параметры подбираются так, чтобы воспроизвести экспериментальные равновесные свойства ядерной материи. Различные параметризации, давая одинаковые свойства ядерной материи, различаются кривизной кривой энергии связи в точке насыщения, которая связана со значением сжимаемости ядерной материи:

K = 9р

2 d2[E/A]

d2 р2

. (8)

р=ро

Другой способ описания упругого рассеяния — это оптическая модель с /-зависимым кором. Оптический потенциал тогда запишем в виде

и (г) = Усои1 (г) + Уо/у (г) — гШо М (г) + Усоге(г), (9)

здесь УСои1(г) — кулоновский потенциал равномерно заряженной сферы; У,Ш — глубины соответственно вещественной и мнимой частей оптического потенциала, /х = = (1+ехр((г — Ях)/ах)) 1 — радиальная зависимость потенциала в форме Вуд-

1 /3 1 /3

са—Саксона, где Ях = гх(Ар/ + А/ ), х = У,Ш. Для описания рассеяния в области больших углов к потенциалу добавлен отталкивающий кор. В качестве УСоге(г) использовался параболический /-зависимый отталкивающий кор:

{Ук (г), г < Ясоге,

о,;>Ясо„, ' (10)

14(г) = с( 1 - , Дсоге = Гк + Дг (1 - (-1)') /2,

V Я2оге /

где С, г к, Аг — свободные параметры. Для радиуса кора должно выполняться соотношение г к ~ Яг + Зависимость от / потенциала кора вводится для описания расщепления полос положительной и отрицательной чётности. Значение кора позволяет определить коэффициент сжимаемости ядерной материи: К = 9С (« 250 МэВ).

В реакции 160 + 12С существенным процессом, влияющим на сечение упругого рассеяния на большие углы, является механизм передачи а-кластера от налетающего ядра 160 ядру мишени 12С, с образованием ядра в основном состоянии (реакция 12С(160,12 С)160), и связь выходных каналов. Такой процесс может быть описан в методе искажённых волн, а взаимодействие выходных состояний учитывается методом связи каналов. Тогда с учётом передачи кластера для сечения упругого рассеяния можно записать

-^у- = I/ег(0) + 3/вШВА{ССВА)(л - 0)| , (11)

где /е1 (6) — амплитуда упругого рассеяния; /о»ВА(ССВА) (6) — амплитуда, рассчитанная в методе искажённых волн и ССВА модели соответственно, где замена 6 ^ п — 6 связана с неразличимостью ядер рассеянных упруго и образованных в результате передачи в основное состояние; Б — свободный параметр, связанный со спектроскопическим фактором.

10-1 г 10-2 10-3 10-4 10-

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

120

0ц.м' град-

80 100 120 140 , град.

Рис. 1. Иллюстрация для сравнения экспериментального сечения упругого рассеяния 16 О + 12 О с расечитанным в модели двойной свертки с разными силами при энергии Елаб. = 200,0 МэВ (а), 62,0 МэВ (б):

точки с тонкой линией — эксперимент, штриховая линия — CDM3Y1, сплошная жирная линия — CDM3Y6, пунктирная линия — BDM3Y1, штрихпунктирная линия — независимый от плотности

Результаты.

Модель двойной свёртки. В качестве эффективных нуклон-нуклонных сил, независимых от плотности и о, ъех, брались силы M3Y-Paris:

М») = 11061,625 еХр(~45)- 2537,5 еХр(~2'55)

4в

2,5в

(12)

, , ехр(-4в) ехр(-2,5в) ехр(-0,7072в) , , уех(й) = —1524,25 ——-- — 518,75 ——-— - 7,8474—----. 13

Ел \ ) ' л „ ' ОЕ„ ' А 7П7П „ V /

4в

2,5в

0,7072в

Таблица 1

Параметры ядер

Ядро ро, фм~3 -ш, фм 2 |3, фм"2 {г2)1Г\ фм

1б0 0,1317 0,6457 0,3228 2,64

12С 0,1644 0,4988 0,3741 2,407

Для описания плотности ядер использовалась модель модифицированного гармонического осциллятора

р(г) = р0(1 + тг2) ехр(—Рг). (14)

Параметры ядер 16С, 12C приведены в табл. 1 [3].

Параметры зависимости от плотности в (7) выбраны так, чтобы проследить влияние коэффициента сжимаемости на сечение упругого рассеяния. Они представлены в табл. 2.

Во всех расчётах кулоновский радиус Ес = 1,35(Ар/3 + А1/3). При Елаб. = 200,0, 62,0 МэВ сравнивались сечения упругого рассеяния для потенциалов с различной зависимостью от плотности. Параметры потенциала представлены в табл. 3. Они найдены по наилучшему согласию с экспериментальными данными.

С помощью рис. 1 можно сравнить результаты расчёта, сделанного на основании параметров потенциала из табл. 3, с экспериментом. Видно, что введение зависимости от плотности улучшает поведение сечения упругого рассеяния на больших углах

Таблица 2

Параметры функции плотности из (7)

Модель С а |3, фм3 у, фм3" п К, МэВ

СБМЗ¥1 0,3429 3,0232 3,5512 0,5 1 188

СБМЗУб 0,2658 3,8033 1,4099 4,0 1 252

ВБМЗУ! 1,2521 0,0 0,0 1,7452 1 270

при большей энергии, для меньшей энергии описание хуже. При уменьшении энергии ухудшается также описание и области передних углов. Это является следствием приближения замороженной плотности (плотности в области перекрытия не изменяются), так как уменьшение энергии налетающего ядра увеличивает время нахождения ядер в области взаимодействия, что приводит к большим возмущениям плотности в области перекрытия ядер. Другой причиной худшего описания при низких энергиях является увеличение длины волны де Бройля сталкивающихся ядер, и, следовательно, взаимодействие может происходить с кластерами ядер, что не учитывается в модели свёртки. При этом разные модели потенциала, которые соответствуют коэффициентам сжимаемости K = 188, 252, 272 МэВ, дают одинаковые сечения упругого рассеяния. Можно сказать, что модель двойной свёртки позволяет извлечь коэффициент сжимаемости ядерной материи при больших энергиях взаимодействия. Так как различные силы в модели двойной свёртки дают очень близкие результаты, то сечение для широкого диапазона энергий было проанализировано с силами CDM3Y6 с коэффициентом сжимаемости K = 252 МэВ. Найденные значения параметров для модели CDM3Y6 представлены в табл. 4.

Таблица 3

Значения параметров потенциала из (1)

£ла6., МэВ Модель N W0, МэВ rw, фм aw, фм

CDM3Y1 0,750 18,937 1,219 0,582

200,0 CDM3Y6 0,762 18,937 1,219 0,584

BDM3Y1 0,766 18,935 1,220 0,585

Dens. Indep. 0,822 20,090 1,227 0,571

CDM3Y1 1,086 8,442 1,398 0,371

62,0 CDM3Y6 1,106 8,412 1,396 0,376

BDM3Y1 1,111 8,406 1,395 0,377

Dens. Indep. 1,075 8,730 1,374 0,422

Таблица 4

Значения параметров потенциала

из (1) в модели ОВЫвУв для широкого диапазона энергии

Ялаб., МэВ N W0, МэВ rw, фм aw, фм

200,0 0,762 18,937 1,219 0,584

170,0 0,771 20,205 1,161 0,735

132,0 0,781 14,991 1,181 0,662

124,0 0,775 14,738 1,166 0,653

115,9 0,771 13,474 1,170 0,613

100,0 0,776 13,072 1,159 0,595

94,8 0,780 16,211 1,068 0,649

80,0 0,754 15,468 1,038 0,656

75,01 0,817 5,978 1,427 0,350

62,0 1,106 8,412 1,396 0,376

42,0 0,799 7,097 1,123 0,900

На рис. 2, 3 приведены результаты расчёта в модели CDM3Y6 для различных энергий со значениями потенциалов из табл. 4.

Расчёт в модели с I-зависимым кором. Найденные значения потенциала (9) для различных энергий представлены в табл. 5.

На рис. 4 представлена иллюстрация для сравнения результата с кором и без кора при двух энергиях с параметрами из табл. 5. Видно, что кор влияет на область больших и промежуточных углов, а остальная часть потенциала определяет область передних углов. На рис. 5, 6 показаны результаты расчёта сечения упругого рассеяния для различных энергий в модели с /-зависимым кором. Модель

10 10

10-3

10 10

10-1 10-2 10-3 10-4 10-

120

0ц.м.' граД-

0 20 40 60 80 100 120 0ц.м> граД -

1

10-1

Ц10-2

СС

Ю-3

>

10-4 10-

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 е , гРад-

10-

0 20 40 60 80 100 120 140

е , град-

10-1 10-2

10 10 10

0 20 40 60 80 100 120 140

е , гРад-

10

0 20 40 60 80 100 120 140

е , град-

Рис. 2. Иллюстрация для сравнения экспериментального сечения упругого рассеяния 160 +12 С с рассчитанным в модели двойной свёртки CDM3Y6 при энергии Елаб. = 200,0 (а), 170,0 (б), 132,0 (в), 124,0 (г), 115,9 (д), 100,0 МэВ (е):

точки с тонкой линией — эксперимент, сплошная жирная линия — CDM3Y6

10

20 40 60 80 100 120 140

е , град-

10-1

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

10-2 г

10-3 г

10

0 20 40 60 80 100 120 140

е , гРад-

10-

10-3

10-

20 40 60 80 100 120 140

ец.м, гРад-

1

10-1 10-2 10-3 10-4

0 20 40 60 80 100 120 140

е , гРад-

8 10

Л

10-2

10

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 ец.м., гРаД-

Рис. 3. Иллюстрация для сравнения экспериментального сечения упругого рассеяния 160 +12 О с рассчитанным в модели двойной свёртки CDM3Y6 при энергии Елаб. = 94,8 (а), 80,0 (б), 75,01 (в), 62,0 (г), 42,0 МэВ (д):

точки с тонкой линией — эксперимент, сплошная жирная линия — CDM3Y6

0

1

0

д

0ц.м' град- 0ц.м, град.

Рис. 4- Иллюстрация для сравнения экспериментального сечения упругого рассеяния 16 О + 12 С с рассчитанным в оптической модели с /-зависимым кором при энергии Елаб. = 200,0 МэВ (а), 62,0 МэВ (б):

точки с тонкой линией — эксперимент, штриховая линия — расчёт без кора, сплошная жирная линия — расчёт с кором

Таблица 5

Параметры потенциала с /-зависимым кором

ЕЛ Vo Г-v a г, Wo rw, фм aw, фм С, МэВ Гк, фм Дг К, МэВ

200,0 69,99 1,00 0,68 14,40 1,25 0,59 27,74 5,23 0,49 249,66

170,0 45,85 1,08 0,75 15,10 1,25 0,58 28,40 5,68 0,02 255,60

132,0 45,00 1,07 0,75 24,92 1,10 0,65 32,00 5,08 0,48 288,00

124,0 45,00 1,14 0,59 13,35 1,25 0,61 31,99 5,33 0,37 287,91

115,9 87,34 1,12 0,55 25,00 1,27 0,38 28,64 5,65 0,90 257,76

100,0 67,52 1,15 0,55 10,64 1,24 0,50 31,96 5,60 0,04 287,64

94,8 95,55 1,02 0,63 9,39 1,30 0,28 29,06 5,61 0,80 261,54

80,0 51,82 1,20 0,52 6,63 1,35 0,15 26,23 6,00 0,07 236,07

75,01 52,29 1,18 0,52 10,11 1,18 0,18 32,00 5,28 0,53 288,00

62,0 68,12 1,17 0,51 7,39 1,19 0,65 27,86 5,42 0,80 250,74

42,0 49,58 1,13 0,60 12,32 0,82 0,64 31,99 5,68 0,86 287,91

неплохо описывает всю область энергий, кроме равной 200 МэВ, что позволяет использовать её для нахождения коэффициента сжимаемости в области малых энергий, где модель свёртки плохо работает. Значения коэффициента сжимаемости, полученные из расчёта, согласуются с полученными в других моделях [6].

Передача кластера. В связи с важностью для данной реакции канала передачи а-кластера проведены его расчёт в модели DWBA и учёт связи выходных каналов в модели CCBA. Схема, использованная в расчёте, показана на рис. 7.

Для описания процесса передачи необходимо задать потенциал, хорошо описывающий упругое рассеяние во входном и выходном каналах. В качестве его вещественной части использовался потенциал(WS2) вида V(r) = V0fWs(r), где fws — формфактор Вудса—С аксона. Мнимая часть бралась в форме Вудса—С аксона. В роли потенциала связанного состояния кластера с остовом использовался потенциал Вудса—Саксона с параметрами радиуса R0 = 1,3ALO'i и диффузности a = 0,55, глубина потенциала подбиралась для согласия энергии связи кластера (для основного состояния 7,165 МэВ, для состояния 2+ 0,248 МэВ) c квантовым состоянием этого кластера в потенциальной яме.

10

10-3

^10-4

10

100 120

10 10101010-

100 120

ец.м, град.

ец.м, гРад.

1

10-1 10-2

. 10-3 10-4 10-

0 20 40 60

100 120 140 160 180

10

ец.м., гРаД.

0 20 40 60 80 100 120 140

ец.м., гРад.

10

•б* 10

Л

10-3

10

0 20 40 60 80 100 120 140

е , град.

10

20 40 60 80 100 120 140

е , град.

Рис. 5. Иллюстрация для сравнения экспериментального сечения упругого рассеяния 16 О +12 О с теоретически рассчитанным в оптической модели с /-зависимым кором при энергии Елаб. = 200,0 (а), 170,0 (б), 132,0 (в), 124,0 (г), 115,9 (д), 100,0 МэВ (е):

точки с тонкой линией — эксперимент, сплошная жирная линия — расчёт

0

ец.м, град.

Рис. 6. Иллюстрация для сравнения экспериментального сечения упругого рассеяния 16 О +12 О с теоретически рассчитанным в оптической модели с /-зависимым кором при энергии Елаб. = 94,8 (а), 80,0 (б), 75,01 (в), 62,0 (г), 42,0 МэВ (д):

точки с тонкой линией — эксперимент, сплошная жирная линия — расчёт

6O + 12C

2C + 16O

6O + 12C

2C + 16O (2+, 6,917 МэВ)

2C + 16O (осн. сост.)

Рис. 7. Схемы расчёта в модели DWBA (слева) и CCBA (справа)

Квантовые числа состояния кластера определялись из соотношения Тальми—Мошин-ского [4]: 2(Ж — 1) + Ь = ^4=1 2(щ — 1) + и, где щ, ¡^ — квантовые числа составляющих кластер нуклонов в модели гармонического осциллятора; N, Ь — квантовые числа кластера. В случае а-кластера в основном состоянии 160 получаем 2N + Ь = 6. Для состояния 2+ в ядре 160 кластер находится в состоянии 3d, что следует из соотношения 2N + Ь = 8. Это выражение получается, если предположить, что два нуклона переходят с осцилляторного уровня 1р на уровень 1с1 или 2в. Спектроскопические амплитуды, полученные из расчёта, приведены в табл. 6.

Таблица 6

Спектроскопические амплитуды, использованные в расчёте передачи а-кластера

Ялаб., МэВ DWBA ССВА

<а(3*) (Е-12 С|160)чs <а(3в) (х)12 С|160)чs (а(3d) (i)12 С|160)2+

200,0 1,4 1,4 1,4

170,0 1,4 1,4 0,7

132,0 0,9 1,8 0,9

124,0 1,2 1,8 3,0

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

115,9 1,2 2,3 1,2

100,0 1,2 2,0 1,8

94,8 1,4 2,0 1,8

80,0 1,2 1,8 2,4

75,01 1,6 1,6 3,2

62,0 1,6 2,6 7,8

42,0 2,0 3,5 1,2

На рис. 8, 9 представлены результаты расчёта в модели DWBA и в оптической модели с потенциалом, использованным в DWBA-расчёте. Как видно, модель DWBA даёт подъём сечения на больших углах, но плохо описывает структуру сечения.

На рис. 10, 11 показаны результаты, полученные с учётом канала передачи в состояние 2+ 16 O, и связь этого канала с основным состоянием. Замечено, что с учётом передачи в неосновное состояние улучшается описание структуры сечения на больших углах.

Расчёты выполнены в программе "Fresco" [5].

Заключение. В работе проведён анализ экспериментальных данных упругого рассеяния 16O + 12C в широком интервале энергий Елаб. =42 + 200 МэВ в рамках оптической модели с потенциалом двойной свёртки, зависящим от плотности, и в модели с /-зависимым кором, а также в модели искажённых волн для учёта процесса передачи а-кластера с влиянием связи выходных каналов на процесс упругой передачи а-кластера. Проанализировано влияние зависимости от плотности при разных энергиях:

1010-2

42 10-

10-

10

20 40 60 80 100 120

е , град-

20 40 60

0ц.„, гРад-

100 120

1

10-1

а

I 10-2 & 10-3 10-4 10-

0 20 40 60

10

100 120 140 160 180

ец.м, гРад-

0 20 40 60 80 100 120 140

ец.м, гРад.

10-

^ 10-

10-

0 20 40 60 80 100 120 140

е , гРад.

10

0 20 40 60 80 100 120 140

е, гРад.

Рис. 8- Иллюстрация для сравнения экспериментального сечения упругого рассеяния 16 О +12 С с теоретически рассчитанным с учётом передачи а-кластера в модели DWBA при энергии Елаб. = 200,0 (а), 170,0 (б), 132,0 (в), 124,0 (г), 115,9 (д), 100,0 МэВ (е):

точки с тонкой линией — эксперимент, сплошная жирная линия — расчёт по оптической модели с потенциалом WS2, штриховая линия — расчёт с учётом передачи а-кластера

0

Рис. 9- Иллюстрация для сравнения экспериментального сечения упругого рассеяния 16 О +12 С с теоретически рассчитанным с учётом передачи а-кластера в модели DWBA при энергии Елаб. = 94,8 (а), 80,0 (б), 75,01 (в), 62,0 (г), 42,0 МэВ (д):

точки с тонкой линией — эксперимент, сплошная жирная линия — расчёт по оптической модели с потенциалом WS2, штриховая линия — расчёт с учётом передачи а-кластера

10-1 10-2 10 10

20 40 60 80 100 120 ец.м., граД.

0 20 40 60

100 120

ец.м., град.

1

10-1

-й" 10-2

Л

10-3

10-

10

100 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 20 40 60 80 100 120 140

е, град.

10

10-3

10

0 20 40 60 80 100 120 140

е, град.

10

0 20 40 60 80 100 120 140

е,,.м, граД.

Рис. 10. Иллюстрация для сравнения экспериментального сечения упругого рассеяния 160 +12 О с теоретически рассчитанным с учётом передачи а-кластера и связью выходных каналов в модели ООВА при энергии Елаб. = 200,0 (а), 170,0 (б), 132,0 (в), 124,0 (г), 115,9 (д), 100,0 МэВ (е):

точки с тонкой линией — эксперимент, сплошная жирная линия — расчёт по CCBA модели

0

10

0 20 40 60 80 100 120 140 0п.и> гРаД.

10-

0 20 40 60 80 100 120 140 0п.и> гРаД.

10-

-Й

10-

0 20 40 60 80 100 120 140 0п.и> гРаД.

1

¡Ш-

I 10-2 10-3 10-4

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

1

10-1 10-2 10-3 10-4

д

0 20 40 60 80 100 120 140 9п.м> гРаД.

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

9ц.и, гРаД.

Рис. 11. Иллюстрация для сравнения экспериментального сечения упругого рассеяния 16О +12 С с теоретически рассчитанным с учётом передачи а-кластера и связью выходных каналов в модели ССВА при энергии Елаб. = 94,8 (а), 80,0 (б), 75,01 (в), 62,0 (г), 42,0 МэВ (д):

точки с тонкой линией — эксперимент, сплошная жирная линия — расчёт по CCBA модели

модель двойной свёртки с зависимостью от плотности позволяет получить коэффициент сжимаемости при высоких энергиях, а модель с /-зависящим кором — значение кора при низких и средних энергиях « 250 МэВ, которое согласуется со значением из других расчётов [6]. Показанно также, что влияние связи выходных каналов улучшает поведение сечения на больших углах.

Литература

1. Гриднев К. А., Оглоблин А. А. Аномальное рассеяние назад и квазимолекулярная структура ядер // Физика элем. частиц и атомн. ядра. 1975. Т. 6. Вып. 2. С. 393-434.

2. Khoa D. T., von Oertzen W., Bohlen H. G. et al. Nuclear rainbow scattering and nucleus-nucleus potential // J. Phys. (G). 2007. Vol. 34. P. R111-R164.

3. El-AzabF. M., MahmoudZ. M. M., Hassan G. S. Analysis of heavy ions elastic scattering using the double folding cluster model // Nucl. Phys. (A). 2001. Vol. 691. P. 671-690.

4. Satchler R. G. Direct nuclear reactions. Oxford—New York, 1983. 833 p.

5. Thompson I. J. Coupled reaction channels calculations in nuclear physics // Comp. Phys. Rep. 1988. Vol. 7. P. 167-212.

6. BlaizotJ. P. Nuclear compressibilities // Phys. Rep. 1980. Vol. 64. N 4. P. 171-248.

Статья поступила в редакцию 28 июня 2011 г.

2011 ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА Сер. 4. Вып. 4

ХИМИЯ

УДК 541.123.31/33:(546.791.6+547.464.2) М. А. Мягкова-Романова, С. А. Тимофеев

КОМПЬЮТЕРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ РАДИОМЕТРИЧЕСКОГО МЕТОДА ЭКСТРАКЦИОННОГО РАЗДЕЛЕНИЯ РАДИОАКТИВНЫХ ИЗОТОПОВ

Введение. Разработка методов фазового разделения и выделения изотопов является одной из традиционных задач радиохимии [1]. Величиной, характеризующей эффективность процесса разделения для выбранной пары изотопов, служит коэффициент разделения, представляющий собой отношение коэффициентов распределения этих изотопов между двумя фазами:

а2

Коэффициент распределения определяет эффективность извлечения изотопа из одной фазы в другую. Например, при жидкостной экстракции коэффициент распределения равен отношению концентраций целевого изотопа в органической и водной фазах после их разделения:

_ Сорг.

Сводн.

В экстракционных процессах практический интерес представляет также использование величины Е — процента извлечения (экстракции):

В = (1)

а + -^шь.

где УвОДН. и У0рг. — объёмы водной и органической фаз после экстракции.

Если объёмы водной и органической фаз равны, то формула (1) упрощается:

^ 100а Е =-.

а +1

Очевидно, что для оценки эффективности процесса экстракции необходимо определять концентрации изотопов в растворах. В случае микроколичеств изотопов наиболее удобным методом определения их содержания в растворах является радиометрический, при котором концентрации изотопов пропорциональны их активностям и находятся по

измеренным с помощью детектора излучения (счётчика) количествам импульсов соответствующей фазы

со _ идо ■

СорГ. идорг. !

Со =ид0

водн. водн.?

где С°рг. и Содн. — концентрации изотопа в органической и водной фазах на момент их разделения; Дорг и Дводн — активности органической и водной фракций на момент разделения; к — коэффициент пропорциональности, зависящий от условий измерений. Если условия одинаковы для обеих фаз, то

до

орг.

до

водн.

Для определения а необходимо подобрать начальные условия эксперимента, т. е. такое количество исходного материнского изотопа и время накопления дочернего, чтобы можно было зарегистрировать активность каждой из экстракционных фаз, достаточную для корректного определения этой величины.

Подбор условий экспериментальным путём требует использования радиоактивных изотопов, что представляет определённую дополнительную экологическую опасность и вредность для экспериментатора. Предварительное компьютерное моделирование позволило бы создать оптимальные условия последующего химического эксперимента и оценить количественные характеристики радиоактивного распада и экстракции исследуемых изотопов.

Ранее в работах [2-4] было проведено компьютерное моделирование экстракционных систем с целью поиска таких условий, которые могли бы позволить получить наиболее эффективное разделение и концентрирование радионуклидов и прогнозировать выбор условий экстракции предполагаемого эксперимента.

Постановка задачи. Разделение смеси радиоактивных изотопов (в нашем случае

П1П 0 10 --

рассматривается разделение изотопов 212 РЬ и 212 В^ находящихся между собой в подвижном радиоактивном равновесии) включает в себя следующие стадии:

— приготовление исходного раствора, в котором в момент времени ¿исх. находится некоторое количество атомов материнского изотопа Ж1исх., распадающихся с образованием атомов дочернего изотопа;

— накопление дочернего изотопа в течение времени ¿накопл.;

— экстракция дочернего изотопа в органическую фазу и фиксация времени (момента) разделения фаз ¿о. Материнский изотоп в органическую фазу при этом не переходит.

Атомы дочернего изотопа, образовавшиеся за время

¿накопл. ¿0 ¿исх. ?

распределяются между водной и органической фазами.

Далее проводятся измерения активностей исходного раствора, водной и органической фаз в заданные моменты времени ^. Детектор регистрирует активность только дочернего изотопа (212В^ и не регистрирует активность материнского изотопа, так как энергия излучения последнего меньше (в 6,4 раза) энергии излучения дочернего изотопа [5, с. 25]. Длительность каждого измерения выбирают так, чтобы получить достаточное число импульсов от каждой фазы (раствора), с учётом активности растворов и коэффициента эффективности (счётности) детектора ксч.:

ксч = ^ 100 %,

где /изм. — число частиц (далее — импульсов), зарегистрированных детектором за выбранный интервал времени; /ист. — истинное число частиц, попавших в детектор за тот же интервал времени.

Чаще всего за единицу времени измерения выбирают 100 с.

По результатам измерений строятся графики зависимостей активностей растворов от времени, рассчитываются активности фаз на момент их разделения (¿о), коэффициент распределения, степень выделения дочернего изотопа и проводится статистическая обработка результатов.

По аналогии с описанным экспериментом компьютерное моделирование радиометрического контроля процесса экстракции радионуклидов должно содержать следующие этапы:

— ввод исходных данных;

— математическое моделирование процессов радиоактивного распада материнского и дочернего изотопов в исходном растворе, водной и органической фракциях;

— имитация измерений детектором излучений числа импульсов каждого из растворов в течение заданного времени;

— построение графиков зависимости активностей растворов (фракций) от времени;

— расчёт активностей водной, органической фаз и исходного раствора на момент окончания процесса экстракции — разделения фаз;

— расчёт коэффициента распределения;

— моделирование статистики эксперимента.

Под исходными данными здесь подразумеваются периоды полураспада радионуклидов, исходная активность материнского изотопа, время накопления дочернего изотопа в исходном растворе и предполагаемый коэффициент распределения дочернего изотопа между водной и органической фазами. Для моделирования радиометрических измерений необходимо также задать в программе время «включений» детектора, длительность измерений (интервалов подсчёта импульсов) и коэффициент счётности детектора излучений.

Ключевыми моментами компьютерной программы являются:

— моделирование радиоактивного распада для смеси изотопов с учётом вероятностного характера процесса;

— подсчёт числа импульсов, полученных в произвольно заданные моменты времени за сеансы имитации измерений активностей растворов детектором.

Для решения описанной задачи разработана математическая модель радиоактивного распада смеси материнского и дочернего изотопов на основе законов радиоактивных равновесий и закона распределения Пуассона для необратимых случайных процессов [6].

Описание модели. Распад радионуклида экспериментально наблюдается с помощью детектора излучений, который регистрирует количество импульсов через определённые интервалы времени. Следовательно, в качестве математической модели такого эксперимента можно предложить последовательность или массив чисел, равных интервалам времени между регистрируемыми актами распада:

N

п

i=Nисх

где Qi — интервал времени, прошедший между (г — 1)-м и г-м актами регистрации импульсов.

Так как радиоактивный распад ядер является необратимым случайным процессом и подчиняется распределению Пуассона, то для расчёта интервала времени между двумя актами регистрации импульсов [7] можно использовать формулу

д = "Т^Т1®(1"д)' (2)

где Q — интервал времени между случайными событиями при необратимом случайном процессе (далее — поток Пуассона); Е — случайное целое число в интервале [0,1]; 1иЬ1 — интенсивность потока Пуассона. По определению

1пП = —!—, (3)

¿сред.

где ¿сред. — средний интервал времени между двумя случайными событиями, обратно пропорциональный средней скорости событий.

Активность радионуклида зависит от количества его атомов (Ж) и вероятности (постоянной) радиоактивного распада (X), которая, в свою очередь, связана с периодом полураспада соотношением

№

Т 1/2

т. е. А = ХЖ.

Таким образом, для процесса регистрации импульсов радиоактивного распада интенсивность потока Пуассона определяется активностью измеряемого радионуклида, так что

1иП = ксч.А2 = ксч.Х2^2, (5)

где ксч. — коэффициент счётности детектора; А2 — активность регистрируемого (дочернего) изотопа, имп/с; Х2 — постоянная распада дочернего изотопа, 1/с; Ж2 — число атомов дочернего изотопа.

Со временем число атомов дочернего изотопа изменяется по закону радиоактивного распада для системы двух изотопов, находящихся между собой в генетической связи (см. [8]):

N2 = + ^^ - е-^] , (6)

Х2 — Х1

где N1,0, N2,0 — соответственно количество атомов материнского и дочернего изотопов в начальный момент времени ¿о; Х1 — постоянная распада материнского изотопа; Х2 — постоянная распада дочернего изотопа.

В этом случае интенсивность потока Пуассона для процесса регистрации импульсов от дочернего изотопа можно выразить

1пП = ксчА2,0е~м + ¿1,07-^- [е-^ - . (7)

Х2 — Х1

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Введём коэффициент распределения дочернего изотопа

Аорг.

(8)

водн. А2,о

Тогда для органической фазы, в которую материнский изотоп не экстрагируется,

Ао = 0;

1пПорг, = ксчА21о-^— е"К (9)

а +1

После окончания экстракции и отделения органической фракции от водной в последней из-за нарушения радиоактивного равновесия начинает накапливаться дочерний изотоп за счёт распада материнского. Тогда для водной фазы

1 X

1пПвот. = ксчА21о—~ е-}* + ¿1,0 7—Ц- - , (10)

а +1 Л2 — XI

где ¿1,0 и ¿2,0 — активности материнского и дочернего изотопов в момент разделения фаз (¿о) соответственно, т. е. на момент окончания процесса экстракции.

Пусть в начальный момент времени эксперимента ¿исх. число атомов материнского изотопа ^1,исх., а число атомов дочернего изотопа

^2,исх. =0, (11)

после чего дочерний изотоп накапливается (и начинает распадаться) за некоторое время ¿накопл. до момента разделения фаз в процессе ¿0 экстракции:

¿накопл. ¿0 ¿исх. • (12)

Тогда активность дочернего изотопа в исходном растворе на момент разделения фаз определяется формулой

А2,о = ¿1,исХ. т-^т- [е-'14 - , (13)

Х2 — XI

где ¿1,исх. = Х1^1,исх. — исходная активность материнского изотопа.

Поскольку каждый акт распада уменьшает число атомов на 1, то средняя скорость распада, а значит, и интенсивность потока Пуассона уменьшаются в процессе эксперимента, и это необходимо учесть при расчёте интервала времени между регистрируемыми импульсами по формуле (2).

Таким образом, используя формулы (2)—(13), можно рассчитать массивы интервалов времени между последовательно регистрируемыми импульсами радиоактивного распада дочернего изотопа в исходном растворе, органической и водной фазах. Полученные массивы являются достоверной математической моделью эксперимента по наблюдению радиоактивного распада с помощью детектора излучения.

Задавая в программе время измерений активности — моменты «включения детектора» — и продолжительность измерений (например, 100 с), можно провести выборки из полученных массивов и подсчитать число импульсов, попавших — «зарегистрированных детектором» — в выбранный интервал времени. Поскольку в формуле (2) присутствует случайное число Я, то при каждом новом старте программы для одинаковых начальных условий получаются массивы интервалов времени, отличные от предыдущих, в пределах статистики Пуассона. Рассчитанные значения количества импульсов также будут несколько различаться аналогично результатам, наблюдаемым в эксперименте.

Предлагаемая математическая модель соответствует реальной статистике закона радиоактивного распада и отражает вероятностный характер процесса. Она положена в основу компьютерной программы «Радиометрия 1.0», предназначенной для моделирования радиометрических измерений в процессах экстракционного разделения изотопов.

Описание программы. Компьютерная программа «Радиометрия 1.0» написана на языке VBasic 5.0 , является автономным файлом «exe», имеет «оконный» интерфейс и совместима со всеми версиями ОС Windows. Программа состоит из модулей: «Моделирование измерений», «Обработка экспериментальных данных» и «Контрольная задача».

После ввода исходных данных:

— периода полураспада материнского изотопа,

— периода полураспада дочернего изотопа,

— исходной активности материнского изотопа,

— времени, прошедшего с момента начала накопления дочернего изотопа до момента разделения фаз,

— предполагаемого коэффициента разделения,

— коэффициента эффективности (счётности) детектора излучений — программа рассчитывает массивы интервалов времени между регистрируемыми импульсами распада дочернего изотопа в исходном растворе, водной и органической фазах.

По окончании ввода значений времени включения детектора и интервалов, в течение которых регистрируются импульсы, программа выбирает из массивов заданные временные интервалы и подсчитывает число импульсов, попавших в эти интервалы. Результаты расчётов программно вводятся в таблицу и могут быть сохранены в виде бинарного файла, пригодного для использования в других программах (например, «MS EXCEL»).

С помощью модуля «Обработка экспериментальных данных» строятся графические зависимости рассчитанных активностей от времени. Из графика изменения активности органической фазы в полулогарифмических координатах получают значение активности этой фазы на момент разделения АОрГ'.

Значение активности дочернего изотопа в водной фазе на момент разделения фракций рассчитывается по формуле (см. [9])

AfT'ie-^2 - e-x2t2 ) _ Ав°;цн' (e-lltl - e-^ )

^водн. _ ¿,ti \_/_Z,t2 У_(14*1

g — g-_ g ——'

где AT', AT' — активности дочернего изотопа в водной фазе, измеренные в моменты времени ti и t2 соответственно; Xi, X2 — постоянные распада материнского и дочернего изотопов.

Получаемые графики наглядно демонстрируют зависимость активностей и соответственно количества дочернего изотопа в исходном растворе, водной и органической фазах от времени. Эти графики также можно сохранить в файлах в формате .bmp совместно с файлами таблиц измерений.

Меняя исходное количество материнского изотопа, время накопления дочернего изотопа и предполагаемый коэффициент их разделения, можно программно подобрать условия, при которых будет накапливаться определённое количество дочернего изотопа (в граммах), и рассчитать его по формуле

_ МА2Р0Г'Т2

то2

6 • 1023кгч Ы2'

где М — атомная масса дочернего изотопа; Т2 — период полураспада дочернего изотопа.

При установке в программе «флажка» в строке «Статистика» можно многократно «включать» детектор регистрации излучения для одних и тех же начальных условий, получать большой набор экспериментальных данных и рассчитывать статистическую погрешность эксперимента, используя формулы

-^орг. _ ™ Тводн. _ ™

2,0 — п ' 2,0 — п '

i=1 i=1

лорг. _ , /^орг. чводн. _ -ГВ°ДН- , /т-водн.

а2,0 = а2,0 ^у а2,0 1 а2,0 = а2,0 ^ V А2,0

борг. — -торг. 100 %, 5водн. — -тводн. 100 %, А2,0 А2,0

-торг. -7-водн.

где А2 о , А о — среднее значение активностей дочернего изотопа в органической и водной фазах соответственно на момент их разделения, рассчитанное из результатов п измерений; 5орг, 5водн. — относительные ошибки определения активностей дочернего изотопа на момент разделения органической и водной фаз.

Коэффициент распределения дочернего изотопа между фазами, с учётом статистических наблюдений, определяется как среднее между минимальным и максимальным значениями этой величины, а именно:

2,0 ~ V 2'° 2'° V 2'° - ашт + ап

*-7 —111 ал *-7 — ..

-¡-ВОДН. /-¡-ВОДН. -¡-водн. /-¡-водн. 2

А2 , о + V А2 , о А2 , о _ V А2 , о

(15)

В зависимости от начальных условий модельного эксперимента, а также от набранной статистики измерений рассчитанный коэффициент распределения с разной степенью точности совпадает с заданным в программе. Таким образом, можно оценить достоверность радиометрического определения эффективности экстракции с модельным экспериментом.

Модуль «Контрольная задача» разработан для использования программы в обучающих целях. При выполнении «Контрольной задачи» коэффициент распределения дочернего изотопа задаётся программно с помощью генератора случайных чисел, запоминается в служебном файле и заранее неизвестен. Обучающиеся должны провести моделирование радиометрического экстракционного разделения и рассчитать коэффициент распределения дочернего изотопа между фазами. Сходимость рассчитанного и заданного программой значений является свидетельством правильности выполнения задачи.

Пример использования компьютерной программы «Радиометрия 1.0» в практической работе. Выделение изотопа висмута 212Bi проводится методом жидкостной экстракции из смеси изотопов 212РЬ (№В, Т1/2 = 10,6 ч) и 212Bi (№С, Т1/2 = 60,5 мин) [9], находящихся между собой в подвижном радиоактивном равновесии. Исходный радионуклид 212 РЬ является членом ториевого ряда и образуется в то-роновом (высокоэманирующем) источнике при а-распаде 216Ро (№А, Т1/2 = 0,158 с) [5]. В качестве экстрагента используется свежеприготовленный 0,2 %-ный раствор ди-тизона в четырёххлористом углероде. Подробное описание процесса экстракционного разделения данной радиоактивной пары можно найти в работе [9].

После экстракционного разделения фаз проводят измерения радиоактивности: — органической фазы — через каждые 10-15 мин, наблюдая распад 212 В^

а

— водной фазы — через каждые 15-20 мин, наблюдая накопление 212 Bi за счёт распада 212 РЬ.

Параллельно с измерением активности органической и водной фаз измеряют активность исходного раствора — «равновесную» смесь (212РЬ + 212В^ — через каждые 30 мин, как минимум, в течение полутора часов, наблюдая уменьшение активности исходного раствора за счёт распада 212РЬ.

В табл. 1 приведены данные измерений активности исходного раствора, органической и водной фракций, полученные в трёх экспериментах по выделению изотопа 212 Bi без носителя методом жидкостной экстракции. Здесь и далее в таблицах выражение «А имп/100 с» означает число импульсов, зафиксированных детектором излучений за 100 с. Предполагается, что эффективность регистрации (коэффициент счётности) одинаков для всех измерений и равен 10 %. На рис. 1 представлены данные эксперимента 1 (в качестве примера). Результаты экспериментов 2 и 3 — аналогичны.

Таблица 1

Определение коэффициента распределения изотопа 212Б1 радиометрическим методом

Исходный раствор Органическая фаза Водная фаза

t, мин А имп./ЮО с мин А имп./ЮО с мин А имп./ЮО с

Эксперимент 1

0 1670 10 520 15 610

20 1620 20 480 30 690

40 1580 30 420 45 830

70 1490 40 380 65 930

90 1450 50 330 80 1005

110 1410 60 290 - -

Птш = 1,15, атах = 1,36, а = 1,25

Эксперимент 2

0 2505 10 780 15 915

20 2430 20 720 30 1035

40 2370 30 630 45 1245

70 2235 40 570 65 1380

90 2175 50 495 80 1465

110 2115 60 435 -

аШт = 1,16, атах = 1,34, а = 1,25

Эксперимент 3

20 652 15 286 10 210

40 631 30 241 25 286

60 603 45 195 40 345

80 584 60 154 55 410

100 561 75 130 70 465

120 542 90 122 - -

аШт = 1,97, атах = 2,59, а = 2,28

Значения активности органической фазы в момент разделения АОрГ' получены линейной экстраполяцией функции зависимости логарифма активности А0рг' от времени на ось У. Значения активности водной фазы в момент разделения АВТ' рассчитаны по формуле (14). Минимальный, максимальный и средний коэффициенты распределения

212Bi рассчитаны по формулам (15).

1800

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

1600

1400

1200

= Е 1000

и

800

600

400

200

Исходный раствор Водная фаза

Органическая фаза

1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 t, с

Рис. 1. Зависимость изменения активности исходного раствора, водной и органической фаз от времени по данным радиометрического эксперимента

Данные результатов компьютерного моделирования аналогичной задачи приведены в табл. 2 и представлены на рис. 2. В табл. 2 указаны вводимые в программу данные: исходная активность материнского и время накопления дочернего изотопов.

Таблица 2

Определение коэффициента распределения изотопа методом компьютерного моделирования

2Б1

Исходный раствор

Органическая фаза

Водная фаза

Эксперимент 1. Атьв,исх. = 500 имп./с, Ь

накопл

= 18 ч

0 1700 10 866 15 884

20 1635 20 783 30 987

40 1609 30 665 45 1045

70 1564 40 614 65 1115

90 1478 50 554 80 1179

110 1439 60 458 - -

1,20, ап

1,38, а = 1,29

Эксперимент 2. Атьв,исх. = 500 имп./с, Ь

накопл

= 12 ч

0 2511 10 1255 15 1302

20 2515 20 1100 30 1550

40 2395 30 950 45 1519

70 2344 40 917 65 1691

90 2305 50 735 80 1771

110 2276 60 700 - -

1,21, ап

1,36, а = 1,29

Эксперимент 3. Атьв,исх. = 100 имп./с, Ь

накопл.

= 8 ч

20 661 15 405 10 263

40 588 30 298 25 266

60 612 45 278 40 327

80 612 60 204 55 349

100 590 75 186 70 405

120 574 90 174 - -

2,00, ап

2,53, а = 2,27

Сравнение приведённых в табл. 1, 2 результатов показывает соответствие математической модели реальному радиометрическому исследованию. Разброс значений

0

а

Рис. 2. Зависимость изменения активности исходного раствора, водной и органической фаз от времени по данным компьютерного моделиро-

1800 1600 1400 о 1200 2 1000 ^ 800 600 400 200

Исходный раствор Водная фаза

Органическая фаза

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000

г, с

Рис. 3. Зависимости активности растворов от времени, полученные в результате моделирования однократного измерения и среднего из трёх измерений

1800-1 1600 140012001000 800 600400 200 0

___ Исходный раствор

*-*-*—* *

-*—*—*—В

Водная фаза

х — однократное измерение Е — среднее из трёх измерений

Органическая фаза

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000

г, с

активности относительно теоретической кривой радиоактивного распада, получаемый благодаря применению потока Пуассона в математической модели радиоактивного распада, аналогичен получаемому при реальных измерениях. При этом на один модельный эксперимент затрачивается от 2 до 5 мин (в зависимости от скорости процессора компьютера), в то время как реальный эксперимент, с учётом времени, необходимого для равновесного накопления дочернего изотопа 212В^ длится примерно 2-3 дня.

Следует отметить, что компьютерная программа позволяет моделировать сколь угодное число измерений и повышать точность определения коэффициента распределения за счёт набора статистики эксперимента. В табл. 3 приведены данные результатов моделирования с накоплением статистических данных, а на рис. 3 этот пример проиллюстрирован. На нём видно, как накопление данных «сглаживает» ошибки эксперимента и кривые распада приближаются к теоретическим.

Заключение. Из сравнения представленных выше экспериментальных данных и данных компьютерного моделирования можно сделать вывод, что математическая модель, положенная в основу программы «Радиометрия 1.0», соответствует реальным процессам радиоактивного распада и накопления изотопов и адекватно отражает случайный характер процессов. Разработанная программа может использоваться для моделирования условий реального эксперимента по выделению дочернего изотопа как методом жидкостной экстракции, так и другими методами. Например, из табл. 1 видно, что коэффициент распределения дочернего изотопа между органической и водной

фазами изменяется от 1,35 до 2,70 в зависимости от количества дочернего изотопа в исходном растворе. Это означает, что при одинаковой эффективности экстрагента (экстракционной смеси) процент выделенного дочернего изотопа будет зависеть от начальных условий эксперимента: исходного количества материнского изотопа, времени накопления дочернего изотопа и соотношения скоростей распада материнского и дочернего изотопов. Компьютерное моделирование позволит без затрат времени, химических реактивов и при полной экологической чистоте эксперимента оптимизировать исходные условия выделения целевого радионуклида.

Таблица 3

Результаты моделирования измерений радиоактивности исходного раствора, органической и водной фаз с накоплением данных

Ь, с Аисх./100 с АорГ./100 с Аводн./100 с

1 2 3 среднее 1 2 3 среднее 1 2 3 среднее

1 1630 1713 1767 1703 990 1005 1002 992 679 715 697 706

900 1642 1624 1708 1658 777 801 841 816 861 825 826 845

2100 1636 1650 1574 1620 631 648 670 646 971 989 1046 1000

3300 1605 1506 1546 1552 501 531 509 517 1122 1047 1084 1090

4500 1588 1575 1522 1561 375 380 434 394 1147 1168 1144 1143

5000 1522 1606 1549 1559 391 337 388 379 1181 1149 1214 1181

5700 1538 1530 1462 1510 320 308 320 320 1208 1250 1195 1219

6900 1422 1509 1530 1487 220 259 231 241 1206 1303 1218 1246

7100 1464 1495 1533 1497 247 237 235 241 1202 1214 1311 1235

8300 1451 1461 1509 1473 203 193 192 199 1269 1254 1231 1262

9500 1476 1456 1382 1438 148 171 161 156 1305 1289 1260 1272

10700 1414 1421 1451 1428 118 125 108 119 1287 1247 1284 1270

11900 1377 1418 1356 1383 114 89 99 102 1233 1295 1263 1255

13100 1359 1361 1260 1327 97 74 89 89 1238 1252 1270 1252

Программа также может быть использована в обучающих целях для лучшего понимания студентами экстракционных процессов, физических и статистических закономерностей радиоактивного распада и накопления в качестве безопасного и экономичного многократного тренинга перед реальным радиохимическим экспериментом.

В программе предусмотрен модуль «Контрольная задача», в котором коэффициент распределения обучающемуся заранее неизвестен. Чтобы его рассчитать, необходимо осознанно выполнить все стадии моделирования, аналогичные радиометрическим измерениям в практической работе. Преподаватель, сравнивая коэффициент распределения, заданный программой, с результатом, полученным при выполнении модельного эксперимента студентом, может оценить степень готовности последнего к выполнению практической задачи, что важно при работе с радиоактивными веществами.

Отметим, что предварительное компьютерное моделирование радиохимических задач особенно актуально в свете возросших требований к экологической безопасности реальных научных и учебных экспериментов, связанных с радиоактивностью и источниками ионизирующих излучений.

Литература

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

1. Нефёдов В. Д., ТекстерЕ. Н., ТороповаМ.А. Радиохимия. М., 1987. 272 с.

2. Мягкова-Романова М. А., Макаров Л. Л. Применение методов компьютерного моделирования к изучению экстракционных систем // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4: Физика, химия. 1995. Вып. 4. С. 71-74.

3. Мягкова-Романова М. А., Макаров Л. Л. Опыт моделирования экстракционных процессов // Радиохимия. 1988. Т. 40. № 2. С. 113-121.

4. Мягкова-Романова М. А., Макаров Л. Л. Изучение влияния аниона и экстрагента на коэффициент распределения солей уранила методом математического моделирования // Радиохимия. 2001. Т. 43. № 4. С. 345-350.

5. Сборник практических работ по радиохимии: учеб. пособие. СПб., 2010. 72 с.

6. Рытов С. М. Случайные процессы. М., 1976. 164 с.

7. ГмурманВ. Е. Теория вероятностей и математическая статистика. М., 2008. 479 с.

8. МуринА.Н. Физические основы радиохимии. М., 1971. 288 с.

9. Сборник лабораторных работ по радиохимии: учеб. пособие. СПб., 2003.

Статья поступила в редакцию 13 мая 2011 г.

УДК 541.64:536.7

Вестник СПбГУ. Сер. 4. 2011. Вып. 4

В. М. Юдович, М. Е. Юдович, А. Н. Пономарёв, А. М. Тойкка

ЭФФЕКТЫ СИНЕРГИЗМА ПРИ МОДИФИКАЦИИ ЭПОКСИНОВОЛАЧНЫХ КОМПОЗИТОВ ФУЛЛЕРОИДНЫМИ НАНОЧАСТИЦАМИ ТОРОИДАЛЬНОЙ ФОРМЫ

В настоящей статье изложены результаты работы, продолжающей цикл теоретических исследований и экспериментов по выяснению механизмов и последствий наномоди-фикации полимерных сред активными углеродными частицами [1—6]. Так, в частности, в работах [2, 3] был рассмотрен эффект взаимодействия плоской электромагнитной волны с неметаллическими наночастицами различной топологии (реально синтезированных к настоящему времени). Подробно не останавливаясь на выводах, приведём лишь наиболее принципиальный: это наличие гигантского (до 105 раз) усиления поля при падении его на поверхность наночастицы тороидальной формы (рис. 1). При этом наибольший эффект достигается, как показали дополнительные расчёты, для частиц с определёнными размерами, а именно: радиус тора Я = 20 + 30 нм; радиус сечения тора плоскостью, перпендикулярной его плоскости, г = 4 + 5 нм (на рисунке г = 4 нм). Именно такой топологией обладают так называемые астралены [7]. В то же время для нанотрубки аналогичное усиление составляет всего несколько десятков раз, а в случае сферической частицы вообще отсутствует.

105

R, нм

1,5 2,0 2,5

Диэлектрическая проницаемость

Рис. 1. Зависимость коэффициента усиления поля от диэлектрической проницаемости торообразной наночастицы: длина волны X = 109 нм

Далее, хорошо известна теоретически обоснованная [8, 9] и экспериментально подтверждённая [10] общая теория ван-дер-ваальсовых сил между телами. Получаемые в рамках данной теории соотношения весьма сложны. Так, например, для силы взаимодействия между двумя телами с площадью в, разделёнными прослойкой толщиной I,

имеем (см. [9])

П

- g_

32л;/2 J

о

= —в--г / (¿со / ж2с£е

(£1 +£3)(Ё2 +Ё3) &х _ г (£1 - £з)(£2 - £3)

Л ПЮ0 т

= ^123—в, (1)

где А123 — так называемая константа Гамакера, а диэлектрические проницаемости граничащих сред £1, £2 и £3 зависят от частоты. Силу (или энергию) взаимодействия по формуле (1) напрямую рассчитать нельзя, хотя бы потому, что неизвестны значения диэлектрических проницаемостей в полубесконечном частотном интервале. Однако существуют оценки [9] и прямые физические измерения [10], которые показывают, что напряжённость поля ван-дер-ваальсовой природы на поверхности любого физического тела составляет 104-106 В/см. Именно с наличием этих полей связывают существование таких явлений, как адгезия и когезия, а также физсорбцию.

Если поместить на межфазную границу (т. е. на границу сред с разными диэлектрическими проницаемостями) тороидальную наночастицу, то следует ожидать гигантского (на 4-5 порядков) усиления ван-дер-ваальсовых сил взаимодействия. Другими словами, синергизм двух факторов — наличие межфазной границы и наночастицы специальной топологии — может привести к образованию совершенно необычных структур, особенно в системах с химическими реакциями.

Для экспериментального подтверждения данного теоретически предсказанного эффекта нами были выбраны композиции на основе эпоксиноволачной смолы DEN431 (отвердитель — диаминодифенилсульфон, ДАДФС). Предварительные результаты, опубликованные в работе [5], с очевидностью показали, что использование астрале-нов в качестве модификаторов позволяет сильно и немонотонно изменять структуру и практически значимые свойства эпоксидных композиционных материалов.

Авторами предпринята попытка более детального и количественного исследования обнаруженного эффекта. При этом в качестве основного был выбран метод ИК-спек-троскопии. Принципиальным моментом, как следует из вышеизложенного, является сравнение двух ситуаций в полимеризующейся системе:

а) «объёмная» полимеризация (при отсутствии в системе межфазных границ);

б) «поверхностная» полимеризация (в системе с межфазными границами).

Условия приготовления и модификации образцов подробно изложены в работе [5].

Спектры пропускания регистрировались с помощью ИК-фурье-спектрофотометра FTIR SHIMADZU 84008 в таблетках КВг и тонких эпоксицеллюлозных плёнках. Определялась зависимость интенсивности (в единицах оптической плотности) характеристических полос реагирующих эпокси- и аминогрупп от концентрации вводимого в систему наномодификатора.

Изучались среды со следующими значениями концентраций астраленов: 0, 0,003, 0,005, 0,007, 0,01, 0,02, 0,05 и 0,1 мас. % для обеих экспериментальных ситуаций, причём в ситуации (б) использовалась в качестве подложки целлюлоза [5]. Была также выбрана аналитическая область спектра (680-920 см-1), в которой поглощают реагирующие функциональные группы.

На рис. 2, 3 приведены спектры пропускания немодифицированных образцов, нормированные по интенсивности. При этом нормировка для «объёмной» ситуации выполнялась по полосе сульфогруппы ДАДФСа 1140 см-1 (не участвующей в реакции), а для «поверхностной» ситуации — по полосе целлюлозы в области 870 см-1. Такой выбор полос внутреннего стандарта обусловлен тем, что интенсивное поглощение целлюлозы полностью маскирует поглощение сульфогруппы в окрестности 1140 см-1.

Рис. 2. Спектр поглощения отверждённой эпоксидной смолы в аналитической области:

«объёмная» ситуация; пунктирной линией обозначен экспериментальный спектр, сплошной — суммарный спектр

Волновое число, 1/см

Рис. 3. Спектр поглощения отверждённой эпоксидной смолы в аналитической области:

«поверхностная» ситуация; пунктирной линией обозначен экспериментальный спектр, сплошной — суммарный спектр

821 1/см — полоса отвердителя

0,7 ------------------------------------------------------------------------------------

и

3 03

е

у

и т п

О 0,2

0,1

0

0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,10 Концентрация астраленов, мас. %

Рис. 4- Зависимость интенсивности полосы аминогруппы от концентрации

астраленов в матрице: «объёмная» ситуация

На рис 2, 3 показано разделение спектров на составляющие их полосы. Разделение проводилось в предположении лорентцева контура всех полос по программе [11]. Легко убедиться, что в рассматриваемой спектральной области содержится 8 полос поглощения эпоксидной матрицы. Это справедливо и для всех других образцов, изученных в настоящей работе. Отнесение полос было сделано в соответствии с данными [12]. Результаты отнесения следующие:

— полосы в области 914, 785 и 754 см-1 принадлежат поглощению эпоксигрупп смолы;

— полосы в области 820 и 720 см-1 — поглощению аминогрупп отвердителя.

Таким образом, проследив за изменением интенсивности этих полос, в зависимости

от концентрации модификатора, можно определить результаты влияния последнего на реакцию полимеризации эпоксиноволачной смолы. Кривые для всех полос ведут себя одинаковым образом, поэтому мы привели лишь некоторые из них (рис. 4, 5).

Анализ представленного материала свидетельствует о том, что астралены в процессе «объёмной» полимеризации выступают как эффективный катализатор, значительно уменьшая количество непрореагировавших эпокси- и аминогрупп. Максимума этот эффект достигает при концентрациях наномодификатора 0,01-0,02 мас. %. Интересно, что при дальнейшем увеличении концентрации эффект заметно ослабевает. Это можно объяснить либо вторичной агломерацией наночастиц, либо их взаимным экранированием.

Принципиально другая картина наблюдается при введении в реагирующие системы межфазных границ (графики соответствующих зависимостей приведены на рис. 6, 7).

В случае «поверхностной» полимеризации эффект катализирования сохраняется лишь при малых концентрациях астраленов (вплоть до 0,005 мас. %). При дальнейшем

754 1/см — полоса отвердителя

0,6 т....................................................................................

з

Н 0,2 ■ ■ О

0,1 -

0

0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,10 Концентрация астраленов, мас. %

Рис. 5. Зависимость интенсивности полосы эпоксигруппы от концентрации

астраленов в матрице: «объёмная» ситуация 821 1/см — полоса отвердителя

Концентрация астраленов, мас. %

Рис. 6. Зависимость интенсивности полосы аминогруппы от концентрации

астраленов в матрице: «поверхностная» ситуация

увеличении количества наночастиц наблюдается явление, меняющее, можно сказать, знак эффекта. Это явление назовём ингибированием реакции. Существенно, что при

754 1/см — полоса отвердителя

0,8т------------------------------------------------------------------------------------

[3 0,3-

с

О

0,2-

0,1--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

0

0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,10 Концентрация астраленов, мас. %

Рис. 7. Зависимость интенсивности полосы эпоксигруппы от концентрации

астраленов в матрице: «поверхностная» ситуация

увеличении концентрации астраленов в условиях конкуренции двух эффектов — ката-лизирования и ингибирования — преобладает последний.

Учитывая, что две рассмотренные экспериментальные ситуации различаются лишь наличием во втором случае межфазной границы, следует констатировать, что мы имеем дело с проявлением резонансно усиливающей ван-дер-ваальсовы поля (на границах раздела) способности астраленов. Именно это свойство данных частиц было рассмотрено выше.

В качестве заключения следует отметить, что реализация в среде с химической реакцией двух конкурирующих и разнонаправленных процессов обеспечивает формирование эпоксиноволачного композита с повышенными физико-механическими характеристиками, такими как прочность на разрыв, повышенная термостойкость и улучшенные мембранные свойства [5, 6].

И ещё одно важное обстоятельство. В подавляющем числе случаев при исследованиях структуры полимерных нанокомпозитов исходят из аддитивности свойств матрицы и наполнителя [13]. Результаты нашей работы свидетельствуют о неправомерности этих представлений. Если для модификации используют действительно активные на-ночастицы, следует ожидать синергизма действия различных эффектов.

Литература

1. Гуняев Г. М., Каблов Е. Н., Ильченко С. И. и др. Наномодифицированные углепластики с повышенной вязкостью разрушения // Труды ТПКММ-2006. М., 2006. С. 88-98.

2. Пономарёв А. Н, ЮдовичМ.Е, Груздев М. В., Юдович В. М. Неметаллическая наноча-стица во внешнем электромагнитном поле. Топологические факторы взаимодействия мезо-структур // Вопросы материаловедения. 2009. № 4(60). С. 17-22.

3. Ponomarev A. N., Yudovitch M. E., Gruzdev M. V., Yudovitch V. M. Theoretical estimation of topological factor in interaction of the nanoparticles with electromagnetic waves // J. Scientific Israel — Technological Advantages. 2009. Vol. 11. N 3. P. 20-26.

4. Юдович В. М., Юдович М. Е., Тойкка А.М., Пономарёв А. Н. Физико-химические свойства плёночного нанокомпозитного материала полифениленоксид—астрален и возможность его использования при мембранном разделении // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4: Физика, химия. 2009. Вып. 3. С. 59-65.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

5. Юдович В. М., Морозова С. Е., Юдович М. Е. и др. Физико-механические и мембранные свойства наномодифицированного композита эпоксиноволачная смола—астрален // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4: Физика, химия. 2010. Вып. 3. С. 82-89.

6. Юдович В. М. Наночастицы фуллероидной природы как эффективные модификаторы структуры реактопластов // Материалы межд. научного форума «Ломоносов-2011». Секция физ. химии I. М., 2011.

7. Пономарёв А. Н., Юдович М. Е. Многослойные углеродные наночастицы фуллероидного типа тороидальной формы // Патент РФ № 2397950, приоритет от 23 апреля 2008 г., реестр ФИПС 27.08.2010.

8. ДзялошинскийИ. Е., ЛифшицЕ. И., ПитаевскийЛ. П. Общая теория вандерваальсовых сил // Усп. физ. наук. 1961. Т. 73. Вып. 3. С. 381-422.

9. БарашГ. С., ГинсбургВ. Л. Электромагнитные флуктуации в веществе и молекулярные (вандерваальсовы) силы между телами // Усп. физ. наук. 1975. Т. 116. Вып. 1. С. 5-81.

10. Israelachvili J. N. Intermolecular and Surface Forces, Third Edition. London: Academic Press, 1992. 450 p.

11. MagicPlotStudent. URL: http://magicplot.com (дата обращения: 10.10.2007).

12. Mayo D. V., Miller F. A., Hannah R. V. Course notes on the interpretation of infrared and Raman spectra. [W. p.]: A John Willey & Sons publication, 2003. 567 p.

13. Углерод: фундаментальные проблемы науки, материаловедение, технология // Материалы 7-й межд. конф. Владимир, 2010. 488 c.

Статья поступила в редакцию 3 июня 2011 г.

УДК 06.54.31

Вестник СПбГУ. Сер. 4. 2011. Вып. 4

Д. Г. Летенко, В. А. Никитин, К. Н. Семёнов, Н. А. Чарыков, А. А. Золотарёв, А. С. Иванов

МЕХАНИЗМ ПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРИЧЕСТВА И КЛАСТЕРИЗАЦИИ В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ ФУЛЛЕРЕНОЛА-d*

Введение. Как известно, лёгкие фуллерены (Сбо и C70) находят в настоящее время широкое применение в самых различных областях науки и техники (см. обзорные работы [1, 2]). Однако их широкое применение зачастую тормозится практически полной несовместимостью с водой и водными растворами. Например, истинная растворимость фуллерена Сб0 в воде при 25 С составляет 1,3 • 10"11 г/л, а фуллерена C70 в тех же условиях — 1,1 • 10"13 г/л согласно [2-4]. То же относится и к большинству производных лёгких фуллеренов (галоген- [фтор-, хлор-, бром- и иод-], оксо-, амино-, карбоксо-и т. п.) — они, как правило, малорастворимы в воде и водных растворах (см., например, в [3, 4]).

Между тем водорастворимые формы производных фуллеренов могут находить самое широкое применение в машиностроении (в водорастворимых охлаждающих и антифрикционных составах), строительстве (в качестве растворимых присадок к цементам и бетонам), медицине и фармакологии (вследствие хорошей совместимости с водой, физиологическими растворами, кровью, лимфой, желудочным соком), косметологии (при использовании водных и водно-спиртовых основ), а также в других областях науки и техники.

Договоримся о терминах. К фуллеренолам имеет смысл относить не только гидроксилированные производные самого легкодоступного из всех фуллеренов (Сбо) — Сб0(ОН)ж, но и производные всех других индивидуальных фуллеренов С„(ОН)ж (n = 60, 70, 76, 78, 84, 90 ...), причём помимо собственно гидроксильных групп в фулле-ренолы могут входить также некоторые иные негидроксильные группы — кислородные (=О, -О-) С„(ОН)жОу, солевого типа, например [С„(ОН)жОу](ONa)z. Наконец, к фул-леренолам отнесли смеси индивидуальных фуллеренолов разного состава или индивидуальные фуллеренолы невысокой чистоты (например, менее 95 мас. %) [5-8].

Синтез и идентификация фуллеренола-d. Нами был выбран метод прямого синтеза [5, 6, 8], как более простой и устойчивый. Фуллеренол, полученный по этому методу, здесь и ниже будем называть «фуллеренол-d», т. е. фуллерен "direct". Выбранный метод основан на прямом одностадийном гомогенно-каталитическом окислении фуллерена Сб0 в бензольном растворе в присутствии катализатора — гидроксида тетрабутиламмония [(н-С^д^N]OH, с последующей отгонкой бензола, растворением фуллеренола в воде и перекристаллизацией продукта — осаждение метанолом ^ растворение в воде.

Идентификация фуллеренола-d проводилась методами электронной спектроскопии с помощью спектрофотометра SPECORD M-32, инфракрасной спектроскопии на приборе SHIMADZU FTIR-8400S, высокоэффективной жидкостной хроматографии. Условия эксперимента были следующими: жидкостный хроматограф — "Lumachrom"

* Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (№ 11-08-00219-а), а также всероссийского конкурса «Поддержка высокотехнологичных инновационных молодёжных проектов» и федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009—2013 гг. (государственный контракт № 16.740.11.0437).

lg (а, мкСм/см) 543210

-3 -2 -1 lg (С, мас. %)

3 -2 -1 lg (С, мас. %)

lg Ц,(Н+)

lg Цо(он-)

Рис. 1. Зависимость удельной (а) и молярной (б) объёмной электропроводности истинных водных растворов фуллеренола-(1 (^ а, ^ ц) от массового процента фуллеренола-(1 (^ С) при 25 °С

0

1

фирмы "Lumex" (С.-Петербург) масс-спектрометрии — в работе использован брукеров-ский масс-спектрограф MICROTOF (Bruker). Наши данные повсеместно соответствали имеющимся в литературе по идентификации фуллеренолов, полученных вышеуказанным методом [5-8]. В результате идентификации мы установили формальную усреднённую формулу молекул фуллеренола-d — Сб°(0Н)2°^220°^з, что вполне соответствует работам [5, 6, 8]. В дальнейших расчётах принимали условную молекулярную массу фуллеренола-d равной 1128 а. е., т. е. отвечающей условной формуле фуллерено-ла-d — Сбо(0Н)24.

Измерение электропроводности водных растворов фуллеренола-d. Для

определения удельной электропроводности водных растворов фуллеренола-d (о) была задействована методика, описанная в работе [9], для измерений использовался измеритель электропроводности Cyber Scan PC-300, разрешающая способность составляла 0,05 отн. % от верхней границы диапазона измерений, точность измерений ±0,5 отн. %. Измерения удельной электропроводности продублированы в лаборатории кафедры физической химии СПбГТИ(ТУ) с использованием измерителя иммитанса RCL. Растворы были насыщены атмосферным воздухом. Опыты проводились в изотермических условиях — T = 25,0 ± 0,1 °С. Результаты измерений удельной электропроводности водных растворов фуллеренола-d в зависимости от массового содержания фуллеренола-d представлены на рис. 1. и в табл. 1.

В ходе измерений определялись:

— удельная электропроводность (данные с индексом *°) получена в истинных водных растворах фуллеренола-d без последующей ультразвуковой обработки;

— удельная электропроводность (данные c индексом *1) получена в истинных водных растворах фуллеренола-d с последующей пятиминутной ультразвуковой обработкой;

— удельная электропроводность (данные c индексом *2) получена в водных взвесях, представляющих собой водный раствор фуллеренола-d со взвешенным гибридным на-ноуглеродным материалом (HFNCM — см., например, [9, 10]) с концентрацией взвеси 10~5 мас. % без последующей ультразвуковой обработки;

— удельная электропроводность (данные е индексом *3) получена в водных взвесях, представляющих собой водный раствор фуллеренола^ со взвешенным гибридным наноуглеродным материалом (HFNCM) с концентрацией взвеси 10~5 мас. % с последующей пятиминутной ультразвуковой обработкой.

Значения молярной электропроводности ц получены по данным с индексом *0.

Таблица 1

Параметры электропроводности водных растворов фуллеренола^

№ раствора Концентрация С, мас. % Молярность М, моль/л Удельная электропроводность 0, мкСм/см Молярная электропроводность |i, См-см2/моль

1 0,00000 0,000 5,00*и -

2 0,00001 8,87 • 10~8 5,26*и 4,20й"1; 3,95*2; 4,03*3 59300

3 0,0001 1,77 • Ю-7 6,36*° б^Г1; 5,48*2; 5,90*3 7170

4 0,0002 8,87 • Ю-7 7,07*и 7,55й"1 3990

5 0,0005 4,43 • 10~6 12,7*и 13,4*1 2870

6 0,0007 6,21 • 10~6 16,8*и 17,б*1 2710

7 0,001 8,87 • 10~6 23,0*и 23,9*1; 23,б*2; 24,I*3 2590

8 0,01 8,87 • 10~Б 193*и 186*1; 177*2; 178*3 2180

9 0,1 8,87 • 10~4 1800*и 1690*1; 1630*2; 1620*3 2030

10 0,4 0,00355 6700*и 1890

11 1,0 0,00887 15200*и 1710

12 2,0 0,0177 29300*° 1650

13 3,0 0,0266 40200*и 1510

14 6,5 0,0576 70000*и 1210

Все базовые истинные растворы фуллеренола^ в воде (серий *0>*1) готовились гравиметрически (прямым растворением навески фуллеренола^ в определённой массе дистиллированной воды с последующей фильтрацией полученного раствора через бумажный фильтр «синяя лента»). Затем проводилось их последовательное разбавление. Аналогично готовились взвеси гибридного наноуглеродного материала (HFNCM) в истинных растворах фуллеренола^ в воде (серий *2'*3), причём фиксация концентрации

взвеси гибридного наноуглеродного материала (HFNCM) — 10-5 мас. % также происходила гравиметрически (по массе используемой взвеси).

На рис. 1 и в табл. 1 показано следующее:

1. Данные всех серий *°-*3 крайне близки друг к другу (находятся практически в пределах инструментальной ошибки), т. е. влияние дополнительного перемешивания, возможного разрушения ассоциатов (агрегатов) или наличие взвешенных микрочастиц (представляющих собой электронный проводник) в низких концентрациях практически не сказывается на значениях удельной объёмной электропроводности истинных растворов (взвесей) на основе фуллеренола-^ Поэтому, естественно, прочие данные — ^ а, ц, а, Кд, рКд — определены из данных с индексом полученных в истинных водных растворах фуллеренола^ без последующей ультразвуковой обработки.

2. Значение а(С) (С — мас. % фуллеренола^ в жидкой фазе) монотонно растёт с ростом С, причём зависимость ^ а от ^ С — практически линейная во всей области концентраций, кроме очень сильно разбавленных растворов — С < 10-3 мас. %.

Расчёт молярной электропроводности водных растворов фуллеренола-ё. Молярная электропроводность вычислялась по формуле

1000а 2

ц, = -, См • см /ммоль,

где М (моль/л) — молярность раствора фуллеренола-^ формально рассчитанная по соотношению

10С = 1128'

На рис. 1 и по данным табл. 1 хорошо видно, что значение ц(С) (С — мас. % фуллере-нола^ в жидкой фазе) монотонно падает с ростом С, причём выраженная нелинейная зависимость ^ ц от ^ С имеет сигмоидный ход. Представленные на рис. 1 данные предельной эквивалентной (молярной) электропроводности ионов — Н+ и ОН- в водных растворах (см., например, [11]) и ц^- показывают, что значения ц(С) превосходят значения и ц^- на 0,5-1 порядок для концентрированных растворов фуллерено-ла^ и на 2-3 порядка для разбавленных растворов. Такое несоответствие невозможно объяснить, приняв какой-либо из механизмов диссоциации (и, соответственно, переноса заряда) в растворах фуллеренола^ (щелочной либо кислотный)

[Сб°(ОН)24] ^ [Сб°(ОН)2з]+ + ОН- (1)

или

[Сб°(ОН)24] ^ [Сб°(0Н)23О]- + Н+. (2)

Действительно, предположить многостадийную диссоциацию фуллеренола^ по схемам (1), (2) кажется невозможным. Более того, для разбавленных растворов просто не хватает числа ионов Н+ и ОН-, способных к диссоциации в принципе. С другой стороны, массивные фуллеренольные ионы типа [Сб°(ОН)23]+ или [Сб°(ОН)23О]- должны обладать сравнительно низкой подвижностью и также, что маловероятно, служить основными или даже существенными переносчиками заряда. Иными словами, при расчёте мы принимали числа переноса: ¿[Сб°(ОН)23О]- « 0, ¿[Н+] « 1 или ¿[Сб°(ОН)23]+ « 0, ¿[ОН-] « 0. Таким образом, у авторов оставалось единственно возможное объяснение полученному эффекту, а именно: в системе наблюдается иной механизм переноса заряда, не требующий массопереноса, причём, вероятнее всего, механизм переноса заряда может существенно изменяться с изменением концентрации растворов фуллеренола-^

Здесь, по мнению авторов, следует, что условия переноса заряда в условно «бесконечно разбавленном» растворе фуллеренола-d и, пусть разбавленном, но «конечно разбавленном» растворе одинаковы или близки, а всё различие в значениях ц и ц0 связано только с процессом диссоциации. Недиссоциированные молекулы фуллеренола-d не проводят электрический ток. Если допустить, что уже в сравнительно разбавленных растворах формируется проводящая структурная сетка, облегчающая перенос заряда (например, по эстафетному механизму), то увеличение измеряемых значений ц (и, как следствие, рассчитанных значений а) становится вполне объяснимым.

Кластеризация фуллеренола-d. Распределение наночастиц фуллеренола-d по размеру в водных растворах разных концентраций проводилось методом динамического светорассеивания на приборе Malvern Zetasizer (Great Britain).

Типичные графики распределения ассоциатов по размерам для водных растворов фуллеренола-d представлены на рис. 2, а, б. При этом концентрации фуллеренола-d изменялись в широких пределах — Сфуллеренол « 0,0137 + 18,3 г/л (Мфуллеренол ~ « 1,2 • 10~5 + 1,5 • 10~2 моль/л). Размеры ассоциатов водных растворов фуллеренола-d приведены в табл. 2. К сожалению, более концентрированные растворы фуллеренола, в частности Мфуллеренол « 0,17 моль/л, непрозрачны и используемый метод определения размеров ассоциатов становится непригодным.

Таблица 2

Размеры ассоциатов водных растворов фуллеренола-d

Объёмная Молярная Средний диаметр Оценка среднего

№ концентрация концентрация ассоциата числа молекул

фуллеренола-d фуллеренола-d фуллеренола-d фуллеренола-d

Мфуллеренол > г/л М, моль/л 8, нм в ассоциате N, ед.

1* 0 0 1,8 и 1 • 10и

2 0,0137 0,000012 5,8 2 • Ю1

3 0,151 0,00013 37 га 4 • 10"

4 1,66 0,0014 60 га 2 • 104

5 18,3 0,015 1100 га 2 • 10'

6 201 0,17 Раствор непрозрачен Раствор непрозрачен

* Данные получены прямым расчётом.

На представленных графиках хорошо видно, что:

— с увеличением концентрации фуллеренола^ монотонно возрастает средний диаметр ассоциатов фуллеренола^ (5), причём особо резкий рост размеров ассоциатов наблюдается при переходе от раствора № 4 К раствору № 5 (Сфуллеренол ~ 1,66 —> — 18,3 г/л) — 5 « 60 — 1100 нм);

— распределение ассоциатов фуллеренола^ по линейным размерам достаточно «острое», особенно с учётом сложного состава смеси. Так, полуширина пика интенсивности (5х/2) составляет около 1 отн. ед., что соответствует различию в размерах ассоциатов не более чем на порядок;

— в растворах № 2-5 методом динамического светорассеяния не обнаружено неас-социированных (хотя и, возможно, гидратированных фуллеренолов) с диаметром 5 < < 2 нм. Это, в свою очередь, означает, что даже разбавленные растворы фуллеренола^ очень сильно ассоциированы;

— на представленной в логарифмической форме зависимости среднего размера ассоциатов фуллеренола^ от его концентрации 1п 5 — f (1^ Сфуллеренол) присутствует довольно устойчивая линейная корреляции. Иными словами, искомая зависимость

80

0,1 1 10 100 1000 10000

Размер ассоциата, нм

б в

lg (d(M), моль/л) lg (d(M), моль/л)

Рис. 2. Распределение ассоциатов фуллеренола-d по размерам (а), средние размеры ассоциатов (б) и среднее число мономерных частиц фуллеренола^ в одном ассоциате (в) в водных растворах фуллеренола^ в логарифмической шкале

б(Сфуллеренол) может быть выражена простым соотношением 5 = аСфулле;ренол + 5о, где а, в — константы; 5о — значение диаметра мономерной гидратированной молекулы фуллеренола^ (при Сфуллеренол ^ 0), полученное расчётным методом. Очевидно, что во всех случаях 5о С 5 (Сф уллеренол = 0).

Остановимся на оценочном расчёте значения 5о несколько подробнее. Очевидно:

5о « 5(Сбо) + 2[г(С—0) + г(0—Н) + 5(Щ0) + т(0-■ • Н)],

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

где 5(Сбо) ~ 0,68 нм, согласно [1] — «диаметр» сфероидной молекулы Сбо; г(С-О) ~ « 0,14 нм — длина связи С—О для алифатических спиртов; г(О-Н) « 0,10 нм — длина связи О—Н; 5(Н20) « 0,14 нм — «диаметр» молекулы Н2О в сфероидном приближении вычислен из поляризуемости молекулы воды а(Н20) « 1/(6л)5(Н20)3; г(О---Н) « « 0,20 нм — средняя длина водородной межмолекулярной связи 0-Н [11, 12]. В результате нами получено оценочное значение 5о ~ 0,20 нм.

На рис. 2, в представлена зависимость среднего числа мономерных частиц фулле-ренола^ в одном ассоциате в водных растворах фуллеренола^ от концентрации (М) в логарифмической шкале. Расчёт проводился по формуле

N = [^аГТ\

Мономерная гидратированная молекула фуллеренола

Первичный кластер

Кластеры перколяции фуллеренола в равновесии друг с другом и мономерами

Вторичный кластер перколяции фуллеренола

Рис. 3. Способы ассоциации кластеров перколяции фуллеренола^ (полярные варианты)

где Куфаекроид — формальный упаковочный коэффициент, характеризующий отношение объёма, занятого мономерными молекулами фуллеренола^ в ассоциате, к общему объёму ассоциата (в сфероидном приближении). При оценке было принято значение КуфаК?оид — 1/2 отн. ед., практически совпадающее со значением Куфакюид для чистой воды и несколько меньшее, чем в случае плотнейшей упаковки сфероидами КуфаК?оид(тах) « 0,74 отн. ед. Значение Ж — порядок фуллеренольного ассоциата или так называемого «кластера перколяции». Действительно, мономерные молекулы фуллеренола^ могут упаковываться принципиально двумя разными способами. На рис. 3 слева представлен вариант равновесия всех кластеров перколяции разного размера друг с другом и мономерными молекулами, справа — варианты иерархической структуры, когда мономерные молекулы формируют первичный кластер перколяции, первичные кластеры перколяции формируют вторичный кластер, вторичные — третичный и т. д. Авторы полагают много более вероятным второй тип организации кластеров в фуллеренольных растворах, поскольку, прежде всего, нами не найдено одновременно сразу несколько кластеров различных размеров, сосуществующих в одном и том же растворе, а мономерных молекул не найдено вовсе (рис. 2, а).

В нашем случае: Ж — 0 для фуллеренольного мономера (раствор № 1), Ж — 1, 2 для фуллеренольных ассоциатов в растворах № 2-4, Ж — 3 для фуллеренольных ассоциатов в растворе № 5.

На представленной в логарифмической форме зависимости среднего числа молекул мономеров фуллеренола^ от его концентрации ^ N — f (^ Сфуллеренол) (см. рис. 2, в) наблюдается устойчивая линейная корреляции (что абсолютно неудивительно), т. е. зависимость N(Сфуллеренол) может быть также выражена простым соотношением N — уСфуллеренол + 1, где у, е — константы. Следует отметить огромное значение N(Сфуллеренол « 18,3) « 2 • 107 г/л частиц, что косвенно свидетельствует о разрушении однофазности (гомогенности) жидкого раствора и его переходе в микроколлоидное состояние. Естественно, оно же будет характерно и для всех растворов больших концентраций 18,3-201 г/л.

а, 12 11 10 9 8 7 6

мкСм/см

lg (C

фуллеренол:

, мас. %)

lim а

с ^ о

PH 8

7 6 5432 1

-4 -3 -2 lg (C, мас. %)

lim PH

-О......C-.0..........

Рис. 4- Зависимость удельной объёмной электропроводности (а) и водородного показателя (б) истинных водных растворов фуллеренола^ от массового процента фуллеренола^ (^ С) в 0,25 %-ном растворе Н2Я04 при 25 С

0

О возможном механизме электропроводности. Таким образом, предположение, высказанное нами выше, подтверждается из независимых данных об ассоциации молекул фуллеренола-d.

Логично предположить, что в водных растворах фуллеренола-d наблюдается по меньшей мере два механизма переноса заряда.

1. Характерный для разбавленных растворов фуллеренов (некластеризованных или сравнительно слабокластеризованных). Переносчиками заряда являются лёгкие ионы H+ и OH~. Перенос заряда связан с массопереносом этих ионов.

2. Характерный для более концентрированных растворов фуллеренов (сильнокла-стеризованных). Перенос заряда осуществляется по «эстафетному механизму» между фуллеренольными кластерами. В этом случае он может быть и не связан с массопереносом каких-либо ионов.

Для проверки наших предположений были проведены измерения удельной электропроводности (о) и водородного показателя (рН) для растворов фуллеренола-d различных концентраций в 0,25 %-ном водном растворе H2SO4. Именно на этой концентрации кислоты эффекты изменения электропроводности проявляются наиболее ярко во всём диапазоне значений. Методика измерения о описана выше, значения рН определялись с помощью рН-метра марки "Delta 320", электрод InLab 413 «3 в 1» (IP 67); точность измерения составляла ДрН = 0,05 отн.ед. Измерения проводились в воздушной атмосфере при комнатной температуре (T = 22 ± 2 °С), иными словами, растворы естественным образом были насыщены атмосферным воздухом, включающим, в частности, углекислый газ (СО2). Результаты представлены на рис. 4.

Как можно убедиться, фуллеренол-d в кислых растворах очень незначительно повышает их удельную электропроводность, примерно на 2-3 отн. % при концентрациях фуллеренола-d (C = 10~5 ^ 10~2 мас. %), причём концентрация фуллеренола-d C = 10~4 мас. % оказывает максимальный эффект. Далее в растворах с концентрацией C = 10~2 ^ 5 • 10-1 наблюдается значительное снижение удельной электропроводности на « 40 отн. %.

В то же время значения рН при низких концентрациях фуллеренола-d остаются практически неизменными: pH « 1,6 ± 0,1 отн. ед., а затем резко возрастают (при C > 10-1 мас. % фуллеренола-d). Как раз для этих концентраций наблюдается неконтролируемый рост размеров кластеров на основе молекул фуллеренола-d и, как следствие, смена механизма электропроводности.

Весьма вероятно также, что молекулы фуллеренола-d оказывают сильное деструк-турирующее действие на сетку растворителя (в нашем случае — воды). В пользу этого предположения косвенно свидетельствует довольно странная структура электронных спектров водных растворов фуллеренола-d дальней УФ-области (длина волн X = 190 ^ ^ 210 нм). Несмотря на то, что сам фуллеренол-d эффективно поглощает свет в этом спектральном диапазоне для концентраций фуллеренола-d C = 10-5 ^ 10-2 мас. %, наблюдаются отрицательные значения оптической плотности D = —0,02^—0,05 отн. ед. при l =1 см (раствор сравнения — чистая вода). И только при C > 10-2 мас. % оптические плотности в этом диапазоне становятся положительными.

Следует также отметить, что установление стационарных измеряемых значений удельной электропроводности и водородного показателя для растворов фуллеренола-d — процесс длительный и продолжается часами — до суток, что, возможно, связано с блочным механизмом растворения, с последующей гидратацией и сложной кластеризацией, обусловленной последовательным образованием нанокластеров различного порядка иерархии.

Литература

1. Сидоров Л. Н., Юровская М. А. Фуллерены. М.: Экзамен, 2005. 688 с.

2. Пиотровский Л. Б., Киселёв О. И. Фуллерены в биологии. СПб., 2006. 334 с.

3. Семёнов К. Н., Чарыков Н. А. Растворимость лёгких фуллеренов и их производных. М.: LAMBERT Academic Publishing, 2011. 237 с.

4. Semenov K. N., Charykov N. A., Keskinov V. A. et al. Solubility of light Fullerenes in Organic Solvents //J. Chem. Eng. Data. 2010. Vol. 55. P. 13-36.

5. Semenov K. N., Charykov N. A., Keskinov V. A. Fullerenol Synthesis and Identification. Properties of Fullerenol Water Solutions // J. Chem. Eng. Data. 2011. Vol. 56. P. 230-239.

6. СемёновК. Н., ЧарыковН. А., ЛетенкоД. Г. и др. Синтез и идентификация фуллеренола // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4: Физика, химия. 2010. Вып. 4. С. 79-86.

7. LiJ., TakeuchiA., OzawaM. et al. Сбо Fullerol Formation by Quaternary Ammonium Hydroxides //J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1993. P. 1784-1788.

8. ЛетенкоД. Г., ЧарыковН. А., СемёновК. Н. и др. Синтез и идентификация фуллеренола, полученного методом прямого окисления // Журн. прикл. химии. 2010. Т. 83. № 12. С. 1948-1952.

9. Летенко Д. Г., Никитин В. А., Чарыков Н. А. и др. Физико-химические свойства водных дисперсий смешанного наноуглеродного материала фуллероидного типа. Часть I // Вестн. гражданских инженеров. 2010. Т. 23. № 2. C. 123-131.

10. Летенко Д. Г., Никитин В. А., Семёнов К. Н., Чарыков Н. А. Получение углеродных наноструктур из отходов химических производств // Вестн. гражданских инженеров. 2010. Т. 22. № 1. C. 108-119.

11. Краткий справочник физико-химических величин / под ред. А. А. Равделя, А.М.Пономарёвой. М., 2009. 240 с.

12. Химическая энциклопедия / под ред. И.Л.Кнунянц. М., 1988. Т. 1. 625 с.; 1990. Т. 2. 673 с.; 1995. Т. 4. 642 с.

Статья поступила в редакцию 17 июня 2011 г.

УДК 547.512

Вестник СПбГУ. Сер. 4. 2011. Вып. 4

А. П. Молчанов, Р. Р. Костиков

О ВЗАИМОДЕЙСТВИИ а-ХЛОР-, а, а-ДИХЛОР-И а, а, а-ТРИХЛОРТОЛУОЛОВ С ЭТИЛМАГНИЙБРОМИДОМ В ПРИСУТСТВИИ ТЕТРАИЗОПРОПОКСИДА ТИТАНА

Введение. Соединения, содержащие низковалентный титан, активно применяются в качестве катализатора или реагента процессов восстановления, например, в реакциях Макмарри [1-3] или Кулинковича [4, 5] (см. также [6]). Недавно условия реакции Кулинковича были применены в синтезе моногалогенциклопропанов из гем-дигалоген-циклопропанов [7-9].

Нами изучено взаимодействие смешанного реагента, образующегося при действии реактива Гриньяра на тетраизопропоксид титана, с а-хлорзамещёнными толуолами 1а-е.

Во всех случаях при использовании эквимольных количеств этилмагнийбромида, тетраизопропоксида титана и хлорида Ia-в с выходами 10-17 % образуются соединения IIa—в, являющиеся формальными продуктами димеризации радикалов, которые возникают при отщеплении галогена от исходного хлорида. Идентификация продуктов реакции выполнена при помощи сравнения данных газожидкостной или тонкослойной хроматографии с эталонными соединениями и спектрами 1Н ЯМР. В то же время, если используется полуторакратный избыток реактива Гриньяра к изопропоксиду титана (опыт 2а)) из бензальхлорида, то получается продукт дегалогенирования дихлорида II6 — транс-стильбен III.

Механизм реакций не установлен. Среди продуктов реакций отсутствуют соединения, содержащие в своей структуре этильную или диметиленовую группы, а также возможные продукты радикальных реакций (см. механизм в работе [9]). Следует также отметить, что в экспериментах применяли эквимольные соотношения реагентов в отличие от методики Кулинковича [10, 11] (двух- и трёхкратный избыток реактива Гриньяра). Возможная схема превращений представлена ниже: на первой стадии из реактива Гриньяра образуется этилтриизопропоксититан (IV). При недостатке реактива Гриньяра он не вступает в дальнейшую реакцию с образованием производного титанациклопропана V, а обменивает этильный радикал на бензильный с образованием интермедиата VI. Последний вступает в реакцию нуклеофильного замещения галогена в другой молекуле бензилгалогенида I и даёт продукт сдваивания радикалов — соединение II. Образование стильбена III из хлорида I6 при избытке реактива Гриньяра

R .R'

PhCRR'Cl Ia-в

Ph ^^ III

R = R' = H (Ia, IIa), R = H, R' = Cl (16, II6), R = R' = Cl (Ie, IIe)

может быть объяснено участием производного титанациклопропана V, отщепляющего от бензальхлорида (Та) два атома хлора.

EtMgBr + Ti(O-iPr). . » EtTi(O-iPr)3

5 v м -iPrOMgBr OiPr

IV IX

PhCRR'Cl + IV -► PhCRR'Ti(OiPr)3 OiPr

I -EtCl VI 3 V

I + VI -► II + ClTi(OiPr)3

Экспериментальная часть. Элементный анализ соединений проводили на CHN-анализаторе Hewlett-Packard 185-B. Спектры ЯМР ХН записаны на приборе Bruker DPX-300 при 300 МГц. Проверку чистоты и идентификацию соединений проводили методом газожидкостной хроматографии (хроматограф «Цвет 126», детектор ионизационно-пламенный, газ-носитель — азот, колонки стеклянные 3000 х 4 мм2, неподвижные фазы: 5 % SE-30 или 10 % XE-60 на Chromaton N-AW) и тонкослойной хроматографии на пластинах Silufol UV-254.

Опыт 1. Реакция с бензилхлоридом (Ia). К свежеприготовленному раствору этилмагнийбромида, полученному из 1,2 г (50 ммоль) магния и 3,5 г (50 ммоль) бромистого этила в 40 мл тетрагидрофурана, добавляли в течение 1 ч при комнатной температуре раствор 14 г (50 ммоль) тетраизопропоксида титана в 25 мл ТГФ. Реакционную смесь перемешивали 1 ч и добавляли в течение 1/2 ч раствор 4,5 г (40 ммоль) бензилхлорида (Ia) в 20 мл ТГФ. Перемешивание продолжали 2 ч, и реакционную смесь вылили в 100 мл 10 %-ной серной кислоты с 200 г льда. Органические вещества экстрагировали 200 мл диэтилового эфира, эфирный слой промывали 10 %-ным раствором Na2CO3, высушивали безводным MgSO4. По данным ГЖХ, в смеси кроме исходного хлорида Ia присутствует углеводород IIa. После испарения эфира и отгонки хлорида Ia в вакууме (т. кип. 82-84 °С/30 мм) остаток хроматографировали на силика-геле (элюент: гексан—этилацетат, 4/1). Получено 0,6 г (17 %) 1,2-дифенилэтана (IIa), т. пл. 53 °С (лит. 51-52 °С [12], 53 °С [13, с. 72]).

Опыт 2. Реакция с бензальхлоридом (I6 ). а) Раствор этилмагнийбромида, полученный из 2,4 г (100 ммоль) Mg, 10,9 г (100 ммоль) EtBr в 80 мл ТГФ, добавили к раствору 3,2 г (20 ммоль) бензальхлорида (I6) и 2,5 г (9 ммоль) Ti(O-iPr)4 в 50 мл ТГФ при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакционную смесь оставили на ночь, затем добавили 20 мл воды. Осадок отфильтровали и промыли ТГФ. После высушивания органического раствора над безводным MgSO4 растворитель испаряли, а к остатку добавили гексан и осадок перекристаллизовывали из этанола. Выход транс-стильбена (III) 0,6 г (33 %), т. пл. 122-123 °С (лит. 122-123 °С [12], 125 °С [13, с. 44]), идентифицирован также методом ГЖХ.

б) К раствору этилмагнийбромида из 2,4 г (100 ммоль) Mg и 10,9 г (100 ммоль) EtBr в 80 мл ТГФ добавили раствор 14,2 г (50 ммоль) Ti(OiPr)4 в 50 мл ТГФ. Раствор перемешивали 1 ч, охладили до 0 °С и добавили раствор 8 г (50 ммоль) хлорида I6 в 20 мл ТГФ. Реакционную смесь оставили на ночь, затем вылили в смесь 100 мл 10 %-ной H2SO4 и 200 г льда. После обработки реакционной смеси аналогично опыту 1 в органическом слое идентифицированы соединения III и II6. Выделили 0,6 г (10 %) жезо-1,2-дифенил-1,2-дихлорэтана (II6), т. пл. 193 °С (этанол) (лит. 191-193 °С [12],

189 °С [14]). Спектр ЯМР 1Н (CDCI3), м.д.: 5,80 с (2Н), 7,40-7,43 м (6Н), 7,62-7,65 м (4Н). Найдено, %: С 68,99, 69,20; Н 5,39, 5,50. C14H12CI2. Вычислено, %: С 68,97, Н 5,33.

в) По методике опыта 2б) из 1,2 г (50 ммоль) Mg и 5,5 г (50 ммоль) EtBr в 40 мл ТГФ, 14,2 г (50 ммоль) Ti(OiPr)4 в 30 мл ТГФ и 3,2 г (20 ммоль) хлорида 1б в 20 мл ТГФ из реакционной смеси выделили 1,5 г хлорида 1б (47 % от исходного) и 0,2 г (8 %) дихлорида II6.

Опыт 3. Реакция с бензотрихлоридом (Ie). К раствору этилмагнийбромида, полученному из 1,2 г (50 ммоль) Mg и 5,5 г (50 ммоль) EtBr в 40 мл ТГФ, в течение 1 ч добавляли раствор 14,2 г (50 ммоль) Ti(O-iPr)4 в 30 мл ТГФ и смесь перемешивали 1 ч. Затем при комнатной температуре в течение 1 ч добавляли раствор 3,9 г (20 ммоль) бензотрихлорида (Ie) в 20 мл ТГФ и перемешивали 12 ч. После обработки реакционной смеси, аналогичной в опыте 1, получили 0,5 г (16 %) 1,1,2,2-тетрахлор-1,2-дифенилэтана (IIe), т. пл. 162 °С из этанола (лит. 160-162 °С [12]). Спектр 1Н ЯМР, (CDCI3), м.д.: 7,25-7,37 м (6Н), 7,43-7,52 м (4Н).

Литература

1. McMurry J. E, Fleming M. P. New method for the reductive coupling of carbonyls to olefins //J. Am. Chem. Soc. 1974. Vol. 96. P. 4708-4710.

2. McMurry J. E. Titanium induced dicarbonyl-coupling reaction // Acc. Chem. Res. 1983. Vol. 16. P. 405-411.

3. McMurry J. E. Carbonyl-coupling reactions using low-valent titanium // Chem. Rev. 1989. Vol. 89. P. 1513-1524.

4. Kulinkovich O. G., de MeijereA. 1,n-Dicarbanionic Titanium Intermediates from Monocar-banionic Organometallics // Chem. Rev. 2000. Vol. 100. P. 2789-2734.

5. Кулинкович О. Г. Алкилирование производных карбоновых кислот диалкоксититанацик-лопропановыми реагентами // Изв. РАН. Сер.: Хим. 2004. № 5. С. 1022-1043.

6. McMurry J. E. Organic chemistry of low-valent titanium // Acc. Chem. Res. 1974. Vol. 7. P. 281-286.

7. Al DulayymiJ. R., BairdM. S., BolesovI. G. et al. A Simple Hydrodehalogenation of 1,1-Di-halocyclopropanes // Tetrahedron Lett. 1996. Vol. 37. P. 8933-8936.

8. Кулинкович О. Г., АстаповичИ. В., МасаловН. В. Восстановление гем-дигалогенцикло-пропанов этилмагнийбромидом в присутствии тетраизопропоксида титана // Журн. орган. химии. 1998. Т. 34. P. 1327-1329.

9. Al DulayymiJ. R., BairdM. S., BolesovI. G. et al. Hydrodehalogenation of 1,1-dibromocyc-lopropanes //J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2. 2000. P. 1603-1617.

10. Kulinkovich O. G., Sviridov S. V., Vasilevski D. A. Titanium (IV) Isopropoxide-Catalyzed Formation of 1-Substituted Cyclopropanols // Synthesis. 1991. P. 234.

11. KimS.-H., Je Sung M., ChaJ. K. Intra- and Intermolecular Kulinkovich Cyclopropanation Reactions of Carboxylic Esters with Olefins // Org. Synthesis. 2003. Vol. 80. P. 11-114.

12. Joshi A. V., Beidossi M., TahaN. Tandem Pd/C-catalyzed reductive couplimg and degalo-genation of benzylic halides // Synth. Commun. 2005. P. 2715-2722.

13. Свойства органических соединений / под ред. А. А. Потехина. Л., 1984.

14. Бритцин В. Н., Сергучев Ю. А., Ганущак Н. И. Хлорирование транс-диарилэтиленов в хлороформе и уксусной кислоте // Журн. общей химии. 2001. Т. 71. С. 290-293.

Статья поступила в редакцию 28 июня 2011 г.

УДК 543.544

Вестник СПбГУ. Сер. 4. 2011. Вып. 4

А. Л. Москвин, А. Н. Мельниченко, О. Ю. Диченко

ФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АММИАКА В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ С ХРОМАТОМЕМБРАННЫМ КОНЦЕНТРИРОВАНИЕМ*

Введение. При организации систем контроля на химических производствах всё больше внимания уделяется контролю содержания в воздухе рабочей зоны вредных веществ. Предпочтения зачастую отдаются легкоавтоматизируемым схемам, одной из которых является непрерывный проточный анализ.

Существует несколько способов перевода веществ из газовой в жидкую фазу — бар-ботирование с использованием барботёров различной конструкции, поглощение с применением диффузионного скруббера [1], а также хроматомембранная жидкостная абсорбция [2]. При хроматомембранной жидкостной абсорбции массообмен между потоками жидкости и газа происходит в бипористой среде из гидрофобного материала с открытыми порами, обычно политетрафторэтилена. При этом по макропорам перемещается поглощающая водная фаза, а по микропорам — газ, содержащий исследуемый компонент, который подается и выводится из массообменного слоя через гидрофобные непроницаемые для жидкости микропористые мембраны. Поток жидкости с поглощённым исследуемым веществом при необходимости смешивается с потоками реагентов и подаётся в проточный детектор. Эффективность процесса хроматомембранной жидкостной абсорбции в существенной степени зависит от структуры бипористого массо-обменного слоя, которая определяется условиями его получения [3].

Но немаловажным фактором в условиях проточных методов анализа является общее давление жидкости в системе, контроль которого необходим для обеспечения бесперебойной работы. В настоящее время существуют две схемы реализации хромато-мембранного массообменного процесса: с бипористыми и поликапиллярными массооб-менными блоками. В обоих вариантах газовая фаза движется по микропорам массообменного блока, в то время как жидкость — по макропорам. В случае бипористого блока макропоры расположены хаотически и неоднородны по размерам. В поликапиллярном массообменном блоке макропоры представляют собой строго ориентированные в объёме микропористого политетрафторэтилена каналы (капилляры), имеющие сечение определённой конфигурации и площади по всей длине [4].

Целью представляемой работы является обоснование возможности применения хро-матомембранных матриц для выделения аммиака из воздуха с последующим его фотометрическим определением, а также сравнение эффективности определения содержания аммиака в воздухе при использовании двух видов массообменных блоков — бипо-ристого и поликапиллярного.

Экспериментальная часть. До введения в силу ГОСТ Р 52105-2003, регулирующего обращение с отходами ртути и её соединений, наиболее часто для определения ионов аммония использовали их реакцию с раствором меркурийодида калия с образованием окрашенного в жёлтый цвет раствора. В последнее время из-за токсичности входящей в реагент ртути и большого количества ограничений метода он был вытеснен индофенольным методом, основанным на реакции Бертло, который превосходит метод с реактивом Несслера по чувствительности в 10 раз. В этом случае ионы

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

* Работа поддержана РФФИ (проект № 09-03-00011а).

аммония реагируют с фенольным компонентом и хлордонорным реагентом в присутствии катализатора при высоком значении рН с образованием синего индофенольно-го красителя. На основании данных, полученных М. Кромом [5], для реакции были выбраны в качестве хлордонорного реагента дихлоризоцианурат натрия, а в качестве фенольного компонента — салицилат натрия. В качестве катализатора использовался нитропруссид натрия.

Определение проводилось с использованием проточного фотометрического детектора Ocean Optics USB650 RED TIDE с лампой LS-1. Длина оптического пути составляла 10 мм. Для раствора сравнения выбрана холостая проба, если не указано иначе.

В работе применялись хроматомембранные ячейки (ХМЯ) оригинальной конструкции, предоставленные ООО «Росаналит-Технология», обеспечивающие возможность замены массообменных блоков и мембран с сохранением внешних коммуникаций. В ХМЯ использовались поликапиллярные и бипористые массообменные блоки из пористого политетрафторэтилена собственного изготовления одинаковых форм и размера 50 х 10 х 14 мм3 (первой указана длина, за которую принимается протяжённость мас-сообменного слоя по направлению движения водной фазы, второй — ширина — размер массообменного слоя перпендикулярно движению потоков водной и газовой фаз, третьей — высота — протяжённость слоя по направлению движения газовой фазы). Диаметр макропор в бипористых блоках находился в диапазоне от 0,5 до 1,5 мм, диаметр микропор — от 0,5 до 1 мкм. Для изготовления блоков того и другого типа использовались описанные ранее технологии: бипористых — в работе [3], поликапиллярных — в работе [4].

Чтобы осуществить ввод газовой фазы в микропоры массообменных блоков, последние со сторон ввода и вывода газовой фазы были ограничены гидрофобными газопроницаемыми фазоразделительными мембранами производства ООО «Росаналит-Технология», обеспечивающими эффективное разделение фаз [6]. Расходы пробы, реагентов и анализируемого газа регулировались с помощью перистальтических насосов и контролировались с помощью секундомера, мерного цилиндра и мыльно-плёночного расходомера. Водные растворы компонентов готовились по точной навеске, а градуиро-вочные растворы ионов аммиака — объёмно-объёмным способом из ГСО ионов аммиака концентрацией 1 г/л.

Результаты и их обсуждение. Продукт реакции аммиака с салицилатом натрия и дихлоризоциануратом натрия в присутствии нитропруссида натрия имеет максимум поглощения при длине волны 690 нм. При комнатной температуре реакция кинетически замедлена и значительно ускоряется при нагревании до 40 °С. Для выбора оптимального времени термостатирования была проведена серия экспериментов, по результатам которой построены кривые, представленные на рис. 1, зависимости аналитического сигнала (оптической плотности) от времени термостатирования для разных концентраций аммиака в растворе, при этом за 1 мин смешанная с реагентами проба доставлялась в термостат. В эксперименте в качестве раствора сравнения применялась деионизован-ная вода.

На основании анализа графиков было выбрано время t = 6 мин, необходимое для образования окрашенного продукта реакции в термостате. При этом аналитический сигнал достиг значения больше 90 % от максимального с сохранением достаточно высокой экспрессности анализа.

На рис. 2 представлена зависимость аналитического сигнала от концентрации аммиака в водной фазе. В качестве градуировочных растворов использовались растворы, приготовленные из ГСО аммиака концентрацией 1 г/л методом разбавления.

А

0,40 0,35 0,30 0,25 0,20

Рис. 1. Зависимость оптической плот- 0,15 ности от времени термостати-рования для растворов аммиака с различными концентрациями:

1 — 0 мг/л; 2 — 0,2 мг/л; 3 — 0,4 мг/л; 4 — 0,8 мг/л

0,10 0,05

6

г, мин

10 12

3

А - А„

Рис. 2. Зависимость аналитического сигнала от концентрации аммиака в градуи-ровочных растворах:

А — сигнал пробы, Ао — сигнал холостой пробы

0,4

С, мг/л

Генерируемую газовую смесь с известной концентрацией аммиака получали, пропустив воздух через ёмкость с раствором аммиака в деионизованной воде. Содержание аммиака в генерируемой газовой смеси проверялось с помощью кислотно-основного титрования. Для этого через поглотитель Рихтера, заполненный 10 мл 0,01М серной кислоты, пропускалась генерируемая газовая смесь с заданным расходом в течение определённого времени. На выходе из первого поглотителя подключали второй с аналогичным раствором, предназначенный для проверки полноты поглощения в первом. Результаты титрования для поглотителей 1 и 2 представлены в табл. 1. Практически нулевое содержание аммиака во втором поглотительном сосуде позволяет сделать вывод о полноте поглощения аммиака и рассчитать его концентрацию в газовой фазе.

Для дальнейших экспериментов предполагали линейный характер зависимости концентрации NHз в газовой фазе от концентрации аммиака в ёмкости с раствором при постоянной температуре, а в качестве конечного метода определения вместо титрования использовали фотометрический метод по градуировочной зависимости (см. рис. 1).

Таблица 1

Результаты определения содержания аммиака в генерируемой газовой смеси

Смесь Объём воздуха (П л ' Объём титранта (0,0088М NaOH) (Vt) , мл Количество поглотившегося аммиака, мг Концентрация аммиака в газовой фазе (Cr), мг/л

Поглотитель 1

1а 12,698 4,6 0,89 0,070

16 12,695 4,5 0,91 0,072

Среднее значение 0,071

Поглотитель 2

2а 12,698 10,6 0 0

26 12,695 10,55 0,0075 0,0006

Среднее значение 0,0003

A - A0 а A - A,

Рис. 3. Зависимость аналитического сигнала от концентрации аммиака в генерирующем растворе при одинаковом расходе воздуха через ячейку (а) и от расхода генерируемой газовой смеси при постоянной концентрации аммиака в растворе (б)

Концентрация аммиака в газовой фазе определялась по формуле

1000 Cirn

g — -,

где Cg — концентрация аммиака в воздухе рабочей зоны, мг/м3; Ci — концентрация аммиака в поглотительном растворе, определяемая с использованием градуировочной зависимости, мг/л (см. рис. 2); œi — расход поглощающей жидкости (деионизованной воды), мл/мин.; œg — расход анализируемого воздуха через ХМЯ, мл/мин.

Для бипористых и поликапиллярных массообменных блоков были получены зависимости аналитического сигнала от концентрации аммиака в генерирующем растворе при одинаковом расходе воздуха через ячейку и от расхода генерируемой газовой смеси при постоянной концентрации аммиака в растворе. Эти зависимости представлены на рис. 3. Линейный вид зависимостей позволяет сделать вывод о прямой пропорциональности аналитического сигнала от количества аммиака, пропущенного через хромато-мембранную ячейку, а также о том, что эффективность поглощения не изменяется при увеличении расхода газа для обоих видов массообменных блоков.

На выходе газовой фазы из ячейки был установлен поглотитель Рихтера с 10 мл 0,01М серной кислоты, с помощью которого контролировали полноту поглощения аммиака в ХМЯ. Контроль осуществлялся путём сравнения результатов определения содержания аммиака в газовой фазе, полученных титрованием и фотометрически с предварительным хроматомембранным концентрированием в хроматомембранных ячейках с бипористыми и поликапиллярными массообменными блоками. Данные представлены в табл. 2 и свидетельствуют о том, что эффективность поглощения в бипористых и поликапиллярных массообменных блоках практически не различается, но в то же время сходимость результатов в случае бипористого блока в 2 раза хуже, чем в случае поликапиллярного, что может объясняться наличием в теле бипористого блока «застойных» зон. Кроме того, поликапиллярные блоки с равномерно расположенными прямыми каналами имеют значительно меньшее сопротивление для движения жидкой фазы, что обусловливает меньшее внутреннее давление в системе, чем в случае использования бипористого блока. В силу этих причин использование поликапиллярных блоков для решения данной задачи является более предпочтительным.

Таблица 2

Результаты определения аммиака титрованием и фотометрически с хроматомембранным концентрированием

Смесь № Относительная оптическая плотность (А — Ао) Концентрация аммиака в жидкости (Сж), мг/л Концентрация аммиака в воздухе (Сг), мг/л Относительное СКО, %

Бипористая ХМЯ

1 0,179 0,43 0,067

2 0,168 0,40 0,063

3 0,198 0,48 0,075

Среднее значение 0,068 8,4

Поликапиллярная ХМЯ

1 0,17 0,41 0,064

2 0,2 0,48 0,075

3 0,187 0,45 0,070

Среднее значение 0,070 4,3

Значение, полученное титрованием 0,071 1,4

С применением этой схемы был проведён анализ воздуха в лаборатории. В конце рабочего дня концентрация аммиака практически постоянна (рис. 4, а) и её значение колеблется около 8 мг/м3 при значении ПДК аммиака в воздухе рабочей зоны, равном 20 мг/м3 [7]. Рис. 4, б иллюстрирует изменение концентрации аммиака во времени в вытяжном шкафу при внезапном выключении активной вентиляции с последующим её включением.

Полученные результаты свидетельствуют о возможности применения хроматомем-бранных ячеек для извлечения аммиака из воздуха для последующего его проточного фотометрического определения. Сравнение значений аналитического сигнала при извлечении аммиака одной концентрации из воздуха с применением бипористых и поликапиллярных массообменных блоков показало одинаковую эффективность. В то же время использование поликапиллярных массообменных блоков обеспечивает гораздо меньшее давление в гидравлической схеме проточного анализа, что наряду с более

С, мг/л

г

16-, 14121086 4 2 0

10

15 20 t, мин

25

30

С, мг/л

g

40 35 30 25 20 15 10 5

0

10

20

30

t, мин

40

50

60

Рис. 4- Определение концентрации аммиака в воздухе лаборатории в конце рабочего дня (а); изменение концентрации аммиака со временем при остановке активной вентиляции в вытяжном шкафу с последующим её включением (б)

надёжными метрологическими характеристиками делает применение хроматомембран-ных ячеек на основе поликапиллярных массообменных блоков более предпочтительным при определении аммиака в воздухе.

Время единичного определения аммиака в воздухе при предложенной схеме анализа составляет 6 мин.

Литература

1. Zhang Genfa, Purnendu K. Dasgupta, Shen Dong. Measurement of atmospheric ammonia // Environ. Sci. Technol. 1989. Vol. 23. N 12. P. 1467-1474.

2. MoskvinL. N. Chromatomembrane method for the contimuous separation of substances //J. of Chromatography (A). 1994. Vol. 669. P. 81-87.

3. Родинков О. В., Москвин Л. Н., ВаськоваЕ. А. Оптимизация пористой структуры гидрофобной матрицы для осуществления хроматомембранных массообменных процессов // Журн. физ. химии. 2005. Т. 79. № 3. С. 539-542.

4. МосквинЛ. Н., Родинков О. В., Москвин А. Л. и др. Устройство для осуществления мас-сообмена между жидкой и газовой фазами. Патент РФ № 2392038 на изобретение. Решение о выдаче патента от 18.01.2010.

5. Krom M. D. Spectrophotometry determination of ammonia: a study of a modified Berthelot reaction using salicylate and dichloroisocyanurate // The Analyst. 1980. Vol. 105. N 1249. P. 305.

6. Москвин А. Л., Мельниченко А. Н., Диченко О. Ю., МосквинЛ. Н. Влияние структуры массообменных матриц и фазоразделительных мембран на «эффект памяти» хроматомембранных ячеек в парофазном анализе // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4: Физика, химия. 2011. Вып. 1. C. 94-102.

7. ГН 2.2.5.686-98. Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны. Гигиенические нормативы. М., 2003.

Статья поступила в редакцию 17 июня 2011 г.

УДК 543.544.32

Вестник СПбГУ. Сер. 4. 2011. Вып. 4

Т. Е. Морозова, И. Г. Зенкевич

НОВЫЕ ВАРИАНТЫ МЕТОДА СТАНДАРТНОЙ ДОБАВКИ. ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАМФОРЫ В ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТАХ

Введение. Среди методов количественного газохроматографического анализа метод стандартной добавки является единственным, который можно применять для определения суммарного содержания компонентов гетерофазных систем путём анализа только одной из фаз, а также для определения аналитов в сложных матрицах [1].

В аналитической практике сложные матрицы встречаются довольно часто, в том числе в составе некоторых фармацевтических препаратов, суспензий, эмульсий и различных мазей. До настоящего времени анализ таких образцов оставался сложной задачей, поскольку их прямое дозирование в хроматографические колонки невозможно, а любые попытки экстракции целевых аналитов различными растворителями сопровождаются их огромными потерями. Подобные сложные образцы, особенно если их матрицы обладают сорбционными свойствами, на стадии пробоподготовки рекомендуют искусственно превращать в гетерофазные системы, в которых анализируемые компоненты распределены в соответствии с их коэффициентами распределения между фазами. При этом для анализа выбирают тот слой, в котором содержание мешающих веществ минимально [2], что часто требуется для количественного определения компонентов фармпрепаратов.

Один из наиболее известных вариантов метода стандартной добавки, предназначенный для определения суммарного количества аналитов в образцах, основан на соотношении (см. [3])

Л/Т — тд°б.

а _ 1'

Р2 1

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

(1)

где Мх — масса определяемого компонента; тдоб. — масса добавки; Р\ и Р2 — площади пиков определяемого компонента до и после добавки соответственно.

Для дополнительного контроля точности количественного определения используют метод последовательных стандартных добавок с последующей экстраполяцией результатов на нулевую стандартную добавку (см. [1, 4, 5]):

Мхг = Ер7д°б1Л, (2)

Т1 ~ 1

где Мх. — масса определяемого компонента; тдоб/. — суммарное количество стандартной добавки на 1-й стадии; Р\ и Р.\ — площади пиков определяемого компонента до и после 1-й добавки соответственно.

В работе [4] было показано, что для некоторых образцов, матрицы которых обладают сорбционными свойствами, экстраполяцию результатов можно проводить не только на нулевую, но и на бесконечно большую стандартную добавку. Подобные модификации метода стандартной добавки позволяют выявить возможные искажения результатов анализа, так как при экстраполяции результатов на нулевую или бесконечно большую добавку исключаются погрешности определения за счёт изменения коэффициентов распределения анализируемых компонентов между двумя фазами гетерофазной системы.

Метод последовательных стандартных добавок использовали для определения таких труднолетучих веществ, как, например, алкалоиды в экстрактах растений [6] или пестициды в сельскохозяйственных продуктах [7]. Этот же способ можно рекомендовать и для определения компонентов лекарственных препаратов.

К преимуществам метода стандартной добавки, как обсуждалось в работе [5], следует отнести и то, что при выполнении газохроматографического анализа на приборах устаревших моделей его точность оказывается наибольшей. Это связано с тем фактом, что при оптимальных величинах добавок содержание определяемых компонентов в пробах варьирует не более чем в 2-3 раза, и даже сильно выраженные эффекты сорбции аналитов в хроматографических системах сказываются на результатах в незначительной степени. Такие эффекты сорбции можно классифицировать как недостаточную инертность хроматографических систем, поэтому проверка оборудования на соответствие этому критерию должна быть неотъемлемой частью любого анализа. Основной недостаток этого метода заключается в необходимости хроматографических измерений минимум дважды: до и после введения добавок, что может заметно увеличить время анализа.

Представляемая работа посвящена обсуждению особенностей применения различных модификаций метода стандартной добавки (при контроле инертности хроматогра-фической системы) для количественного определения камфоры в некоторых фармацевтических препаратах, матрицы которых различаются по реологическим и сорбционным свойствам.

Экспериментальная часть.

Контроль инертности хроматографических систем. Приготовление тест-образцов (№ 1, 2, 3, 4) для контроля инертности хроматографических систем. В качестве тест-веществ для контроля инертности хроматографических систем были использованы 2,3-бутандиол, втор.-бутилтолуол и 1-гептанол. Некоторые важнейшие свойства этих соединений на стандартных неполярных полидиметилсилоксановых неподвижных фазах приведены в табл. 1.

Таблица 1

Физико-химические и хроматографические свойства тест-соединений

Компонент Мол. масса Мол. формула Ткип.) ^ df RI ± зы

2,3-бутандиол 90 С4Н10О2 181 1,05 782 ± 25

втор.-бутилтолуол 148 СцНхб 198 0,86 1081 ± 10

1-гептанол 116 CVHieO 176 0,82 953 ±13

Образец № 1 готовили, смешивая исследуемые соединения в соотношении 1:1:1 по объёму. Образцы № 2, 3 и 4 готовили, разбавляя образец № 1 хлористым метиленом в 10, 100 и 1000 раз соответственно. Объём дозы 2 мкл (микрошприц Hamilton объёмом 10 мкл).

Приготовление тест-образца камфоры для контроля инертности хроматографи-ческой системы при выполнении конкретного анализа. Для приготовления модельного образца № 1 добавляли 11,9 мг камфоры и 10 мг н-тридекана (внутренний стандарт) в 10 мл смеси воды и этилового спирта, затем экстрагировали 1 мл хлористого метилена. Отбирали и дозировали нижний слой, объём дозы 1 мкл (микрошприц Hamilton объёмом 10 мкл). Образцы № 2, 3 и 4 готовили, разбавляя образец № 1 в 2, 4 и 8 раз соответственно. Модельные образцы с использованием хлороформа в качестве

растворителя готовили аналогичным образом. Масса камфоры составляла 90 мг, масса тридекана — 20 мг.

Приготовление смесей для анализа Оригинального Большого Бальзама Биттне-ра (производство РФ по лицензии). Для проверки возможностей метода стандартной добавки при анализе фармацевтических препаратов были выбраны две серии Оригинального Большого Бальзама Биттнера, содержащего 95 мг камфоры на 100 мл препарата [8]. Образцы для определения содержания камфоры готовили, добавляя 1 мл хлористого метилена к 10 мл бальзама. Полученную смесь центрифугировли в течение 1 мин. Дозировали нижний слой. Объём проб — 5 мкл (микрошприц Hamilton объёмом 10 мкл). Образцы с использованием хлороформа готовили аналогичным способом. В полученные смеси последовательно добавляли точные навески камфоры с повторением перед каждой стадией анализа процедур их перемешивания и центрифугирования.

Приготовление смесей для анализа камфорной мази (производство РФ). В состав камфорной мази (Р № ЛС-000249) входит: 10 % камфоры, 54 % вазелина, 8 % парафина нефтяного твёрдого, 28 % ланолина безводного. Подготовка проб включала растворение точных навесок образцов мази (около 0,4 г) в смеси 1 мл гексана и 1 мл ацетонитрила. Дозировали нижний ацетонитрильный слой. Объём дозы — 5 мкл (микрошприц Hamilton объёмом 10 мкл). В полученные смеси последовательно добавляли точные навески камфоры с повторением перед каждой стадией анализа процедур их перемешивания и центрифугирования.

Приготовление смесей для анализа мази BENGAY (производство США). В состав мази BENGAY входит: 4 % камфоры, 10 % ментола, 30 % метилсалицилата, состав гидрофобной матрицы не указан. Подготовка проб включала растворение точных навесок образцов мази (около 0,4 г) в смеси 1 мл гексана и 1 мл ацетонитрила. Дозировали нижний ацетонитрильный слой. Объём дозы — 5 мкл (микрошприц Hamilton объёмом 10 мкл). В полученные смеси последовательно добавляли точные навески камфоры с повторением перед каждой стадией анализа процедур их перемешивания и центрифугирования.

Внутренний стандарт (н-тридекан) во все образцы добавляли непосредственно в исходные образцы до подготовки проб.

Газохроматографический анализ проводили на хроматографе «Цвет-500М» с пламенно-ионизационным детектором и стеклянной насадочной колонкой размерами 3 м х х 2 мм с 5 % SE-30 на хроматоне N (0,16-0,20 мм) в изотермических условиях при температуре 140 °С. Температура детектора и испарителя составляли 180 и 200 °С соответственно. Газ-носитель — азот, объёмная скорость — 10 мл/мин. Объём дозируемых проб — 5 мкл (микрошприц Hamilton объёмом 10 мкл). Обработку хроматограмм проводили с использованием программно-аппаратного комплекса «Мультихром» (Ampersend, Москва, версия 15). Для статистической обработки экспериментальных данных использовали программное обеспечение Microsoft Excel (пакет ПО Microsoft Office 2003) и ORIGIN 8.0. Число параллельных определений площадей пиков целевых компонентов при анализе каждого из образцов составляло не менее 5. Для оценки погрешностей полученных результатов в случае трёхкратной стандартной добавки использовали метод наименьших квадратов, а в случае двойной добавки — средние значения погрешностей найденных содержаний камфоры для первой и второй добавок.

Результаты и их обсуждение.

Контроль инертности хроматографической системы. Одной из важных стадий количественного анализа, особенно при использовании приборов устаревших моделей, является проверка инертности хроматографических систем. Суть подхода,

предложенного в работе [10], заключается в сравнении результатов анализа смеси нескольких тест-веществ без растворителя и в виде серии растворов в инертных растворителях в том же соотношении, но с последовательно уменьшающимися концентрациями. В качестве компонентов тест-смеси были выбраны 2,3-бутандиол, втор.-бутил-толуол и 1-гептанол, соединения с различной полярностью, имеющие различное число активных атомов водорода в составе гидроксильных групп. Некоторые из них были использованы ранее как компоненты так называемых Grob Test Mixtures (2,3-бутандиол) [9], а другие (втор.-бутилтолуол и 1-гептанол) выбраны впервые в данной работе. Согласно работе [9] критерием принятия гипотезы об инертности на заданном уровне концентраций компонентов является выполнение неравенства

Е w - s")2 < \l (EAS?)2 + (Е (з)

где Sf и Sy — относительные площади пиков тест-соединений предыдущей и последующей серии разбавлений; ASf и ASy — их стандартные отклонения.

В табл. 2 представлены результаты анализа тест-образцов для контроля инертности хроматографической системы.

Таблица 2

Результаты анализа тест-образцов для контроля инертности используемой

хроматографической системы

Относительные площади

Компонент Соотношение компонентов пиков ± стандартные отклонения, %

2,3-бутандиол 1 • 1 • 1 20,5 ±0,2

1-гептанол втор.-бутилтолуол (смесь без растворителя) 30,2 ±0,1 49,2 ±0,2

2,3-бутандиол 19,5 ±0,8

1-гептанол Разбавление в 10 раз 30,2 ±0,2

втор.-бутилтолуол 50,3 ±1,0

2,3-бутандиол 14,1 ±1,2

1-гептанол Разбавление в 100 раз 31,4 ±0,3

втор.-бутилтолуол 54,5 ±1,4

2,3-бутандиол 7,0 ±1,7

1-гептанол Разбавление в 1000 раз 33,0 ± 1,5

втор.-бутилтолуол 60,0 ± 1,2

Из данных табл. 2 следует, что при разбавлении смеси тест-веществ в 10 раз относительные площади компонентов, включая наиболее полярный 2,3-бутандиол, изменяются незначительно. Однако при разбавлении исходного образца в 100 раз они уменьшаются с 20,5 ± 0,2 % до 14,1 ± 1,2 %, а при разбавлении в 1000 раз — уже до 7,0 ± 1,7 %. Следовательно, границей инертности используемой хроматографической системы по 2,3-бутандиолу оказывается диапазон разбавлений между 1 : 10 и 1 : 100, что при дозе 2 мкл соответствует абсолютным количествам этого диола приблизительно от 76 до 8 мкг в пробе.

Аналогичную проверку целесообразно проводить непосредственно для анализируемых соединений, в данном случае камфоры. В табл. 3 представлены результаты такого тестирования.

Таблица 3

Результаты анализа смеси камфора/н-тридекан для контроля инертности используемой хроматографической системы

Относительные площади

Компонент Соотношение компонентов пиков ± стандартные отклонения, %

Камфора 1:1 88,7 ± 1,1

м-тридекан (исходный раствор) 11,3 ± 1,1

Камфора м-тридекан Разбавление в 2 раза 88,7 ±0,8 11,3 ±0,8

Камфора м-тридекан Разбавление в 4 раза 87,3 ±0,9 12,7 ±0,9

Из данных табл. 3 следует, что относительные площади пиков камфоры при разбавлении исходной пробы в 4 раза изменяются статистически незначимо, следовательно, хроматографическую систему в данном диапазоне концентраций по выбранному компоненту можно считать инертной. Так как при введении стандартных добавок концентрация определяемого вещества увеличивается, проводить в дальнейшем серии разбавлений не требуется. Таким образом, тестирование системы по определяемому веществу — камфоре — показало, что результаты количественного газохроматографическо-го анализа модифицированным методом стандартной добавки не искажены эффектами сорбции аналитов.

Аппроксимация результатов на нулевую стандартную добавку. Как уже

было отмечено выше, при использовании метода последовательных стандартных добавок возможны два вида аппроксимации результатов анализа: на бесконечно большую [4] и нулевую [1, 7] стандартные добавки. Эти процедуры позволяют скомпенсировать вероятные изменения коэффициентов распределения определяемых компонентов между фазами. Данные табл. 4 иллюстрируют экстраполяцию результатов определения содержания камфоры в камфорной мази на нулевую величину добавки.

Как видно, с увеличением числа добавок (суммарной массы добавки) количество определяемого компонента в пробе уменьшается приблизительно в 2 раза. Это связано с тем, что введение добавки в образец изменяет её свойства. В связи с этим необходимо экстраполировать полученные значения на нулевую величину добавки, моделируя систему, не искажённую её введением. Рисунок иллюстрирует такую экстраполяцию.

Таблица 4

Экстраполяция результатов анализа на нулевую стандартную добавку на примере определения содержания камфоры в камфорной мази

Характеристика содержания камфоры в исходном образце Масса камфоры, мг

Указано (по составу мази) 90

Найдено после первой добавки (масса добавки 27 мг) 76 ± 17

Найдено после второй добавки (масса добавки 28 мг) 50 ±7

Найдено после третьей добавки (масса добавки 30 мг) 47 ±6

Найдено после экстраполяции результатов на нулевую добавку 86 ± 12

Из данных табл. 4 и графика на рисунке можно сделать вывод о том, что применение экстраполяции результатов анализа на нулевую добавку значительно повышает точность анализа по сравнению с методом однократной стандартной добавки.

70-

60-

50-

40-

щ

к -

Щ

ч

Щ

а с • о

св

30-

20-

<3 10-

10 20 30 40 50

Масса добавки, мг

60

70

80

90

Экстраполяция результатов количественного определения содержания камфоры на нулевую стандартную добавку: параметры регрессионного уравнения М = атдоб. + Ь, а = —0,50 ± 0,24, Ь = 86 ± 12, К = 0,86

Определение камфоры в фармацевтических препаратах. Ещё одним источником ошибок как метода стандартной добавки, так и последовательных стандартных добавок является непостоянство объёма дозируемых проб. Для компенсации этих ошибок в ходе подготовки проб в образцы обычно рекомендуют вводить внутренний стандарт, количество которого в процессе анализа остаётся постоянным. При этом все абсолютные значения площадей пиков заменяют относительными. В этом случае формула (2) должна быть модифицирована следующим образом:

Мх

тдоб.

Рг/Ру

Рг/Р^

- 1

(4)

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

где Мх. — масса определяемого компонента; тдоб.д — суммарное количество стандартной добавки на г-й стадии; Р\ и Р.. — абсолютные площади пиков определяемого компонента до и после г-й добавки соответственно; Рреп.. и Рреп.г — абсолютные площади внутреннего стандарта до и после введения добавки соответственно.

Результаты анализа некоторых фармпрепаратов с использованием метода стандартной добавки в двух вариантах (I и II) представлены в табл. 5 и 6.

I. С использованием абсолютных площадей пиков при расчёте количества определяемого компонента в пробе по формуле (2) и экстраполяцией на нулевую величину добавки.

II. С использованием относительных площадей пиков определяемого компонента и внутреннего стандарта по формуле (4) и экстраполяцией на нулевую величину добавки.

При анализе мази BENGAY активные компоненты препарата (камфору, ментол и метилсалицилат) на насадочной колонке разделить не удалось, поэтому определяли их суммарное содержание с использованием добавки только камфоры. Результаты

0

анализа этой мази лучше всего соответствуют заданному количеству активных компонентов. Погрешности результатов для двух вариантов определений (I и II) составляют —0,2 и —0,6 % соответственно, что иллюстрирует высокую точность метода. Смоделировать образец мази не представлялось возможным, поскольку состав гидрофобной матрицы не указан.

Таблица 5

Результаты количественного определения содержания камфоры в некоторых фармацевтических препаратах методом I

Препарат Указанное количество камфоры в образце Найденное количество камфоры в том же количестве образца (отн. погрешность, %)

Камфорная мазь 2,50 г/25 г 2,36 ±0,32 г (-5,6)

Оригинальный Большой Бальзам Биттнера 9,5 мг/10 мл Экстрагент СНС13 5,4 ± 0,04 мг (-48) Экстрагент СНС13 4,1 ± 0,2 мг (-57)

Мазь ВЕ^АУ 0,160 г*/0,6677 г 0,1597 ±0,037 г (-0,2)

* Суммарное содержание камфоры, ментола и метилсалицилата в неразделенном хроматографи-ческом пике.

Таблица 6

Результаты количественного определения камфоры в некоторых фармацевтических препаратах методом II

Препарат Указанное количество камфоры в образце Найденное количество камфоры в том же количестве образца (отн. погрешность, %)

Камфорная мазь 2,50 г/25 г 2,42 ±0,17 г (-3,2)

Оригинальный Большой Бальзам Биттнера 9,5 мг/10 мл Экстрагент СНС13 6,5 ±0,1 мг (-32) Экстрагент СНС13 5,6 ± 0,3 мг (-43)

Мазь ВЕ^АУ 0,139* г/0,316 г 0,1381 ±0,021 г (-0,6)

* Суммарное содержание камфоры, ментола и метилсалицилата в неразделенном хроматографи-ческом пике.

Менее точные совпадения результатов с указанными были получены при анализе камфорной мази (производство РФ). Причиной этого может являться летучесть камфоры. При сравнении погрешностей определения содержания камфоры двумя вариантами метода последовательных стандартных добавок (—5,6 % для варианта I и —3,2 % для варианта II) можно сделать вывод о том, что точность второго варианта выше.

Анализ Оригинального Большого Бальзама Биттнера, в отличие от остальных препаратов, проводили с использованием двух экстрагентов. Результаты определения содержания камфоры в случае хлороформа следует считать более надёжными, чем в случае хлористого метилена, так как применение более низкокипящего растворителя приводит к его испарению и, как следствие, занижению результатов анализа и увеличению систематической погрешности определений. При сравнении данных табл. 5 и 6 для Оригинального Большого Бальзама Биттнера (экстрагент СНС1з) можно говорить о более высокой точности варианта с введением в пробу внутреннего стандарта (—48 % и —32 %). Найденное содержание камфоры при анализе Бальзама значительно отличается от указанного (практически на 30 %), что, вероятно, связано с летучестью этого соединения или/и с нарушениями технологического процесса приготовления препарата.

Применение при анализе различных модификаций метода последовательных стандартных добавок позволило сделать вывод о высокой точности каждого из них. Использование нескольких добавок определяемого аналита в гетерофазную систему с последующей экстраполяцией результатов на нулевую величину, а также разработка модификации метода последовательных стандартных добавок с введением внутреннего стандарта являются объединением трёх процедур, ранее известных по отдельности [1, 4, 10]. Такая совокупность приёмов позволяет повысить точность определения по сравнению с методом однократной стандартной добавки, что показано на примере анализа некоторых фармацевтических препаратов.

Литература

1. Зенкевич И. Г., Климова И. О. Применение метода стандартной добавки для количественного хроматографического анализа // Журн. аналит. химии. 2006. Т. 61. № 10. С. 10481054.

2. Зенкевич И. Г., Рагозина Т. Н. Количественный газохроматографический анализ компонентов гетерофазных систем методом двойной стандартной добавки // Журн. прикл. химии. 1998. Т. 71. № 5. С. 763-767.

3. НовакЙ. Количественный анализ методом газовой хроматографии / пер. с англ. М., 1978. 180 с.

4. Зенкевич И. Г., Морозова Т. Е. Особенности метода стандартной добавки для количественного определения аналитов в сложных матрицах, обладающих сорбционными свойствами // Аналитика и контроль. 2010. Т. 14. № 3. С. 164-171.

5. Макаров Е. Д., Зенкевич И. Г. Сравнение модифицированных методов двойного внутреннего стандарта и стандартной добавки для количественного газохроматографического анализа компонентов гетерогенных смесей // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4: Физика, химия. 2007. Вып. 2. С. 80-87.

6. Grubner O., First M. W., Huber G. L. Gas chromatographic determination of nicotine in gases and liquids with suppression of adsorption effects // Anal. Chem. 1980. Vol. 52. N 11. Р. 1755-1758.

7. Остроухова О. К., Зенкевич И. Г. Сравнение методов внешнего стандарта и стандартной добавки для количественного хроматографического определения пестицидов в растительных объектах // Журн. аналит. химии. 2006. Т. 61. № 5. С. 481-491.

8. URL: http://www.reles.rU/cat/tradefm/0riginal%20Great%20Bittner%20Balsam/1/ (дата обращения: апрель 2011 г.)

9. Зенкевич И. Г., Макаров Е. Д., Макаров А. А., Климова И. О. Способ и критерии контроля инертности газохроматографических систем // Аналитика и контроль. 2006. Т. 10. № 2. С. 175-183.

10. Зенкевич И. Г., Макаров Е. Д., Макаров А. А. и др. Особенности эксплуатации хроматографов устаревших моделей. Характеристика инертности хроматографических систем // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4: Физика, химия. 2007. Вып. 1. С. 91-101.

Статья поступила в редакцию 17 мая 2011 г.

В. В. Пакальнис, И. В. Зерова, В. В. Алексеев, С. И. Якимович

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЭТИЛОВЫХ ЭФИРОВ 4-ГЕТАРИЛ-2,4-ДИОКСОБУТАНОВЫХ КИСЛОТ С ГИДРАЗИДАМИ

В представляемой работе, являющейся продолжением предыдущих систематических исследований, мы изучили таутомерное поведение продуктов конденсации этиловых эфиров 4-гетарил-2,4-диоксобутановых кислот I и II, где 1,3-дикарбонильный фрагмент несёт в качестве обрамляющих заместителей сложноэфирную группировку и пятичленный 2-тиенильный или шестичленный 3-пиридильный гетероцикл, с гидра-зидами бензойной и 2-пиридинкарбоновой кислот III и IV.

Ранее нами было показано, что реакция 1,3-дикарбонильных соединений с гидрази-дами заканчивалась на стадии, предшествующей образованию 1-ацилпиразолов [1, 2]. Продукты такой конденсации в кристаллическом состоянии могут иметь гидразонное, енгидразинное или 5-гидрокси-2-пиразолиновое строение. В растворах эти производные, которые только условно ожно называть ацилгидразонами, способны показывать прототропные равновесия между линейными структурами, а также кольчато-цепные равновесия, где 5-гидрокси-2-пиразолину противостоит одна из открытых форм или их совокупность [1-5].

Выбранные 1,3-дикарбонильные соединения I и II обладают двумя различными ке-тонными группами, поэтому реакции с азотистыми нуклеофилами могут заканчиваться образованием региоизомерных производных. Сразу отметим, что их взаимодействие с гидразидами III и IV протекает со 100 %-ной региоселективностью. Были выделены продукты конденсации (V-VIII) только по связи С=О, смежной со сложноэфирным радикалом, как это указано на схеме ниже. На ней также приведены возможные тау-томерные и конфигурационные формы, в которых могут существовать обсуждаемые продукты конденсации и которые могут быть участниками таутомерных равновесий в растворах.

Укажем далее, что если регионаправленность реакции конденсации не зависит от структуры реагентов, то строение образующихся производных V-VIII и их таутомер-ный состав в растворах различаются решительным образом. Эти заключения были сделаны на основе изучения ацилгидразонов V-VIII методами спектроскопии ЯМР 1Н и 13 С при сопоставлении со спектральными характеристиками широкого круга ранее изученных подобных производных 1,3-дикарбонильных соединений [1-5]. Кроме того, мы привлекли в качестве дополнительного модельного соединения продукт конденсации диэтилового эфира 2-оксобутан-2,4-диовой кислоты IX с гидразидом III (соединение X).

В данном случае реакция, естественно, осуществляется по кетонной связи С=О, возникающий продукт конденсации X способен существовать только в линейных гидра-зонной А или енгидразинной Б формах (см. схему). Производное X структурно весьма близко продуктам конденсации гидразидов III и IV с 1,3-дикарбонильными соединениями I и II по связи С=О, соседней со сложноэфирной группировкой. Спектральные свойства ацилгидразона X вполне могут быть использованы как для оценки регио-направленности реакции гидразидов с соединениями I и II, так и для определения

ОБг

К'

бю2с

К'

ОО I, II, IX

+

О Я' III, IV

О

■Vм 0

О

Я'

К О Ъ1Н

О

л.

бюс н

О' Я'

л

О

н

\

Я'

N

\

О

н

Н О

Я'

2\

\ N / — N

/ \

Л Н

\\ О

бю2с

ОН

^^Ш, X

таутомерного и конфигурационного состава соответствующих ацилгидразонов в растворах.

В спектре ЯМР ХН раствора соединения X в CDC1з, снятом непосредственно после растворения и отражающего строение этого вещества в кристаллическом состоянии, наблюдается набор резонансных сигналов, соответствующий одному из конфигурационных изомеров гидразонной формы. Так, имеющийся в спектре синглетный сигнал интенсивностью в два протона при 5 3,86 и сигнал интенсивностью в один протон при 11,24 м. д. с уверенностью можно отнести к протонам метиленовой группы 1,3-дикар-бонильной составляющей и протону связи NH этой формы.

При выдерживании раствора соединения X в его спектре ЯМР 1Н возникает новый набор сигналов, указывающий на появление альтернативного диастереомера

Б

г

Е

гидразонной формы А, принадлежащие ему сигналы вышеуказанной метиленовой группы и связи NH находятся при 6 3,68 и 13,50 м. д. Значительно более низкопольное положение сигнала связи NH позволяет принять для появляющегося диастереомера ^-конфигурацию Az , при которой возможно образование прочной хелатной внутримолекулярной водородной связи (ВМВС) с участием атома водорода связи NH и атома кислорода связи С=О сложноэфирной группировки (см. схему).

Хорошо известно, что образование хелатной связи вызывает значительное низкопольное смещение сигнала протона при гетероатоме в спектрах ЯМР 1Н [3, 4]. Естественный вывод — первоначальный набор сигналов принадлежит S-гидразонной форме Ae, и именно в ней существует производное X в кристаллическом состоянии.

Вид спектра раствора соединения X в CDCI3 перестает меняться после выдерживания в течение 2 сут, что указывает на установление равновесия между конфигурационными изомерами гидразонной формы А. В равновесии существенно преобладает Z-изомер AZ, его доля составляет 95 %, а содержание конкурирующего изомера AE не превышает 5 %. Сдвиг диастереомерного равновесия в сторону Z-построения Az следует связать с его стабилизацией благодаря образованию хелатной ВМВС.

Процесс конфигурационного перехода фиксируется и спектроскопией ЯМР 13С. В спектре ЯМР 13 С раствора соединения X в CDCl3, полученном сразу после растворения образца, также имеем один набор сигналов, соответствующий одной из гид-разонных структур. После выдерживания раствора в течение 2 сут этот набор практически исчезает, сменяясь другим набором, также соответствующим гидразонной структуре.

Отметим, что в спектрах ЯМР соединения X мы не находим каких-либо указаний на появление второй линейной формы, енгидразинной Б. Прототропное равновесие полностью сдвинуто в сторону гидразонного таутомера А.

Обратимся к производным эфиров 4-гетарил-2,4-диоксобутановых кислот V-VIII. В спектре ЯМР 1Н раствора соединения V в CDCl3, снятом сразу после растворения образца, имеются два набора сигналов. Один из них отвечает гидразонной структуре. Так, синглетный сигнал при 6 4,42 должен быть отнесён к протонам метиленовой группы 1,3-дикарбонильной составляющей, а сигнал при 6 11,89 м. д. вдвое меньшей интенсивности вполне может принадлежать протону связи NH. Сравнение со спектральными свойствами модельного соединения X показывает большое сходство с характеристиками S-диастереоизомерной гидразонной структуры последнего. Это позволяет утверждать, что обсуждаемый набор сигналов в спектре производного V принадлежит S-гидразонной структуре Ae , возникающей при взаимодействии 1,3-дикарбонильного соединения I с бензоилгидразином III по связи С=О, смежной со сложноэфирным заместителем (см. схему).

Второй набор сигналов в спектре соединения V содержит два несимметричных дублета при 6 3,44 и 3,69 м. д., образующих типичную систему АВ (Jab = 19,2 Гц), и уширенный сигнал при 5,55 м. д., что является прямым указанием на наличие 5-гидрок-си-2-пиразолинового таутомера В. В его структуре имеется центр хиральности, атом углерода в положении 5 цикла. Это и обусловливает диастереотопность метиленовых протонов при атоме углерода в положении 4, а соответственно и появление системы АВ в спектре ЯМР 1Н. Уширенный сигнал при 6 5,55 м. д., очевидно, принадлежит протону связи ОН. Сопоставление со спектральными данными, относящимися к продуктам конденсации 1,3-дикарбонильных соединений, существующих как 5-гидрокси-2-пиразолины или имеющих эту форму как составную часть таутомерного равновесия [1-5], полностью согласуется с указанным выше выводом.

Судя по интенсивности сигналов, таутомером, доминирующим в свежеприготовленном растворе соединения V, является Е-гидразон Ае . Скорее всего, производное V в кристаллическом состоянии и обладает Е-гидразонной структурой. При переходе в раствор по причине благоприятного пространственного расположения NH-функции в гидразонном элементе и связи С=О, соседней с 2-тиенильной группой, происходит быстрый частичный переход в 5-гидрокси-2-пиразолиновую форму В и устанавливается кольчато-цепное равновесие между Е-гидразоном Ае и циклическим таутомером В.

При выдерживании раствора соединения V вид его спектра меняется. Появляется третий набор сигналов, который постепенно становится наиболее интенсивным. Этот набор соответствует гидразонному построению с ^-конфигурацией Az. Сигнал протона связи NH возникающего диастереомера находится при 5 13,55 м. д., в той же области, что и соответствующие сигналы ^-гидразонной формы Az в спектре модельного соединения X.

Изменения спектра раствора соединения V в СDC1з прекращаются через 2 сут, устанавливается трёхкомпонентное кольчато-цепное равновесие: 5-гидрокси-2-пиразо-лину В противостоят Z- и Е-гидразоны Az и Ае (таблица). Содержание циклического таутомера В после достижения равновесного состояния невелико (6 %), внутри гид-разонной формы, как и можно было ожидать, доминирует Z-диастереомер А2; (80 %) с его хелатной ВМВС, доля Е-диастереомера Ае — 14 %.

Ацилгидразоны этиловых эфиров 4-гетарил-2,4-диоксобутановых кислот У-УШ

Структура Таутомерный и конфигурационный

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

№ соединения в кристаллическом состав растворов

состоянии в СБС13

V А Е Аг (80 %), АЕ (14 %), В (6 %)

VI А2 А.2 (93 %), АЕ (7 %)

VII В кг (12 %), Бг (2 %), В (86 %)

VIII Б2 А2 (72 %), АЕ (3 %), Б2 (17 %), В (8 %)

Смена растворителя, переход к ДМСО^в не сказываются на составе участников равновесия. Несколько возрастает доля циклического таутомера В (15 %). Однако внутри гидразонной составляющей происходит существенное перераспределение в пользу ^-конфигурации Ае (77 %), доля доминировавшего в СDC1з Z-диастереомера А2; в ДМСО^б равна всего 8 %. Это связано, очевидно, с более выраженной неспецифической сольватацией сильным диполярным растворителем ДМСО^в более полярного Е-гидразонного построения Ае и с образованием межмолекулярной водородной связи (ММВС) между протоном NH связи Е-диастереомера Ае и молекулами растворителя, обладающего высокими основными свойствами.

Аналогичное исследование с помощью спектроскопии ЯМР ацилгидразонов VI-VIII, включающее временной мониторинг спектров ЯМР 1Н и 13С, сопоставление со спектрами модельного соединения X, а также со спектрами ранее исследованных ацилгидразонов 1,3-дикарбонильных соединений, имеющими в кристаллическом состоянии гидразонное, енгидразонное или 5-гидрокси-2-пиразолиновое строение [1—5], показали, что в кристаллическом состоянии производное VI имеет Z-гидразонное строение Az, соединение VII обладает циклической структурой В, а производное VIII является Z-енгидразином Бz. В СDC1з в случае соединения VI мы сталкиваемся только с конфигурационным равновесием между Z - и Е-гидразонами Az и Ае .В растворе

производного VII равновесие включает три компонента, к гидразонной форме, представленной только Z-диастереомером Az, присоединяются Z-енгидразинная форма Б^, также имеющая хелатную ВМВС, и циклическая, доминирующая форма В. Наконец, в случае соединения VIII мы встречаемся уже с четырёхкомпонентным равновесием, в качестве участников которого выступают геометрические изомеры гидразонного тау-томера Az и Ae, Z-енгидразинная форма Бz и кольчатая форма В. Можем отметить, что замена 2-тиенильного цикла на 3-пиридильный заместитель благоприятствует сопряжённой енгидразинной форме Б и кольчатому 5-гидрокси-2-пиразолиновому тау-томеру В. Это следует связать с высокими электроноакцепторными свойствами 3-пи-ридильного заместителя, увеличивающего интенсивность р-я-я-сопряжения в енгидра-зине Б, а также электрофильность соседней связи С=О и соответственно её склонность к внутримолекулярным взаимодействиям с нуклеофильными группами.

Отметим также, что использование гидразида пиколиновой кислоты IV вместо бен-зоилгидразина благоприятствует линейным таутомерам, гидразонному А и енгидразин-ному Б. Подобный эффект отмечался и ранее, например при исследовании таутомерии ацилгидразонов трифторметилсодержащих 1,3-дикетонов [1, 5]. Это объяснялось образованием дополнительной ВМВС между атомом азота 2-пиридильного кольца и про-тонизированным атомом водорода NH-группы в линейных таутомерах.

Наконец, как самое характерное, хотелось бы выделить, что в данной работе были рассмотрены четыре близкородственных соединения V-VIII, но каждое из них в кристаллическом состоянии имеет свое структурное построение, а в растворах характеризуется своим, индивидуальным таутомерным равновесием.

Экспериментальная часть. Спектры ЯМР ХН и С записаны на приборе Bruker DPX-300 в CDCI3 и ДМСО-de, рабочие частоты 300 (ХН) и 75 МГц (13С). Оценку таутомерного состава выполняли, интегрируя сигналы, соответствующие различным таутомерным формам; точность определения ±2 %.

Этиловые эфиры 4-гетарил-2,4-диоксобутановых кислот (соединения I и II) были получены сложноэфирной конденсацией диэтилового эфира щавелевой кислоты и 2-ацетилтиофена и 3-ацетилпиридина.

Диэтиловый эфир 2-оксобутан-1,4-диовой кислоты (соединение IX) был получен сложноэфирной конденсацией диэтилового эфира щавелевой кислоты и этилового эфира уксусной кислоты. В качестве конденсирующего агента использовался гидрид натрия.

Этиловый эфир 2-[(£)-2-(бензоилгидразоно)-4-оксо-4-(2-тиенил)]бутано-вой кислоты (V). К раствору 0,68 г (3 ммоль) этилового эфира 4-(2'-тиенил)-2,4-ди-оксобутановой кислоты в 5 мл абсолютного этанола прикапывают при перемешивании раствор 0,41 г (3 ммоль) бензоилгидразина в 5 мл абсолютного этанола. Перемешивание продолжают в течение 2 ч. Выпавшие через некоторое время из реакционной среды кристаллы отфильтровывают и сушат. Из маточного раствора выделяют дополнительную порцию продукта конденсации. Общий выход этилового эфира 2-[(^)-2-(бен-зоилгидразоно)-4-оксо-4-(2-тиенил)] бутановой кислоты (V) 0,774 г (75 %), ¿пл. 113 °С. Спектр ЯМР 1Н (CDCI3), ô, м. д.: (Ae, 14 %): 1,27 (3Н, т, J = 7,3 Гц, СН3); 4,33 (2Н, к, J = 7,3 Гц, ОСН2); 4,42 (2Н, с, СН2); 7,42 (1Н, т, J = 4,4 Гц, Наром.); 7,52-7,66 (3Н, м, Наром.); 7,85 (1Н, д, J = 5,5 Гц, Наром.); 8,13 (2Н, д, J = 6,4 Гц, Наром.); 8,25 (1Н, д, J = 3,7 Гц, Наром.); 11,89 (1Н, уш. с, NH); (Az, 80 %): 1,41 (3Н, т, J = 7,3 Гц, СН3): 4,34 (2Н, с, СН2); 4,35 (2Н, к, J = 7,3 Гц, ОСН2); 7,20 (1Н, т, J = 4,6 Гц, Наром.); 7,52-7,66 (3Н, м, Наром.): 7,71 (1Н, д, J = 4,6 Гц, Наром.); 7,81 (1Н, д, J = 3,7 Гц, Наром.); 7,97 (2Н, д, J = 7,3 Гц, Наром.); 13,55 (1Н, уш. с, NH); (В, 6 %) 1,36 (3Н, т, J = 7,3 Гц,

СНз); 3,45 (!Н, д, Jab = 19,2 Гц, С4Нв); 3,66 Н, д, Jab = 19,2 Гц, С4НА); 4,33 (2Н, к, J = 7,3 Гц, ОСН2); 5,55 (ХН, с, ОН); 6,99 (ХН, уш. т, J = 3,7 Гц, Наром.); 7,12 (ХН, д, J = 2,7 Гц, Наром.); 7,50 (2Н, т, J = 7,3 Гц, Наром.). Остальные сигналы наложены на сигналы других таутомеров. Спектр ЯМР 13С (свежеприготовленный раствор в CDCI3), 5, м. д.: (Ae) 14,89 (СН3); 38,61 (СН2); 62,14 (ОСН2); 129,10 (2Cph); 129,44 (2Cph); 129,73 (Си*); 132,90(Cph); 133,97 (Cph); 135,15 (Си*); 136,23 (Си*); 143,55 (CHet); 162,62; 165,03 (C02Et, COPh); 188,23 (COHet); C=N не локализован. Найдено, %: С 59,36; Н 4,60; N 8,15. ^7^5^048. Вычислено, %: С 59,29; Н 4,68; N 8,13.

По аналогичной методике были получены соединения VI-VIII, X.

Этиловый эфир 4-оксо-2-[(^ )-2-(N '-пиридин-2-карбонил)гидразоно]-4-(2-тиенил)бутановой кислоты (VI). Выход 0,838 г (81 %), ¿пл. 165 °С. Спектр ЯМР 1Н (CDCI3), 5, м. д.: (Az, 93 %): 1,30 (3Н, т, J = 7,3 Гц, СН3); 4,37 (2Н, с, CH2); 4,37 (2Н, к, J = 7,3 Гц, OCH2); 7,18 (1Н, т, J = 4,6 Гц, Наром.); 7,52 (1Н, д, д, J = 7,3, 4,6 Гц, Наром.); 7,70 (1Н, д, J = 4,6 Гц, Наром.); 7,81 (1Н, уш. д, J = 3,7 Гц, Наром.); 7,91 (1Н, т, д, J = 7,3, 1,8 Гц, Наром.); 8,33 (1Н, уш. д, J = 8,2 Гц, Наром.); 8,71(1Н, уш. д, J = 3,7 Гц, Наром.); 14,28 (1Н, уш. с, NH); (Ae, 7 %): 1,26 (3Н, т, J = 7,3 Гц, СН3); 4,43 (2Н, к, J = 7,3 Гц, OCH2); 12,46 (1Н, уш. с, NH) остальные сигналы не локализованы или наложены на сигналы изомера. Спектр ЯМР 13С (свежеприготовленный раствор в CDCI3), 5, м. д.: (Az): 14,20 (СН3); 45,18 (СН2); 62,60 (ОСН2); 123,82 (Сру); 127,52 (Сру); 128,70 (СшО; 132,93 (Си*); 134,53 (Си*); 137,38 (Си*); 137,84 (C=N); 143,34 (COHet), 149,12 (Сру); 149,24 (Сру); 161,78; 162,07 (TO2Et, СОРу); 189,08 (COHet). Найдено, %: С 55,60; Н 4,40; N 12,10. C16H15N3O4S. Вычислено, %: С 55,64; Н 4,38; N 12,17.

Этиловый эфир 1-бензоил-5-гидрокси-5-(3-пиридил)-4,5-дигидро-1Н^-пи-разол-3-карбоновой кислоты (VII). Выход 0,905 г (89 %), ¿пл. 141-142 °С. Спектр ЯМР 1Н (CDCI3), 5, м. д.: (Az, 12 %): 1,29 (3Н, т, J = 7,3 Гц, СН3); 4,32 (2Н, к, J = 7,3 Гц, OCH2); 13,57 (1Н, уш. с, №Н); остальные сигналы не локализованы или наложены на сигналы изомера; (bZ, 2 %): 1,48 (3Н, т, J = 7,3 Гц, СН3); 4,46 (2Н, к, J = 7,3 Гц, OCH2); 6,33 (1Н, с, С=СН); 13,45 (1Н, уш. с, NН); 13,82 (1Н, уш. с, NН); остальные сигналы не локализованы или наложены на сигналы изомера; (В, 86 %): 1,36 (3Н, т, J = 7,3 Гц, СН3); 3,29 (1Н, д, Jab = 19,1 Гц, С4 Нв); 3,64 (1Н, д, Jab = 19,1 Гц, С4 На); 4,36 (2Н, к, J = 7,3 Гц, OCH2); 5,44 (1H, уш. с, OH), 7,33 (1Н, д, д, J = 5,3, 7,9 Гц, Наром.); 7,47 (2Н, т, J = 7,3 Гц, Наром.); 7,57 (1Н, т, J = 7,3 Гц, Наром.); 7,83 (1Н, д, д, J = 2,0, 7,9 Гц, Наром.); 7,98 (2Н, д, J = 7,3 Гц, Наром.); 8,60 (1Н, уш. д, J = 4,0 Гц, Наром ); 8,77 (1Н, уш. с, NH). Спектр ЯМР 13С (свежеприготовленный раствор в CDCI3), 5, м. д.: (B): 14,52 (СН3); 49,73 (С4); 62,76 (ОСН2); 95,08 (C5); 123,84 (Сру); 124,25 (Сру); 128,49 (2Ср^; 130,84 (2Ср^; 132,44 (Ср^; 132,94 (Сру); 138,72 (СрО; 146,42 (Сру); 146,62 (С3); 149,98 (Сру); 161,47, 169,55 (CO2Et, COPh). Найдено, %: С 63,60; Н 4,99; N 12,29, C18H17N3O4. Вычислено, %: С 63,71; Н 5,05; N 12,38.

Этиловый эфир [(Z)-4-оксо-4-(3-пиридил)-2-[^'-(пиридин-2-карбонил)ги-дразино]бут-2-еновой кислоты (VIII). Выход 0,918 г (90 %), ¿пл. 134 °С, Спектр ЯМР 1Н (CDCI3), 5, м. д.: (Az, 72 %): 1,31 (3Н, т, J = 7,3 Гц, СН3); 4,38 (2Н, к, J = 7,3 Гц, OCH2); 4,44 (2Н, с, CH2); 7,46-7,56 (2Н, м, Наром.); 7,93 (1Н, уш. т, J = 7,3 Гц, Наром.); 8,27 (1Н, уш. д, J = 8,2 Гц, Наром.); 8,34 (1Н, д, J = 7,3 Гц, Наром.); 8,73 (1Н, уш. д, J = 4,6 Гц, Наром.); 8,85 (1Н, уш. д, J = 4,6 Гц, Наром.); 9,22 (1Н, уш. с, Наром.); 14,31 (1Н, уш. с, №Н); (Ae, 3 %): 1,41 (3Н, т, J = 7,3 Гц, СН3); 9,39 (1Н, уш. с, Наром.); 12,11 (1Н, уш. с, №Н); остальные сигналы не локализованы или наложены на сигналы изомера; Б, 17 %): 1,50 (3Н, т, J = 7,3 Гц, СН3); 4,51 (2Н, к, J = 7,3 Гц, OCH2); 6,37

^Н, с, С=СН); 7,38 (ХН, д, д, J = 7,8, 5,5 Гц, Наром.); 7,53 (ХН, д, д, J = 5,5, 7,8 Гц, Наром.); 7,93 (ХН, т, д, J = 8,2, 1,8 Гц, Наром.); 8,16 (ХН, уш. д, J = 8,2 Гц, Наром.); 8,31 (ХН, д, J = 7,3 Гц, Наром.); 8,64 ^Н, уш. д, J = 4,6 Гц, Наром.); 8,71 (ХН, уш. д, J = 3,7 Гц, Наром.); 9,08 (ХН, уш. с, Наром.); 13,50 (!Н, уш. с, №Н); 13,88 Н, уш. с, №Н); (В, 8 %): 1,41 (3Н, т, J = 7,3 Гц, СН3); 3,39 (ХН, д, Jab = 19,6 Гц, С4НВ); 3,78 (ХН, д, Jab = 19,6 Гц, С4НА); 4,38 (2Н, к, J = 7,3 Гц, OCH2); 7,10 (ХН, уш. с, Наром.); 7,74 (ХН, уш. с, Наром.); 7,86 (!Н, д, J = 8,0 Гц, Наром.); 8,46 (ХН, уш. д, J = 9,5 Гц, Наром.); 8,86 (ХН, уш. т, J = 5,8 Гц, Наром ); 9,22 (ХН, уш. д, J = 1,5 Гц, Наром ); остальные сигналы не локализованы или наложены на сигналы изомера. Спектр ЯМР 13С (CDCI3), 5, м. д.: (Az): 14,22 (СН3); 44,81 (CH2); 62,62 (OCH2); 123,80, 124,15, 127,55, 131,84, 135,74 (Сру); 136,96 (C=N); 137,84, 149,08, 149,10, 149,86, 154,28 (Сру); 161,62, 162,01 (CO2Et, СОРу-2); 195,54 (С=О). Найдено, %: С 59,90, Н 4,69, N 16,49. C17H16N4O4. Вычислено, %: С 60,00, Н 4,74, N 16,46.

Диэтил 2-[(£)-2-бензоилгидразино]сукцинат (Х). Выход 0,881 г (96 %), ¿пл. 136 °С. Спектр ЯМР 1Н (CDCI3), 5, м. д.: (Ae, 5 %): 1,27 (3Н, т, J = 7,2 Гц, СН3); 1,37 (3Н, т, J = 7,1 Гц, СН3); 3,86 (2Н, с, СН2); 4,21 (2Н, к, J = 7,2 Гц, OCH2); 4,35 (2Н, к, J = 7,1 Гц, OCH2); 7,47 (2Н, т, J = 7,4 Гц, Наром.); 7,57 (1Н, т, J = 7,3 Гц, Наром.); 7,97 (2Н, д, J = 7,4 Гц, Наром.); 11,24 (1Н, уш. с, №Н); (Az, 95 %): 1,25 (3Н, т, J = 7,4 Гц, СН3); 1,33 (3Н, т, J = 7,3 Гц, СН3); 3,68 (2Н, с, CH2); 4,18 (2Н, к, J = 7,4 Гц, OCH2); 4,34 (2Н, к, J = 7,3 Гц, OCH2); 7,49 (2Н, т, J = 7,1 Гц, Наром.); 7,57 (1Н, т, J = 7,1 Гц, Наром.); 7,96 (2Н, д, J = 7,1 Гц, Наром.); 13,50 (1Н, уш. с, №Н). Спектр ЯМР 13С (CDCI3), 5, м. д.: (Ae): 14,52 (СН3); 34,01 (CH2); 62,95 (2OCH2); 128,53; 138,70 (С=N); 164,32 (TOPh); 169,40 (2CO2Et); (Az): 14,27 (СН3); 40,13 (CH2); 61,58 (OCH2); 62,68 (OCH2); 128,13, 129,25, 132,62, 133,09 (Срь); 135,15 (С=N); 162,69 (СОPh); 170,02 (2CO2Et). Найдено, %: С 58,69; Н 4,96; N 9,09, C15H18N2O5. Вычислено, %: С 58,82; Н 5,92; N 9,15.

Литература

1. Якимович С. И., ЗероваИ. В., Зеленин К. Н. Таутомерия гидразонов 1,3-дикарбонильных соединений // Рос. хим. журн. 1999. Т. 43. № 1. С. 115-125.

2. Якимович С. И., ЗероваИ. В., Пакальнис В. В. Кольчато-цепные равновесия азотистых производных // Соврем. пробл. органич. химии. 2010. Вып. 15. С. 217-250.

3. Пакальнис В. В., ЗероваИ. В., Якимович С. И. Взаимодействие ароил- и гетероароилтри-фторацетонов с ароилгидразинами // Журн. общ. химии. 2007. Т. 77. № 10. С. 1665-1676.

4. Пакальнис В. В., ЗероваИ. В., Якимович С. И., Алексеев В. В. Взаимодействие ароил-и гетероароилтрифторацетонов с тиобензоилгидразином // Химия гетероциклических соединений. 2008. № 5. С. 765-775.

5. Пакальнис В. В., ЗероваИ. В., Плясунова А. И., Якимович С. И. Взаимодействие алифатических фторалкилсодержащих 1,3-дикетонов с гидразидами // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4: Физика, химия. 2008. Вып. 4. С. 79-86.

Статья поступила в редакцию 14 июня 2011 г.

В. Г. Поваров, Г. Б. Лисовенко, А. А. Фальк

КИСЛОТОРАСТВОРИМЫЕ СОРБЕНТЫ В ОБЗОРНОМ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ ОРГАНИЧЕСКИХ ПРИМЕСЕЙ ВОДЫ И ВОЗДУХА

Введение. При экоаналитическом обследовании объектов окружающей среды часто возникает ситуация, когда перечень подлежащих определению веществ изначально не установлен. По этой причине обследование распадается на ряд специализированных анализов, требующих значительных затрат времени, разнообразного оборудования и способов пробоподготовки. Наиболее остро эта проблема стоит при анализе органических соединений, для которых применяют сорбционное концентрирование. В этом случае всегда существует опасность пропустить интересующий компонент из-за неполноты десорбции или из-за слишком большого разбавления пробы десорбирующим растворителем. Сам растворитель требуется предварительно очищать от примесей до уровня 10~4 %. Необходимость же в пробоподготовке, обеспечивающей наблюдаемость максимального количества компонентов одной пробы, весьма велика, особенно при первичном обследовании объекта [1]. Использование хроматографа с масс-спектрометричес-ким детектированием позволяет идентифицировать несколько десятков компонентов за один анализ. Естественно, это требует применения капиллярных колонок и эффективного способа предварительного концентрирования аналитов. Такие анализы получили название обзорных, и они играют большую роль в мониторинге окружающей среды.

В представляемой работе обсуждается подход, основанный на использовании по-верхностно-слойных сорбентов на кислоторастворимой основе [2]. В отличие от своих полимерных и углеродных аналогов [3] эти сорбенты легко растворяются в небольшом количестве водного раствора минеральной кислоты (HCl, H2SO4), и затем компоненты экстрагируются несколькими миллилитрами диэтилового эфира. Как показала практика, названный приём предварительного концентрирования оказался эффективен при газохроматографическом определении труднолетучих органических соединений воды и воздуха.

Приготовление сорбентов, подготовка растворителей и влияние типа сорбента на вид хроматограммы. В качестве кислоторастворимой основы мы использовали фракцию оксида магния с размером частиц около 0,5 мм, которую прокаливали на воздухе в течение 1 ч при температуре 700 С для устранения следов органических примесей. Если этого не сделать, то на хроматограммах могут появиться посторонние пики. Данную разновидность сорбента использовали для улавливания полиароматических углеводородов (ПАУ) из выхлопных газов автомобилей.

Сорбционное концентрирование органических веществ из воды потребовало модификации поверхности оксида органическими соединениями, поскольку чистый оксид обладал низкими сорбционными свойствами. Модифицирование проводилось двумя способами: из газовой фазы и из раствора.

Газофазное модифицирование поверхности оксида магния проводили, насыщая его парами псевдокумола при комнатной температуре путём продувания газовой фазы с парами через сорбционную трубку с оксидом. Количество нанесённой органической фазы. Соотношение MgO : СбН5СН(СН3)2 равнялось 19 : 1.

I, B -1,01

а

I, B

0,5 и

0,0 -0,5 -1,0-1,5 -2,0-2,5 --3,0-3,5 -

б

2,5

2,0

3,0-

1,5-

3,5

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 t, с

200 0 200 400 600 800 100012001400 1600

t, с

Рис. 1. Хроматограмма эфирного экстракта сорбента модифицированного псевдокумолом (а), парами стирола (б):

детектор электронзахватный, объём экстракта — 200 мкл, ввод в испаритель — 2 мкл, условия хроматографирования в тексте

Из раствора нанесение проводили следующим образом. Навеску углеводорода (УВ), в нашем случае ундекана или псевдокумола, растворяли в диэтиловом эфире, раствор перемешивали с навеской MgO и упаривали эфир. Навеску углеводорода выбирали такой, чтобы соотношение MgO : УВ составляло 5:1. Диэтиловый эфир перед использованием дважды перегоняли для устранения труднолетучих примесей до уровня 10~4 % по массе. Контроль за чистотой осуществляли газохроматографическим методом с применением пламенно-ионизационного и электронзахватного детекторов. Большое содержание модификатора из раствора объясняется тем, что применяемый нами сорбент — пористый, и большая часть растворенного углеводорода попадает в поры и не участвует в эффективном извлечении компонентов из водной фазы. При нанесении из газовой фазы, напротив, молекулы органического вещества с трудом проникают во внутренние поры, что позволяет уменьшить количество модификатора.

Все полученные сорбенты проверялись на совместимость с используемой процедурой пробоподготовки. В первую очередь нас интересовало отсутствие посторонних (лишних) пиков на хроматограмме. Для этого 0,5 г сорбента растворяли в 4 мл 20 %-ной серной кислоты и проводили экстракцию 4 мл диэтилового эфира. Эфирные вытяжки переносили в специальные пробирки и упаривали до объёма 100-200 мкл. Конечный объём зависел от содержания труднолетучего модификатора в сорбенте. Объём подбирался таким образом, чтобы содержание модификатора в растворе не превышало 50 %. В хроматограф вводили пробы объёмом 1-2 мкл шприцем Agilent на 10 мкл. Хроматографический анализ выполняли на приборах «Цвет 500М» и HP-5890 Series II. В анализе использовалась капиллярная колонка 0,25 мм х 30 м с фазой DB-5. Газ-носитель — азот; Тнач. = 70 °С, Ткон. = 220 °С. Скорость подъёма температуры — 6-10 С/мин. На рис. 1 представлены хроматограммы эфирных экстрактов, полученных при пробоподготовке исследованных сорбентов, и видно, что модифицирование поверхности оксида магния стиролом приводит к появлению большого количества пиков на хроматограмме, а это неприемлемо. В свою очередь, использование псевдоку-мола даёт чистую нулевую линию по всей хроматограмме, начиная с момента выхода пика кумола.

Характеристика сорбентов и расчёт сорбционных выходных кривых в проточном режиме. В начале работы мы изучили эффективность приготовленных сорбентов на тестовых веществах в статическом и проточном режимах. Методика экспериментов в статическом режиме описана в работе [2].

В качестве тестовых веществ использовались водные растворы метилоранжа и кси-ленолового оранжевого с концентрацией 1 мг/л. Контроль за убылью красителя из водной фазы проводили фотометрическим методом. Пренебрегая вкладом десорбции на начальной стадии процесса, мы получили для убыли красителя из раствора уравнение

^ _ —ахЬ

с,э '

где а — удельная константа сорбции; х — концентрация сорбента (мг/мл); О — концентрация красителя в момент времени Ь. Результаты измерений представлены в табл. 1.

Таблица 1

Удельные константы сорбции органических соединений

Сорбент Метилоранж а ■ 1СР6 мл/с/мг Ксиленоловый оранжевый а ■ 10~6 мл/с/мг

1^0 2,6 2,8

М^О + РегОз 1,5 1,1

М^О-пропионилхлорид 0,4 -

М^О-стирол 16 16

ЯЮз 0,1 2,5

Уголь 17 8

MgO + РеЯ 0,8 -

М^О-псевдокумол 7 6

Из табл. 1 видно, что наилучшими сорбционными свойствами по сравнению с активированным углём обладает оксид магния, покрытый стиролом и псевдокумолом. Модифицирование поверхности оксидом железа, сульфидом железа, пропионилхлори-дом, а также использование силикагеля С-120 не привело к существенному улучшению сорбционных свойств. В практике анализа водных растворов и газовых сред чаще всего используют не статический, а проточный вариант концентрирования, поскольку он более эффективен и точно фиксирует объём пропущенной пробы. Следовательно, нужны либо специальные эксперименты по изучению свойств сорбентов в проточном режиме, либо корректная модель, позволяющая выполнять расчёт выходных кривых проточного режима по данным статических экспериментов.

Оговоримся сразу, что, несмотря на обилие моделей такого рода, их практическая ценность невелика. Дело в том, что процессы сорбции в порах весьма сложны, и их количественное описание требует большого числа экспериментов, которые не представляют интереса для химика-аналитика. Поэтому мы построили модель с одним подгоночным параметром, который вычисляли исходя из экспериментальной выходной кривой. Для этого в стеклянную трубку диаметром 5 мм насыпали 500 мг сорбента, при этом получался слой высотой 40-45 мм. С обеих сторон трубку затыкали кусочками стекловаты. Через трубку пропускали исследуемый раствор со скоростью 0,5-5 мл/мин и измеряли концентрацию сорбируемого вещества через каждые 5 мл пропущенного раствора. По результатам измерений строилась выходная кривая, представляющая зависимость изменения концентрации от объёма пропущенного раствора. Величина X

в этом случае рассчитывается по формуле

х _ ркрн

рк - Рн

где рк — кристаллографическая, рн — насыпная плотность сорбента. Учитывая, что кристаллографическая плотность оксида магния равна 3,6 г/см3, а насыпная плотность находилась в пределах 0,6 г/см3, величина X получалась равной 720 мг/см3.

Поскольку константа десорбции в условиях статических экспериментов нами не измерялась, а для расчёта выходных кривых она, несомненно, нужна, то именно эта константа и была выбрана на роль подгоночного параметра. Модель сорбционного концентрирования в проточном режиме строилась, исходя из предположения, что процессы сорбции и десорбции протекают в линейной области. При этом У = асх — скорость сорбции, У2 = вух — скорость десорбции, в — удельная константа десорбции, у — масса сорбированного вещества на единицу массы сорбента. Тогда для концентрации растворенного органического вещества в любой точке раствора, обтекающего сорбент, можно записать два дифференциальных уравнения

^ = и^ - аСХ + рХУ,

дУ

аОХ - вХУ,

где г — время с момента начала проточного эксперимента; г — координата, вдоль которой движется раствор через слой сорбента. Данную систему можно проинтегрировать численно при начальных условиях:

О (г = 0,г) = У (г = 0,г) = 0, О (Ь, г = -0) = О0.

Изменяя величину в, можно добиться того, что экспериментальные данные совпадут с теоретическими. Полученное значение можно принять в качестве значения константы десорбции в. Так, для сорбента, покрытого псевдокумолом, выходная кривая совпадает с расчётной при в = 1,7 • 10~3 1/с.

Таким образом, для установления всех величин, влияющих на процесс в проточном режиме, нужно иметь результаты измерений константы сорбции в статическом эксперименте и хотя бы одну выходную кривую для проточного эксперимента. Тогда выходные кривые для других скоростей пропускания раствора и степеней заполнения трубки находятся расчётным путём. Результаты расчёта кривых представлены на рис. 2 и 3.

Определение концентрации ПАУ в выхлопных газах легкового автомобиля. Определение ПАУ в выхлопных газах ДВС не представляет особой сложности, поскольку эти компоненты хорошо сорбируются на большинстве полимерных и неорганических сорбентов (см. [4, 5]). Однако всегда возникает вопрос о полноте десорбции сконцентрированных компонентов. Наш метод полного растворения сорбента лишён этого недостатка.

Но остаётся опасность проскока аналитов через сорбционную трубку. Чтобы убедиться в отсутствии проскока, мы пропускали через две соединённые последовательно трубки насыщенные при 50 °С пары нафталина в воздухе. При последующем анализе содержимого сорбционных трубок мы неоднократно убеждались в отсутствии пика нафталина на хроматограмме эфирного экстракта из второй (считая от воздуха с парами) трубки. Это означает, что проскока нафталина нет. Поскольку другие ПАУ обладают

с/с„

Рис. 2. Результаты оптимизации значения константы десорбции при сопоставлении выходных кривых с экспериментальными данными по сорбции ксиленолового оранжевого из водного раствора в проточном режиме:

А — сигнал пробы, Ао — сигнал холостой пробы; 1 — к = 2 • 10-3; 2 — к = 1,7 • 10"3; 3 — к =1,5 • 10~3; 4 — к =1,3 • 10~3;

100

V, мл

200

Рис. 3. Влияние скорости пропускания раствора через трубку с сорбентом на форму выходных кривых:

остальные параметры системы не изменяются; 1 — V = 6 мл/мин; 2 — V = = 4,8 мл/мин; 3 — V = 2,4 мл/мин; 4 — V = 1,2 мл/мин;

1

0

меньшей, чем нафталин, летучестью, мы решили, что по этим компонентам проскока также не будет. В качестве объектов анализа были взяты выхлопные газы автомобилей «Нива 21213» и «УАЗ-469». На рис. 4 представлена хроматограмма эфирного экстракта, полученного по описанной методике при пропускании 10 л выхлопных газов автомобиля «УАЗ» при частоте вращения вала 3000 об/мин на холостом ходу. Идентификация компонентов проводилась по индексам удерживания, в качестве реперных соединений использовались нафталин, антрацен и пирен. Найденные концентрации ПАУ для двигателя «УАЗ» составили 35 по нафталину, 20 по антрацену и 12 мг/м3 по пирену. В случае автомобиля «Нива» концентрации этих же компонентов оказались в 6-10 раз ниже. По виду хроматограммы можно заметить множество других пиков в области выхода ПАУ. Некоторые из пиков по индексам удерживания были отождествлены с аценафтеном, флуореном и хризеном. Таким образом, использование кислоторастворимых сорбентов оказалось весьма успешным для концентрирования ПАУ из выхлопных газов и может быть рекомендовано к использованию.

Извлечение труднолетучих органических примесей из водных растворов. При анализе водных сред результат оказался не столь определённым. Дело в том, что многие из растворенных в воде органических веществ довольно реакционноспособны и могут реагировать с кислотой при растворении сорбента или трансформироваться под действием кислоты.

Рис. 4- Хроматограмма эфирного экстракта, полученного при концентрировании ПАУ из выхлопных газов автомобиля «УАЗ»:

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

электронзахватный детектор, объём выхлопных газов 10 л, объём экстракта 200 мкл, ввод в испаритель хроматографа — 2 мкл

и, В 32-

Нафталин Антрацен Пирен

-200 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 г, с

0,04

03

0,02

0,00

Кг

Раствор реперов

-200

"г

~г

"г

~г

200

400 600

800

г, с

1000 1200 1400 1600

Рис. 5. Хроматограмма эфирного экстракта, полученного при концентрировании м-алканов из водного раствора:

детектор пламенно-ионизационный; объём исходного раствора — 100 мл, объём экстракта — 300 мкл, ввод в испаритель — 2 мкл; для сравнения приведена хроматограмма раствора тех же алканов в эфире, которая сдвинута вправо на 20 с

1

0

Чтобы избежать ошибок при интерпретации, нам пришлось ограничиться определением предельных углеводородов. На рис. 5 представлена хроматограмма эфирного экстракта, полученного при извлечении н-алканов Сц—С23 из 100 мл водного раствора этих компонентов. Концентрации компонентов в растворе находились на уровне 1 мг/л. Концентрирование проводили 500 мг сорбента М^О с добавкой псевдокумола. Режим концентрирования статический, продолжительность 12 ч. Результаты анализа

представлены в табл. 2, где видно, что степень извлечения находится в диапазоне от 12 до 25 %, при этом наблюдается закономерное снижение по мере уменьшения числа атомов углерода в н-алкане.

Таблица 2

Результаты газохроматографического анализа водного раствора н-алканов с использованием предварительного концентрирования на кислоторастворимом сорбенте

м-алкан Ь выхода, с Высота пика, мВ Степень

в стандарте в экстракте извлечения, %

С23 1408 35,1 8,3 24

С20 1125 75,9 19,2 25

С17 922 35,1 8,0 23

Схб 772 68,3 15,8 23

С14 687 195,1 41,3 21

С13 597 86,4 14,4 17

С12 496 24,6 3,8 15

Си 390 68,3 8,0 12

Заключение. Предложенный метод концентрирования органических примесей на кислоторастворимом сорбенте М^О с добавками труднолетучей органической одноком-понентной фазы оказался удобен для обзорных газохроматографических анализов. При концентрировании из воздуха наблюдается практически полное улавливание примесей. При концентрировании из воды степень извлечения находится на уровне 10-25 %.

Предложенная методика получения сорбента и пробоподготовки не искажает результаты анализа появлением лишних пиков, минимизирует количество органического экстрагента и может быть реализована в условиях обычной химической лаборатории.

Литература

1. Исидоров В. А., Зенкевич И. Г. Хромато-масс-спектрометрическое определение следов органических веществ в атмосфере. Л., 1982.

2. Поваров В. Г., ЛисовенкоГ. Б. Применение кислоторастворимых сорбентов для концентрирования труднолетучих органических веществ из воды // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4: Физика, химия. 2010. Вып. 4. С. 105-113.

3. Москвин Л. Н., Родинков О. В., Карпов Д. С. Концентрирование органических соединений из водных растворов на поверхностно-пористых углеродно-тефлоновых сорбентах // Тезисы докл. II межд. симп. «Разделение и концентрирование в аналитической химии». Краснодар, 2005. С. 72-73.

4. ГОСТ Р ИСО 12884-2007. Воздух атмосферный. Определение общего содержания полиароматических углеводородов (в газообразном состоянии и в виде твёрдых взвешенных частиц).

5. Клюев Н. А., ЧурановаТ. С., Соболева Е. И. Определение полиароматических углеводородов в объектах окружающей среды // Аналитика и контроль. 1999. № 2.

2011 ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА Сер. 4. Вып. 4

КРАТКИЕ НАУЧНЫЕ СООБЩЕНИЯ

УДК 548.12 В. Н. Маркин

ДИФРАКЦИОННОЕ ПОВЫШЕНИЕ СИММЕТРИИ И ГОМОМЕТРИЧЕСКИЕ СТРУКТУРЫ

Введение. В начале 50-х годов ХХ в. на примере кристаллических структур некоторых модификаций SiC было обнаружено явление, которое получило название дифракционного повышения симметрии (diffraction enhancement of symmetry) [1]. Установлено, что дифракционная симметрия может быть выше, чем класс Лауэ (в соответствии с принципом Кюри), и это вызывает значительные трудности в определении кристаллических структур.

До сих пор, однако, нет удовлетворительной теории дифракционного повышения симметрии, применимой к широкому классу кристаллических структур. Рассматриваются лишь отдельные частные случаи, и не предпринимаются попытки кристаллохи-мического анализа этого явления.

Основная идея представленной работы состоит в том, чтобы рассматривать проблему дифракционного повышения симметрии, используя аппарат теории гомометриче-ских структур [2]. С этой целью вводится понятие векторной системы для двух разных нецентросимметричных точечных множеств, обладающих тем свойством, что свёртка этих множеств оказывается центросимметричной.

Теорема о гомометрическом сдвиге. Введём следующие обозначения: MP и Mq — дискретные точечные множества со структурными амплитудами P и Q соответственно; Mр, Mq — инвертированные множества, структурные амплитуды которых P* и Q* (комплексно сопряжённые величины).

Определение. Разностной системой назовём два дискретных точечных множества Mp и Mq, если имеет место соотношение

МР * Mq = МР * MQ, МР ^ МР, Mq ^ MQ.

Геометрически это означает, что свёртка двух нецентросимметричных множеств оказывается центросимметричной. Это понятие относится к конечным и к периодическим структурам. То, что такие множества существуют, показывает конкретный пример: Mp{0, 2, 6,12}, Mq{1, 3,11}. Свёртку двух числовых множеств можно представить в виде матрицы, которая образуется при сложении элементов строки и столбца Mp

•—о-•

б

Рис. 1. Конечная разностная система (а); гомометрические структуры с произвольным сдвигом +и (б), —и (в)

и Мд или при вычитании элементов Мр и Мд (отсюда понятие «разностная система»):

/ 0 2 6 12 \ -1 Г~-[ 1 5 тг

-3-3-13 9 \ -И -И -9 -5 1 )

Согласно теореме о свёртке фурье-преобразование свёртки двух функций есть произведение фурье-преобразований сомножителей. Поэтому, если Мр * Мф = Мр * то PQ* = P*Q. Теперь мы можем доказать теорему о гомометрическом сдвиге. Рассмотрим две кристаллические структуры со структурными амплитудами и , такие что = Р + Qei2яHu, Г2 = Р + Qe-i2яHu, где и — произвольный вектор сдвига Ыд относительно начала координат.

Теорема. Если PQ* = Р*Q, Р = Р*, Q = Q*, то две структуры Г1 = Р + +Qei2яHu и Г2 = Р+Qe-i2яHu различны, но имеют одинаковый набор интенсивностей дифракционных максимумов, то есть \Р\\2 = \Г2\2 (условие гомометрии).

Доказательство. Действительно, \Р1\2 = \Р\2 + \Q\2+PQ*e-i2яHu+Р *Qei2яHu, аналогично \Г2\2 = \Р\2 + ^\2 + PQ*ei2яHu + Р*Qe-i2яHu. Отсюда

^ - \Р\\2 = - Р*Q)(ei2яHu - в-аяНи). Так как Р(3* = Р*(5, то = |Т2|2 при любых значениях Н. ■

На рис. 1 представлена иллюстрация этой теоремы для приведённой ранее конечной системы.

Следует отметить, что из доказательства теоремы вытекает возможность замены точек множества на атомы с реальными функциями атомного рассеяния /\ и /2. В этом случае = /\Р + /2Qei2яHu и Г2 = /\Р + /2Qe-i2яHu. Это обстоятельство позволяет рассматривать доказанную теорему как достаточно общую конструкцию, приводящую к гомометрическим структурам.

Гомометрический дублет Паттерсона. Как известно, простейшей периодической гомометрической парой являются два разных циклотомических набора Паттерсона из четырёх точек, размещённых по позициям субрешётки кратности 8 [3]. Эти два набора оказываются дополнительными, т. е. Ыа и Ыв = Ыя и Ыа П Ыв = 0, где Ыя — циклическая субрешётка, Ыа{0, 1, 3, 4}, Ыв{2, 5, 6, 7}. Покажем, что эти структуры можно интерпретировать с помощью теоремы о гомометрическом сдвиге. Рассмотрим два множества Ыр(0, Т/4) и Ыд(0, Т/2), где Т — период решётки. Эти множества

Рис. 2. Гомометрический дублет из четырёх точек, размещённых по позициям субрешётки кратности 8 (а); сдвиговые структуры (б)

б

•-©-•-©-•

•-•-©-6-•

О

-О

Рис. 3. Дифракционное повышение симметрии, векторная система имеет симметрию Ршш2

Рис. 4. Зеркального равенства нет, но гомо-метрическое равенство сохраняется при аффинном преобразовании

образуют разностную систему, и поэтому структуры Е! и Е являются гомометриче-скими структурами. Поскольку и — это произвольный вектор, то гомометрическая система имеет свободный параметр, который можно как угодно варьировать. На рис. 2 приведён пример гомометрического дублета Паттерсона.

Паттерсон нашел ещё один дублет из четырёх точек, размещённых по позициям субрешётки кратности 13 {0,1, 3, 9} и {0,1,4, 6}, но в этом случае все атомы должны быть одного сорта и такая система оказывается беспараметрической [4].

Дифракционное повышение симметрии. Если вектор сдвига и перпендикулярен вектору Т решётки, то две структуры зеркально равны, но их векторные системы равны не только зеркально, но и трансляционно в силу теоремы о сдвиге. Это приводит к тому, что в векторной системе появляется плоскость симметрии, которой нет в кристаллической структуре. Соответственно дифракционная симметрия оказывается более высокой, чем класс Лауэ. Таким образом, дифракционное повышение симметрии есть следствие существования гомометрических структур (рис. 3).

Если две гомометрические и зеркально равные структуры подвергнуть одному и тому же аффинному преобразованию, которое не является операцией симметрии, то зеркальное равенство исчезает, но гомометрическое равенство сохраняется, поскольку аффинные преобразования любой параллелограмм переводят также в параллелограмм (рис. 4).

©

-О

В этой работе на примере очень простых кристаллических структур рассматривалось явление дифракционного повышения симметрии как непосредственное следствие фазовой проблемы рентгеновского структурного анализа. Такой подход представляется автору наиболее целесообразным, так как позволяет с единой точки зрения, применяя теорию векторного пространства и алгебраические методы, изучать геометрическую и дифракционную симметрию разнообразных кристаллических структур.

Литература

1. Iwasaki H. On the diffraction enhancement of symmetry // Acta Cryst. 1972. Vol. A28. P. 253-260.

2. Hosemann R., Bagchi. On homometric structures // Acta Cryst. 1954. Vol. 7. P. 237-241.

3. Patterson A. L. Homometric structures // Nature. 1939. Vol. 143. P. 939.

4. Patterson A. L. Ambiguites in the X-ray analysis of crystal structures // Phys. Rev. 1944. Vol. 65. P. 195.

Статья поступила в редакцию 20 июня 2011 г.

Н. П. Бобрышева, А. О. Козин, А. А. Селютин

МАГНИТНОЕ РАЗБАВЛЕНИЕ СЛОЖНЫХ ОКСИДОВ 8г2Мп8Ъ06 И 8г2Сг8Ъ06

В последние годы в двойных перовскитах А2В'В"Об (где А — Бг, В' — А1 или 3^эле-мент, В'' — БЬ) обнаружены различные варианты искажений структуры, которые приводят к понижению кубической симметрии кристаллической решётки, например до тетрагональной [1]. Однако общего мнения относительно того, какие именно позиции (атомов Бг или 3^элемента) искажаются, пока нет. Для выяснения этого вопроса представляют интерес результаты магнитного разбавления сложных оксидов Бг2МпБЬОв и Бг2СгБЬОб [2, 3], поскольку в разбавленных твёрдых растворах можно установить характер кислородного окружения парамагнитных атомов. Кроме того, полученные в настоящее время структурные данные позволяют с новых позиций рассмотреть магнитные характеристики исследованных оксидов.

Была исследована магнитная восприимчивость разбавленных твёрдых растворов Бг2МпБЬОб и Бг2СгБЬОб в изоморфном диамагнитном растворителе Бг2А1БЬО6. Твёрдые растворы Бг2МжА1_жБЬОв (0,01 ^ х ^ 0,08) получены керамическим методом по общепринятой методике прокаливанием на воздухе при температуре 900 С в течение 200 ч [3]. Согласно данным рентгенофазового анализа, образцы имеют структуру Бг2А1БЬОб. Магнитная восприимчивость измерена по методу Фарадея в интервале температур 77-400 К. Погрешность измерений составляла 1-2 %.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Магнитное разбавление подтвердило антиферромагнитный характер обменных взаимодействий между атомами 3^элемента, свойственный двойным перовскитам. В структуре перовскита атомы Мп(Ш) и Сг(111) обычно являются высокоспиновыми. Однако и для хрома, и для марганца экстраполяция значений эффективного магнитного момента на бесконечное разбавление раствора приводит к значениям, существенно меньше высокоспиновых. В области температур 80-250 К Мп(Ш) растёт от 2,84 до 3,80 МБ; Сг(111) слабо увеличивается от 1,42 до 1,81 МБ в интервале 80-450 К. Характер этих температурных изменений соответствует теоретическим для низкоспиновых состояний (термы 3Т1д и 2Е соответственно). В случае марганца при температуре выше 250 К значения становятся практически постоянными, что указывает на появление высокоспинового состояния (терм 5 Ед). Таким образом, вблизи Т = 250 К обнаруживается обратимый переход из низкоспинового состояния атомов марганца в высокоспиновое.

Для атомов Мп(Ш) оба спиновых состояния встречаются достаточно часто, но для Сг(111) — это крайне редкое явление. Даже с учётом тетрагональных искажений решётки объяснить реализацию низкоспинового состояния трудно. Однако новые данные о вращении или наклоне октаэдров из атомов кислорода В''Об относительно кристаллографических осей указывают на дополнительное понижение симметрии кислородного окружения. В случае сильных искажений трёхкратно вырожденный уровень ¿2д может расщепляться на синглетный — нижний и двукратно вырожденный — верхний, что уже позволяет реализоваться низкоспиновому состоянию Сг(111). Кроме того, сдвиг двух атомов кислорода из своих позиций в октаэдре В''Об может привести

к плоскоквадратной координации B-позиций, и, вероятно, что изученные твёрдые растворы могут быть новым примером геометрически фрустрированных оксидных систем.

Литература

1. FaikA., Iturbe-Zabalo E, UrcelasI., Igartua J. M. // J. Sol. State Chem. 2009. Vol. 182. P. 2656.

2. БрачБ.Я., Бобрышева Н. П., РакитинЮ.В., Рябков Ю. И. // Вестн. Ленингр. ун-та. Сер.: Физика, химия. 1982. № 16. С. 3.

3. Бобрышева Н. П., Козин А. О., Паничев Н. А. Химия твёрдого тела: сб. статей. Деп. ОНИИТЭХИМ, Черкассы № 870 XII Д-80 С. 152.

Статья поступила в редакцию 24 июня 2011 г.

Е. Г. Земцова, С. О. Кириченко, Г. О. Абдрашитов, В. М. Смирнов

СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ ВОДНЫХ СУСПЕНЗИЙ АЭРОСИЛА С ПОВЕРХНОСТНЫМИ ТИТАНКИСЛОРОДНЫМИ ГРУППАМИ*

В последнее время всё большее значение придается исследованиям в области регулирования физико-химических свойств поверхности различными физическими и химическими методами и получению на этой основе новых веществ и материалов с улучшенными функциональными свойствами.

Одним из направлений инновационного развития производства неорганических материалов является разработка нового поколения наноструктурированных дисперсных материалов, которые могут найти широкое применение в лакокрасочной промышленности. Решение данной проблемы связано с использованием тонких оксидных слоёв (микро- и наноструктур), нанесённых на различные дисперсные подложки. Материалы, содержащие наночастицы оксида титана, позволяют защитить от выцветания не только деревянные, но и текстильные изделия.

Одним из наиболее перспективных методов синтеза двумерных элемент-кислородных наноструктур на дисперсных подложках является метод молекулярного наслаивания (МН) [1, 2], позволяющий получить твёрдые вещества заданного химического состава и строения. Следует отметить, что коллоидно-химические характеристики наноструктур, синтезированных методом МН, ещё мало изучены, а устойчивость суспензий оксидных наноструктур практически не исследовалась.

В настоящем сообщении представлены результаты синтеза титанкислородных наноструктур на поверхности аэросила (марки 0X50 и А-300) и исследования устойчивости суспензий двухкомпонентных наноструктур на подложке оксида кремния (аэросил) в широком диапазоне фонового электролита (KCl).

Синтез титанкислородных групп на поверхности непористой подложки осуществляли методом молекулярного наслаивания (ML-ALD) в газовой фазе. Процесс проводили в проточном стеклянном (пирекс) реакторе в токе тщательно осушенного аргона (точка росы — (—80 °С)). В качестве подложки использовали непористый кремнезём (аэросил марки 0X50 и А-300). Частицы аэросилов, по данным электронно-микроскопических исследований, имели форму, близкую к сферической. Схема строения частицы аэросила представлена на рис. 1.

Использование аэросила в качестве подложки было обусловлено двумя обстоятельствами:

— первое связано с отсутствием пор в структуре кремнезёма, что облегчает исследование этого вещества;

— второе связано с широким использованием аэросила в качестве наполнителя композиционных материалов, а также в других областях практического применения.

Согласно данным химического анализа, содержание ионов Ti+4 в образцах 1 и 4 значительно меньше, чем можно было ожидать исходя из количества исходных ОН-групп на поверхности аэросила (табл. 1).

* Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009—2013 г., гос. контракт № П 1040.

н

о \

Н-

о

н

-о^ /

I о

\

.оЛ

81-о^81. о 81 о

н / о /

о

о 81 о 81 о 81 о 81 о 81 о 81 о 81 о

\ 81

\

0

1

8к

о о 81 о

/ о \ о о

о

81

/ н

\ н

н

о

н

Рис. 1. Схема частицы аэросила Таблица 1

Физико-химические характеристики исходных подложек

Объект м2/г г, нм ОН-, мкг/м2

ЯЮ2 (А-300) 220 10 137,7

ЯЮ2 (ОХ-50) 42,5 31 135,2

Для увеличения содержания ионов Т1+4 на основании дополнительных исследований было предложено предварительно наносить на поверхность алюминийкислородные группы. При нанесении на поверхность аэросила первоначально алюминийкислород-ных групп, а затем титанкислородных групп происходит увеличение в несколько раз содержания ионов Т^4 (табл. 2).

Таблица 2

Содержание титана в синтезированных образцах, мкг/м2

Подложка ОХ-50 Подложка А-300

№ Образец Содержание ТТ мкг/м2 № Образец Содержание Т1, мкг/м2

1* [ЯЮзЬТл-О 25,5 4* [ЯЮзЬ^-О 27,0

2* [8Ю2]\ 1 АЮ\ 1 ТЮ 105,0 5* [8Ю2]\ 1 АЮ\ 1 ТЮ 104,0

3** [8Ю2]\ 1 АЮ\ 2 ТЮ 151,0 6** [в102]\ 1 АЮ\ 2 ТЮ 145,0

* Образцы с одним монослоем титанкислородных групп. ** Образцы с двумя монослоями титанкислородных групп.

Для изучения устойчивости суспензий нами применялся широко используемый метод фотометрии, основанный на измерении светопропускания (оптической плотности) системы [3, 4]. Измерения проводили на фотометре КФК-3-01 «ЗОМЗ», раствором сравнения служила дистиллированная вода. Чтобы выяснить приемлемое значение длины волны для исследований, был снят спектр исходного золя БЮ2 — зависимость длины волны А, от светопропускания. Установлено, что максимум поглощения приходится приблизительно на 380 нм, именно эта длина волны и была выбрана для дальнейших исследований. Измерения проводили в кювете длиной 50 мм. Отметим, что частицы

Рис. 2. Седиментационная устойчивость водных суспензий синтезированных образцов; подложка ОХ-50 (а), подложка А-300 (б):

1 — [SiO2]-OH; 2 — [SiO2]\ 1Al-O\ 1Ti-O; 3 — [SiO2]\ 1Al-O\ 2Ti-O; 4 — [SiO2]-OH;

5 — [SiO2]\ 1Al-o\ 1Ti-O; 6 — [SiO2]\ 1Al-o\ 2Ti-O

в исследуемых суспензиях, вероятнее всего, находились в виде агрегатов, поэтому перед измерением оптической плотности исследуемые золи обрабатывались ультразвуком в течение 10 мин.

Исследуемые золи смешивались с раствором электролита определённой концентрации при помощи поршневого смесителя. Смешение происходило во встречных потоках в Т-образном канале, из которого смесь подавалась непосредственно в измерительную кювету. Время измерения отсчитывалось с момента заполнения кюветы исследуемой системой. Далее строились зависимости относительной оптической плотности (Dt — Do)/Do от времени. Для всех систем выполнено исследование кинетики изменения оптической плотности золя при добавлении коагулянта различной концентрации. На основании данных об измерении устойчивости суспензий изучаемых образцов, основанных на определении светопропускания, строились зависимости относительной оптической плотности от времени.

Исследования устойчивости системы в водной среде и нахождение порога коагуляции были выполнены для всех синтезированных образцов. На приведённых графиках кинетической зависимости оптической плотности (рис. 2) видно, что для образцов 1 -3, где подложкой является аэросил марки ОХ-50, все суспензии вначале устойчивы (6 мин), а затем наблюдается постепенное осветление раствора. Такое поведение невозможно однозначно интерпретировать на основании полученных экспериментальных данных.

Для наноструктур, синтезированных на поверхности подложки аэросила А-300, наблюдается неустойчивое поведение всех образцов (4-6). Исходная подложка аэросила марки А-300 тоже не обладала седиментационной устойчивостью в нейтральной области pH. Такое его поведение мы связываем с образованием крупных агрегатов частиц в водной среде.

Для синтезированных образцов с подложкой аэросила 0Х-50 также было выполнено исследование кинетики изменения оптической плотности суспензий при добавлении коагулянта (KCl) различной концентрации (рис. 3). На графиках видно, что при малых концентрациях электролита в воде происходит осветление раствора в кювете. Рост оптической плотности заметен при концентрации электролита (KCl), превышающей порог коагуляции. Из экспериментально полученных зависимостей был определен порог коагуляции (табл. 3).

Рис. 3. Агрегативная устойчивость синтезированных образцов на аэросиле ОХ-50; а — [S1O2]\ 1Al-O\ 1Ti-O, б — [S1O2]\ 1Al-O\ 2Ti-O: 1 — 0,01М, 2 — 0,03М, 3 — 0,1М, 4 — 0,3М KCl

Таблица 3 Рассчитанный порог коагуляции для синтезированных образцов на аэросиле ОХ-50

Данные табл. 3 показывают, что нанесение титанкислородных групп на поверхность аэросила приводит к уменьшению порога коагуляции системы.

Такое изменение порога коагуляции может быть связано с изменением электрохимической природы поверхностного слоя частицы. Известно, что суспензия объёмного оксида титана неустойчива в нейтральной области рН (не коагулирует), и низкий порог коагуляции в нашем случае может свидетельствовать о близости свойств синтезированных титанкислород-ных наноструктур и объёмного оксида титана. Сопоставление результатов измерений устойчивости золей исходного оксида кремния (аэросила) и синтезированных образцов показывает, что нанесение титанкислородных групп на поверхность аэросила приводит к уменьшению порога коагуляции золей на порядок по сравнению с исходной подложкой.

Образец [SiOa] [Si02]\ 1АЮ\ lTi-O [Si02]\ 1АЮ\ 2ТЮ

Порог коагуляции, М 0,150 0,044 0,084

Литература

1. Алесковский В. Б. Химия надмолекулярных соединений. СПб., 1996. 256 с.

2. Смирнов В. М, ЗемцоваЕ. Г., Морозов П. Е., Виноградов А. С. Особенности проведения принудительной организации квазиодномерных железоорганических наноструктур на кремнезёме и исследование их магнитных свойств // Журн. общ. химии. 2008. Т. 79. № 12. С. 1944-1948.

3. Клебанов А. В., Богданова Н. Ф., Ермакова Л. Э., Сидорова М. П. Электроповерхностные характеристики (гидр)оксидов и оксидных наноструктур в растворах 1:1-зарядных электролитов. Электрокинетические характеристики бемита, гетита и оксида кремния // Коллоид. журн. 2001. Т. 63. № 5. С. 624.

4. Рогоза О. М., Голикова Е. В., Чернобережский Ю. М. Электроповерхностные свойства и агрегативная устойчивость водных дисперсий Nb2OБ // Коллоид. журн. 1995. Т. 57. № 2. С. 226.

О. В. Родинков, Г. А. Журавлёва

ПОВЫШЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ АДСОРБЦИОННОГО КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ ПОЛЯРНЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ ПРИ АНАЛИЗЕ ВЛАЖНОГО ВОЗДУХА*

Введение. Определение органических веществ в воздухе на уровне предельно допустимых и фоновых концентраций, как правило, включает стадию концентрирования [1, 2]. К наиболее распространённым методам концентрирования примесей при анализе воздуха относится динамическая сорбция, которая осуществляется путём пропускания анализируемого воздуха через колонку, заполненную сорбентом [1-4]. Негативное влияние на адсорбционное концентрирование оказывает присутствующий в воздухе водяной пар, увеличение содержания которого приводит к снижению сорбционной ёмкости большинства сорбентов [4, 5]. Особенно сильно этот эффект проявляется для низкомолекулярных органических соединений. Обычно используемые в лабораторной практике для осушки воздуха неорганические соли, такие как СаС12 или М^СЮ^, в данном случае непригодны, поскольку наряду с водяным паром в значительных количествах сорбируют и полярные органические вещества, в частности низшие алифатические спирты

[4, 6].

Цель представляемой работы — поиск гигроскопичной соли, практически не сорбирующей полярные органические вещества, для повышения эффективности их адсорбционного концентрирования при анализе влажного воздуха.

Экспериментальная часть. Выбранную в качестве сорбционно-активного материала соль наносили из водного раствора на диатомитовый носитель для газовой хроматографии «Порохром» (размер частиц 0,5-1,0 мм) в количестве 30 % от массы носителя. Для этого навеску носителя 1 г заливали 5 мл 6 %-ного водного раствора соли и при постоянном перемешивании выпаривали воду над электрической плиткой, не допуская разбрызгивания. Приготовленный сорбент выдерживали в сушильном шкафу при 250 С до постоянной массы и хранили в герметичном бюксе. Исследуемый сорбент помещали в колонку из нержавеющей стали 5 х 0,3 см2 и оценивали его сорбционные свойства по отношению к водяному пару и тестовым органическим веществам (метанолу и ацетону). Для этого через колонку пропускали поток влажного воздуха или модельной газовой смеси с объёмным расходом 200 мл/мин.

Оценку ёмкости сорбента по отношению к водяному пару проводили гравиметрическим методом. Поток воздуха увлажняли, пропуская через 1 %-ный водный раствор поваренной соли, которую добавляли в воду для предотвращения возможной конденсации водяного пара на стенках колонки, и направляли его в две последовательно соединённые колонки. Первую заполняли исследуемым сорбентом, а вторую, предварительно взвешенную, колонку заполняли хлоридом кальция, который в условиях эксперимента практически полностью поглощал водяные пары, проскочившие через первую колонку. После пропускания определённого объёма воздуха взвешивали вторую колонку и по увеличению её массы судили об объёме до проскока (Ув) водяного пара через исследуемый сорбент. Величину У в относили к 1 г сорбента-осушителя.

Оценку параметров удерживания органических веществ на исследуемых сорбентах проводили на модельных газовых смесях тестовых веществ, которые получали,

* Авторы выражают благодарность РФФИ (грант 09-03-00124а) за поддержку настоящей работы.

с/с0 1,0-|

V, л

Рис. 1. Выходные кривые удерживания метанола из воздуха с различной относительной влажностью при 20 °С:

1 — 100 %; 2 — 50 %; 3 — 25 %; сорбент — 36 % угля БАУ на ПТФЭ

пропуская поток воздуха через водные растворы с заданной концентрацией этих веществ. Концентрации тестовых веществ в модельных газовых смесях составляли 50 ± 5 мг/м3, а их концентрации в водных растворах задавали, исходя из заранее экспериментально найденных по известной методике [7] коэффициентов распределения между жидкой и газовой фазой. Относительную влажность получаемых модельных газовых смесей регулировали за счёт добавления к водным растворам тестовых веществ этиленгликоля. Как известно [8], растворы этиленгликоля в воде достаточно точно подчиняются закону Рауля, и относительная влажность газовой фазы над подобными растворами будет равна молярной доле воды в растворе.

Выходящий из сорбционной колонки поток газа направляли в дозирующую петлю (1 мл) обогреваемого крана-дозатора, с помощью которого периодически отбирали порции газовой фазы и вводили их в газовый хроматограф. Определение тестовых веществ проводили на хроматографе «Цвет 500М» с пламенно-ионизационным детектором и микронасадочной колонкой 100 х 0,2 см2 с трифторпропилметилсиликоновым эластомером СКТФТ-100 (10 %) на инертоне NAW (0,16-0,19 мм).

На хроматограммах измеряли высоты пиков аналита (К) и относили их к высотам пиков, полученным при вводе в хроматограф модельной газовой смеси, поступающей в сорбционную колонку (Ко). В пределах линейной области зависимости сигнала детектора от концентрации аналита величина К/Ко равна величине с/со, где с и со — концентрации аналита на выходе из сорбционной колонки и на входе в неё соответственно. Строили выходные кривые удерживания тестовых веществ в виде зависимостей с/со от У, где У — объём газа, пропущенного через колонку. Из полученных кривых определяли объём до проскока (Ув) и объём удерживания (Уд). За величину Ув принимали объём газа, пропущенного через колонку (У), который соответствует 95 %-ному извлечению аналита из пробы. За величину Уд принимали объём пропущенного через колонку газа, для которого выполняется условие с/со = 0,5.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Результаты и их обсуждение. Установлено, что параметры удерживания полярных органических веществ даже на гидрофобных сорбентах, к которым можно отнести и активный уголь, довольно сильно зависят от влажности анализируемого воздуха. В качестве иллюстрации на рис. 1 приведены выходные кривые удерживания метанола из воздуха с различной влажностью на композиционном поверхностно-слойном сорбенте (ПСС) на основе активного угля БАУ (36 %) и пористого политетрафторэтилена

(ПТФЭ) в качестве носителя. Как было показано ранее [9, 10], подобные сорбенты позволяют значительно повысить эффективность сорбционного концентрирования по сравнению с чистым углём того же гранулометрического состава.

Ряд неорганических солей обладают высокой гигроскопичностью, образуя во влажном воздухе кристаллогидраты с несколькими молекулами воды, и могут рассматриваться в качестве потенциальных осушителей воздуха [11]. Однако многие из них при этом сорбируют и пары полярных органических соединений, что и было использовано нами для концентрирования последних при их газохроматографическом определении в воздухе [6]. При поиске соли, избирательно сорбирующей водяной пар, рационально исходить из её способности образовывать кристаллогидраты и растворимости в спиртах. Ранее было установлено [6], что только хорошо растворимые в спиртах неорганические соли значительно удерживают спирты из газовой фазы. На основании этого можно сделать обратное предположение, что только плохо растворимые в спиртах соли, способные образовывать кристаллогидраты при комнатной температуре, могут претендовать на роль осушителей, избирательно сорбирующих водяной пар и не сорбирующих спирты.

Как показали результаты настоящей работы, эта гипотеза подтвердилась. В таблице представлены значения растворимостей в воде и метаноле некоторых образующих кристаллогидраты солей и объёмы до проскока водяного пара и метанола на полученных из этих солей сорбентах. На роль оптимального избирательного осушителя может претендовать фторид калия, обладающий невысокой молярной массой и образующий при комнатной температуре кристаллогидрат с четырьмя молекулами воды. Как видно из таблицы, сорбционная ёмкость KF к водяному пару в несколько раз выше, чем у предложенного ранее [5] для селективной сорбции водяного карбоната калия, который не удерживает полярные органические соединения.

Сравнительная характеристика растворимости неорганических солей [12] и параметров удерживания сорбентов на их основе при 20 "С

Растворимость, г/л Параметры удерживания, л/г

Соль в воде в метаноле вода метанол

Ув Ув Ун

КГ 950 1,9 20,2 ± 1,0 < 0,05 < 0,05

К2СОз 1110 ± 1 8,5 ± 0,6 < 0,05 < 0,05

СО804 355 4,18 2,4 ±0,2 0,11 ±0,02 0,31 ± 0,03

Си804 205 10,4 7,1 ± 0,5 1,2 ± 0,06 2,3 ±0,1

СаС12 745 299 25,6 ± 1,1 2,3 ±0,1 5,6 ± 0,4

СоС12 529 385 29,2 ± 1,5 4,6 ±0,3 14,5 ±0,8

Способность к избирательной сорбции водяного пара позволяет использовать сорбент на основе KF в качестве осушителя влажного воздуха при сорбционном концентрировании полярных органических соединений с целью их газохроматографического определения. При этом анализируемый воздух пропускают через две последовательно соединённые сорбционные колонки, первая из которых заполнена сорбентом на основе фторида калия, а вторая — сорбентом для концентрирования определяемых веществ. На рис. 2 приведены выходные кривые удерживания метанола и ацетона из воздуха, насыщенного водяным паром, с использованием предколонки с осушителем на основе KF и без неё. Таким образом, предложенная схема сорбционного концентрирования

V, л

12

16

Рис. 2. Выходные кривые удерживания метанола (1, 2) и ацетона (3, 4) из воздуха, насыщенного водяным паром, в колонке с ПСС (36 % БАУ на ПТФЭ) без предколонки (1, 3) и с предколонкой (2, 4)

с предварительной осушкой анализируемого воздуха позволяет в несколько раз (в случае метанола до семи) увеличить параметры удерживания полярных органических веществ.

0

4

8

Литература

1. Исидоров В. А. Органическая химия атмосферы. СПб., 1992. 288 с.

2. Руководство по контролю загрязнений атмосферы. Л., 1979. 448 с.

3. Муравьёва С. И., Буковский М. И., Прохорова Е. К. и др. Руководство по контролю веществ в воздухе рабочей зоны. М., 1991. 368 с.

4. ДруговЮ. С., Родин А. А. Пробоподготовка в экологическом анализе. СПб., 2002.

5. ДруговЮ. С., Родин А. А. Газохроматографический анализ загрязненного воздуха. М., 2006.

6. Родинков О. В., Бугайченко А. С., Москвин Л. Н. Композиционные сорбенты для сорбци-онного и хроматомембранного концентрирования и выделения летучих органических веществ из водной и газовой сред // Завод. лаб. 2009. С. 11-17.

7. Витенберг А. Г, Иоффе Б. В. Газовая экстракция в хроматографическом анализе: паро-фазный анализ и родственные методы. Л., 1982.

8. Коган В. Б., Фридман В. М., Кафаров В. В. Равновесие между жидкостью и паром: справочное пособие. М.; Л., 1966. Кн. 1.

9. Родинков О. В., Бугайченко А. С., Кислова О. Ф. Получение композиционных угольно-фторопластовых сорбентом методом суспензионного насыщения и оценка их аналитических возможностей // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4: Физика, химия. 2008. Вып. 4. С. 77-82.

10. Родинков О. В., Журавлёва Г. А., Бугайченко А. С. Угольно-фторопластовые сорбенты для экспрессного концентрирования паров органических веществ при анализе воздуха // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4: Физика, химия. 2010. Вып. 4. С. 109-115.

11. Свойства неорганических соединений: справочник / под ред. В. А. Рабиновича. Л., 1983. 392 с.

Н. Н. Кочурова, Н. Г. Абдулин, И. А. Тихомиров, И. И. Гермашева

ВЛИЯНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ВОДНЫХ РАСТВОРОВ

АЛКИЛСУЛЬФАТОВ НАТРИЯ

НА ИХ ТРИБОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА*

Динамическое поверхностное натяжение — это поверхностное натяжение свежеобразованной неравновесной поверхности, которая может наблюдаться на струе жидкости, при образовании пузырьков, капель и т. п.

Механическое определение поверхностного натяжения для плоской поверхности описывается формулой Баккера [1]

+^

У = |(РN (г) - Рт(г))Лг, (1)

где у — механический аналог поверхностного натяжения, который определяется работой, затраченной на увеличение поверхности путём растяжения; Ры и Рт — соответственно нормальная и тангенциальная составляющие тензора давления; 2 — координата в направлении, перпендикулярном разделяющей поверхности.

В работе [2] получена термодинамическая формула для поверхностного натяжения плоского поверхностного слоя, неравновесного в отношении адсорбции, поляризации и электризации. Под поляризацией системы предполагаются ориентация полярных молекул и образование двойного электрического слоя, в результате чего возникает скачок электрического поверхностного потенциала. Предполагая, что вследствие локального нарушения электронейтральности двойного электрического слоя на поверхности образуется свободный заряд д, мы должны дописать член дс!%, где х — поверхностный потенциал. Член такого вида обычно отсутствует по причине электронейтральности поверхностного слоя. В результате уравнение адсорбции для неравновесного поверхностного слоя приобретает вид

N к Мв

¿у = _здТ - е гж - Е ^ - ю - Е -± « - -

г ,к г, к

\ I А'. , ,

,х \ г, х Iх г, х \ г, х

" I Е + В"^«,2)) " ^Х, (2)

г,к,х

где в — избыточная энтропия на единицу поверхности; Т — температура; Г — адсорбция; — химический, рг — электрохимический потенциалы частиц сорта г; N — число частиц; А — площадь поверхности; \ткх) и \ткх ) — средние значения соответственно проекции и квадрата проекции дипольного момента на ось х = х,у,г; Акх и Вкх — сродство ориентации; г — означает сорт частиц; к — номера слоёв, на которые разбита поверхность разрыва между фазами а и в, причём в каждом слое химический (или электрохимический) потенциал считается постоянным.

* Работа поддержана грантом НШ-6291.2010.3.

у, мН/м 68,5-

у, мН/м 56,6-,

5 6

г

1п г (с)

у, мН/м 65,064,664,2

у, мН/м 64,2

63,8

5 6

в

Рис. 1. Результаты эксперимента:

1п г (с)

— ДСН, 2,5 • 10

-3

1п г (с)

а

б — ДСН, 5-10-3 моль/л, 20 °С; в -

5 • 10-3 моль/л, 25 С; г — ДСН X 10-3 моль/л, 20 С

моль/л, 20 С;

ДСН, 12,5

3

6

2

3

6

Все переменные в формулах (1) и (2) являются функциями времени. Первые два члена в правой части в (2) соответствуют равновесному уравнению Гиббса, остальные — неравновесным процессам адсорбции, поляризации и электризации, протекающим в системе.

Эксперимент. В работе исследовалось динамическое поверхностное натяжение трёх веществ: децилсульфата натрия (ДСН), додецилсульфата натрия (ДДСН) и тетра-децилсульфата натрия (ТДСН). Использовались вещества квалификации коллоидно-химически чистые. Исследования динамического поверхностного натяжения проводились для следующих концентраций ДСН: 2,5 • 10~3 моль/л (при 20 С), 5,0 • 10~3 моль/л (при 20 и 25 С), 12,5 • 10~3 моль/л (при 20 С) (рис. 1). Для ДДСН взята концентрация 1,05 • 10~3 (25 С) (рис. 2). Для ТДСН исследовались концентрации 2,6 • 10~5 моль/л (при 20 С) и 9,0 • 10-5 (20 С) (рис. 3).

Измерения поверхностного натяжения проводились методом максимального давления в газовом пузырьке. Благодаря тому, что использовался точный прибор П. П. Пу-гачевича ГАЗ П-1 КТ [3], пузырёк газа создавался гелием, который практически не растворяется и не адсорбируется, вследствие тщательного термостатирования и устранения возможных механических воздействий на установку удалось уменьшить погрешность измерения до ±0,1 мН/м [4].

Результаты эксперимента и их обсуждение. На рис. 3 представлены зависимости динамического поверхностного натяжения у от логарифма времени Ь, измеряемого в секундах. Поверхностное натяжение растворов ПАВ традиционно уменьшается с ростом температуры и ростом концентрации ПАВ, что согласуется с полученными результатами (рис. 1, а, в). Так, для раствора ДСН при 20 С поверхностное натяжение ниже при одинаковом возрасте поверхности Ь и наибольшей концентрации 12,5 • 10~3 моль/л (рис. 1, г). Аналогично у раствора ТДСН (при 20 С) натяжение ниже при концентрации

Рис. 2. Результаты эксперимента:

ДДСН, 1,05 • 10-3 моль/л, 25 С

а

у, мН/м 71,0-

у, мН/м 66,5

66,0

65,5

65,0

64,5

64,0

63,5

70,5 70,0

2

у, мН/м 70,0

69,5 -

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

69,0-

4 5

б

23

6 7 1п г (с) 68,568,0 67,5 67,0

Рис. 3. Результаты эксперимента:

а — ТДСН, 2,6 • 10-5 моль/л, 20 С; б — ТДСН, 9 • 10-5 моль/л, 20 С

1п г (с)

3

1п г (с)

6

9,0 • 10~5 (рис. 3, б), чем при 2,6 • 10~5 моль/л (рис. 3, а). Измерения поверхностного натяжения растворов ДСН при одинаковом возрасте поверхности показали, что увеличение температуры от 20 С (рис. 1, б) до 25 С (см. рис. 1, в) приводит к его небольшому уменьшению.

На всех графиках можно выделить три участка. Сначала наблюдается рост поверхностного натяжения. Далее следуют максимум и слабое изменение поверхностного натяжения. Время, отвечающее максимальному поверхностному натяжению, колеблется для разных изотерм от 50 с до 2 мин. И, наконец, третий участок соответствует области интенсивной адсорбции.

Рост поверхностного натяжения на начальном этапе и, как следствие, появление максимума на изотермах могут быть связаны с электрическим состоянием поверхности.

Вследствие трения в процессе роста поверхности пузырька на ней возникает свободный заряд (трибо-эффект). Таким образом, происходит локальное нарушение

электронейтральности двойного электрического слоя, на поверхности образуется свободный заряд q ив уравнении (2) появляется член qd%, чем и обусловлены низкие значения поверхностного натяжения при малом времени и возникновение максимума на изотермах. Появление члена qd% представляется вероятным в неравновесных условиях образования поверхности при достаточно свежей поверхности (малые времена) и низкой концентрации электролита (когда двойной электрический слой достаточно протяжённый и легко деформируемый). В нашем случае для самой маленькой концентрации ДСН — 2,5 • 10~3 моль/л наблюдается наиболее сильный рост поверхностного натяжения на начальном этапе. Для концентрации ДСН 12,5 • 10~3 моль/л наблюдается уже меньший рост поверхностного натяжения (максимум более пологий). Повышение температуры приводит к некоторому разрыхлению поверхностного слоя и возможности образования свободного заряда. Поэтому при одной концентрации раствора ДСН 5 • 10~3 моль/л при 25 °С увеличение поверхностного натяжения больше, чем при 20 °С. Чем ниже концентрация электролита, тем более протяжённым является диффузный слой, легче происходит его тангенциальный разрыв и тем больший образуется заряд на поверхности (тем существеннее вклад члена qd% в динамическое поверхностное натяжение). Увеличение поверхностного натяжения Ду при малых значениях времени до максимума на наших изотермах составляет несколько десятых миллиньютона на метр, оценки показывают, что это вполне соответствует вкладу в поверхностное натяжение, который может давать член qd% (если воспользоваться литературными значениями q = 4 • 10-7 Кл/см2 и Ду = 0,1 В) [5-7].

Таким образом, с момента образования свежей поверхности возникают два процесса: электризация поверхности и адсорбция. Первый приводит к увеличению поверхностного натяжения, а второй — к его уменьшению, и тем большему, чем больше длина углеводородной цепи ПАВ и больше возраст поверхности. Конкуренция этих двух процессов приводит к тому, что в наших экспериментах при увеличении длины углеводородной цепи у ТДСН и ДДСН трибоэффект проявляется слабее, чем у ДСН.

Литература

1. Bakker G. Kapillarität und Oberflächenspannung: Handbuch der Experimentalphysik. Bd. VI. Leipzig, 1928.

2. Кочурова Н. Н, Русанов А. И. К неравновесной термодинамике динамического поверхностного натяжения // Коллоид. журн. 1984. Т. 46. № 1. С. 9-14.

3. Пугачевич П. П. Усовершенствованный газовый прибор с одним капилляром для измерения поверхностного натяжения // Журн. физ. химии. 1962. Т. 36. № 5. С. 1107-1109.

4. Хабаров В. Н., Русанов А. И., Кочурова Н. Н. Автоадсорбция и поверхностная энтропия жидкостей. 3. Вода // Коллоид. журн. 1976. Т. 38. № 1. С. 120-125.

5. ЛёбЛ.Б. Статистическая электризация. М.; Л., 1963. 408 с.

6. Натансон Г. Л. К вопросу о механизме баллоэлектрических явлений // Докл. АН СССР. 1950. Т. 73. № 5. С. 975-978.

7. Лопатенко С. В., Контуш С. М. Механизм естественной зарядки капель при дроблении полярных жидкостей // Изв. АН СССР. Серия: Энергетика и транспорт. 1984. № 1. С. 151-154.

2011

ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

Сер. 4.

Вып. 4

МАТЕРИАЛЫ III МЕЖДУНАРОДНОЙ КОНФЕРЕНЦИИ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОФИЗИКИ»

ЭМИЛИЯ ВЕНИАМИНОВНА ФРИСМАН (1911-1996)

14-15 июня 2011 г. в Санкт-Петербургском университете прошла III Международная конференция «Современные проблемы молекулярной биофизики», посвящённая 45-летию создания на физическом факультете кафедры молекулярной биофизики и 100-летию со дня рождения профессора Эмилии Вениаминовны Фрисман. Эти две даты тесно связаны. Э. В. Фрисман была активным организатором обучения студентов по новой специализации. Созданная ею научная школа характеризуется высоким уровнем исследований в области молекулярной биофизики и физики полимеров.

За неполные полвека дипломы специалистов по молекулярной биофизике получили более 300 человек. В 1993 г. после введения двухуровневой системы образования на физическом факультете СПбГУ по инициативе Э. В. Фрисман была создана магистерская программа «Молекулярная биофизика». Выпускники кафедры успешно работают в научных и учебных заведениях нашей страны, а также в ведущих научных центрах мира.

В конференции принимали участие представители Московского, Санкт-Петербургского и Волгоградского государственных университетов, Института белка РАН (Пу-щино), Петербургского института ядерной физики им. Константинова, Института высокомолекулярных соединений РАН (Санкт-Петербург), Института цитологии РАН (Санкт-Петербург), Университета Потсдама (Германия), Московского государственного областного университета, Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова РАН (Санкт-Петербург), НИИАГ им. Д.О.Отта СЗО РАМН (Санкт-Петербург), Севастопольского национального технического университета, Института биологии Карельского НЦ РАН (Петрозаводск). Среди них были учёные, аспиранты и студенты — физики, химики, биологи — специалисты в области биофизики, биохимии, молекулярной физики, спектроскопии. Иными словами, конференция объединила представителей многих смежных областей науки, работающих над решением самых разных задач молекулярной биофизики. Особо следует отметить участие выпускников физического факультета СПбГУ разных лет, обучавшихся по специализации «Молекулярная биофизика», а также сегодняшних студентов и аспирантов кафедры молекулярной биофизики.

В двух выпусках журнала вниманию читателей будут предложены статьи, подготовленные по материалам конференции «Современные проблемы молекулярной биофизики».

Н. А. Касьяненко

ВКЛАД Э.В.ФРИСМАН В НАУКУ О ПОЛИМЕРАХ И МОЛЕКУЛЯРНУЮ БИОФИЗИКУ

Эмилия Вениаминовна Фрисман была основателем научной школы в области физики биополимеров, одним из организаторов подготовки специалистов на кафедре молекулярной биофизики, которую она возглавляла более 30 лет. Работы Э. В. Фрисман по физике полимеров стали классическими и внесли огромный вклад в развитие этой науки. Около 300 выпускников физического факультета ЛГУ являются её учениками, многие из которых продолжают свои исследования в научных учреждениях нашей страны и зарубежных лабораториях. Жизнь и творческая деятельность Эмилии Вениаминовны являются примером самоотверженного служения науке и до настоящего времени вдохновляют многих людей, занимающихся физикой макромолекул.

Научная биография Эмилии Вениаминовны совпала со временем бурного развития физики. Её юность пришлась на период становления квантовой механики: высказанная Максом Планком в самом начале ХХ в. идея о квантовании энергии и появление за этим квантовой теории фотоэффекта Альберта Эйнштейна заложили основу новой теоретической физики. Эти представления получили дальнейшее развитие в работах Нильса Бора, Эрнеста Резерфорда, Луи де Бройля, Джорджа Томсона, Вольфганга Паули. 1925-1927 гг. иногда называют золотыми годами физики. В это время Вернер Гейзенберг, Макс Борн, Паскуаль Иордан, Эрвин Шрёдингер и Поль Дирак сумели превратить квантовую механику в стройную логичную теорию (вывод волнового уравнения Шрёдингера и матричная механика Гейзенберга, Борна, Иордана дали основу описания квантовых явлений, а Дирак разработал общую теорию). Таким образом, к началу 30-х гг. были сформулированы основы квантовой механики, определившей направление развития физики и промышленных технологий (это в дальнейшем привело к появлению ядерной бомбы, лазеров, транзисторов, а затем и компьютеров).

В СССР физика также развивалась успешно: в 1934 г. Лев Ландау публикует феноменологическую теорию среднего поля для фазовых переходов, в 1937 г. вышли работы Петра Капицы по сверхтекучести гелия. Надо отметить, что в те годы Ленинградская физическая школа была необычайно сильна. Она дала пятерых Нобелевских

Эмилия Вениаминовна Фрисман

лауреатов по физике. Это П. Л. Капица, Н. Н. Семёнов, Л. Д. Ландау, И. Е. Тамм, а позднее Ж. И. Алфёров. В 1918 г. А. Ф. Иоффе основал Физико-технический институт, а Д.С.Рождественский организовал Государственный оптический институт, который возглавлял до 1932 г., когда его сменил Сергей Иванович Вавилов. Именно Рождественский был инициатором создания физического факультета университета в 1919 г. на базе отделения физико-математического факультета. Среди выпускников физического (и физико-механического) факультета университета — Н.Н.Семёнов, Л.Д.Ландау, А. М. Прохоров, Е. Ф. Гросс, В. А. Фок.

Сказанное выше помогает понять, в какое время Э. В. Фрисман начинала свою научную деятельность на физическом факультете Ленинградского государственного университета, каков был уровень преподавания и научных исследований. В 1939 г. она заняла должность старшего лаборанта на кафедре общей физики. Вскоре Эмилия Вениаминовна стала работать под руководством молодого профессора Виктора Николаевича Цветкова, защитившего в 1940 г. докторскую диссертацию по жидким кристаллам, и вышла за него замуж. В начале Великой Отечественной войны Цветков начал изучать строение и молекулярные свойства каучуков. Эти работы проводились в 1941-1944 гг. в эвакуации в г. Елабуге совместно с сотрудниками ВНИИСК (ВНИИ синтетических каучуков во время войны находился в Казани). За работу в период войны в 1946 г. Э. В. Фрисман была награждена медалью «За доблестный труд в Великой Отечественной войне 1941-1945 гг.». Вскоре после войны, весной 1947 г. Э. В. Фрисман защитила кандидатскую диссертацию на тему «Изучение геометрической формы и оптической анизотропии молекул полимера в растворе».

В 1945 г. на физическом факультете была организована кафедра физики полимеров, которую возглавил В. Н. Цветков. Впервые в университете была начата подготовка специалистов в этой области, и Эмилия Вениаминовна принимала в ней самое активное участие.

Она занималась физикой полимеров фактически со времени возникновения этой науки, вскоре после появления статьи Германа Штаудингера [1], поставившей точку в споре о том, являются ли полимеры коллоидными системами или представляют собой длинные цепи — макромолекулы. Её первые научные работы, выполненные под руководством Виктора Николаевича Цветкова, были посвящены, в частности, доказательству справедливости представления Штаудингера. Например, работа [2] была посвящена изучению деполяризации рассеянного света в зависимости от степени полимеризации полистирола. Результат, свидетельствующий о резком падении фактора деполяризации при использовании вертикально поляризованного и естественного света при достижении степени полимеризации, соответствующей сворачиванию полимера в клубок, однозначно свидетельствовал в пользу концепции Штаудингера. Интересно отметить, что хотя именно Штаудингер ввёл в науку понятие «макромолекула» и модель её цепного строения, он долгие годы был против представления о сворачивания полимера в клубок, предложенного в работах Ф.Эйриха, Г.Марка, Э.Гута [3, 4], и являлся сторонником стержнеобразной модели макромолекулярной цепочки. Дискуссия о модели полимерной цепи привела к появлению блестящих работ Вернера Куна [5], заложивших основы статистической физики макромолекул вместе с трудами Гута и Марка [3, 6].

Исследования Штаудингера в области вискозиметрии [7], посвящённые изучению связи между молекулярной массой полимеров и вязкостью их растворов, определившие во многом статус вискозиметрического метода в развитии экспериментальной базы физики полимеров, сыграли огромную роль и в научной биографии Э. В. Фрисман. Этот

метод на протяжении многих лет был основным в экспериментах, и его традиционно использовали для проверки практически всех теорий гидродинамического поведения макромолекул, посвящённых вопросам протекаемости клубков (роли гидродинамического взаимодействия сегментов с растворителем), объёмных эффектов в растворах гибких и жёсткоцепных полимеров, полиэлектролитного набухания полиионов. Метод вискозиметрии стал в дальнейшем одним из ведущих в исследованиях лаборатории, возглавляемой Э. В. Фрисман. Ею был сконструирован в соответствии с принципиальной схемой, предложенной Зиммом и Крозерсом [9], низкоградиентный ротационный вискозиметр [8], позволявший проводить измерения при градиентах скорости 0,1-10 с-1.

Обычно Э. В. Фрисман с сотрудниками рассматривала гидродинамическое поведение и конформационные особенности полимеров разными методами [24, 25]. Ещё одним методом, с помощью которого была получена значительная часть экспериментальных данных самой Эмилией Вениаминовной, а затем сотрудниками, студентами и аспирантами под её руководством, был метод динамического двойного лучепреломления (двойного лучепреломления в потоке). Разработке и проверке его теории были посвящены широко известные фундаментальные работы, написанные В. Н. Цветковым вместе с Э. В. Фрисман [10-14]. Этим методом получены блестящие экспериментальные данные, составившие золотой фонд науки о полимерах. В первую очередь это работы, посвящённые изучению эффекта формы в растворах полимеров [15-19]. Филигранно проведённые эксперименты с переменой знака двойного лучепреломления при использовании полимеров с отрицательной собственной анизотропией позволили подтвердить представления о причинах, определяющих вклад эффекта формы в измеряемое двойное лучепреломление. Именно методом динамического двойного лучепреломления были получены результаты [26, 27], которые привели к открытию явления ближнего ориен-тационного порядка в растворах полимеров: 19 февраля 1987 г. за № 331 с приоритетом 30 июня 1963 г. зарегистрировано открытие «Свойство растворов полимеров». Открытие определяется следующей формулой: «Экспериментально установлено неизвестное ранее свойство растворов полимеров, заключающееся в корреляции между оптической анизотропией сегмента макромолекулы и оптической анизотропией молекул растворителя, обусловленное существованием ближнего ориентационного порядка в растворах полимеров (эффект Фрисман—Дадиваняна)».

Были изучены и другие факторы, влияющие на оптическую анизотропию макромолекул [20, 21].

В 1952 г. Карл Вольдемар Циглер синтезировал полиэтилен низкого давления и впервые стал использовать катализаторы (комплексы на основе хлоридов титана) [22], а вскоре Джулио Натта получил стереорегулярный полипропилен. Эти работы открыли новые возможности для синтеза различных полимеров. Химия полимеров стала развиваться необычайно быстро. Новые материалы требовали от физиков тщательного анализа структуры и свойств синтезируемых макромолекул, что определило дальнейшее развитие науки о полимерах.

Ещё в 1941-1942 гг. П. Флори и М. Л. Хаггинс разработали термодинамическую теорию растворов полимеров на основе квазикристаллической модели раствора, что позволило рассчитать энергию смешения полимера с растворителем. Флори показал, что для каждого разбавленного раствора полимера существует такая температура (тэта-температура), при которой он ведёт себя как идеальный раствор. В 50-е гг. Флори и его сотрудники учли гидродинамическое поведение растворов и указали на влияние «эффекта исключённого объёма» при разработке термодинамики разбавленных растворов [23].

Если 40-е гг. можно назвать временем становления ленинградской школы физики полимеров, то 50-60-е гг. — это время её расцвета. В 1948 г. был создан Институт высокомолекулярных соединений (ИВС), который и ныне является одним из ведущих научных центров страны, где проводятся фундаментальные исследования по химии, физикохимии и физике высокомолекулярных соединений. В ИВСе в то время работали прекрасные учёные: М. В. Волькенштейн, С.Е.Бреслер, В. Н. Цветков, С.Я.Френкель и др. К концу 50-х гг. в институте сложилась очень творческая атмосфера. Квалифицированные экспериментаторы и сильная теоретическая группа (под руководством М. В. Волькенштейна в то время работали О. Б. Птицын, Т. М. Бирштейн, Ю. Я. Готлиб) обеспечили появление прекрасных научных работ. В университете на кафедре физики полимеров также проводились интересные исследования.

Становление московской школы науки о полимерах связано с именем В. А. Карги-на. В 40-е гг. он от коллоидной химии перешел к исследованию полимеров. К числу первых учеников Каргина относится А. А. Тагер, защитившая под его руководством в 1940 г. в Физико-химическом институте им. Л. Я. Карпова кандидатскую диссертацию. Во время эвакуации она оказалась в Свердловске, где в 1958 г. организовала в Уральском университете кафедру химии высокомолекулярных соединений, которой заведовала в течение тридцати лет. В 50-е гг. Каргин стал работать в МГУ, а в 1955 г. возглавил организованную на химическом факультете по инициативе ректора МГУ академика Петровского кафедру высокомолекулярных соединений. В то время учениками Каргина были ставшие затем академиками В. А. Кабанов, который внес большой вклад в развитие синтеза новых полимеров, Н. А. Платэ, чьи работы по модификации полимеров, начатые в 50-е гг., снискали широкую известность, Н. Ф. Бакеев, возгла-вивиший в 60-е гг. лабораторию структуры полимеров. Исследования были посвящены синтезу и химической модификации макромолекул и выявлению закономерностей механических и термомеханических свойств полимеров в зависимости от их состава и структуры. Эти работы определили методологию исследований школы В. А. Каргина в последующие годы.

Ленинградская школа физики полимеров академиков не произвела (членами-корреспондентами АН СССР стали только М. В. Волькенштейн в 1966 г. и В. Н. Цветков в 1968 г.), но это было следствием крайней централизации управления научными исследованиями, характерной для нашей страны. Сейчас очевидно, какой огромный вклад ленинградские учёные, занимавшиеся исследованием макромолекул, внесли в развитие теоретической и экспериментальной физики полимеров. К тому времени, например, относятся монографии М. В. Волькенштейна [28], Т. М. Бирштейн и О. Б. Птицына [29], В. Н. Цветкова, В.Е. Эскина и С.Я.Френкеля [30]. Следует отметить, что позднее, когда в физику полимеров С. Эдвардс ввёл квантово-механические представления [31, 32], его идеи получили развитие в исследованиях профессора МГУ (работавшего одновременно в Институте физических проблем АН СССР) И. М. Лифшица, предложившего для полимерной цепи аналог уравнения Шрёдингера, и его учеников А. Р. Хохлова и А. Ю. Гросберга [33-35]. Предложенный отечественными учёными подход и работы П. де Жена [36, 37], выявившего аналогию между поведением жидких кристаллов и фазовым переходом металла в сверхпроводящее состояние и показавшего, что статистика одиночной длинной полимерной цепочки в хорошем растворителе эквивалентна статистике магнетика вблизи фазового перехода второго рода, вывели статистическую физику полимеров на совершенно новый уровень.

В 1964 г. Э. В. Фрисман защитила докторскую диссертацию «Исследование оптического и гидродинамического поведения макромолекул в растворах синтетических

и биологических полимеров». Как видно из названия, в это время уже появились первые результаты по изучению биополимеров (см., например, [38]), и научные интересы Э. В. Фрисман сместились в область молекулярной биофизики.

Огромная научная интуиция Эмилии Вениаминовны способствовала тому, что вскоре после расшифровки структуры ДНК [39-41] она со своими учениками переключилась на исследование биологических полимеров и достигла на этом поприще больших успехов. Таким образом, становление молекулярной биологии и молекулярной биофизики, как и в случае физики полимеров, опять практически совпало по времени с её первыми работами в этой области.

В первой половине 60-х гг. на физическом факультете ЛГУ на кафедре биомолекулярной и фотонной физики по инициативе М. В. Волькенштейна, академика А. Н. Те-ренина и Э. В. Фрисман впервые в стране была организована подготовка специалистов по молекулярной биофизике, в частности в области физики биополимеров. Э. В. Фрис-ман возглавила это направление и до конца своей жизни оставалась его бессменным руководителем (в 90-е гг. после перехода на двухуровневую систему подготовки специалистов на физическом факультете оно трансформировалось в магистерскую программу «Молекулярная биофизика»).

Первые работы Э. В. Фрисман в области молекулярной биофизики были посвящены изучению структуры и конформационных параметров нативной и денатурированной ДНК и РНК [38, 42]. До середины 70-х гг. эксперименты выполнялись на образцах ДНК, выделяемых в лаборатории В.И.Воробьёва (Институт цитологии АН СССР), который стал соавтором Э. В. Фрисман на протяжении многих лет. Продолжались также исследования синтетических полимеров [24-27].

Эмилия Вениаминовна обладала филигранной техникой эксперимента и требовала тщательного отношения к исследованиям от сотрудников. Её скрупулезное отношение к мелочам в эксперименте позволили получить чрезвычайно интересные и надёжные данные при работе с капризными биологическими объектами. Она говорила ученикам, что первым (и желательно последним) человеком, подвергающим сомнению полученный результат, должен быть сам экспериментатор. Многократная проверка полученных данных, сопоставление результатов разных методов, анализ влияния условий эксперимента, расчёты параметров для разных моделей — это далеко не все подходы, используемые ею при научной работе. И все её работы до настоящего времени остаются актуальными. Ошибок у неё не было. Эмилия Вениаминовна статьи писала и правила медленно, никогда не приводя одних и тех же данных в разных работах. Это обстоятельство в какой-то мере помешало широкой известности некоторых очень важных для физики полимеров её работ.

Приведу один пример. Ещё в 60-е гг. Эмилией Вениаминовной с сотрудниками были проведены исследования влияния ионной силы раствора на конформацию молекулы ДНК и оценена её жёсткость [43, 44]. В 1972 г. на IV Международном биофизическом съезде в Москве она сделала блестящий доклад о вкладе ближних и дальних электростатических взаимодействий в размеры молекулярного клубка ДНК в растворах разной ионной силы. К сожалению, он был опубликован только в материалах этого съезда [45]. А экспериментальные данные, используемые для анализа в этом докладе, были посланы в печать раньше и опубликованы в работе [46], посвящённой изучению комплексов ДНК с гистоном £1 (согласно современной терминологии, с гистоном Н1). Таким образом, подробные рассуждения о причинах наблюдаемых конформационных изменений ДНК, индуцированных изменением концентрации малых ионов в растворе, в статью не вошли и остались малодоступными для широкой аудитории исследователей.

Все 70-е гг. в научной литературе продолжалась дискуссия о влиянии ионной силы раствора на персистентную длину ДНК. Необычайно популярными были работы Маннинга с его представлением о конденсации противоионов на поверхность полииона [47-49], однако этот подход предсказывал иное от наблюдаемого в эксперименте поведение полиионов в растворах. Тем не менее это спровоцировало появление огромного количества публикаций, подтверждающих «уменьшение степени ионизации ДНК до 25 % в водно-солевых растворах», как предсказывала теория Маннинга. В работе [50] было показано, что приближение Дебая—Хюккеля с гипотезой о конденсации проти-воионов, предложенной Маннингом, приводит к завышению экранировки зарядов полииона противоионами. Граничные условия для решения уравнения Дебая—Хюккеля надо искать с учётом того, что фракция «конденсированных противоионов» на самом деле формирует диффузное облако, размеры которого изменяются с концентрацией электролита.

Попытки найти адекватное теоретическое описание влияния ионной силы раствора на конформационные параметры полиионов были предприняты ещё в 50-е гг. в работах Качальского и Лифсона [51, 52]. Этот подход предсказывал анизотропное набухание (развёртывание) цепочек с переходом к практически полностью вытянутым конфор-мациям, что противоречило экспериментальным данным. Попытки перенести или модифицировать результаты теорий объёмных эффектов, развитых для незаряженных макромолекул, на решение задач о полиэлектролитном набухании были предприняты и Флори [53]. Однако наиболее удачно этот вопрос решён в работах О.Б.Птицына [54-56], в которых были предложены соотношения, хорошо согласующиеся с экспериментальными данными. Не было лишь учтено возрастание жёсткости полиионов в области малых ионных сил. Справедливости ради следует сказать, что экспериментально эту особенность поведения размеров полиионов при малых ионных силах можно заметить только при строгом соблюдении условий изоионности растворов, да ещё и для достаточно жёстких макромолекул — полиэлектролитное набухание гибких полиионов велико, и в этом случае вклад ближних электростатических взаимодействий относительно мал.

Проблема была решена в конце 70-х гг., когда в появившихся независимо работах Одайка, Школьника и Фиксмана [57-60] (основа известной сейчас OSF-теории) были предложены соотношения для описания полиэлектролитных эффектов в растворах жёстких сильно заряженных полимеров. Через несколько лет появились широко известные работы Хагермана [61, 62], в которых методом двойного лучепреломления в электрическом поле была определена жёсткость молекулы ДНК. Оценка персистентной длины ДНК и её зависимость от ионной силы раствора полностью совпали с данными, полученными в работах Э. В. Фрисман за 15 лет до этого.

Зависимость персистентной длины ДНК (и её характеристической вязкости) от ионной силы раствора OSF-теория предсказывала достаточно хорошо [63], тогда как для гибких полиионов её применение приводит к завышенному вкладу ближних электростатических взаимодействий, огромному возрастанию жёсткости и, как следствие, заниженному полиэлектролитному набуханию [64]. В работе [50] показано, что, несмотря на очевидные недостатки теории Маннинга, предложенный им подход имеет большие преимущества по сравнению с решением уравнения Пуассона—Больцмана, которое лежит в основе OSF-теории. Развитие компьютерных технологий способствовало широкому применению метода Монте-Карло к решению задач, связанных с рассмотрением полиэлектролитов [65]. В настоящее время в этой области физики макромолекул достигнут определённый прогресс. Успешно решены задачи о поведении слабо заряженных

полиионов (см., например, [66]), появились новые подходы, связанные с применением идеи скейлинговых преобразований, предложенной впервые П. Ж. де Женом [67].

При этом работы Э. В. Фрисман не потеряли своей актуальности, а феноменологическая теория, развитая в её лаборатории, прекрасно описывает экспериментальные данные для жёстких и гибких полиионов в широкой области ионных сил [68]. В работах Э. В. Фрисман впервые была определена термодинамическая жёсткость денатурированной ДНК [69, 70], изучено влияние плотности заряда двойной спирали на размеры и жёсткость макромолекулы в растворах разных рН [71]. Таким образом, всестороннее исследование полиэлектролитных свойств жёсткоцепных и гибких полиионов было выполнено Э. В. Фрисман с сотрудниками. Выводы о поведении полиионов в растворах разной ионной силы, сформулированные даже в её ранних работах, и сейчас не вызывают сомнений, хотя за многие годы популярными становились самые разные, порой противоположные точки зрения.

В интерпретации экспериментальных данных она была очень осторожна, хотя и говорила, что ошибку в последующей работе можно исправить, но эксперимент должен быть безупречен. В 1974 г. была опубликована статья, авторами которой предложена модель гетерогенной структуры дезоксирибонуклеопротеинов [72]. Сведения о дискретных повторяющихся частицах в хроматине [73], их изображение, полученное с помощью электронного микроскопа [74], характеристика нуклеосомы [75] появились практически в то же время. Идея о закручивании ДНК вокруг гистонов обсуждалась в лаборатории, но в работу не попала. Вместе с тем, приведённый в работе [72] рисунок отражает именно эту идею.

Стоит также упомянуть о работах, выполненных в лаборатории Э. В. Фрисман в первой половине 70-х гг. и посвящённых изучению интеркаляции гетероциклических соединений (см., например, [76]), которые также были новыми и актуальными. Они однозначно подтвердили дискуссионную в то время модель Лермана [77] и явились основой для создания методики изучения взаимодействия ДНК с низкомолекулярными лиган-дами, отвечающей самым строгим требованиям. Этот подход до настоящего времени является наиболее пригодным для исследования широкого круга биологически активных веществ.

В связи с появившимися в начале 70-х гг. работами о В-, А-конформационном переходе ДНК в спирто-водных смесях [78] возник вопрос о состоянии третичной структуры и персистентной длины макромолекулы в этих системах. Работы Э. В. Фрисман, посвящённые исследованию конформационных переходов ДНК в спирто-водных смесях (см., например, [79]), содержали новые данные и повлияли на представления о поведении ДНК в смешанных растворителях.

Чрезвычайно актуальными были и работы Э. В. Фрисман, посвящённые рассмотрению причин конденсации ДНК в растворе, индуцированной различными агентами [80]. Конденсация ДНК приводит к образованию дискретных компактных частиц (иногда тороидальной формы), причём макромолекула сохраняет В-конформацию [81, 82]. Исследование конформационных изменений ДНК, предшествующих конденсации [83], позволило предложить модель сворачивания ДНК в подобные структуры.

Как видно из вышесказанного, работы Э. В. Фрисман всегда отражали основные тенденции развития науки о полимерах и биологических макромолекулах. В 80-е гг. её публикации были посвящены (помимо традиционных вопросов) исследованию молекулярного механизма действия противоопухолевых препаратов на основе координационных соединений металлов [84] и изучению влияния ионизирующей радиации на молекулу ДНК [85]. Перечень публикаций показывает, насколько широк был круг научных

интересов Э. В. Фрисман, причём в каждой области исследований ею получены новые данные, позволившие понять молекулярные основы изучаемых явлений.

Лучшим признанием высокой научной квалификации и педагогического мастерства Эмилии Вениаминовны Фрисман являются её научная школа и огромная армия учеников, которые продолжают развитие идей, сохраняют заложенные традиции и принципы. Об этом свидетельствует и посвящённая её памяти традиционная конференция «Современные проблемы биофизики», которая раз в 5 лет в середине июня собирает на физическом факультете Санкт-Петербургского государственного университета не только её учеников, но и всех желающих представить результаты своих научных исследований.

Литература

1. StaudingerH. Uber Polymerisation // Berichte der Deutschen Chemischen Gesellschaft. 1920. Bd. 53. N 6. S. 1073-1085.

2. Цветков В.Н., Фрисман Э. В. О деполяризации света, рассеянного в растворах каучу-кообразных полимеров // Докл. АН СССР. 1945. Т. 47. № 8. С. 571-574.

3. GuthE., MarkH. Zur innermolekularen Statistik, insbesondere bei Kettenmolekulen // Mo-natsch. Chem. 1934. Bd. 65. N 1. S. 93-121.

4. EirichF., MarkH. Hochmolekulare Stoffe in Losung // Ergebn. exakt. Naturwiss. 1936. Bd. 15. S. 1.

5. Kuhn W. Uber die gestalt fadenformiger moleculi in iosungen // Kolloid Z. 1934. Bd. 68. S. 2-15.

6. MarkH. The elasticity of long chain compounds as a statistical effect // Trans. Faraday Soc. 1936. Vol. 32. N 1. P. 97-115.

7. Staudinger H. Viscosity investigations for the examination of the constitution of natural products of high molecular weight and of rubber and cellulose // Trans. Faraday Soc. 1933. Vol. 29. N 140. P. 18-32.

8. Фрисман Э. В., ЩагинаЛ.В., Воробьёв В. И. Стеклянный ротационный вискозиметр // Коллоид. журн. 1965. Т. 27. С. 130-134.

9. ZimmB., CrothersD. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1962. Vol. 48. N 6. P. 905-911.

10. ZvetkovW., Frisman E. Birefringence of Polyisobutylene Solutions under Flow // Acta Physicochimica URSS. 1945. Vol. 20. N 1. P. 61-96.

11. Цветков В.Н., Фрисман Э. В. Геометрическая форма и оптические свойства цепных молекул в растворе // Докл. АН СССР. 1954. T. 47. № 4. С. 647-650.

12. Фрисман Э. В., Цветков В. Н. Деформация макромолекул в потоке и её влияние на знак динамического двойного лучепреломления раствора полимера // Докл. АН СССР. 1956. T. 106. № 1. С. 42-45.

13. Frisman E. V., Tsvetkov V. N. The Effect of Shape in Streaming Birefringence of Polymer Solutions // J. Polum. Sci. 1958. Vol. 30. N 121. P. 297-314.

14. Цветков В. Н., Фрисман Э. В., Птицын О. Б., Котляр С. Я. Эффект формы в динамическом двойном лучепреломлении растворов полимеров // Журн. техн. физики. 1958. T. 28. Вып. 7. С. 1428-1436.

15. Фрисман Э. В., Архипова Э. Н. Зависимость знака двойного лучепреломления в потоке от концентрации раствора полимера // Докл. АН СССР. 1957. T. 115. № 3. С. 491-493.

16. Фрисман Э. В. Новые сведения об ориентации двойного лучепреломления в потоке растворов полимеров // Докл. АН СССР. 1958. T. 118. № 1. С. 72-74.

17. Фрисман Э. В., Сибилёва М. А., Краснопёрова А. В. Гидродинамические и оптические свойства растворов полимеров в области больших концентраций // Высокомолек. соед. 1959. T. 1. Вып. 4. С. 597-606.

18. Фрисман Э. В., СюйМао. Динамическое двойное лучепреломление и вязкость в системе полиизобутилен-бензол вблизи критической температуры растворения // Высокомолек. соед. 1961. T. 3. Вып. 2. С. 285-289.

19. Фрисман Э. В., СюйМао. Температурная зависимость динамического двойного лучепреломления растворов полимеров в «идеальном растворителе» // Высокомолек. соед. 1961. T. 3. Вып. 2. С. 276-284.

20. Фрисман Э. В., Сибилёва М. А. Зависимость собственной анизотропии макромолекул от молекулярного веса полимера // Высокомолек. соед. 1961. T. 3. Вып. 8. С. 1284-1285.

21. Бирштейн Т. М., БудтовВ. П., Фрисман Э. В., Яновская Н. К. Влияние состава сополимера на оптическую анизотропию его молекул // Высокомолек. соед. 1962. T. 4. Вып. 3. С. 455-462.

22. ZieglerK. // Angew. Chem. 1952. Vol. 64. P. 323-326.

23. FloryP. Principles of the Polymer Chemistry. New York, 1953.

24. Фрисман Э. В., СюйМао. Влияние внутренней вязкости макромолекул на их деформируемость в потоке // Высокомолек. соед. 1964. Т. 6. Вып. 1. С. 41-46.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

25. СюйМао, Фрисман Э. В. Светорассеяние и вязкость растворов полипарахлорстирола в бутаноне // Высокомолек. соед. 1962. T. 4. Вып. 12. С. 1839-1843.

26. Фрисман Э. В., Дадиванян А. К., Дюжев Г. А. К вопросу об определении оптической анизотропии макромолекул // Докл. АН СССР. 1963. T. 153. № 5. С. 1062-1064.

27. Frisman E. V., DadivanianA. K. Effect of Solvent on the Optical Behavior of Macromolecules in a laminar Flow //J. Polym. Sci. 1967. Part C. N 16. P. 1001-1009.

28. Волькенштейн М. В. Конфигурационная статистика полимерных цепей. [Б. м.], 1959.

29. Бирштейн Т. М., Птицын О. Б. Конформации макромолекул. М., 1964.

30. Цветков В. Н., ЭскинВ. Е., Френкель С. Я. Структура макромолекул в растворах. М., 1964.

31. Edwards S. F. The statistical mechanics of polymers with excluded volume // Proc. Phys. Soc. 1965. Vol. 85. N 4. P. 613-624.

32. ДойМ., Эдвардс С. Динамическая теория полимеров. М., 1998. 440 с.

33. ЛифшицИ.М. Некоторые вопросы статистической теории биополимеров // Журн. эксп. теор. физики. 1968. Т. 55. C. 2408-2422.

34. ЛифшицИ. М., Гросберг А. Ю., Хохлов А. Р. Объемные взаимодействия в статистической физике полимерной макромолекулы // Усп. физ. наук. 1979. T. 127. № 3. C. 353-390.

35. Гросберг А. Ю., Хохлов А. Р. Статистическая физика макромолекул. М., 1989. 344 с.

36. De Gennes P.-G. The Physics of Liquid Crystals. Oxford, 1974.

37. De Gennes P.-G. Scaling concepts in polymer physics. Cornell, 1979. 324 p.

38. Фрисман Э. В., Воробьёв В. И., Щагина Л. В., ЯновскаяН. К. Динамическое двойное лучепреломление в растворах дезоксирибонуклеиновой кислоты. Оптическая анизотропия молекул дезоксирибонуклеиновой кислоты в нативном и агрегированном денатурированном состояниях // Высокомолек. соед. 1962. T. 4. Вып. 5. С. 762-768.

39. Watson J.D., Crick F. H. A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid // Nature. 1953. Vol. 171. P. 737-738.

40. Wilkins M. H. F., Stokes A. R., Wilson H. R. Molecular Structure of Deoxypentose Nucleic Acids // Nature. 1953. Vol. 171. P. 738-740.

41. Franklin R., Gosling R. Molecular Configuration in Sodium Thymonucleate // Nature. 1953. Vol. 171. P. 740-741.

42. Фрисман Э. В., ЯновскаяН. К., Щагина Л. В. и др. Динамическое двойное лучепреломление растворов высокомолекулярной рибонуклеиновой кислоты // Цитология. 1962. T. 4. С. 323-325.

43. Фрисман Э. В., Щагина Л. В., Воробьёв В. И., Шапиро Г. В. Гидродинамическое поведение молекул нуклеиновых кислот в растворах разной ионной силы // Биохимия. 1966. T. 31. № 5. C. 1027-1032.

44. Щагина Л. В., Рихтер Д., Фрисман Э. В., Воробьёв В. И. Влияние ионной силы раствора на термодинамическую жёсткость молекул нативной ДНК // Молек. биол. 1969. T. 3. Вып. 2. С. 221-227.

45. Фрисман Э. В. Оптическое и гидродинамическое поведение ДНК и её комплексов с биологически активными лигандами // Доклады симпозиумов IV межд. биофизического конгресса. Пущино, 1973. T. I. C. 301-317.

46. Фрисман Э. В., Дьякова Е. Б., Голикова А. И. и др. Сравнительное изучение конформа-ции свободной ДНК и комплексованной с гистоном f1 в растворах разной ионной силы // Мо-лек. биол. 1973. T. 7. Вып. 5. С. 745-752.

47. Manning G. S. Limiting laws and counterion condensation in polyelectrolyte solutions. I. Colligative properties. I. Colligative properties // J. Chem. Phys. 1969. Vol. 51. N 3. P. 924-933.

48. Manning G. S. Limiting laws and counterion condensation in polyelectrolyte solutions. I. Colligative properties. II. Self diffusion of small ions //J. Chem. Phys. 1969. Vol. 51. N 3. P. 934-946.

49. Manning G. S. The molecular theory of polyelectrolyte solutions with applications to the electrostatic properties of polynucleotides // Quart. ReV. Biophys. 1978. Vol. ll. N 2. P. 179-246.

50. Le BretM., ZimmB. Distribution of counterions around cylindrical polyelectrolyte and Manning's condensation theory // Biopolymers. 1984. Vol. 23. N 2. P. 287-312.

51. Katchalsky A., LifsonS. The electrostatic free energy of polyelectrolyte solution. I. Randomly kinked macromolecules // J. Polym. Sci. 1953. Vol. 11. N 5. P. 409-423.

52. LifsonS., Katchalsky A. The electrostatic free energy of polyelectrolyte solution. II. Fully stretched Macromolecules // J. Polym. Sci. 1954. Vol. 13. N 68. P. 43-55.

53. Flory P. Molecular configuration of polyelectrolytes // J. Chem. Phys. 1953. Vol. 21. N 1. P. 162-163.

54. Птицын О. Б. Теория растворов полиэлектролитов. I. Размеры молекул полиэлектоли-тов при малых степенях ионизации // Высокомолек. соед. 1961. T. 3. № 7. C. 1084-1092.

55. Птицын О. Б. Теория растворов полиэлектролитов. II. Макромолекулы полиэлектролитов в солевых растворах // Высокомолек. соед. 1961. № 8. C. 1252-1262.

56. Птицын О. Б. Теория растворов полиэлектролитов. III. Влияние неравномерного распределения зарядов вдоль цепи на размеры и форму макромолекул // Высокомолек. соед. 1961. T. 3. № 9. C. 1401-1410.

57. OdijkT. Polyeieclroiytes near rod limit // J. Polym. Sci. Polym. Phys. Ed. 1977. Vol. l5. N 3. P. 447-483.

58. SkolnikJ., Fixman M. Electrostatic persistent length of a wormlike polyelectrolyte // Macro-molec. 1977. Vol. l0. N 5. P. 944-948.

59. Fixman M. The Poisson-Boltzmann equation and its application to polyelectrolytes //J. Chem. Phys. 1979. Vol. 70. P. 4995-5005.

60. Fixman M. The flexibility of polyelectrolyte molecules //J. Chem. Phys. 1982. Vol. 76. N 12. P. 6346-6353.

61. Hagerman P. Investigation of the flexibility of DNA using transient electric birefringence // Biopolym. 1981. Vol. 20. N 7. P. 1503-1535.

62. Hagerman P. Electrostatic contribution to the stiffness of DNA molecules of finite length // Biopolym. 1983. Vol. 22. N 3. P. 811-814.

63. Фрисман Э. В., Касьяненко Н. А. Гидродинамическое и оптическое поведение молекулы ДНК в растворах большой ионной силы // Молек. биология. 1990. T. 23. № 2. С. 301-317.

64. Tricot M. Comparison of experimental and theoretical persistence length of some polyelec-trolytes at various ionic strengths // Macromolecules. 1984. Vol. 17. N 9. P. 1698-1704.

65. Ramanathan G. V. Statistical Mechanics of electrolytes and polyelectrolytes. III. The cylindrical Poisson-Boltzmann equation //J. Phys. Chem. 1983. Vol. 78. P. 3223-3232.

66. Khokhlov A. R., Khachaturian K. A. On the theory of weakly charged polyelectrolyt-es // Polymer. 1982. Vol. 23. N 12. P. 1742-1750.

67. De Gennes P. G. Global molecular shapes in polyelectrolyte solutions, in Colston Papers No. 29: Ions in Macromolecular and Biological Systems. 1978.

68. Слоницкий С. В., ФрисманЭ. В., Валеев А. К., Ельяшевич А. М. Расчёт характеристической вязкости синтетических и биологических полиэлектролитов различной жёсткости. Влияние ионной силы на термодинамическую жёсткость молекул нативной ДНК в водных и водно-органических растворителях // Молекул. биол. 1980. T. 14. № 3. С. 484-495.

69. Фрисман Э. В., Щагина Л. В., Воробьёв В. И. Влияние условий тепловой денатурации на оптические и гидродинамические параметры молекул нуклеиновых кислот // Высокомолек. соед. 1967. T. А9. № 8. С. 1745-1750.

70. Веселков A. H., Морошкин В. А., Полякова И. Д. и др. Конформация молекулы денатурированной ДНК в растворах разной ионной силы // Молек. биология. 1976. T. 10. C. 1050-1060.

71. Касьяненко Н. А., Бартошевич С. Ф., ФрисманЭ. В. Исследование влияния рН среды на конформацию молекулы ДНК // Молекулярная биология. 1985. T. 19. № 5. C. 1386-1393.

72. Frisman E. V., SibilevaM. A., Djakova E. B. et al. Studies of Deoxyribonucleoproteins Progressively Depleted of Proteins in Sulutions of Various Ionic Strengths // Biopolymers. 1974. Vol. 13. P. 863-877.

73. HewishD. R, Burgoyne L. A. Chromatin sub-structure. The digestion of chromatin DNA at regularly spaced sites by a nuclear deoxyribonuclease // Biochem Biophys Res Commun. 1973. Vol. 15. N 2. C. 504-510.

74. Olins A. L, OlinsD.E. Spheroid chromatin units (v bodies) // Science. 1974. Vol. 183. N 4122. P. 330-332.

75. Kornberg R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA // Science. 1974. Vol. 184. N 139. C. 868-871.

76. Морошкина Е. Б., Шишов А. К., Кривцова М. А. и др. Исследование влияния акридиновых красителей на молекулярную структуру ДНК // Молек. биология. 1975. T. 9. № 4. С. 836-844.

77. LermanL. S. The structure of the DNA-acridine complex // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1963. Vol. 49. P. 94-102.

78. Ivanov V. I., MinchenkovaL. E., MinyatE. E. et al. The B to A transition of DNA in solution // J. Mol. Biol. 1974. Vol. 87. P. 817-833.

79. Frisman E. V., Veselkov A. N., Slonitsky S. V. et al. The Influence of Alkohol-water Solvents on the Conformation of Deoxyribonucleic Add // Biopolymers. 1974. Vol. 13. P. 2169-2178.

80. Akimenko N. M., Dijakova E. B., Evdokimov Yu. M. et al. Viscosimetric study on compact form of DNA in water-salt solutions containing polyethyleneglycol // FEBS Letters. 1973. Vol. 38. N 1. P. 61-63.

81. LermanL. S. The polymer and salt-induced condensation of DNA // Physica-Chemical Properties of Nucleis Acids / ed. by J. Duchesne. New York, 1973. Vol. 3. P. 59-76.

82. WidomJ., Baldwin R. L. Cation-induced Toroidal Condensation of DNA // J. Mol. Biol. 1980. Vol. 144. P. 431-453.

83. Kasyanenko N., Arikaine N., Frisman E. Investigation of DNA Complexes With Iron Ions in Solution // Biophysical Chemistry. 1998. Vol. 70. P. 93-100.

84. Касьяненко Н. А., Карымов М. А., Дьяченко С. А. и др. Исследование взаимодействия молекулы ДНК с координационными соединениями двухвалентной платины. II. Влияние природы и расположения лигандов в первой координационной сфере платины // Молек. биология. 1995. T. 29. С. 585-596.

85. Frisman E., Zarubina O. Effect of y-Irradiation on the Conformation of the native DNA Molecule // Biophysical Chemistry. 1993. Vol. 46. P. 37-46.

Е. Б. Морошкина

ИНТЕРКАЛЯЦИЯ КАК СПОСОБ СВЯЗЫВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ С ДВУСПИРАЛЬНОЙ ДНК

Способность многих низкомолекулярных соединений образовывать комплексы с молекулой ДНК была известна ещё до того, как Уотсон и Крик предложили модель двойной спирали. После описания вторичной структуры ДНК, естественно, возник интерес к способу связывания этих соединений с двойной спиралью ДНК и их влиянию на структуру макромолекулы. В 1961 г. Лерман [1] выдвинул интеркаляционную гипотезу для описания взаимодействия двуспиральной ДНК с аминоакридиновыми красителями (рис. 1), соединениями, обладающими плоским гетероциклическим хромофором. Согласно его гипотезе, хромофор лиганда встраивается между парами азотистых оснований ДНК. В месте встраивания происходят локальные изменения структуры двойной спирали: раскручивание и увеличение расстояния между соседними парами азотистых оснований на толщину гетероциклического хромофора, которая составляет 3,4 А.

Ж

ын+

■2 "2 профлавин

О ОН

ОСЫ О ОН О

<рЫ3О>

НО^ +ыы3

дауномицин

СОСЫ3 Оы

Ы3С-

N

О

-С-СН

ы2С

О

\

С \

N

Ы3С

О II

СЫ-С-О

Н3С

О II

"С~СН \

ЫН /

Н2С

2

ЧС-СН С

Н ЫН

О

О \\

СН С

НЫ I

СН * , СН С

НЫ Н

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

-ы-

О СН С

2 СН О

-О-С-

Н

С

,СН3

N

СН2

С /

^СН,

О

СН

3 3

актиномицин D

Рис. 1. Примеры химической структуры соединений, интеркалирующих в двойную спираль ДНК

Основными предпосылками для такой модели послужили увеличение вязкости растворов ДНК, уменьшение её коэффициента седиментации и характер изменения линейного дихроизма ДНК при взаимодействии с акридиновыми красителями.

В то же время возникали и альтернативные модели связывания, согласно которым молекулы лиганда размещались в малой бороздке ДНК [2]. Согласно этим моделям, наблюдаемые изменения гидродинамических и оптических свойств растворов ДНК, содержащих акридиновые красители, вызваны увеличением термодинамической жёсткости двойной спирали ДНК.

Для строгого экспериментального подтверждения существования интеркаляции различными косвенными методами потребовалось почти 20 лет. За это время было предложено несколько методик, позволяющих зафиксировать предсказываемые моделью удлинение и раскручивание двойной спирали ДНК при связывании с некоторыми соединениями, обладающими плоским гетероциклическим хромофором. Среди них можно назвать определение удлинения цепи ДНК в работах Райнерта [3] по измерению характеристической вязкости комплексов лигандов с ДНК различной молекулярной массы, определение угла раскручивания двойной спирали ДНК в работах Уоринга [4] по измерению коэффициента седиментации кольцевых ДНК в комплексе с различным содержанием лиганда.

В лаборатории молекулярной биофизики на физическом факультете Ленинградского государственного университета под руководством Э. В. Фрисман в 1970 г. была выработана методика определения удлинения цепи ДНК при связывании с использованием методов вискозиметрии и динамического двойного лучепреломления [5]. Параллельное определение характеристической вязкости

г 1 (ЬА)3/2 з

(где Ь — контурная длина; А — длина статистического сегмента; М — молекулярная масса; Ф — коэффициент Флори; у — коэффициент линейного набухания) и оптической анизотропии статистического сегмента ДНК

(а! - а2) = (ам - а±)4 1 а

(где (ац — — разность поляризуемостей пары нуклеотидов вдоль и перпендикулярно оси статистического сегмента макромолекулы; а — толщина пары нуклеотидов) в составе комплексов с различным содержанием лиганда позволяет установить, изменяется ли контурная длина (Ь) макромолекулы при комплексообразовании, как это следует из интеркаляционной гипотезы Лермана. Кроме того, данная методика даёт информацию об изменении термодинамической жёсткости цепи макромолекулы (А) при связывании, которое не следует из модельных представлений и которое не определяется другими методами.

Она позволила не только различать интеркаляционное и бороздочное связывания лигандов с ДНК, но и фиксировать появление вторичного связывания с образованием димеров [6]. Так, при интеркаляционном связывании наблюдалось увеличение характеристической вязкости и оптической анизотропии макромолекулы пропорционально количеству связанного лиганда, при бороздочном связывании изменений в параметрах макромолекулы не наблюдается, при образовании димеров рост характеристической вязкости прекращается, а оптическая анизотропия продолжает расти, как при интер-каляционном связывании (рис. 2).

1,9 и

1,3-

1,5-

1,7-

1,1:

1,0

1,4

1,2

1,6

1,8

Рис. 2. Зависимость [п]/[п]о (1) и (ау — а2)/(ау -- а2)о (2) от Г = Ссоед./Сднк для комплекса ДНК с интеркалирующими про изводными феноксазона

0,9

0,0 0,2 0,4 0,6

0,8

г

В первых же экспериментах было установлено, что при связывании акридиновых красителей с ДНК и контурная длина, и длина статистического сегмента макромолекулы увеличиваются пропорционально количеству связанного лиганда (см. [5]):

Здесь индексы «г» и «0» характеризуют комплекс и свободную ДНК соответственно.

Позднее, когда было установлено, что в процессе интеркаляции изменение макро-молекулярных параметров ДНК имеет некоторые вариации, соединения, подобные акридиновым красителям, стали называть классическими интеркаляторами.

Свидетельства об интеркаляции хромофора в двойную спираль ДНК, полученные с помощью прямого метода рентгеноструктурного анализа, опубликованы только в 1987 г., когда была получена структура комплекса олигонуклеотида с антрацикли-новым антибиотиком дауномицином [7]. Собственно, именно тогда и была поставлена точка в вопросе о существовании интеркаляционного связывания лигандов с ДНК.

Постепенно интерес исследователей сместился от простых модельных соединений — акридинов, фенантридинов, ксантонов, феназинов — к соединениям, обладающим различной биологической активностью: противоопухолевой, противомикробной, мутагенной. Прежде всего это были антибиотики: антрациклины, актиномицины, блео-мицин и другие, содержащие в своей структуре плоский гетероциклический хромофор различной природы.

Используя описанную выше методику, мы показали, что антрациклиновый антибиотик дауномицин интеркалирует в двойную спираль ДНК [8]. Термодинамическая жёсткость макромолекулы при этом возрастает гораздо сильнее, чем это наблюдалось для акридиновых красителей. Позже методом рентгеноструктурного анализа [7] было показано, что при интеркаляции молекулы дауномицина образуются две водородные связи, ориентированные вдоль оси двойной спирали ДНК, что может служить причиной увеличения её термодинамической жёсткости.

Ещё более сложная ситуация возникла при изучении взаимодействия ДНК с актино-мицином D. Несмотря на наличие плоского гетероциклического хромофора, различные косвенные методы давали весьма противоречивые результаты, которые не укладывались в рамки ни интеркаляционной [9], ни бороздочной модели [10]. Так, раскручивание двойной спирали при связывании свидетельствовало об интеркаляции [4], но в то же время увеличения характеристической вязкости не происходило [9], т. е. не фиксировалось увеличения контурной длины макромолекулы.

Ьг = Ьо(1 + г); Лг = Ло(1+ г).

Исследование взаимодействия актиномицина D с помощью наших методов показало, что оптическая анизотропия комплекса была заметно меньше, чем у свободной ДНК [11]. Единственное предположение, которое можно было тогда сделать для согласования гидродинамических и оптических результатов, заключалось в том, что при образовании комплекса возникают изгибы двойной спирали ДНК в месте связывания антибиотика. Эти регулярные изгибы (кинки) приводят к тому, что плоскости всех азотистых оснований оказываются под некоторым углом, отличным от 90°, к оси статистического сегмента макромолекулы, которая в этом случае не совпадает с осью двойной спирали. Примерно 10 лет спустя появились работы по рентгеноструктурному анализу комплексов ДНК с актиномицином D, в которых было показано, что одновременно с интеркаляцией хромофора имеет место взаимодействие пентапептидных колец молекулы антибиотика в малой бороздке ДНК, что приводит к изгибу оси макромолекулы в месте связывания [12].

Таким образом, оказалось, что разработанная нами методика позволяет не только выявлять интеркаляцию хромофора, но и отслеживать дополнительные эффекты, возникающие при взаимодействии с ДНК сложных молекул лигандов, обладающих различными функциональными группами.

Обнаружение того факта, что многие соединения, обладающие противоопухолевой активностью, являются интеркаляторами, инициировало исследования молекулярных биологов и биохимиков, посвящённые поиску молекулярных механизмов такой активности. В частности, нужно было ответить на вопрос, почему классические интерка-ляторы, такие как простые аминоакридины, феназины, ксантоны, противоопухолевой активностью не обладают.

Во многих работах было показано, что интеркалирующие соединения, обладающие противоопухолевой активностью, являются ингибиторами ферментов топоизомеразы I [13] и топоизомеразы II [14]. Эти ферменты связываются с ДНК, делают одно- или двухцепочечный разрыв молекулы ДНК (расщепляют фосфодиэфирную связь), «протаскивают» в образовавшийся разрез другую цепь или участок молекулы ДНК, а затем «сшивают» разрыв. Такие процедуры необходимы в процессах репликации и транскрипции. Работают эти ферменты «на грани фола». Дело в том, что накопление разрывов цепи ДНК, особенно двойных разрывов, запускает в клетке процесс «самоуничтожения» — апоптоз. Этот процесс запрограммирован природой, чтобы вовремя удалять дефектные клетки из ткани. Таким образом, ингибирование топоизомеразы на стадии «сшивания» может спровоцировать переход клетки в апоптоз. В опухолевых клетках процессы репликации идут постоянно, так как клетка постоянно делится, поэтому эти клетки наиболее уязвимы для действия ингибиторов топоизомеразы.

Почему же интеркаляторы являются такими ингибиторами? Интеркаляция соединения, приводящая к увеличению расстояния между соседними парами нуклеотидов в месте взаимодействия ДНК и топоизомеразы, не даёт возможности ферменту провести заключительную операцию по сшиванию разрезанных концов [15]. Такой ингибитор должен иметь достаточно высокое сродство к молекуле ДНК и не просто интеркалиро-вать в двойную спираль ДНК, но и иметь группы, придающие соединению специфичность по отношению к месту связывания фермента на ДНК или к самому ферменту.

Знания о механизмах биологической активности, в свою очередь, привели к синтезу большого количества соединений, содержащих помимо интеркалирующего хромофора другие функциональные группы. Такие соединения стали называть гибридными, или бифункциональными. Природный антибиотик актиномицин D тоже можно считать бифункциональным соединением.

2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

Рис. 4. Зависимость [п]/[п]0 (1) и (ах — а2)/ /(ах — а2)о (2) от г = Ссоед./Сднк для комплекса ДНК с диакридином

Разновидностью бифункциональных соединений стали так называемые бисинтер-каляторы, соединения, содержащие два плоских гетероциклических хромофора (моно-и гетеродимеры). В случае одновременной интеркаляции обоих хромофоров константа связывания соединения с ДНК повышалась на несколько порядков, что увеличивало эффективность соединения как комплексона ДНК. Для бисинтеркаляционного связывания необходима линкерная цепочка между хромофорами оптимальной длины, поскольку, несмотря на то, что любой промежуток между парами оснований может стать местом интеркаляции хромофора (специфичность к последовательности, как правило, отсутствует), встраивание хромофора в двойную спираль не может происходить через каждую пару нуклеотидов, а только через две пары (правило «исключённого соседа»

[16]). Следовательно, минимальная длина линкера должна составлять примерно 10 А

[17]. Многочисленные исследования показали, что при длине линкера менее 8 А интер-калирует только один из хромофоров, а при длине линкера в 11 А и более интеркали-руют оба хромофора [17-20]. А вот при промежуточных значениях длины линкерной цепочки параметры комплекса и изменения в структуре ДНК не соответствуют ни бис-, ни моноинтеркаляции [19, 20]. Возникло даже предположение, что в этом случае нарушается правило «исключения соседа» [20].

Применение нашей методики к исследованию взаимодействия с ДНК диакриди-на с линкерной цепочкой длиной 8,8 А (рис. 3) продемонстрировало, что значительное увеличение характеристической вязкости сопровождается некоторым падением оптической анизотропии (рис. 4). Анализ полученных результатов показал, что это соединение является бисинтеркалятором, однако, как и в случае с актиномицином D, происходит изгиб двойной спирали, в результате которого несколько уменьшается оптическая анизотропия статистического сегмента, но при этом длины линкера в 8,8 А достаточно для интеркаляции обоих хромофоров без нарушения правила «исключённого соседа» [21].

Другой вариант создания бифункциональных гибридных соединений — объединение в одной молекуле двух известных по своим способностям специфически связываться с ДНК групп. Так, химиками Технологического института в процессе поиска

биологически активных аналогов антибиотика актиномицина D созданы соединения, содержащие гетероциклический хромофор актиномицина, а вместо пеп-тидлактонных группировок — фрагменты другого антибиотика, дистамицина, специфично связывающегося с молекулой ДНК по малой бороздке (рис. 5). Такие соединения названы дистакцинами. Наши исследования дистакцинов показали, что присоединение больших фрагментов дистамицина, у которых число метилпиррольных колец достигает трёх, приводит к связыванию соединения в малой бороздке двойной спирали ДНК подобно дистамицину, а интеркаляции актиноцинового хромофора не происходит [22]. Этот результат показал, что объединение в одной молекуле различных способных к индивидуальному взаимодействию с ДНК групп, не всегда приводит к их одновременному связыванию с ДНК.

С группой химиков кафедры органической химии Технологического института, которую возглавлял Евгений Николаевич Глибин, мы проводили совместную работу в 1982-2005 гг. Группа занималась синтезом аналогов актиномицина D с целью создания более эффективного противоопухолевого препарата, лишённого побочных эффектов, свойственных актиномицину [23]. Многочисленные исследования аналогов акти-номицина, у которых варьировалась структура пептидлактонных колец, находящихся в 1-м и 9-м положениях хромофора, показали, что структура заместителей в этих положениях очень сильно влияет на сродство и способ связывания молекулы аналога с ДНК. В связи с этим были синтезированы и исследованы производные актиноцина (хромофор актиномицина), содержащие в 1-м и 9-м положениях группировки различной природы (рис. 6) [24].

В процессе совместной работы мы получили возможность проводить систематические исследования влияния отдельных химических групп и их положения на

СОЯ

СН3 СН3

Я =

-НЫ"

N

I

СН

СО

-ЫН- (СН2)- Ы(СН3)2

Рис. 5. Химическая структура дистакцинов

ЫН,

О

Я

Рис. 6. Химическая структура производных актиноцина:

1. И.1 = И2 = NHC(CH2OH)з, Из = И4 = СН3; 2. И = И2 = OБ, Из = И4 = СН3;

3. И.1 = И.2 = NHC6HlзO5, И.3 = И.4 = СНз; 4. И = ^2 = NH(CH2)2N(C2H5)2, И.3 = И.4 = CHз; 5. И1 = И2 = NH(CH2)2N(CHз)2, Из = И4 = СН3; 6. И.1 = И2 = №И(СН2)3^СН3)2, Из = И4 = СН3; 7. И1 = ОН, И2 = NH(CH2)3N(CH3)2, Из = ОСН3, И4 = СН3; 8. И1 = ОН, И2 = МИ(СН2)3N(CH3)2, Из = ОСН3, И.4 = Н; 9. И1 = ОН, И2 = NH(CH2)3N(CHз)2, И3 = С1, И4 = СН3; 10. И1 = ОН, И2 = NH(CH2)3N(CH3)2, Из = Н, И4 = СН3; 11. И1 = N^^^N(^13^, И2 = ОН, Из = ОСНз, И4 = Н; 12. И1 = NH(CH2)БCOOH, И2 = NH(CH2)БCONH(CH2)3N(CHз)2, Из = ОСНз, И4 = Н

хромофоре на способ связывания соединения с ДНК. Прежде всего, было показано, что феноксазоновый и фенотиазоновый хромофоры являются классическими интеркалято-рами [11]. Однако целый ряд факторов может препятствовать интеркаляции хромофора в двойную спираль ДНК. Так, например, положение аминогруппы на хромофоре не влияет на способность хромофора интеркалировать. В то же время в отсутствие этой группы хромофор не интеркалирует в двойную спираль ДНК [25]. Этот факт позволяет сделать вывод, что наличие плоского гетероциклического хромофора не является достаточным условием интеркаляционного связывания лиганда с ДНК. Для интеркаляции необходима определённая электронная структура хромофора, на которую значительное влияние оказывает электронно-донорная аминогруппа. Другой причиной отсутствия интеркаляционного связывания являются стерические препятствия, создаваемые громоздкими заместителями. Так, оказалось, что громоздкий заместитель в 7-м положении хромофора затрудняет интеркаляцию фенотиазона в двойную спираль ДНК [25].

Ещё одна причина, влияющая на способ связывания феноксазонового хромофора, — его ионное состояние. Было показано, что аналоги актиномицина, находящиеся в цвиттерионной форме (рис. 6, соединения 9-11 ), не интеркалируют в двойную спираль ДНК [26]. Интеркаляция также не происходит, если катионоидная группа или другой центр связывания с ДНК расположены далеко от хромофора из-за длинного линкера (рис. 6, соединение 12) [27].

Соединения, содержащие диалкиламиноалкильные группировки различной длины (рис. 6, соединения 4, 5), взаимодействуют с ДНК двумя способами: первый — классическая интеркаляция мономера лиганда, второй — внешнее присоединение к двойной спирали за счёт электростатических взаимодействий [6]. Соотношение количества молекул, связанных с ДНК разными способами, при общем равном количестве связанных молекул лиганда зависит от длины аминоалкильной цепи. Соединения, содержащие в аминоалкильной цепи три группы -СН2 (рис. 6, соединение 6), связывается с ДНК в виде димера, один из мономеров которого интеркалирует в двойную спираль и служит местом связывания для второго мономера (см. рис. 2).

После того как было установлено, что пентапептидлактонные кольца актиномици-на D в положениях 1 и 9 хромофора могут подобно краунсоединениям ассоциировать ионы Na+ [28], в Технологическом институте были синтезированы аналоги актиномицина, содержащие в 1-м и 9-м положениях хромофора краунгруппировки, способные ассоциировать ионы Na+ и K+ (рис. 7). Оказалось, что способ связывания этих соединений с ДНК зависит от структуры краунгруппировки, от размера её полости и от длины линкера, соединяющего краунгруппировку с хромофором [29]. Азакраунсодер-жащие аналоги не связывались с ДНК. А способ связывания (интеркаляционный или бороздочный) соединений, содержащих фрагмент бензо(15-краун-5) (рис. 7, соединения VI, VII), зависит от природы и концентрации противоиона [30].

Следует отметить, что ни один из многочисленных аналогов актиномицина, синтезированных в процессе нашей совместной работы химиками Технологического института, не вызывает тех изменений в структуре ДНК при связывании, какие наблюдаются при взаимодействии с ДНК самого актиномицина D. Тем не менее параллельные исследования биологической активности синтезированных аналогов позволили обнаружить несколько соединений, противоопухолевая активность которых оказалась близкой к активности антибиотика. Все они принадлежат к разным группам рассмотренных выше аналогов (простые аналоги, диалкиламиноалкильные производные и краунсодержащие аналоги), но все являются интеркаляторами.

О^^ЫНЯ О^^ЫНЯ

ЫН,

О

СН

3 СН3

1-УШ

Я

О

ОО ОО

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

О

3

(I)

Я = — (СН2) СОЫН п = 1 (II), п = 2 (III), п = 5 (IV)

О

О О

3

Я =

(V)

Я = — (СН^СОЫН

п = 1 (VI), п = 2 (VII), п = 5 (VIII)

Рис. 7. Химическая структура краунсодержащих производных актиноцина

В заключение коснёмся современного положения дел в области исследований способа связывания различных низкомолекулярных соединений с ДНК. Синтез новых соединений — потенциальных комплексонов ДНК — активно продолжается во всём мире. Соответственно остаётся и проблема определения способа их связывания с ДНК. Нужно отметить, что в качестве экспериментального теста на интеркаляцию, несмотря на огромный прогресс в области рентгеноструктурного анализа, как правило, используют самый простой метод — вискозиметрию [31, 32]. При этом исследуется зависимость вязкости растворов конечной концентрации ДНК от концентрации лиганда в растворе, но не определяется связанная с макромолекулярными параметрами характеристическая вязкость макромолекулы. Увеличение вязкости растворов ДНК в присутствии лиганда является лишь необходимым, но отнюдь не достаточным признаком интерка-ляции, как это было показано в ранних работах по гидродинамическому поведению комплексов ДНК с различными низкомолекулярными соединениями [3, 5, 6, 11]. В результате интеркаляторами объявляется множество соединений, среди которых могут оказаться и не являющиеся таковыми. Ещё один источник появления новых интерка-ляторов — многочисленные исследования по компьютерному моделированию. Согласно некоторым таким исследованиям, интеркаляторами являются соединения, «толщина» которых превышает предполагаемые в модели Лермана 3,4 А [1], а также соединения, не имеющие плоского гетероциклического хромофора [33]. Таким образом, проблема однозначного определения способа связывания низкомолекулярных соединений с молекулой ДНК остаётся актуальной и в настоящее время.

Литература

1. LermanL. S. Structural considerations in interaction of DNA and acridines //J. Mol. Biol. 1961. Vol. 3. P. 18-30.

2. Рурский Г. В. Взаимодействие акридинов с ДНК // Биофизика. 1966. Т. 11. Вып. 5. С. 737-746.

3. Reinert K. E. DNA stiffening and elongation caused by the binding of ethidium bromide // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) — Nucleic Acids and Protein Synthesis. 1973. P. 135-139.

4. Waring M. Variation of the supercoils in closed circular DNA by binding of antibiotics and drugs: Evidence for molecular models involving intercalation //J. Mol. Biol. 1970. Vol. 54. P. 247-279.

5. МорошкинаЕ. Б., Шишов А. К, КривцоваМ. А. и др. Исследование влияния акридиновых красителей на молекулярную структуру ДНК // Молек. биология. 1975. Т. 9. Вып. 6. С. 836-844.

6. Кривцова М. А., Морошкина Е. Б., РлибинЕ.Н., ФрисманЭ.В. Взаимодействие ДНК с низкомолекулярными лигандами различной структуры. II. Комплексы ДНК с актинамином и его аналогами // Молек. биология. 1982. Т. 16. Вып. 1. С. 149-155.

7. WangA.H.J., Ughetto G., Quigley G. J., Rich A. Interactions between an anthracycline antibiotic and DNA: molecular structure of daunomycin complexed to d(CpGpTpApCpG) at 1.2-.ANG. resolution // Biochemistry. 1987. Vol. 26. P. 1152-1163.

8. Веселков А. Н., МорошкинаЕ. Б., Соболева О. И., ФрисманЭ.В. Сравнительное исследование взаимодействия ДНК с дауномицином и профлавином в растворе // Молек. биология. 1984. Т. 18. Вып. 2. С. 481-487.

9. MullerW., Crothers D. M. Studies of the binding of actinomycin and related compounds to DNA // J. Mol. Biol. 1968. Vol. 35. P. 251-290.

10. РурскийР. В. Структура комплекса ДНК-актиномицин // Молек. биология. 1969. Т. 3. Вып. 5. С. 749-757.

11. Кривцова М. А., Морошкина Е. Б., ХамманХ. и др. Изучение взаимодействия ДНК с низкомолекулярными лигандами различной структуры. 1. Комплексы ДНК с актиноми-цином и его простыми аналогами // Молек. биология. 1981. Т. 15. Вып. 3. С. 613-621.

12. KamitoriS., TakusagawaF. Crystal structure of the 2:1 complex between d(GAAGCTTC) and the anticancer drug actinomycin D // J. Mol. Biol. 1992. Vol. 225. P. 445-456.

13. Pommier Y. DNA Topoisomerase I Inhibitors: Chemistry, Biology, and Interfacial Inhibition // Chem. Rev. 2009. Vol. 109. P. 2894-2902.

14. McClendonA. K., OsheroffN. DNA topoisomerase II, genotoxicity, and cancer // Mutation Research. 2007. Vol. 623. P. 83-97.

15. Palumbo M., Gatto B., MoroS. et al. Sequence-specific interactions of drugs interfering with thetopoisomerase-DNA cleavage complex // Biochimica et Biophysica Acta. 2002. Vol. 1587. P. 145-154.

16. Mc Ghee J. D., von Hippel P. N. Theoretical aspects of DNA-protein interactions: Cooperative and non-co-operative binding of large ligands to a one-dimensional homogeneous lattice // J. Mol. Biol. 1974. Vol. 86. P. 469-489.

17. Le PecqJ. B., LebretM., BarbetJ., RoquesB. P. DNA polyintercalating drugs: DNA binding of diacridine derivatives // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975. Vol. 72. P. 2915-2919.

18. KuhlmanK. F., CharveneanN. J., Mosher C. W. Synthesis, DNA-binding and biological activity of a double intercalating analog of ethidium bromide // Nucleic Acids Res. 1978. Vol. 5. P. 2629-2642.

19. Cannelakis E. S., Bono U. E., Bellantone R. A. et al. Diacridines: Bifunctional intercalators. III. Definition of the general site of action // Biochim. et Biophys. Acta. 1976. Vol. 418. P. 300-314.

20. WakelinL. P. G., Romanos M., Chen T. K. et al. Structural limitations on the bifunctional intercalation of diacridines into DNA // Biochemistry. 1978. Vol. 17. P. 5057-5063.

21. Морошкина Е. Б., Степанова Т. Ф., Ракецкая В. В., ФрисманЭ. В. Взаимодействие ДНК с бифункциональным акридиновым красителем // Молек. биология. 1987. Т. 21. Вып. 2. С. 389-394.

22. Кривцова М. А., Морошкина Е. Б., Глибин Е. Н., ФрисманЭ. В. Взаимодействие ДНК с низкомолекулярными лигандами различной структуры. III. Комплексы ДНК с дистакцина-ми // Молек. биология. 1984. Т. 18. Вып. 4. С. 950-956.

23. Glibin E. N. Biological and Biophysical Aspects of Synthetic Phenoxazone Derivatives // Anti-Cancer Drug Design / ed. A. N. Veselkov, D. B. Davies. Sevastopol, 2002. P. 23-31.

24. МорошкинаЕ. Б., КривцоваМ. А., ГлибинЕ. Н. Влияние природы заместителей амидов актиноцина на способ их связывания с ДНК // Биофизика. 2002. Т. 47. С. 444-448

25. МорошкинаЕ. Б., Кривцова М. А. Структура комплексов ДНК с соединениями феноти-азонового ряда // Молек. биология. 1991. Т. 25. Вып. 5. С. 1285-1292.

26. Морошкина Е. Б., Кривцова М. А., Юдина И. Г., Глибин Е. И. Взаимодействие ДНК с амфолитными соединениями на основе актиноцина // Молек. биология. 1998. Т. 32. С. 256-262.

27. МорошкинаЕ. Б., КузьменкоЕ. А., КривцоваМ. А., ГлибинЕ. И. Взаимодействие ДНК с амидами актиноцина, содержащими катионоидные центры в амидных группах // Молек. биология. 2000. Т. 34. С. 448-452.

28. HortiA., Glibin E., Nesterov V. Retention behavior of crown ethers and actinomycin D in reversed-phase HPLC // Chromatographia. 1992. Vol. 34. P. 155-158.

29. МорошкинаЕ. Б., Загоруйко Н. Е., Овчинников Д. В. и др. Исследование зависимости способа связывания с ДНК бензо-краун-содержащих производных актиноцина от размера и удалённости от хромофора краунгруппировок // Молек. биология. 2002. Т. 36. С. 740-746.

30. МорошкинаЕ. Б., Богданов А. А., Колонистова М. О. и др. Влияние природы проти-воионов в растворе на взаимодействие с ДНК производных феноксазона, ксантона и карба-зола, содержащих бензо-краун группировки // Журн. структ. химии. 2009. Т. 50. Вып. 5. С. 1022-1028.

31. DasS., Kumar G. S. Molecular aspects on the interaction of phenosafranine to deoxyribonucleic acid: Model for intercalative drug-DNA binding // Molecular Structure. 2008. Vol. 872. P. 56-63.

32. Ping Zhao, Lian-Cai Xu, Jin-Wang Huang et al. Tricationic pyridium porphyrins appending different peripheral substituents: Experimental and DFT studies on their interactions with DNA. [W. p.], [w. y.].

33. Snyder R. D. Assessment of atypical DNA intercalating agents in biological and in silico systems // Mutation Research. 2007. Vol. 623. P. 72-82.

Статья поступила в редакцию 28 июня 2011 г.

А. К. Дадиванян, Ю. М. Пашинина, О. В. Ноа, Д. Н. Чаусов, Б. А. Королёв

БЛИЖНИЙ ОРИЕНТАЦИОННЫЙ ПОРЯДОК И ГИДРОФОБНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В РАСТВОРАХ БИОЛОГИЧЕСКИХ И СИНТЕТИЧЕСКИХ ПОЛИМЕРОВ

В растворах биополимеров и синтетических полимеров существует ближний ориен-тационный порядок полимер — растворитель — корреляция ориентаций макромолеку-лярных цепей и малых молекул, непосредственно контактирующих с ними [1], который оказывает существенное влияние на оптические, электрические, спектральные, релаксационные свойства макромолекул, молекул растворителя и растворов [2-4]. В последнее время было показано влияние ближнего ориентационного порядка на термодинамику растворов [5-7]. В настоящей работе концепция ближнего ориентационного порядка используется для объяснения природы гидрофобных взаимодействий.

Гидрофобные взаимодействия оказывают существенное влияние на свойства растворов низкомолекулярных соединений, синтетических полимеров и биополимеров [8]. Особенно заметно их влияние на термодинамические свойства водных растворов. Так, гидрофобные взаимодействия характеризуются отрицательными значениями парциальной энтальпии и энтропии смешения, что приводит к нижней критической температуре растворения (НКТР) [8, 9].

В ряде работ гидрофобные взаимодействия объясняются существованием кластеров молекул воды [8, 9], однако теория, основанная на роли кластеров, не позволяет объяснить, например, увеличение теплоёмкости ароматических соединений при растворении в воде [9].

Другим подходом к объяснению природы гидрофобных взаимодействий является гипотеза об их связи с ориентацией молекул воды относительно молекул углеводородов [10].

Корреляция ориентаций молекул компонентов раствора была установлена в иссле-дованях оптической анизотропии и дипольного момента в растворах макромолекул в различных растворителях, поляризованной флуоресценции, линейного инфракрасного дихроизма, эффекта Керра в растворах и набухших полимерах [1-4] и в результате расчётов взаимодействия молекул растворителя с полимерной цепью [11]. При этом значения фактора ориентации молекул растворителя относительно полимерной цепи, полученные из экспериментов и теоретически, оказались в хорошем согласии.

Корреляция ориентаций молекул в растворах полимеров и низкомолекулярных соединений обусловлена зависимостью энергии межмолекулярных взаимодействий от взаимной ориентации молекул компонентов [11].

Для оценки ориентационного порядка в водных растворах нами рассчитана зависимость энергии взаимодействия молекул компонентов от их взаимной ориентации. Была исследована система вода—бензол, в которой парциальные энтропия и энтальпия смешения отрицательны, что свидетельствует о существенной роли гидрофобных взаимодействий в этой системе [9].

Энергия взаимодействия рассчитывалась методом атом—атом потенциалов по соотношениям Е = ^ Егз, где Е^ — энергия взаимодействия между атомами растворителя

Рис. 1. Взаимное расположение неподвижной системы координат XYZ, связанной с молекулой углеводорода, и подвижной 123, связанной с молекулой воды

г и растворенного вещества ]:

Е^ = А ■ в-аПи

В

К'

где К^ — расстояние между атомами г и

Величины А, В и а брались равными 0,154 Дж ■ моль-1, 0,138 Дж ■ моль-1 А-1 и 3,6 А-1 соответственно для взаимодействия между атомами С...С и 0,126 Дж х

х моль-1, 0,18 ■ 10-3 Дж ■

моль-

А 1 и 5,0 А 1 — между атомами Н...Н [12, 13].

Потенциалы взаимодействия атомов О...О принимались равными потенциалам С...С [14]. Такое допущение не должно приводить к серьезным ошибкам, так как ван-дер-ва-альсовы радиусы С (1,85 А)иО (1,60 А) не очень сильно различаются.

При вычислении взаимодействий различных атомов X и У пользовались соотношениями (см. [15])

А

Х...У

у/А.

Х...Х

А

У...У;

Вх.

.У

V Вх...х • Ву...у; а а-., л'

^ (ал-...л- + а у...у) ■

Для взаимодействия между атомами С, О и Н мы получили Ас...н = 0Д4 Дж/моль, Вс...н = 0,5 ■ 103 Дж/моль ■А-1; ас..н = 4'3 А-1; Ао...н = 0'14 Дж/моль, Во...н = = 0'5 ■ 103 Дж/моль ■ А-1; ао...н = 4'3 А-1.

Ориентация молекул воды относительно бензола определялась углами 8, ф и у (рис. 1), которые менялись в интервалах 0-90° с шагом 30°. Начальное значение расстояния между центрами инерции г молекул брали равным 5 А и проводили минимизацию энергии по г. Центры инерции молекул воды относительно молекулы бензола помещали в точки 1 -5 (рис. 2).

На рис. 3 в качестве иллюстрации приведены зависимости энергии взаимодействия от углов, характеризующих взаимную ориентацию молекул при расположении центра инерции молекулы воды

Рис. 2. Взаимное расположение молекул воды и бензола

1

Рис. 3. Зависимость энергии взаимодействия для системы вода—бензол от углов ориентации 0, ф (а) при у = 30° и от углов вращения 0, у (б) при ф = 30°

в точке 1. Такие же зависимости получены и в случае нахождения центра инерции молекулы воды в точках 2—5. Как видно на приведённых рис. 2, 3, существует сильная зависимость энергии межмолекулярного взаимодействия от углов ориентации.

Мы нашли вероятности различных ориентационных состояний при разных положениях центров инерции молекул, пользуясь распределением Больцмана

е—Ег -8те.;ДеДФ

Wik =--:-•

.8т&;ДеДФ

i,k

Зависимости вероятности ориентационных состояний от углов ориентации при температуре 298 K и критической температуре воды 647,3 K, которая существенно выше критической температуры бензола (569,5 K), приведены на рис. 4. Можно убедиться, что вероятности разных состояний сильно различаются, причём вероятность реализации некоторых состояний более чем в три раза превышает вероятность реализации остальных, в то время как при критических температурах воды и бензола ближний ориентационный порядок разрушен полностью [16, 17].

Еще более выраженной оказывается эта зависимость для водных растворов линейных углеводородов, в частности для декана вероятности различаются более чем на порядок (рис. 5, 6).

Если считать, что в исследованной системе реализуются только те состояния, вероятность которых отличается от максимальной не более чем на порядок, то три четверти состояний оказываются исключёнными.

В чистых компонентах, как известно из эксперимента, степень ориентационного порядка выше, чем в растворе. С повышением температуры ближний ориентационный порядок разрушается, и при температурах, близких к критической, распределение молекул по ориентациям становится хаотическим, т. е. все ориентации становятся равновероятными, и реализуются все ориентационные состояния [16, 17].

0,0010 0,0008 0,0006 90 0,0004

30 . 0,0002 Ф,

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

0

Рис. 4. Зависимость вероятности ориентации для системы вода—бензол от углов ориентации 8, ф при у = 30°, Т = 298 К (а) и Т = 647,3 К (б) а

0

90

360

Рис. 5. Зависимость энергии взаимодействия для системы вода—декан от углов ориентации 8, ф (а) при у = 30° и от углов ориентации 8, у (б) при ф = 30°

Таким образом, ориентационный порядок в растворе может быть выше, чем в чистой жидкости, что может объяснить наблюдаемое в эксперименте уменьшение энтропии смешения [1].

Энтропия смешения при образовании растворов низкомолекулярных соединений и полимеров, как было показано в работах [5-7], определяется уравнениями

А5<

СМ

А^СМ + А^СМ

-к

П1 п п ИТ- П1П2Х

-1п фА*! + 112 1п +

Х

П1 + П2Х \ в1 р2 ,

0,006

^ 0,003

0,006

360

0,003

0 360

Рис. 6. Зависимость вероятности ориентации для системы вода—декан от углов ориентации 0, ф (а) при у = 30° и от углов ориентации 0, у (б) при ф = 30°

360

ДБ,

СМ

д сшоз ДБСМ

Д5СМ

-к

П1 1п ф1 + П2 1п ф2 +

п1п2Х а1 а2

-1- 1П +21 1П

П1 + П2 Х \ в1 р2

соответственно, где П1 — число молекул первого компонента; П2 — число молекул второго компонента; N1 и N2 — мольные доли компонентов, ф1 и ф2 — их объёмные доли; Zl и Z2 — координационные числа; а1 и а2 — числа ориентационных состояний молекул чистых компонентов; Р1 и в — числа ориентационных состояний молекул компонентов 1 и 2 в растворе.

Значения химических потенциалов компонентов следующие:

дДС,

СМ

д АН,

см

-Т-

д ДБ,

СМ

дпг дпг дпг

С учётом того, что энтальпию можно представить в виде

П1 + П2Х

изменения химических потенциалов раствора полимера выражаются уравнениями

Дц

1

АН,- Т ДБ

1

ЕТ

1п(1 - ф2 )

ф2

(1)

ДЦ2 = ДЙ2 - ТД^2 = = ЕТ

1п (1 - Ф1) + ( 1 - - ) Жф1 +

Хн +

Хф1

(2)

где Хн = Дю12/(КТ) — параметр взаимодействия, а Дю12 — разность энергий взаимодействия, приходящаяся на один контакт, при замене контактов полимер—полимер, растворитель—растворитель на контакты полимер—растворитель.

Соотношения (1), (2), которые отличаются от полученных Флори [18] членом, обусловленным ближним ориентационным порядком, позволяют получить условия растворения с повышением или понижением температуры.

При AHi > 0 и АБ^ > 0 растворение происходит при повышении температуры, и критическая температура смешения является верхней, а при Д-Нг < 0 и АБ^ < О растворение происходит при понижении температуры, что соответствует нижней критической температуре растворения.

Поскольку при критической температуре в воде происходит полное разрушение ближнего ориентационного порядка, то при температурах, близких к этой точке, при растворении низко- и высокомолекулярных соединений можно ожидать, что значения энтропии смешения будут отрицательными, а значит, будет наблюдаться нижняя критическая температура смешения. Такие экспериментальные факты известны [19].

Предложенный нами подход позволяет объяснить и увеличение парциальной молярной теплоёмкости углеводородов при растворении в воде (таблица) [9]. Если считать, что при растворении, благодаря существованию ближнего ориентационного порядка, связывание молекул воды с молекулами углеводородов приводит к замене поступательных и вращательных степеней свободы колебательными, теплоёмкость каждой молекулы воды увеличится на 3 Я (25,1 Дж/град • моль). Сравнение с экспериментальными данными показывает, что каждая молекула углеводорода оказывается связанной с 12-16 молекулами воды (Жсв ), что приблизительно равно числу молекул, заполняющих первый монослой вокруг молекулы углеводорода.

Термодинамические параметры растворения жидких углеводородов

в воде при 25 °С

Вещество ДЯ°, кДж/моль Дб10, Дж/град • моль АСР, Дж/град • моль Жор

Пропан — 7,5 -92,0 376,2 15

Бутан -3,3 -92,0 413,8 16,5

Бензол -2,5 -54,3 305,1 12

Толуол -2,5 -66,9 355,3 14

Таким образом, предложенный нами подход позволяет не только объяснить природу гидрофобных взаимодействий на качественном уровне, но и провести некоторые количественные оценки, дающие результаты, совпадающие с экспериментальными данными.

Литература

1. Фрисман Э. В., Дадиванян А. К., Дюжев Г. А. К вопросу об определении оптической анизотропии макромолекул // Докл. АН СССР. 1963. Т. 153. С. 1063.

2. Дадиванян А. К., Джавршян Дж. М., Агасарян В. Ю., Айрапетян Г. А. Подвижность ориентированных относительно полимерных цепей молекул красителя // Высокомолек. со-ед. (Б). 1981. Т. 23. С. 674.

3. Цветков Н. В., Диденко С. А., Цветков В. Н. Динамическое и электрическое двойное лучепреломление в растворах карбонилата целлюлозы в смешанных растворителях // Докл. РАН. 1993. Т. 330. С. 725.

4. Дадиванян А. К., Грищенко А. Е., Цветков Н. В., Рюмцев Е. И. Ближний ориентацион-ный порядок в системах полимер—растворитель // Высокомолек. соед. (Б). 2008. Т. 50. № 10. С. 1870-1904.

5. Дадиванян А. К., Ноа О. В. Термодинамические свойства систем с ближним ориентаци-онным порядком // Вестник МГОУ. Труды центра фундаментальных научных исследований. 2006. № 1. С. 51-58.

6. Дадиванян А. К., Ноа О. В. Ближний ориентационный порядок и термодинамические свойства растворов полимеров // Высокомолек. соед. (А). 2007. Т. 49. № 2. С. 313-320.

7. Дадиванян А. К., Ноа О. В., ЧаусовД. Н., Игнатов Ю. А. Определение критических величин при образовании растворов полимеров // Высокомолек. соед. (А). 2008. Т. 50. № 2. С. 1-6.

8. Nemethy G., Sheraga H. A. Effect of hydrophobic interactions on solution properties //J. Chem. Phys. 1962. Vol. 36. P. 3382.

9. Моравец Г. Макромолекулы в растворе / пер. с англ. М., 1967. 398 с.

10. Рубин А. Б. Биофизика. Книга 1. М., 1987. 319 с.

11. Дадиванян А. К., АдонцВ. Г., АйрапетянГ. А. и др. // Высокомолек. соед. (А). 1977. Т. 19. С. 392.

12. Китайгородский А. И. Теоретические расчёты структуры кристаллов // Докл. АН СССР. 1961. Т. 137. С. 116.

13. Китайгородский А. И., Мирская К. В. Использование метода атом-атом потенциалов при определении структуры кристаллов // Кристаллография. 1961. Т. 6. С. 507.

14. БирштейнТ. М., Птицын О. Б. Конформации макромолекул. М., 1964. 391 с.

15. Дашевский В. Г. Использование комбинационных правил при вычислении атом-атом потенциалов // Журн. структ. химии. 1970. Т. 11. С. 912.

16. ВуксМ. Ф. Рассеяние света в газах, жидкостях и растворах. Л., 1977. 320 с.

17. Вукс М. Ф. Электрические и оптические свойства молекул и конденсированных сред. Л., 1984. 334 с.

18. Flory P. J. Principles of Polymer Chemistry. New York, 1953. 594 p.

19. Тагер А. А. Физикохимия полимеров. М., 2007. 573 с.

Статья поступила в редакцию 28 июня 2011 г.

Н. П. Евлампиева, А. В. Добродумов, О. В. Окатова, Э. Коттэ

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ СВОЙСТВА ПОЛИЛИЗИНОВ ДЕНДРИТНОЙ АРХИТЕКТУРЫ

Введение. Дендримерная, или дендримероподобная, архитектура полимерных молекул имеет ряд преимуществ в сравнении с полимерами традиционной линейной структуры, поскольку позволяет в значительно большей степени контролировать топологию, объём, форму, гидродинамические размеры и поверхностные свойства макромолекул. В последние годы число полимеров, молекулы которых обладают дендритной архитектурой, постоянно росло за счёт синтеза дендримеров новой химической структуры и создания дендритных аналогов известных полимеров. Актуальность подобных преобразований макромолекулярной архитектуры во многом связана с запросами современных нано- и биотехнологий, требующих полного контроля свойств на уровне отдельных молекул. При синтезе дендримеров подобные задачи специальным образом решаются за счёт процедур защиты от случайных процессов, и поэтому сама стратегия синтеза позволяет задавать необходимую топологию и получать макромолекулы необходимой плотности, массы и формы [1]. Но эти параметры, как правило, трудно контролировать для статистически свёрнутых цепей линейных макромолекул. Отмеченные выше тенденции проявились и в области синтеза биомолекул, в частности в области синтеза синтетических полиаминокислот и полипептидов, которые имеют широчайшее применение в современной медицине, фармакологии, косметологии и пищевой промышленности.

В представляемой работе исследовано гидродинамическое поведение поли-Ь-лизи-нов новой дендритной архитектуры, синтез которых был разработан французскими химиками [2]. Особенностями методики синтеза этих биополимеров является использование неточечного центра ветвления и стратегии формирования генераций по принципу графт-присоединения. Каждая генерация является исходной для синтеза последующей генерации. Отмеченные особенности синтеза позволили авторам методики классифицировать полученные образцы как дендриграфты поли-Ь-лизина (ДПЛ) [2]. Схематично структура исследованных образцов приведена на рис. 1, где каждая точка соответствует одной лизиновой единице.

Были исследованы четыре последовательных генерации ДПЛ в двух водных буферных системах и апротонном растворителе — диметилформамиде методами вискозиметрии [3], поступательной изотермической диффузии [3], тейлоровской дисперсии [4] и 1Н ЯМР [5]. В задачи работы входило определение коэффициентов поступательной диффузии и гидродинамических размеров молекул ДПЛ в разных растворителях, определение скейлинговых соотношений между гидродинамическими характеристиками ДПЛ и их молекулярной массой, а также сопоставление гидродинамических свойств ДПЛ и дендримеров сходной химической структуры.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Экспериментальная часть. Поступательную диффузию макромолекул в разбавленных растворах можно изучать различными методами, однако только для частиц сферической формы (к которым можно отнести дендримероподобные молекулы) обычно наблюдается совпадение измеряемых коэффициентов поступательной диффузии Б [6]. В работе использованы два традиционных метода — поступательной диффузии

G1

Рис. 1. Химическая структура молекул ДЛП первой (G1), второй (G2), третьей (G3) и четвёртой (G4) генераций в схематичном представлении: каждая точка соответствует группе

-NH—СН— (GH2)4-NH2

-с=о

в диффузометре Цветкова [3] и 1H ЯМР в градиенте напряженности магнитного поля [5], а также один менее известный — метод тэйлоровской дисперсии [4]. Обращение к последнему связано с возможностью одновременно с измерением коэффициентов D определять среднее число лизиновых групп в молекулах ДПЛ по интенсивности поглощения в УФ-области, что позволяла делать использованная методика. Исследование методом тейлоровской дисперсии проведено в фосфатном буфере при рН = 4,5 и ионной силе 0,6M. Протонный ЯМР в растворах ДПЛ в тяжёлой воде с добавлением соли D2O + 0,2M NaCl исследовали на импульсном ЯМР-спектрометре Bruker Avance 300, измерения были проведены в интервале температур 298-315 K (рис. 2). Поступательную изотермичесую диффузию в диффузометре Цветкова изучали в растворах ДПЛ в ДМФ при 298 К. На рис. 3 приведены зависимости дисперсии о2 диффузионных кривых от времени t, из наклона которых определяли коэффициенты D.

Коэффициент поступательной дифузии D использовали для определения гидродинамического диаметра dh молекул, поскольку для частиц сферической формы справедливо соотношение Стокса—Эйнштейна (см. [3])

dh =

кТ

(1)

JtZIJLдl

4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 м.д.

Рис. 2. ХН ЯМР спектр ДПЛ третьей генерации в D2O + 0,2М Ш01: максимум спектра при 4,26 м.д. соответствует протонам группы -СО—СН—N11-

максимум при 3,13 м.д. группе -СН2 —NH—СО-; максимум при 2,93 м.д. относится к концевым группам —СН2 — NH+; остальные максимумы относятся к алифатическим группам —(СН2)П—; температурную зависимость основных сигналов при 2,93 м.д. и 4,26 м.д. использовали для определения коэффициентов самодиффузии молекул ДПЛ

Рис. 3. Зависимость дисперсии диффузионной кривой 02 от времени для ДПЛ разных генераций в ДМФ при концентрации 0,04х 10-2 г-см-3 и Т = 298 К, номер прямой соответствует номеру генерации:

значение дисперсии было определено методом максимальной ординаты и площади под диффузионной кривой [3]

500

400

300

200

100

а2 -104, см2

где к — постоянная Больцмана; Т — абсолютная температура; по — вязкость растворителя.

Характеристическую вязкость [п] растворов ДПЛ определяли только в D2O + + 0,2М ^С1 при 298 К в вискозиметре Оствальда, в котором время течения растворителя составляло 120,5 ± 0,05 с.

Результаты и их обсуждение. В таблице приведены коэффициенты поступательной диффузии Б и рассчитанные по формуле (1) гидродинамические размеры молекул ДПЛ, полученные разными методами в двух водных растворителях и ДМФ.

Степень полимеризации (N), коэффициент поступательной диффузии и гидродинамический диаметр (^) молекул ДПЛ в разных растворителях

Номер генерации

1 2 3 4

м* 8 48 123 365

Диметилс эормамид (ДМФ)

Б" х 107, см2с-1 35,4 32,7 22,0 12,3

йи х 10®, см 15,5 16,8 24,9 44,6

Б20+0,2М

£*** х 107, см2с"1 17,30 9,92 6,23 4,77

йи х 10®, см 21,0 36,7 58,4 77,6

¿к(020 + 0,2М (ДМФ) 1,4 2,2 2,3 1,8

Фосфатный буфер****

Б* х 107, см2с-1 20,98 11,3 7,06 5,86

йи х 10®, см 20,6 39,2 61,2 73,8

* Число мономерных единиц лизина в составе образцов определено методом тейлоровской диспер-

сии.

** Определено методом поступательной диффузии в диффузометре Цветкова.

*** Определено ХН ЯМР.

**** Растворитель приготовлен растворением в дистиллированной воде 50 г • л-1 соли Н2РО—^+ (рН = 4,5, ионная сила 0,6М).

ДПЛ, как и линейные полилизины, являются поликатионами, поскольку в водной среде каждая их аминогруппа приобретает положительный заряд за счёт протониро-вания. Изучение гидродинамических свойств ДПЛ в фосфатных буферах различного состава в интервале рН от 4,5 до 7 при вариации ионной силы показало отсутствие заметной зависимости размеров молекул ДПЛ от природы противоионов, их концентрации и рН среды [7]. Полученные нами данные подтверждают это свойство молекул ДПЛ. Как следует из таблицы, в буферном растворителе D2O + 0,2М ^С1 и в фосфатном буфере более сложного состава гидродинамический диаметр молекул ДПЛ имеет близкие значения для всех генераций. Причём определённое нами значение ¿ь хорошо соответствует полученным ранее оценкам размеров этих молекул в других водных системах [7]. Таким образом, в заряженном состоянии в условиях полного подавления полиэлектролитного эффекта размеры молекул ДПЛ близки и практически не зависят от состава растворителя. Факт постоянства размеров молекул ДПЛ в заряженном состоянии также свидетельствует и об однородности состава образцов ДПЛ, поскольку коэффициенты диффузии, по которым оценивали размеры молекул, были определены различными экспериментальными методами, базирующимися на разных типах усреднения измеряемых параметров.

В то же время размеры молекул ДПЛ в ДМФ существенно отличаются от их размеров в водных растворителях. Приведённое в таблице отношение показывает, что молекулы всех генераций ДПЛ в ДМФ примерно в два раза компактнее, чем в буферных растворителях.

Одной из очевидных причин такого различия следует признать то, что в ДМФ молекулы ДПЛ не заряжены, поскольку ДМФ является для них апротонным растворителем. Отталкивание одноименно заряженных групп ДПЛ в водных средах должно

приводить к увеличению их молекулярных размеров в сравнении с условиями в ДМФ, где электростатическое отталкивание аминогрупп отсутствует.

Однако для ДПЛ можно указать и ещё на одну причину их компактизации в ДМФ, специфическую для молекул данной архитектуры.

Как следует из химической структуры первой генерации ДПЛ (см. рис. 1), «ядро» рассматриваемых молекул представляет собой цепь, состоящую из восьми единиц L-лизина. Для таких стереорегулярных цепей характерны спиральные конформации, которые обычно более свёрнуты и легче реализуемы в незаряженном состоянии полиэлектролита [3]. Таким образом, спирализацию «ядра» поли-L-лизина в составе молекул ДПЛ в ДМФ можно рассматривать как дополнительный механизм, отвечающий за компактизацию этих молекул в незаряженном состоянии.

Общая тенденция для молекул дендримеров, имеющих заряженные концевые группы, изменять конформацию и положение своих концевых групп в зависимости от заряда на этих группах, была предсказана теоретически для дендримеров с одно- и двухточечным центром ветвления [8]. Методом молекулярной динамики показано, что если заряд концевых групп уменьшается, то возможно проникновение концевых групп в дендритную матрицу, что должно сокращать размеры молекул дендримеров [8]. Однако для классических дендримеров типа диамибутановых (DAB) или полиамидо-аминовых (PAMAM) [1, 9, 10], имеющих топологию, сходную с рассмотренной в работе [8], не было отмечено столь существенного изменения размеров молекул в разных растворителях, как было обнаружено для ДПЛ. Более того, например, для дендримеров разных генераций РАМАМ по результатам исследования методом малоуглового нейтронного рассеяния был сделан вывод об инвариантности их размеров относительно рН-усло-вий [11].

Таким образом, дендриграфты поли-L-лизина, в отличие от классических дендри-меров с одно- или двухточечным центром ветвления, проявляют существенную зависимость молекулярных размеров от свойств растворителя. Ядро второй и последующих генераций ДПЛ, если сравнивать их с DAB или PAMAM, не есть точечный центр. Графтированная структура «ядра» ДПЛ диктует иную топологическою организацию их молекул. В отличие от классических дендримеров ДПЛ более асимметричны и не обладают столь регулярной структурой. Другими словами, дендриграфты не так совершенны, как дендримеры. Более того, можно отметить, что в сравнении с DAB или РАМАМ, концевые группы которых в основном сосредоточены на периферии дендритной матрицы, концевые аминогруппы ДПЛ могут находиться и внутри молекул. Это может быть причиной внедрения противоионов буферных растворов внутрь молекул ДПЛ, что тоже может способствовать увеличению их размеров в водных средах.

Обобщая сказанное, сделаем заключение, что дендриграфты полилизина можно считать одной из наиболее эластичных дедритных матриц среди тех, которые уже нашли сегодня применение в биотехнологиях. Установленная в данной работе способность ДПЛ молекул в два раза изменять свои размеры при переходе от ДМФ к водным растворителям может быть использована для эффективного инкапсулирова-ния/декапсулирования малых молекул в фармакологии, для разработки новых вакцин и т. п.

Для полимеров, составляющих гомологическую серию, всегда важно иметь соотношения, связывающие их характеристики с молекулярной массой, — соотношения Марка—Куна—Хаувинка или скейлинговые соотношения [3]. Во-первых, определение скей-линговых соотношений в разных растворителях всегда полезно с практической точки зрения, а во-вторых, такие соотношения могут быть сопоставлены с аналогичными

ln D -4 -

О фосфатный буфер

D2O + 0,2M NaCl

ln [n] 1,2 0,4

ln M

Рис. 4- Зависимости коэффициента поступательной диффузии (Д) в разных растворителях и характеристической вязкости [п] в D2O+0,2M ШС1 от молекулярной массы (М) для образцов ДПЛ в двойном логарифмическом масштабе

соотношениями для дендримеров, что может быть полезно для выявления специфических свойств дендригафтов в сравнении с дендримерами.

На рис. 4 в логарифмическом масштабе приведены зависимости коэффициентов поступательной диффузии D и характеристической вязкости [п] от М молекул ДПЛ в двух растворителях. Молекулярную массу ДПЛ разных генераций рассчитывали с учётом массы лизина 128 г • моль-1 и средней степени полимеризации N, определённой для исследованных образцов методом тейлоровской дисперсии (см. таблицу). Из представленных графических построений получены скейлинговые соотношения для коэффициентов поступательной диффузии

D = 4,12 • 10~5М-°.30±°.07 (ДМФ), (2)

D = 2,24 • 10-5М-°.35±°.03 (D2O + 0,2M NaCl). (2)

Показатели степени в соотношениях (2) близки по величине, отличие имеет порядок экспериментального разброса. Такое совпадение показателей степени в соотношениях Марка—Куна—Хаувинка в разных растворителях позволяет предполагать возможность гомотетичного изменения молекул ДПЛ при изменении среды. Но эта гипотеза нуждается в подтверждении другими методами, так как гидродинамика не может дать однозначной информации о форме молекул, основываясь только на данных об их поступательной диффузии. Можно отметить, что такой тип изменения показателя степени у М в скейлинговых соотношениях (2) в столь разных по свойствам растворителях сильно отличается от линейных по структуре полимеров, для которых показатель степени очень чувствителен к термодинамическому качеству растворителя и, как правило, значительно (иногда в разы) меняется при переходе от одного растворителя к другому [3, 12].

Если же сопоставить полученные для ДПЛ соотношения (2) с соответствующими соотношениями для дендримеров, например PAMAM в метаноле [9, 13], PAMAM, модифицированного карбогидратными концевыми группами [14], или DAB, модифицированного концевыми лактозными группами [15] в водных растворителях, то можно заключить, что показатели степени в них близки и варьируются от 0,25 до 0,37 [13-15]. Можно сказать, что эта характеристика для разной структуры дендримеров в разных растворителях практически всегда близка к 0,3. Учитывая, что значение показателя 0,33 в скейлинговом соотношении для коэффициента поступательной диффузии было теоретически предсказано для гомогенных непроницаемых сфер [12], можно сделать

заключение о том, что дендриграфты и дендримеры ведут себя сходным образом в поступательной диффузии.

Для молекул, гидродинамические свойства которых описываются моделью однородных непроницаемых частиц сферической формы, теория [12] предсказывает, что в соотношении Марка—Куна—Хаувинка для характеристической вязкости [n] ~ Ma скейлинговый индекс должен быть равен нулю. Однако в реальности для многих дендримеров и их производных a = 0, и, более того, иногда зависимость [n] от молекулярной массы в ряду генераций одного дендримера может быть даже немонотонной [1].

Для исследованного ряда генераций ДПЛ в D2O + 0,2M NaCl характеристическая вязкость увеличивалась с увеличением номера генерации. Было получено скейлинговое соотношение

[n] = 2,01 • M 0'12±0'01. (З)

Явное противоречие в гидродинамических свойствах дендримеров, молекулы которых в растворе при поступательном движении ведут себя подобно непроницаемым сферам, но в то же время иначе проявляют себя в отношении вязкостных свойств, обычно принято рассматривать как проявление гибкости молекулами дендритной структуры и доказательством того факта, что дендримеры всё-таки скорее макромолекулы, чем наночастицы [1].

В заключение отметим, что гидродинамические свойства исследованных образцов ДПЛ различных генераций можно считать полностью подобными свойствам высокомолекулярных дендримеров, имеющих диссоциирующие или протонирующиеся в водных растворах концевые группы. Несмотря на различия в химической структуре, денд-риграфты полилизина и такие дендримеры, как производные DAB- или PAMAM демонстрируют очень сходное поведение в поступательном трении и в вязком течении растворов, которое зависит не только от поступательного, но и вращательного трения молекул.

Зависимость размеров молекул дендриграфтов от свойств растворителя, о которой речь шла вначале, можно рассматривать как наиболее значительное их отличие от дендримеров. Полезно привести также следующее сопоставление: размеры молекул ДПЛ в ДМФ (см. таблицу) соответствуют размерам классической матрицы РАМАМ той же генерации (например, в метаноле; см. [1З]), но при этом их молекулярные массы различаются более чем вдвое. Следовательно, матрица ДПЛ в ДМФ является более плотной, чем РАМАМ, и может быть более эффективным инкапсулятором низкомолекулярных соединений.

Литература

1. Dendrimers and Other Dendriric Polymers / ed. by J. M. J. Frechet, D. A. Tomalia. West Sussex, UK, 2001. 6SS p.

2. Collet H., SouaidE., CottetH. et al. An expenditious multigram-scale synthesis of lysine dendrigraft polymers by aqueous N-carboxyanhydride polycondensation // Chem. Eur. J. 2010. Vol. 16. P. 2309-2316.

3. Цветков В. H. Жёсткоцепные полимерные молекулы. Л., 19S6. 379 с.

4. CottetH., BironJ.-Ph., CipelletiL. et al. Determination of individual diffision coefficients in evolving binary mixtures by Taylor dispersion analysis // Anal. Chem. 2010. Vol. S2. P. 1793-1S02.

б. Hrovat M. I., Wade C. G. NMR pulsed gradient diffusion measurements //J. Magn. Res. 19S1. Vol. 44. P. 62-7б.

6. Нефёдов П. П., Лавренко П. H. Транспортные методы в аналитической химии. Л., 19S1. 232 с.

7. CottetH., Martin M., Papillaud A. et al. Determination of dendrigraft poly-L-lysine diffusion coefficients by Taylor dispersion analysis // Biomacromolecules. 2007. Vol. 8. P. 3235-3243.

8. LyulinS. V., Darinskii A. A., LyulinA. V., Michels M. A. J. Computer simulation of the dynamics of neutral and charged dendrimers // Macromolecules. 2004. Vol. 37. P. 4676-4685.

9. Topp A., Bauer B. J., Tomalia D. A., Amis E. J. Effect of solvent quality on the molecular dimensions of PAMAM dendrimers // Macromolecules. 1999. Vol. 32. P. 7232-7237.

10. RamziA., Scherrenberg R., JoostenJ. et al. Structure-properties ralations in dendritic poly-electrolyte solutions at different ionic strength // Macromolecules. 2002. Vol. 35. P. 827-833.

11. Nisato G., IvkovR., Amis A. J. Size invariance of polyelectrolyte dendrimers // Macro-molecules. 2000. Vol. 33. P. 4172-4176.

12. ФлориП. Статистическая механика цепных молекул. М., 1971. 440 с.

13. Павлов Г. М., Корнеева Е. В., Roy R. Сравнительное изучение гидродинамических характеристик молекул исходных полиамидоаминов и лакто-полиамидоаминовых дендриме-ров // Журн. прикл. химии. 2000. Т. 73. № 11. С. 1886-1889.

14. Павлов Г. М., ЭррингтонН., Хардинг С. Е. и др. Молекулярные и структурные характеристики лактодендримеров на основе полиамидоамина // Высокомолек. соед. (A). 2001. Т. 43. С. 118-124.

15. Pavlov G. M., Korneeva E. V., JumelK. et al. Hydrodynamic properties of carbohydrate-coated dendrimers // Carbohydr. Polym. 1999. Vol. 38. P. 195-202.

Статья поступила в редакцию 28 июня 2011 г.

Е. П. Конькова, Р. Ш. Затрудина

УШИРЕНИЕ И СДВИГ ДЛИННОВОЛНОВОЙ ПОЛОСЫ ПОГЛОЩЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ В ПОЛЯРНОМ РАСТВОРИТЕЛЕ

Введение. При разработке новых лекарственных препаратов настоятельно требуется установление связи между молекулярным составом и спектральными свойствами препарата, определяющими в них характер первичных фотопроцессов. Используемые практической медициной вещества находятся в конденсированном состоянии, в котором велико влияние свойств среды на их фотофизические характеристики. Невозможность расчёта уширений спектров поглощения растворов макромолекул заставляет исследователей прибегать к качественным оценкам. В литературе стандартной является процедура нахождения данного типа параметров на основании решения обратной спектральной задачи, когда производится варьирование этих параметров таким образом, чтобы получить удовлетворительное совпадение экспериментальной и расчётной кривых.

Зависимость сдвига и уширения первого синглет-синглетного электронного перехода соответствующих аминокислотных остатков от взаимодействия с водным окружением в значительной степени определяет характер протекания первичных фотофизических процессов, поскольку все эти процессы проходят с участием упомянутых электронных состояний. Кроме того, первый синглет-синглетный электронный переход определяет флуоресцентные свойства молекулы.

Материалы и методы. Коллаген является структурным протеином, основным белковым компонентом, из которого состоят коллагеновые (и ретикулиновые) волокна. В качестве показателя общего количества соединительнотканных волокнистых белков в биоткани может выступать интенсивность флуоресценции коллагена [4].

Молекула коллагена разбивалась на аминокислотные остатки, свободные валентности которых были закрыты атомами водорода, что позволило исключить появление лишних энергетических уровней. Электронный спектр поглощения коллагена является результатом нахождения электронных спектров остатков с учётом кратности их повторения в составе макромолекулы. С этой позиции каждая линия электронного спектра поглощения белка несла информацию об остатке, к которому она относится [5]. Таким образом, остатки, ответственные за наиболее вероятные первые синглет-синглетные электронные переходы, в значительной степени определяли спектральные свойства коллагена на начальном этапе учёта сольватации. Поэтому с целью определения влияния полярного растворителя на спектроскопические характеристики коллагена были рассчитаны длины волн первых синглет-синглетных электронных переходов соответствующих (значимых) остатков в водном растворе с различной концентрацией. Для этого моделировались периодические граничные условия. Изменения в геометрии сольватированных остатков отражали различия между изолированными и находящимися в растворе оптимизированными структурами.

Электронные спектры остатков были рассчитаны неэмпирическим (аЬ тШо) методом в приближении самосогласованного поля (приближение Хартри—Фока) с использованием валентно-расщеплённого базиса 3-21 ГФ, в котором каждая слейтеровская ор-биталь для электронов внутренних оболочек аппроксимирована линейной комбинацией

120 т

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

. 100

80

60

40

20

0

0,5 -

-M-

0

150 200 250 300 350

Phe

0,5

Pro

Glu

Met j_

His

Gly

......

J

0

150 200 250 300 350

50 100 150 200 250 300 Длина волны, нм

-h-1-1

350 400 450

Рис. 1. Электронный спектр поглощения молекулы коллагена и первые синглет-синглет-ные электронные переходы остатков (с учётом кратности повторения в молекуле коллагена)

1

из трёх гауссовых функций, а для валентных электронов вместо каждой слейтеров-ской орбитали используются две линейные комбинации гауссовых функций: одна — из двух, а другая — из одной примитивной гауссовой функции [6]. Для учёта электронной корреляции использован метод конфигурационного взаимодействия. Методом РМЗ осуществлялись оптимизация геометрии и вычисление колебательных спектров (контроль достижения минимума на поверхности потенциальной энергии системы) остатков. Методом ZINDO/S, параметризованным для воспроизведения оптических переходов в УФ-видимой области, вычислены длины волн первых синглет-синглетных электронных переходов сольватированных остатков в водном растворе с различной концентрацией.

Результаты и обсуждение. Результаты квантово-химического расчёта электронного спектра поглощения свободной молекулы коллагена в неэмпирическом приближении представлены на рис. 1.

В области 150-350 нм показаны нормированные в максимуме на единицу результаты полуэмпирического расчёта (с учётом кратности повторения в молекуле белка) первых синглет-синглетных электронных переходов аминокислотных остатков. Видно, что остатками, отвечающими за наиболее вероятные и, следовательно, наиболее значимые на начальном этапе учёта сольватации первые синглет-синглетные электронные переходы в области 150-350 нм, являются глицин (Gly), метионин (Met), глутамин (Glu), пролин (Pro), гистидин (His) и фенилаланин (Phe), которые входят в состав медикаментозного препарата «Семакс», стимулирующего протекание в головном мозге механизмов, защищающих его от повреждения при ишемии головного мозга.

Длина волны первого синглет-синглетного электронного перехода под влиянием межмолекулярных взаимодействий изменяется за счёт изменения энергии основного и первого возбуждённого состояний. В результате флуктуационного движения молекул растворителя в реальных растворах образуются элементарные ячейки с различными конфигурациями водного окружения растворённой молекулы. Очевидно, что в силу различия конфигураций, энергии взаимодействия с окружением у разных молекул растворённого вещества различные. Таким образом, в реальных растворах наблюдаются разброс значений длины волны первого синглет-синглетного перехода,

400-, 300200 100 0

Pro

0

Gly

В:

10 20 30 40 50 0

10

20 30 40 50

g 400 п His ] Met

3 300 -s il 200- д-д- J ^ д: Т д -L I

g 100-

« 0- 1 1 ■ 1

--1-1-1-1-1 T-1-1-1-1-1

0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 50

400 300 200 100 0

Phe

Glu

nf

vrjrrV-i

I

ТГ

0 10 20 30 40 50 0 10

Концентрация, %

20

30

40

50

Рис. 2. Концентрационные зависимости длин волн первых синглет-синглетных электронных переходов глицина (Gly), метионина (Met), глутамина (Glu), пролина (Pro), гистидина (His) и фенилаланина (Phe)

конфигурационное уширение [1]. За конфигурационное уширение принято удвоенное среднеквадратическое отклонение длины волны первого синглет-синглетного электронного перехода по нескольким конфигурациям молекул растворителя в элементарной ячейке при неизменной концентрации раствора.

На рис. 2 представлены концентрационные зависимости длины волны первых син-глет-синглетных переходов глицина (Gly), метионина (Met), глутамина (Glu), пролина (Pro), гистидина (His) и фенилаланина (Phe). Видно, что уширения для Gly, Met и Glu, равные ~ 40, 60, 80 нм, значительно превышают уширения для Pro, His и Phe, равные ~ 20, 20, 20 нм. На рис. 3 показаны проекции оптимизированных аминокислотных остатков на плоскость. Сравнивая рис. 2, 3, убедимся, что уширение и сдвиг первого синглет-синглетного электронного перехода зависят от степени сложности строения соответствующего остатка: чем сложнее молекула (присутствуют циклы, замкнутые системы с сопряжёнными двойными связями, ароматические кольца), тем слабее проявляется эффект конфигурационного уширения перехода.

В реальном растворе при определённой концентрации существует непрерывный статистический набор элементарных ячеек с различными конфигурациями молекул растворителя, индуцирующими различные распределения векторов дипольных моментов растворённых молекул и молекул растворителя. Таким образом, трансформация системы межмолекулярных взаимодействий влечёт изменения в полярности водного

Met

Glu

Рис. 3. Проекции оптимизированных аминокислотных остатков на плоскость рисунка

окружения и дипольного момента сегмента. Дипольный момент молекулы определяет гидратационную оболочку и, следовательно, её чувствительность к водному окружению [2]. С учётом сказанного, изменение дипольного момента остатка в результате взаимодействия с водным окружением рассматривалось как процесс, приводящий к сдвигу значения длины волны первого синглет-синглетного электронного перехода в полярном растворителе.

Получены концентрационные зависимости дипольных моментов Gly, Met, Glu, Pro, His и Phe. На рис. 4 в качестве примера представлены концентрационные зависимости длины волны первого синглет-синглетного электронного перехода (масштаб увеличения) и дипольного момента Met. Видно, что увеличение (уменьшение) полярности сегмента приводит к батохромному (гипсохромному) сдвигу длины волны первого син-глет-синглетного электронного перехода соответствующего остатка.

3 250 -

я -

о я

| 200 -I

ц

«

150

ft

F

ю 60 «

н 50

I

§ 40

о

j 30

3 20 -

§ 10

s «

10 20 30 40 Концентрация, %

50

10 20 30

Концентрация, %

40

50

Рис. 4- Концентрационные зависимости длины волны первого синглет-синглетного электронного перехода (масштаб увеличения) и дипольного момента Met

Спектральный сдвиг существенно зависит от поведения атома в растворённой молекуле, вблизи которой рассматривается молекула растворителя, а именно — от его электроотрицательности. Анализ результатов показал, что в растворе отрицательный заряд у исследуемых аминокислотных остатков индуцировался преимущественно на атомах азота и кислорода. Поскольку третичная структура определяется взаимодействием поверхностных остатков, то для белков гидродинамический радиус близок к истинному размеру молекул, что соответствует значительным концентрациям водного раствора. В связи с этим результаты представлены в области концентрации от 3 до 5 %.

Выводы. Обнаружено, что аминокислотными остатками, отвечающими за наиболее вероятные электронные переходы в молекуле такого важнейшего биполимера, как коллаген (в области 150-350 нм), и аминокислотными остатками, входящими в состав синтетического биополимера «Семакс», обладающего нейропротекторным действием, являются одни и те же аминокислотные остатки, а именно: глицин (Gly), метионин (Met), глутамин (Glu), пролин (Pro), гистидин (His) и фенилаланин (Phe).

Установлено, что уширение первого синглет-синглетного электронного перехода зависит от степени сложности строения соответствующего остатка: чем сложнее молекула (присутствуют циклы, замкнутые системы с сопряжёнными двойными связями, ароматические кольца), тем слабее проявляется эффект конфигурационного уширения перехода. Так, уширения для GLy, Met и Glu составили ~ 40, 60, 80 нм соответственно, что значительно превысило уширения для Pro, His и Phe, равные ~ 20, 20,10 нм.

Можно полагать, что на начальном этапе разброс значений длины волны первого синглет-синглетного электронного перехода сольватированной молекулы прямо пропорционален энергии специфических взаимодействий, а уширение перехода прямо пропорционально энергии универсальных взаимодействий и обратно пропорционально сложности структуры молекулы.

Литература

1. Власова И. М, Буравцов Д. Е., СалецкийА.М. Люминесцентный анализ компонентов крови в исследованиях нейропротекторных свойств препарата «Семакс» при ишемии головного мозга // Журн. прикл. спектр. 2009. Т. 76. № 1. С. 131-137.

2. Затрудина Р. Ш., Конькова Е. П. Изменение спектров флуоресценции цервикальной ткани при некоторых патологиях // Вестн. ВолГУ. Сер. 9: Иследования молодых учёных. 2010. Вып. 8. Ч. 2. С. 133-140.

3. Абдулов Х. Ш. Расчёт интенсивностей полос ИК-спектров ориентированных полимеров // Журн. прикл. спектр. 2004. Т. 71. № 4. С. 451-455.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

4. Грибов Л. А., Баранов В. И., Новосадов Б. К. Методы расчёта электронно-колебательных спектров многоатомных молекул. М., 1984.

5. ЛевшинЛ. В., СалецкийА. М. Люминесценция и её измерения. Молекулярная люминесценция. М., 1989.

6. Морозова Ю. П., Жаркова О. М., Балакина Т. Ю. Влияние протонодонорного растворителя и нежёсткости структуры молекул продана и лаурдана на их спектрально-люминесцентные свойства // Журн. прикл. спектр. 2009. Т. 76. № 3. С. 334-341.

Статья поступила в редакцию 28 июня 2011 г.

Е. П. Конькова, Р. Ш. Затрудина

ВЛИЯНИЕ ВОДЫ НА ПРОЯВЛЕНИЯ ВНУТРИМОЛЕКУЛЯРНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В МОЛЕКУЛЕ NADH

Введение. Роль воды в клетках определяется её химическими и структурными свойствами. Эти свойства связаны с малыми размерами молекул, их полярностью и способностью соединяться друг с другом водородными связями. Из-за симметричного распределения зарядов молекула воды действует как диполь. Дипольный момент обусловливает способность воды активно вступать во взаимодействие с различными веществами.

При исследовании органических молекул, вовлечённых в жизненно важные процессы, одним из основных является вопрос о факторах, определяющих вид электронных спектров поглощения в полярных растворителях. О природе и величине молекулярного взаимодействия можно судить по положению перехода из основного в первое возбуждённое электронное состояние. Зависимость положения данного перехода от взаимодействия с водным окружением будет в значительной степени определять характер первичных фотопроцессов, поскольку все они протекают с участием упомянутых электронных состояний.

Витамин B5, чаще называемый витамином PP (от англ. pellagra preventing factor — антипелларгический фактор), химически представляет собой два вещества, обладающих одинаковой витаминной активностью: никотиновую кислоту и никотинамид. Никотиновая кислота и её амид стали известны ещё в прошлом веке в связи с исследованиями никотина. Однако связь тяжёлого заболевания — пеллагры с недостатком в диете витамина PP была установлена позднее. Биохимическую роль витамин B5 играет в форме кофермента никотинамидадениндинуклеотида.

Никотинамидадениндинуклеотид входит в многочисленную группу дегидрогеназ, принимающих участие почти в 150 различных биохимических реакциях дегидрирования, окисления, N-алкилирования, изомеризации, в восстановлении нитрата до нитрита и далее до аммиака, в фотосинтезе, дыхании, энергетическом обмене, анаэробном расщеплении углеводов. Постоянный интерес к спектрам аденина связан со спектральными исследованиями входящих в молекулы ДНК и РНК пуриновых и пиримидиновых оснований. Аденин и никотинамид характеризуются наличием двойных сопряжённых связей, следовательно п-электронов [2]. Никотинамидадениндинуклеотид может находиться в окисленной и восстановленной формах. Окисленная форма имеет спектр поглощения с максимумом на 340 нм и способность флуоресцировать. Спектр флуоресценции восстановленной формы в водном растворе имеет максимум на 470 нм.

Материалы и методы. Принято разделять два типа межмолекулярных взаимодействий: универсальные (влияние всех молекул растворителя на молекулы растворённого вещества) и специфические (с соседними молекулами растворителя). Основной вклад в энергию универсальных взаимодействий вносит электростатическое взаимодействие дипольных моментов растворённого соединения и молекул растворителя, а в энергию специфических — образование межмолекулярных водородных связей.

Повышению эффективности спектроскопических исследований во многом способствует реализация расчётов физических величин на персональном компьютере

в режиме реального времени. Сегодня различные квантово-химические методы являются широкодоступными благодаря реализации в многочисленных программных комплексах. В качестве самостоятельного физико-химического метода исследования они играют определяющую роль при разработке моделей влияния среды на молекулу. Основная сложность заключается в том, что влияние растворителя для органических молекул основано на вычислении электронной волновой функции для очень большой системы [4]. Поэтому, выбирая метод расчёта электронной волновой функции для такой системы, приходится идти на компромисс между точностью расчёта и затратами машинного времени.

В нашей работе неэмпирический метод использован для расчёта линий поглощения электронного спектра изолированной молекулы NADH и тестирования по этим данным результатов полуэмпирического расчёта энергии перехода из основного в первое возбуждённое электронное состояние. После того как было установлено их приемлемое согласие, полуэмпирический метод применялся для расчёта энергии перехода из основного в первое возбуждённое электронное состояние молекулярных систем в водном окружении. Наиболее ценной является информация именно о происхождении спектральных линий, таким образом, совместное применение неэмпирического и полуэмпирического методов предполагается достаточно разумным.

В расчётах применялись стандартные методы, процедуры и критерии, реализованные в пакете программ HyperChem (версия 7.5). Геометрия исследованных молекулярных систем визуализировалась в том же квантово-химическом пакете. Для расчёта электронного спектра изолированной молекулы NADH был применён неэмпирический метод в приближении самосогласованного поля (ССП/3-21ГФ).

Для расчёта переходов из основного в первое возбуждённое электронное состояние молекул в присутствии растворителя использована полуэмпирическая версия метода самосогласованного поля в приближении частичного пренебрежения дифференциальным перекрыванием (INDO), множество модификаций которого тем не менее приводят к достаточно схожим результатам [5]. Для учёта электронной корреляции был использован метод конфигурационного взаимодействия. Принудительное ускорение сходимости не активировалось. Предварительная минимизация энергии исследуемых систем за счёт изменения пространственного расположения атомов относительно друг друга позволила найти ближайшие локальные минимумы на поверхностях их потенциальных энергий. Геометрии оптимизированных систем использовались в качестве стартовых.

Для исследования кофермента NADH в водном окружении были смоделированы непрерывные с постоянной плотностью макроскопические условия. Молекула NADH в стартовой геометрии помещалась в периодическую ячейку, начальные линейные размеры которой полагали равными удвоенным линейным размерам кофермента. Поэтому максимальная концентрация раствора, при которой исключалось влияние краевых эффектов, составляла 75 % (12 молекул воды на 1 молекулу никотинамидаденинди-нуклеотида). Далее путём увеличения размеров периодической ячейки уменьшалась концентрация раствора. На каждом шаге проводилась минимизация энергии кофер-мента в присутствии растворителя методом молекулярной динамики (алгоритм Polak-Ribiere). Изолированная молекула кофермента имела оптимальную стартовую геометрию, поэтому происходящие в ней в процессе минимизации изменения обусловлены непосредственно действием водного окружения. Взаимодействие молекул воды осуществлялось на основе трёхточечного модельного потенциала TIP3P. Расчёт при концентрации 21 % не был реализован в связи с недостатком вычислительных ресурсов. Максимальное число молекул воды равнялось 138.

Г 1

I .

I

I-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-г

180,8 188,7 201,6 204,2 214,4 225,2 227,9 256,8 289 291,5 324,3 336 365,4 371,4 425

Длина волны, нм

Рис. 1. Рассчитанный ab initio электронный спектр поглощения NADH

0

Результаты и обсуждение. При малых расстояниях между взаимодействующими молекулами (порядка 8-10 А) большую вероятность приобретает процесс ассоциации, образование агрегатов различной сложности. Образование ассоциатов может происходить за счёт универсальных и специфических взаимодействий. Образование разнородных ассоциатов приводит к отличию электронных спектров смеси от суммы спектров её компонент. Характер деформации определяется, как и в случае однородных ассоциатов, взаимным расположением объединившихся молекул. Возникновение ассоциатов существенно изменяет основные оптические свойства раствора, в частности электронные спектры поглощения. В нашем случае взаимодействие аденина и никотинамида в молекуле NADH рассматривается в рамках теории ассоциации с поправкой на химическую природу сил, объединяющих эти молекулы в разнородный ассоциат. Эффективность ассоциации зависит от природы используемого растворителя и структуры взаимодействующих молекул. Поскольку вода является полярным растворителем и оба взаимодействующих соединения имеют активную NH-группу, может происходить усиление процесса ассоциации в результате образования водородных связей непосредственно между аденином и никотинамидом и при помощи молекул воды, выполняющих роль промежуточных мостиков.

На рис. 1 представлен рассчитанный в приближении ССП/3-21ГФ электронный спектр поглощения одиночной молекулы восстановленной формы никотинамидаденин-динуклеотида. Предполагается, что к появлению поглощения на 290 и 420 нм изолированной молекулы NADH приводит взаимодействие аденина и никотинамида.

На рис. 2 приведены концентрационные зависимости длин волн первых синглетных переходов аденина, никотинамида и их ассоциата. Выделение в структуре макромолекулы фрагментов, сохраняющих в известной степени свойства исходной макромолекулы, является часто используемым приёмом [5, 6].

Сравнение полученных зависимостей показало, что молекулярные взаимодействия, проявляющиеся в водном растворе никотинамидадениндинуклеотида, имеют ряд отличительных спектроскопических признаков. Видно, что первые синглетные переходы никотинамида и аденина в ассоциате при наличии водного окружения приходятся на длину волны 430 и 290 нм соответственно.

м 450

н

ы 400

н

ол в 350

а

н и 300

Дли

250

ссрЯ^сь суп аЪ □

Чц»|ММ1>иЦ»»МИ»*|1*»|||> •••• м* •

—I-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1

20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 76

Концентрация, %

450

3 400 н

вол350 а

к 300 Н

л Д

250

• I I' ы I * ■

1,1

—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I

20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 76

Концентрация, %

Рис. 2. Концентрационные зависимости длины волны первых синглетных переходов никотинамида 430 нм), аденина 290 нм) и их ассоциата в молекуле NADH

Данные, представленные на рис. 3 и 4 (концентрация 50 и 51 % соответственно), относятся к поглощению на разных центрах молекулы NADH. Слева направо показаны: геометрии ассоциата, парциальные заряды на молекуле никотинамида.

При концентрации 50 % (36 молекул воды на одну молекулу NADH) поглощение наблюдалось на длине волны 286 нм, что отвечало переходу на коротковолновом поглощающем центре аденине. При концентрации 51 % (водное окружение NADH составляли 35 молекул воды) поглощение наблюдалось на длине волны 429 нм, отвечающей переходу на молекуле никотинамида, длинноволновом поглощающем центре. Для удобства зрительного восприятия из периодических ячеек удалены молекулы воды, не участвовавшие в образовании водородных связей с поглощающими центрами.

Кроме того, на рис. 3, 4 видно, что в обоих случаях водородные связи с адени-ном посредством активной NH2 группы образовали три молекулы воды, водородные связи с никотинамидом отсутствуют. Из сравнения парциальных зарядов на атомах соответствующих поглощающих центров при данных концентрациях раствора обнаружено, что повышение концентрации (уменьшение количества молекул воды в периодической ячейке на одну) приводит в заметному изменению в распределении зарядов поглощающих центров, в результате которого заменяются условия запрещения (разрешения) поглощения на аденине (никотинамиде). Так, заряд на одном из атомов углерода длинноволнового поглощающего центра — никотинамиде (на рис. 3, 4 выделено полужирным) уменьшается в три раза. Таким образом, вероятность передачи энергии определяется всеми молекулами воды. Часть молекулы NADH, связывающая аденин и никотинамид, выполняет роль каркаса, удерживающего взаимодействующие поглощающие центры на естественном для реальной молекуле кофермента расстоянии. Из-за своей роли связующего звена данная часть исключалась из расчётов.

На рис. 3, 4 также показано, что при данных концентрациях аденин и никотина-мид не связаны между собой ни прямой водородной связью, ни с помощью промежуточных мостиков из молекул воды. Таким образом, перенос энергии возбуждения с коротковолнового поглощающего центра аденина на длинноволновой поглощающий

0,132

0,134

0,074

0,150 -0,397

■ 0,087

0,108

0,025

0,077

,253 0,123

0,126'

Рис. 3. Геометрия ассоциата, парциальные заряды на молекулах аденина и никотинамида

при концентрации раствора 50 %

0,086

V-0,030

0,116

Рис. 4. Геометрия ассоциата, парциальные заряды на молекулах аденина и никотинамида

при концентрации раствора 51 %

центр никотинамид по описанным выше каналам исключался. С учётом сказанного изменение в распределении зарядов никотинамида можно связать с безызлучательным переносом энергии возбуждения по индуктивно-резонансному механизму.

Безызлучательный процесс энергии электронного возбуждения представляет собой процесс, при котором возбуждённые молекулы донора энергии вступают во взаимодействие с невозбуждёнными молекулами акцептора энергии. В результате такого взаимодействия появляется дополнительная вероятность для перехода возбуждённой молекулы донора в состояние с меньшей энергией с одновременным переходом молекулы акцептора в состояние с большей энергией. Перенос энергии является «индуктивным», потому что он обусловлен взаимодействием мгновенных диполей, наведённых за счёт колебаний электронной плотности в молекулах аденина и никотинамида. В случае малых молекулярных расстояний (рёбра периодической ячейки ~ 10 А) для молекул с мощными я-электронными облаками дисперсионные силы могут достигать очень больших значений (энергия взаимодействия более десятка килокалорий на моль).

Процесс переноса энергии электронного возбуждения в разнородном ассоциате от коротковолнового поглощающего центра аденина к длинноволновому поглощающему

центру никотинамиду можно представить в следующем виде. Первоначально возбуждённая молекула аденина возвращается в основное состояние, передавая свою энергию путём дисперсионных взаимодействий невозбуждённой молекуле никотинамида, которая при этом переходит в возбуждённое состояние. Перенос энергии электронного возбуждения происходит между не однотипными, а между разнородными молекулами, что соответствует раствору нескольких органических веществ. Таким образом, перенос энергии возбуждения между аденином и никотинамидом напоминает процессы миграции энергии в многокомпонентных системах.

При различных концентрациях раствора донором (акцептором) энергии может выступать как аденин, так и никотинамид. Наблюдавшаяся в ходе компьютерного эксперимента высокая чувствительность к растворителю (обмен ролями донора и акцептора энергии) свидетельствовала о значительном взаимодействии аденина и никотинамида в молекуле NADH. Независимо от природы молекулярных взаимодействий смена ролей может быть объяснена изменением условий запрещения (разрешения) поглощения на аденине (никотинамиде). Смоделирована ситуация, когда поглощение разрешено только на одном из поглощающих центров с одновременным запрещением поглощения на другом. Изменение условий запрещения (разрешения) поглощения происходит под влиянием водного окружения ассоциата, что приводит к изменению энергии соответствующих электронных состояний. Известно, что вероятность направленного переноса энергии от коротковолновых к длинноволновым поглощающим центрам у ароматических углеродов и гетероциклических соединений связана с вероятностями соответствующих электронных переходов и уменьшается при низкочастотном возбуждении. Так, вероятность длинноволнового электронного в изолированной молекуле NADH в области 430 нм выше вероятности коротковолнового электронного перехода в области 290 нм (см. рис. 1), а поглощение на длинноволновом центре происходило чаще (см. рис. 2). При высокочастотном возбуждении возбуждаются коротковолновые и длинноволновые центры, причём энергия эффективно мигрирует к последним.

Выводы. Показано, что взаимодействие аденина и никотинамида в молекуле NADH можно описать в рамках теории ассоциата с поправкой на химическую природу сил, объединяющих эти молекулы в разнородные ассоциаты. Обнаружено, что молекулярные взаимодействия, проявляющиеся в водном растворе NADH, имеют ряд представляющих интерес отличительных спектроскопических признаков, а именно: наблюдается направленный перенос энергии электронного возбуждения от коротковолнового поглощающего центра аденина (290 нм) к длинноволновому поглощающему центру никоти-намиду (430 нм) посредством дисперсионных взаимодействий. Смоделирована ситуация, когда поглощение разрешено только на одном из поглощающих центров с одновременным запрещением поглощения на другом. Изменение условий запрещения (разрешения) поглощения на аденине (никотинамиде) происходит под влиянием водного окружения ассоциата, что приводит к изменению энергии соответствующих электронных состояний.

Литература

1. Затрудина Р. Ш., Конькова Е. П. Изменение дипольного момента молекулы никотинамида в воде по данным полуэмпирических расчётов // Сб. докл. 20-й междунар. конф. «Лазеры. Измерения. Информация». СПб., 2010. Т. 2. С. 132-141.

2. Конев С. В., ВолотовскийИ. Д. Фотобиология. Минск, 1979.

3. Бурштейн К. Я., ШорыгинП.П. Квантовохимические расчёты в органической химии и молекулярной спектроскопии. М., 1989.

4. Кузьмицкий В. А., Волкович Д. И. Расчёты электронного спектра порфина и его производных модифицированным методом INDO/S // Журн. прикл. спектр. 2008. Т. 75. № 1. С. 28-34.

5. Немухин А. В., Колесников И. М., Винокуров В. А. Строение комплекса алюмофенилси-локсана и его фрагментов по данным полуэмпирических и неэмпирических расчётов // Журн. структ. химии. 1995. Т. 36. № 3. С. 410-417.

6. Никитин О. Ю., Новосадов Б. К. Теория пофрагментного расчёта электронной структуры основного состояния многоатомных молекул. Метод промежуточного фрагмента // Журн. структ. химии. 1985. Т. 36. № 3. С. 387-394.

Статья поступила в редакцию 28 июня 2011 г.

А. И. Сулацкая, И. М. Кузнецова, К. К. Туроверов

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО КРАСИТЕЛЯ ТИОФЛАВИНА Т ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ СТРУКТУРЫ АМИЛОИДНЫХ ФИБРИЛЛ*

Введение. Ряд тяжёлых заболеваний человека и животных, связанных с нарушением фолдинга белков, таких как болезни Альцгеймера и Паркинсона, диабет второго рода, прионные заболевания, сопровождаются образованием амилоидных фибрилл [1-7]. Амилоидные фибриллы представляют собой особое компактное состояние белка, которому отвечает глубокий минимум свободной энергии, обусловленный межмолекулярными взаимодействиями макромолекул белка, обогащённых ^-структурами [8]. К настоящему времени известно более 20 белков, которые при определённых условиях могут in vivo переходить в фибриллярную форму и откладываться в виде нерастворимых образований во внеклеточных депозитах. В связи с практической значимостью для медицины выяснение факторов, способствующих образованию амилоидных фибрилл, а также изучение их структуры являются в настоящее время предметом интенсивных исследований.

Результаты последних лет показали, что при определённых условиях белки, никак не связанные с возникновением болезней (а возможно, все белки), могут образовывать амилоидоподобные фибриллы [9-13]. Архитектура амилоидных и амилоидоподобных фибрилл на основе различных белков является сходной — все они представляют собой неразветвлённые фибриллы, образованные в-складчатыми структурами, в-листы которых направлены перпендикулярно оси фибриллы [14, 15]. Однако исследования, в ходе которых были расшифрованы структуры нескольких амилоидоподобных фибрилл с высоким разрешением, показали, что они не являются полностью идентичными [16, 17]. Поскольку фибриллярное состояние белков, обогащённое в-складчатыми структурами, является, по-видимому, одним из основных термодинамически стабильных состояний белковой молекулы, изучение структуры амилоидных фибрилл имеет существенное значение не только для медицины, но и для понимания фундаментальных основ фолдинга белков.

При изучении процессов сворачивания-разворачивания белков и свойств, возникающих при этом промежуточных частично-свёрнутых и неправильно свёрнутых состояний, а также их агрегированных форм широко используется флуоресцентный метод. Он основан на регистрации собственной флуоресценции белков, флуоресценции гидрофобного зонда 1-анилинонафталин-8-сутльфоната (АНС) и бензтиазольного красителя тиофлавина Т (ThT) (рис. 1), который взаимодействует с белками в состоянии амилоидных фибрилл. Связывание ThT с фибриллами высокоспецифично — краситель не взаимодействует с глобулярными белками в нативном состоянии (за исключением ацетилхолинэстеразы и сывороточных альбуминов), с белками в развёрнутом и промежуточных частично-свёрнутых состояниях, а также с аморфными агрегатами белков. Встраивание ThT в амилоидные фибриллы сопровождается существенным возрастанием квантового выхода его флуоресценции (нередко в тысячи раз), тогда как свободный краситель в водном растворе имеет очень низкий квантовый выход (по

* Работа выполнена по программе РАН «Молекулярная и клеточная биология», фонда «Династия» и РФФИ (проект 10-04-90038-Бел.).

нашим данным, около 0,0001). Несмотря на то, что подход, основанный на изучении взаимодействия ТЬТ с амилоидными фибриллами, является одним из эффективных методов диагностики их возникновения [18-24], механизмы этого взаимодействия, а также причины существенного возрастания квантового выхода флуоресценции, сопровождающего встраивание ТЬТ в фибриллы, недостаточно изучены. Существуют гипотезы, согласно которым спектральные свойства и возрастание квантового выхода флуоресценции ТЬТ, инкорпорированного в амилоидные фибриллы, обусловлены димерами, эксимерами или даже мицеллами, которые якобы образуют молекулы красителя. Одна из задач настоящей работы состояла в том, чтобы определить модель связывания ТЬТ с фибриллами, а также объяснить причины возрастания квантового выхода флуоресценции красителя при инкорпорировании в амилоидные фибриллы.

В настоящее время стало очевидным, что ТЬТ можно использовать не только для диагностики возникновения амилоидных фибрилл, но и для изучения их структуры. В литературе можно найти около десятка работ, в которых предпринимались попытки определения значений констант диссоциации и стехиометрии, характеризующих связывание красителя с фибриллами. Для этого в большинстве из них использовался подход, основанный на измерении зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации красителя и (или) амилоидных фибрилл. В представляемой работе показано, что этот метод в принципе не может быть использован для получения информации о стехиометрии и аффинности связывания красителя с фибриллами. В связи с этим актуальной задачей является разработка универсального подхода для изучения параметров связывания ТЬТ и его аналогов с амилоидными фибриллами. Её решение позволит расширить информативность метода изучения структуры амилоидных фибрилл, в основе которого лежит их взаимодействие с флуоресцентным красителем ТЬТ.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Результаты и обсуждение.

Механизм связывания ThT с амилоидными фибриллами. В первых работах, посвящённых изучению спектральных свойств ТЬТ, было отмечено, что при встраивании красителя в амилоидные фибриллы спектры флуоресценции и возбуждения флуоресценции красителя испытывают значительный длинноволновый сдвиг, а квантовый выход флуоресценции существенно возрастает [20]. В последующих работах для объяснения этого феномена были сделаны предположения, что флуоресцентные свойства ТЬТ, инкорпорированного в амилоидные фибриллы, обусловлены тем, что при встраивании краситель образует димеры [25], эксимеры [26] или даже мицеллы [27].

Для проверки гипотезы об образовании красителем димеров были измерены спектры поглощения (зависимость оптической плотности О от длины волны X) растворов ТЬТ в широком диапазоне концентраций красителя (рис. 2, а), для чего были использованы кюветы, имеющие разную длину оптического пути (0,1, 0,2, 0,5, 1,5 см). Полученные результаты свидетельствуют, что положение и форма спектров поглощения, а также коэффициент молярной экстинкции ТЬТ в диапазоне концентраций от 7,5 • 10-6 до 3,7•Ю-4М не зависят от концентрации красителя. Таким образом, можно заключить, что предположения об образовании димеров ТЬТ необоснованны. Поскольку в основном состоянии краситель не образует димеров, то маловероятно, что за короткое время

Рис. 1. Структура молекулы ТЬТ:

угол ф характеризует ориентацию бензтиазольного и аминобензольного колец красителя относительно друг друга

0,9

^ 0,6

0,0

3000

~ 2000 1000

0

0 40 80 120

Т/ц, К ■ сп-3

Рис. 2. Обоснование модели встраивания ТЬТ в амилоидные фибриллы:

а — спектры поглощения ТЬТ в воде для разных концентраций красителя: от 10_6 до 10_4М (кривые 1 —5); б — зависимость интенсивности флуоресценции ТЬТ от концентрации красителя, на вставке эта зависимость представлена в полулогарифмическом масштабе; в — зависимость квантового выхода флуоресценции ТЬТ от температуры и вязкости растворителя, на вставке показан участок зависимости, соответствующий низким температурам и высокой вязкости растворителя

жизни возбуждённого состояния, которое, по нашим данным, в водном растворе не превышает 0,001 нс [28], может произойти образование эксимеров.

Гипотеза об образовании мицелл молекулами красителя выдвинута в работе [27] на основании зависимости интенсивности флуоресценции от его концентрации, по-

строенной в полулогарифмическом масштабе. Было сделано предположение, что возрастание интенсивности флуоресценции красителя связано с образованием мицелл, которые начинают формироваться при концентрации красителя, соответствующей точке перегиба этой зависимости. Авторы статьи предполагают, что с этим эффектом связано и возрастание интенсивности флуоресценции при его взаимодействии с амилоидными фибриллами, т. е. что краситель встраивается в фибриллы в форме мицелл.

Нами измерена интенсивность флуоресценции в водных растворах в широком диапазоне концентраций красителя (рис. 2, б). Оказалось, что на начальном участке зависимости наблюдается отсутствие роста интенсивности флуоресценции красителя, что можно объяснить сопоставимостью интенсивности свечения с интенсивностью свечения примесей воды при низких концентрациях красителя. После достижения концентраций, при которых интенсивность флуоресценции начинает превышать интенсивность флуоресценции примесей растворителя, на графике наблюдается постепенный

350 400 450 500

Я, нм

30 60

[ТЫ], мкМ

в

рост интенсивности флуоресценции с увеличением концентрации красителя (что можно объяснить постепенным увеличением количества флуоресцирующих молекул). Далее происходит выход зависимости на плато. Таким образом, зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации №Т, построенная в обычных координатах, ничем не отличается от зависимостей для любого другого флуоресцирующего вещества, которые в полулогарифмическом масштабе аналогично будут состоять из двух участков, имеющих существенно различный наклон (см. рис. 2, б, вставка). Можно заключить, что характер зависимости, представленной в работе [27], связан с особенностями не красителя, а представления экспериментальных данных, а значит, представления об образовании красителем мицелл в водном растворе и при связывании с амилоидными фибриллами необоснованны.

Кроме того, несостоятельность предложенных гипотез подтверждается тем фактом, что коротковолновый спектр возбуждения флуоресценции в воде не совпадает с длинноволновой полосой спектра поглощения красителя, как это должно быть, а сдвинут относительно длинноволновой полосы поглощения в коротковолновую область так, что максимум спектра возбуждения приходится на минимум в спектре поглощения. При возбуждении в области длинноволновой полосы поглощения в воде флуоресцирует в той же спектральной области, что и №Т, инкорпорированный в амилоидные фибриллы. Спектры флуоресценции свободного и связанного с амилоидными фибриллами красителя в воде сами по себе и в составе амилоидных фибрилл сдвинуты в длинноволновую сторону относительно длинноволновой полосы поглощения, как это и должно быть. Таким образом, необходимо дать специальное объяснение не флуоресцентным свойствам в фибриллах, а существованию «коротковолновых» полос флуоресценции и возбуждения флуоресценции красителя в водном растворе.

Квантово-химические расчёты молекулы показали, что в основном состоянии энергетически выгодной является такая конфигурация молекулы №Т, при которой бензтиазольное и аминобензольное кольца красителя повёрнуты относительно друг друга на угол ф = 37° (или 145, 217, 325°). Формированию плоской структуры молекулы препятствует наличие метильной группы, связанной с атомом азота бензтиазольного кольца, что определяет существование барьера энергии при угле ф = 0° (180°). Существование энергетического барьера при угле ф = 90° (270°) связано с нарушением сопряжения между бензтиазольным и аминобензольным кольцами №Т. Энергетические барьеры, разделяющие состояния молекулы красителя, отвечающие минимумам энергии, относительно низкие, что определяет присутствие в растворе молекул с нарушенной системой п-сопряжённых связей бензтиазольного и аминобензольного колец. Увеличение размера системы п-связей, как известно, сопровождается длинноволновым сдвигом спектра. Поэтому любой изолированный фрагмент должен иметь более коротковолновое положение спектров поглощения и флуоресценции по сравнению с целой молекулой №Т. Таким образом, появление коротковолновых спектров возбуждения флуоресценции и спектров флуоресценции может быть обусловлено существованием в основном состоянии фракции молекул с углами ф, близкими

к 90° (270°). Коротковолновую флуоресценцию можно зарегистрировать только в растворах с низкой вязкостью, когда интенсивность длинноволновой флуоресценции низка. При встраивании в амилоидные фибриллы происходит существенное увеличение квантового выхода длинноволновой флуоресценции, на фоне которой коротковолновая флуоресценция становится незаметной.

Для объяснения существенного увеличения квантового выхода флуоресценции красителя при встраивании в амилоидные фибриллы были изучены флуоресцентные

свойства ThT в водно-глицериновых смесях. Измерена зависимость квантового выхода флуоресценции ThT (q) от вязкости (п) и температуры (T) растворителя. Содержание глицерина в водно-глицериновых смесях изменяли от 13 до 99 %, а температуру растворов — от 3 до 50 °C. Экспериментальные данные в координатах (1/q — 1) от T/п представляют собой прямую (рис. 2, в), пересекающую ось ординат в точке ~ 2,6 (см. рис. 2, в, вставка). Полученные результаты свидетельствуют о том, что нагревание раствора или уменьшение его вязкости (увеличение соотношения вода/глицерин) сопровождаются существенным уменьшением квантового выхода флуоресценции ThT. Это означает, что существует процесс дезактивации возбуждённого состояния молекулы ThT, константа которого зависит от температуры и вязкости растворителя. Мы полагаем, что причиной этого процесса является переход молекулы в возбуждённом состоянии к конформации с углами ф, близкими к 90° (270°), при котором уменьшается сопряжение я-электронной системы бензтиазольного и аминобензольного колец молекулы ThT. Таким образом, существенное увеличение квантового выхода флуоресценции красителя при его встраивании в амилоидные фибриллы обусловлено ограничением подвижности бензтиазольного и аминобензольного колец относительно друг друга. Наряду с этим существует, по крайней мере, ещё одна причина безызлучательной дезактивации возбуждённого состояния ThT, приводящая к тому, что даже в условиях твёрдого раствора, не допускающего существование крутильных колебаний колец относительно друг друга, квантовый выход этого красителя существенно меньше единицы. С нашей точки зрения, причиной этого может быть неплоскостность молекулы ThT в основном состоянии, обусловленная наличием массивной метильной группы, связанной с атомом азота бензтиазольного кольца.

Основываясь на вышесказанном, можем заключить, что гипотезы об образовании димеров, эксимеров и мицелл ThT при его встраивании в амилоидные фибриллы необоснованны. Наиболее убедительной, с нашей точки зрения, является модель, согласно которой ThT связывается с амилоидными фибриллами в мономерной форме. Краситель встраивается в «бороздки», образованные боковыми цепями аминокислотных остатков, ориентированные вдоль оси волокна амилоидных фибрилл перпендикулярно ß-листам. Если сопоставить ширину «бороздок» (6,7± 0,2 А) и ширину молекулы ThT (4,3 ± 0,1 А.), можно заметить, что боковые цепи ß-листов и краситель находятся в непосредственной близости, которая обусловливает возможность их стерических взаимодействий. Эти взаимодействия могут влиять на конформацию молекулы красителя в основном и возбуждённом состоянии и, следовательно, на его квантовый выход флуоресценции. Поскольку длина молекулы ThT составляет 15,2 ± 0,1 А, а ширина ß-листа ~ 4,7 А, то для встраивания красителя необходимы по крайней мере 4 ß-ли-ста. Таким образом, данная модель позволяет объяснить, почему ThT избирательно взаимодействует только с амилоидными фибриллами, обогащёнными ß-складчатыми структурами.

Методика определения параметров связывания ThT с амилоидными фибриллами. В литературе можно найти около десятка работ, в которых предпринимались попытки определения констант диссоциации и стехиометрии, характеризующих связывание ThT с амилоидными фибриллами (см., например, [29]). Все существующие данные об этих параметрах связывания (кроме данных, полученных в статье [30]) основываются исключительно на измерениях зависимостей интенсивности флуоресценции ThT от его концентрации в растворах, содержащих амилоидные фибриллы. Во всех этих работах авторы допустили одну и ту же ошибку — для определения констант связывания и числа мест связывания они использовали суммарную концентрацию ThT,

1,6

ч и 1,2

X

ё 0,8

3 0,4

0,0

2 ^ О 0,2 2

0,0 0,2

0,2 \ и

2,6 2,7 я

4 н ° 0,1

- =—;-г 0,0

350 400

450

Я, нм

500 550

Рис. 3. Спектры поглощения ТЬТ, инкорпорированного в фибриллы, полученные на основе лизоцима:

а — спектр поглощения свободного ТЬТ (1), наложение спектров поглощения свободного, связанного с фибриллами ТЬТ и светорассеяния (2), оптическая плотность, которая определяется светорассеянием (3), спектр поглощения свободного и связанного с фибриллами красителя после исключения вклада светорассеяния (4); на вставке проиллюстрирована процедура вычитания светорассеяния; б — спектр поглощения связанного с фибриллами красителя (1) и спектр поглощения свободного красителя в концентрации, равной концентрации связанного красителя (2)

а не концентрацию свободного, не связанного с фибриллами, красителя. Использование флуоресцентного метода в принципе позволяет определить лишь зависимость интенсивности флуоресценции связанного с фибриллами от общей концентрации красителя в растворе. Кроме того, авторы работ, приведённых в обзоре [29], основывались на предположении, что измеренная интенсивность флуоресценции всегда пропорциональна концентрации связанного с фибриллами красителя и что максимум интенсивности флуоресценции достигается, когда все сайты связывания заняты. На самом деле интенсивность флуоресценции отнюдь не линейно связана с концентрацией флуоресцирующего вещества. Поэтому данные, полученные с использованием флуоресцентного метода, должны быть пересмотрены.

Для определения параметров связывания с амилоидными фибриллами мы

предлагаем подход, основанный на использовании метода абсорбционной спектрофо-тометрии растворов, полученных с помощью метода равновесного микродиализа. Приспособление для равновесного микродиализа представляет единую тефлоновую конструкцию, в которой две камеры равного объёма разделены мембраной, проницаемой для и непроницаемой для фибрилл. В камеру № 1 помещался раствор красителя с концентрацией (Со), в камеру № 2 — амилоидные фибриллы в том же растворителе. Фибриллы на основе лизоцима получали путём инкубирования лизоцима (2 мг/мл) в 0,05М буфере КН2Р04—^0Н в присутствии 3М GdnHCl (рН = 6,3) при температуре 50 °С и интенсивном перемешивании в течение 24 ч [31]. Содержание амилоидных фибрилл в камере № 2 можно охарактеризовать концентрацией раствора белка, используемого для получения фибрилл, с учётом последующего разведения (Ср). Спектр поглощения раствора в камере № 1 после достижения равновесия представлял собой спектр поглощения свободного №Т, а спектр поглощения раствора в камере № 2 — суммарный спектр поглощения свободного и связанного с фибриллами красителя на фоне «кажущегося поглощения», обусловленного светорассеянием фибрилл (рис. 3, а). Учёт влияния светорассеяния проводился с помощью стандартной процедуры [32].

Предлагаемый нами подход позволил впервые определить спектр поглощения №Т, инкорпорированного в фибриллы на основе лизоцима (рис. 3, б). Полученные данные свидетельствуют о том, что встраивание красителя в фибриллы сопровождается

Рис. 4- Зависимость Скетчарда, характеризующая связывание ТЬТ с амилоидными фибриллами на основе лизоцима

длинноволновым сдвигом спектра поглощения и возрастанием коэффициента молярной экстинкции. Коротковолновое положение спектра поглощения свободного в водном растворе является проявлением существенного ориентационного диполь-дипольного взаимодействия молекул красителя с молекулами полярного растворителя в основном состоянии.

Для каждого эксперимента по микродиализу были определены концентрации свободного (Cf) и связанного с фибриллами (Сь) красителя. Зависимость Скетчарда, построенная с использованием экспериментальных данных, даёт наглядное представление о количестве мод связывания красителя с фибриллами (рис. 4). Нелинейность полученной зависимости свидетельствует о существовании двух или более мод связывания (г) с различными значениями констант связывания (Кы) и числом мест связывания (щ) (в то время как её линейность могла бы свидетельствовать об идентичности центров связывания и существовании одной моды). Величины констант связывания и числа мест связывания, адекватно описывающие экспериментальные данные, были определены в предположении существования двух мод связывания методом множественной нелинейной регрессии с использованием уравнения:

Сь = £

щСрС^ Кен + С г

где К л = К—1 — константа диссоциации. Полученные значения Кы, Кь2, щ и щ приведены на рис. 4.

Заключение. Результаты нашей работы способствуют формированию правильных представлений о спектральных свойствах и характеристиках флуоресцентного красителя №Т. Кроме того, разработка специальной методики, позволяющей получать информацию о параметрах связывания с амилоидными фибриллами, а также о спектральных свойствах и характеристиках связанного красителя, является важным шагом на пути изучения и сравнения структуры амилоидных фибрилл. Исследование структуры белков в состоянии амилоидных фибрилл может дать важнейшую информацию для выяснения факторов, способствующих их образованию. Поскольку фибриллярное состояние белков является, по-видимому, одним из основных термодинамически стабильных состояний белковой молекулы, проведённые исследования способствуют пониманию фундаментальных основ фолдинга белков.

Изучение взаимодействия с амилоидными фибриллами может рассматриваться как перспективный подход для создания биосенсорных систем для ранней диагностики

заболеваний, проявлением которых являются различного рода амилоидозы. Разработка методов раннего выявления таких заболеваний является чрезвычайно актуальной задачей, поскольку в настоящее время диагноз удаётся поставить, когда течение заболевания уже необратимо. Нужно заметить, что предлагаемый подход универсален — он может быть использован для нейтральных аналогов ThT, которые могут проникать через гематоэнцефалический барьер, что может найти свое применение в диагностике и терапии нейродегенеративных заболеваний. Кроме того, этот метод может быть использован для анализа взаимодействия химических веществ (в том числе нефлуорес-цирующих), которые способны подавлять процесс образования амилоидных фибрилл. Таким образом, полученные результаты имеют существенное практическое значение для медицины.

Литература

1. Harper J. D., Lieber C. M., Lansbury P. T. Jr. Atomic force microscopic imaging of seeded fibril formation and fibril branching by the Alzheimer's disease amyloid-beta protein // Chem. Biol. 1997. Vol. 4. P. 951-959.

2. Kelly J. W. Amyloid fibril formation and protein misassembly: a structural quest for insights into amyloid and prion diseases // Structure. 1997. Vol. 5. P. 595-600.

3. Carrell R. W., GooptuB. Conformational changes and disease-serpins, prions and Alzheimer's // Curr. Opin. Struct. Biol. 1998. Vol. 8. P. 799-809.

4. Hashimoto M., Masliah E. Alpha-synuclein in Lewy body disease and Alzheimer's disease // Brain Pathol. 1999. Vol. 9. P. 707-720.

5. Koo E. H., Lansbury P. T. Jr., Kelly J. W. Amyloid diseases: abnormal protein aggregation in neurodegeneration // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1999. Vol. 96. P. 9989-9990.

6. Uversky V. N., TalapatraA., Gillespie J. R., Fink A. L. Protein deposits as the molecular basis of amyloidosis. Part I. Systemic amyloidoses // Med. Sci. Monitor. 1999. Vol. 5. P. 1001-1012.

7. Uversky V. N., TalapatraA., Gillespie J. R., Fink A. L. Protein deposits as the molecular basis of amyloidosis. II. Localized amyloidosis and neurodegenerative disorders // Med. Sci. Monitor. 1999. Vol. 5. P. 1238-1254.

8. Jahn T. R., Radford S. E. The Yin and Yang of protein folding // FEBS J. 2005. Vol. 272. P. 5962-5970.

9. Dobson C. M. Protein misfolding, evolution and disease // Trends Biochem. Sci. 1999. Vol. 24. P. 329-332.

10. Uversky V. N., Fink A. L. Conformational constraints for amyloid fibrillation: the importance of being unfolded // Biochim. Biophys. Acta 2004. Vol. 1698. P. 131-153.

11. ChitiF., DobsonC. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease // Annu. Rev. Biochem. 2006. Vol. 75. P. 333-366.

12. FandrichM., Fletcher M. A., Dobson C. M. Amyloid fibrils from muscle myoglobin // Nature. 2001. Vol. 410. P. 165-166.

13. Pertinhez T. A., Bouchard M., Tomlinson E. J. et al. Amyloid fibril formation by a helical cytochrome // FEBS Lett. 2001. Vol. 495. P. 184-186.

14. Dobson C. M. Protein folding and misfolding // Nature. 2003. Vol. 426. P. 884-890.

15. Dobson C. M. Experimental investigation of protein folding and misfolding // Methods. 2004. Vol. 34. P. 4-14.

16. MakinO.S., Serpell L. C. Structures for amyloid fibrils // FEBS J. 2005. Vol. 272. P. 5950-5961.

17. Nelson R., Eisenberg D. Recent atomic models of amyloid fibril structure // Curr. Opin. Struct. Biol. 2006. Vol. 16. P. 260-265.

18. NaikiH., Higuchi K., Hosokawa M., Takeda T. Fluorometric determination of amyloid fibrils in vitro using the fluorescent dye, thioflavin T1 // Anal. Biochem. 1989. Vol. 177. P. 244-249.

19. NaikiH., HiguchiK., Matsushima K. et al. Fluorometric examination of tissue amyloid fibrils in murine senile amyloidosis: use of the fluorescent indicator, thioflavine T // Lab. Invest. 1990. Vol. 62. P. 768-773.

20. LeVineH. 3rd. Thioflavine T interaction with synthetic Alzheimer's disease beta-amyloid peptides: detection of amyloid aggregation in solution // Protein Sci. 1993. Vol. 2. P. 404-410.

21. LeVineH. 3rd. Soluble multimeric Alzheimer beta(1-40) pre-amyloid complexes in dilute solution // Neurobiol. Aging. 1995. Vol. 16. P. 755-764.

22. LeVineH. 3rd. Thioflavine T interaction with amyloid-sheet structures // Amyloid: Int. J. Exp. Clin. Invest. 1995. Vol. 2. P. 1-6.

23. LeVineH. 3rd. Stopped-flow kinetics reveal multiple phases of thioflavin T binding to Alzheimer beta (1-40) amyloid fibrils // Arch. Biochem. Biophys. 1997. Vol. 342. P. 306-316.

24. LeVineH. 3rd. Quantification of beta-sheet amyloid fibril structures with thioflavin T // Methods Enzymol. 1999. Vol. 309. P. 274-284.

25. Groenning M, OlsenL., van de Weert M. et al. Study on the binding of Thioflavin T to beta-sheet-rich and non-beta-sheet cavities //J. Struct. Biol. 2007. Vol. 158. P. 358-369.

26. Raj C. R., Ramaraj R. R. g-Cyclodextrin inducted intermolecular eximer formation of thioflavin T // Chem. Phys. Letters. 1997. Vol. 273. P. 285-290.

27. KhuranaR., Coleman C., lonescu-Zanetti C. Mechanism of thioflavin T binding to amyloid fibrils // J. Struct. Biol. 2005. Vol. 151. P. 229-238.

28. Sulatskaya A. I., Maskevich A. A., Kuznetsova I. M. et al. Fluorescence quantum yield of thioflavin T in rigid isotropic solution and incorporated into amyloid fibrils // PLoS ONE. 2010. Vol. 5. Iss. 10. P. e15385-1-e15385-7.

29. Groenning M. Binding mode of Thioflavin T and other molecular probes in the context of amyloid fibrils-current status //J. Chem. Biol. 2009.

30. Groenning M., NorrmanM., FlinkJ. M. et al. Binding mode of Thioflavin T in insulin amyloid fibrils // J. Struct. Biol. 2007. Vol. 159. P. 483-497.

31. Vernaglia B. A., Huang J., Clark E. D. Guanidine hydrochloride can induce amyloid fibril formation from hen egg-white lysozyme // Biomacromolecules. 2004. Vol. 5. P. 1362-1370.

32. Владимиров Ю. А., Литвин Ф. Ф. Фотобиология и спектральные методы исследования. М., 1964.

Статья поступила в редакцию 28 июня 2011 г.

Олеся В. Степаненко, Ольга В. Степаненко, И. М. Кузнецова, В. В. Верхуша, К. К. Туроверов

СТРУКТУРНЫЕ ПЕРЕХОДЫ ЗЕЛЁНОГО ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО БЕЛКА (sfGFP) ПОД ДЕЙСТВИЕМ ГУАНИДИНТИОЦИАНАТА*

Введение. Флуоресцентные белки (FPs) и их улучшенные мутантные формы с чрезвычайно разнообразными спектральными свойствами нашли широкое применение в клеточной биологии в качестве биологических маркеров [1—4]. Флуоресцентные белки значительно облегчили изучение генной активации, локализации и динамики белков, отдельных органелл и целых клеток [5, 6]. На основе FPs созданы многочисленные биосенсоры, чувствительные к изменению среды (рН, окислительно-восстановительный потенциал, концентрация ионов) [7—11]. Конструкции на основе FPs и явления безызлу-чательного переноса энергии позволяют изучать белок-белковое взаимодействие [1, 12]. Фотоактивируемые флуоресцентные белки, чьи спектральные свойства изменяются при облучении светом, обеспечивают изображения биологических объектов с разрешением, превосходящим дифракционный предел [3]. Недавно созданные FPs, спектры флуоресценции которых простираются в дальнекрасную и инфракрасную область, и FPs, характеризующиеся большим стоксовым сдвигом, позволяют осуществлять прижизненную визуализацию биологических процессов [13, 14].

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Уникальной особенностью всех FPs является их способность формировать хромофор из собственных аминокислот в положении 65-67 без участия каких-либо кофакторов или ферментов [15]. Жёсткая структура ß-бочонка, окружающего хромофор, выполняет многочисленные функции [2, 16]. Синтез хромофора FPs происходит лишь после того, как сформирована нативная пространственная структура вокруг хромофор-образующих аминокислот и правильным образом расположены аминокислоты, катализирующие и направляющие синтез хромофора. Огромное разнообразие спектральных свойств FPs определяется не только химическим различием структур хромофора, но и его взаимодействием с аминокислотами микроокружения. Структура ß-бочонка защищает хромофор от воздействия среды и ограничивает подвижность хромофора, предотвращая его безызлучательную дезактивацию.

Следует заметить, что исследование сворачивания-разворачивания большинства FPs осложняется необратимостью процессов денатурации из-за агрегации белка. Белок sfGFP (super folder GFP) не агрегирует при денатурации и способен к рефолдингу [17]. Процессы разворачивания-сворачивания sfGFP под действием химического дена-туранта изучались с использованием ряда физико-химических методов: абсорбционной спектроскопии, собственной флуоресценции, флуоресценции зелёного хромофора и гель-хроматографии.

Материал и методика. Плазмида pET-28a (+)-sfGFP, кодирующая ген зелёного флуоресцентного белка sfGFP [17], была сконструирована согласно описанной ранее методике [18]. Плазмиду использовали для трансфекции клеток Escherichia coli BL21 (DE3) (Invitrogen, США). Экспрессию sfGFP в Escherichia coli индуцировали 0,5 мМ IPTG (Fluka, Швейцария). Наращивание клеточной массы проводили в течение

* Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (контракт 02.740,11.5141) и гранта Президента РФ (MK-1181.2010.4).

24 ч при 25 °С. Белок очищали с помощью Ni-агарозы (GE Healthcare, Швеция). Чистота образцов обеспечивалась при помощи SDS-электрофореза. Молекулярную массу выделенных белков контролировали с помощью SDS-электрофореза, используя набор стандартных белков (GE Healthcare, Швеция) в качестве маркеров. Препараты гуа-нидинтиоционата (GTC) (Fluka, Швейцария) применяли без дополнительной очистки. Концентрация белка составляла 0,15 мг/мл. Измерения проводили в буферном растворе 50 мМ TrisHCl pH = 8,0.

Спектры поглощения регистрировали с использованием спектрофотометра EPS-3T (Hitachi, Япония). Измерения выполняли в микрокюветах (101,016-QS 5x5 мм2; Hellma, Германия) при комнатной температуре.

Флуоресцентные измерения выполнены с использованием спектрофлуориметра "Cary Eclipse" (Varian, Австралия) и спектрофлуориметра собственного изготовления для определения анизотропии флуоресценции [19]. Триптофановую флуоресценцию регистрировали при возбуждении светом с длиной волны 297 нм. Флуоресценцию хромофора sfGFP возбуждали при длине волны 365 и 470 нм и регистрировали при 510 нм. Для характеристики положения и формы спектров флуоресценции использовали параметр A = I320/I365 (I320 и /зб5 — интенсивности флуоресценции при длине волны регистрации 320 и 365 нм соответственно; см. [21]). Спектры флуоресценции и параметр A корректировали на спектральную чувствительность установки. Анизотропию флуоресценции определяли, используя соотношение r = (Iy — GIy )/(Iy + 2GIy ), где Iy и Iff — вертикальная и горизонтальная компоненты интенсивности флуоресценции, возбуждаемой вертикально поляризованным светом; G — коэффициент, характеризующий различие чувствительности установки к вертикально и горизонтально поляризованному свету: G = Iy/1H, Арег. = 365 нм. Кинетические эксперименты проведены с использованием микрокювет (FLR 10 x 10 мм2; Varian, Австралия), перевод белка в растворы различной концентрации GTC и GdnHCl выполнялся путём ручного смешивания раствора белка высокой концентрации с буфером, содержащим необходимую концентрацию денатуранта. «Мёртвое время» для подобного рода экспериментов не превышает 4 с [21]. Зависимости различных флуоресцентных характеристик sfGFP от концентрации GTC измеряли после инкубации белка в растворах GTC соответствующей концентрации при 23 °С в течение 2, 24, 45, 69, 95 ч.

Гель-хроматография sfGFP при денатурации под действием GTC выполнена на колонке Superdex75 PC 3.2/30 (GE Healthcare, Швеция) с использованием системы AKTApurifier (GE Healthcare, Швеция). Белок перед измерением инкубировали в присутствии соответствующей концентрации GTC в течение 24 ч. Колонку уравновешивали буфером, содержащим GTC в той же концентрации. Гидродинамические размеры sfGFP оценивали по изменению положения пика элюции. В области перехода определяли значение объёма элюции, усреднённое по всем существующим конформациям белка: V = fKVK + fMKVMK, где VK и VMK — объём элюции компактных и денатурированных молекул; fK и fмк — доли компактных и денатурированных молекул, рассчитанные на основании площадей под пиками элюции соответствующих состояний белка.

Результаты. Квазиравновесные зависимости различных характеристик триптофа-новой флуоресценции (интенсивности флуоресценции при фиксированной длине волны регистрации, параметра A = I320/I365 и анизотропии флуоресценции; Хвозб. = 297 нм) и интенсивности флуоресценции зелёного хромофора sfGFP при двух значениях длины волны возбуждения (365 и 470 нм; Арег. = 510 нм) от концентрации гуанидинтиоциана-та (GTC), измеренные после инкубации нативного белка в растворе денатурирующего агента соответствующей концентрации в течение от 1 ч до 94 ч, представлены на

я &

С

I

чо

1,0

0,8

н 0,6 о

0,4 0,2

4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0

2,1 1,8 1,5 1,2 0,9 0,6 0,3

0,21 0,18

-

0,15 «

к =

о £

о

0,12 0,09 0,06 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0

2 I

0 4

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 ^ТС], М [GTC], М

Рис. 1. Структурные переходы sfGFP под действием GTC: регистрируемые характеристики: интенсивность флуоресценции при длине волн регистрации 320 нм (а) и 365 нм (б), параметр А = 1з2о/1зб5 (в), анизотропия флуоресценции при длине волн возбуждения и регистрации 297 и 365 нм (г), интенсивность флуоресценции хромофора при длине волны регистрации 510 нм и длине волн возбуждения 365 нм (д) и 470 нм (е); кружки и квадраты соответствуют процессам денатурации и ренатурации; измерения были выполнены через 1 ч (закрытые символы) и 24 ч (открытые символы) инкубации белка в присутствии заданной концентрации денатуранта; при денатурации sfGFP измерения также выполнены через 45 ч (треугольники), 69 ч (перевёрнутые треугольники) и 94 ч (крестики) инкубации белка в присутствии заданной концентрации денатуранта

г

рис. 1. Квазиравновесие устанавливается при инкубации белка в растворах GTC в течение 24 ч, тогда как в растворах гуанидингидрохлорида ^^НС1) для этого требуется несколько дней [22, 23]. При дальнейшем увеличении времени инкубации белка в присутствии GTC значения регистрируемых параметров остаются постоянными, по крайней мере, в течение 4 сут.

На кривой 1з20 от концентрации GTC, измеренной после 24 ч инкубации sfGFP в растворах денатуранта, можно выделить две подобласти, в которых изменения данного параметра существенно различаются. При небольших концентрациях денатурирующего агента (до 0,1-0,2М GTC) с ростом концентрации GTC наблюдается резкое уменьшение 1з20. Дальнейшее изменение /320 в области концентраций более 0,9-1,0М GTC (рис. 1, а) имеет сигмоидальный характер. На денатурационных кривых интенсивности

ь о

¡0,15

л 0,20 н

0,00

0,25

Рис. 2. Изменение спектров поглощения

sfGFP в видимой области при денатурации под действием GTC: стрелками показано направление изменения двух пиков поглощения при увеличении концентрации дена-туранта; вставка — зависимости изменения интенсивности поглощения при 390 нм (квадраты) и 490 нм (кружки) от концентрации GTC

300 350 400 450 500 550

Длина волны, нм

триптофановой флуоресценции /365 и интенсивности флуоресценции зелёного хромофора, измеренной при возбуждении светом с длиной волны 365 (/365) и 470 нм (/510), также наблюдаются первоначальный резкий спад и последующее сигмоидальное изменение регистрируемого параметра.

Зависимости параметра А и анизотропии флуоресценции sfGFP от концентрации GTC, измеренные при денатурации белка, имеют сигмоидальный характер. Значения этих параметров изменяются лишь незначительно с ростом концентрации GTC до 1,0М. Дальнейшее увеличение концентрации денатурирующего агента приводит к уменьшению значения обоих параметров белка до значений, характерных для полностью развёрнутого белка.

Процесс ренатурации sfGFP был охарактеризован путём измерения стационарных зависимостей различных характеристик триптофановой флуоресценции и флуоресценции хромофора через 24 ч после перевода белка из 2,2М GTC в раствор с меньшим содержанием денатурирующего агента. Показано, что при переводе денатурированного sfGFP в растворы с небольшой концентрацией GTC (0,22М GTC) наблюдается восстановление всех регистрируемых параметров белка до уровня, характерного для нативного белка. В области 0,5-0,8М GTC на кривых параметра А и анизотропии флуоресценции, измеренных при ренатурации sfGFP из полностью развёрнутого состояния, наблюдается плато. Кроме того, наблюдается гистерезис кривых, измеренных при денатурации и ренатурации sfGFP.

На рис. 2 представлены спектры поглощения sfGFP, измеренные через 24 ч после перевода белка в раствор GTC соответствующей концентрации. Спектр поглощения нативного sfGFP имеет выраженную полосу в ближней УФ-области спектра, обусловленную поглощением ароматических остатков белка, и полосу поглощения в видимой области спектра с максимумом при 485 нм и плечом при 390 нм, обусловленную поглощением хромофора в анионной и нейтральной форме соответственно. Увеличение концентрации GTC в растворах белка приводит к существенному изменению полосы поглощения в видимой области sfGFP. Под действием небольших концентраций денатурирующего агента (примерно до 0,2М GTC) происходит резкое уменьшение интенсивности пика поглощения с максимумом при 485 нм и одновременное значительное

0,5 1,0 1,5 ^ТС], М

1,0 1,5 ^ТС], М

Рис. 3. Квазиравновесные зависимости интенсивности флуоресценции хромофора sfGFP при возбуждении в области поглощения нейтральной (а) и анионной (б) форм хромофора: интенсивность флуоресценции скорректирована с учётом изменения оптической плотности

хромофора в нейтральной и анионной форме в присутствии денатурирующего агента соответствующей концентрации; длина волны регистрации — 510 нм; кружки и квадраты соответствуют процессам денатурации и ренатурации

увеличение интенсивности пика поглощения с максимумом при 390 нм (см. рис. 2, вставка) . Дальнейшее изменение интенсивности обоих пиков можно описать сигмоидальной зависимостью. При переводе белка в раствор, содержащий GTC в концентрации более 1,3М, также наблюдается коротковолновый сдвиг пика поглощения при 485 нм.

Следует учитывать, что изменение интенсивности пиков поглощения хромофора sfGFP под действием GTC оказывает влияние на вид зависимости интенсивности флуоресценции хромофора при возбуждении на длине волны 365 и 470 нм от концентрации денатурирующего агента. Поэтому эти зависимости были скорректированы с учётом изменения оптической плотности хромофора в нейтральной и анионной форме в присутствии денатурирующего агента соответствующей концентрации (рис. 3). Представленные в таком виде зависимости интенсивности зелёной флуоресценции отражают изменение квантового выхода флуоресценции хромофора при денатурации белка. В области небольших концентраций GTC характер изменения приведённой интенсивности флуоресценции хромофора sfGFP при двух значениях длины волн возбуждения различается. При возбуждении светом с длиной волны 365 нм интенсивность флуоресценции зелёного хромофора существенно уменьшается (до 13 % от интенсивности нативного белка), тогда как при длине волны возбуждения 470 нм интенсивность флуоресценции хромофора увеличивается только на 20 % по сравнению с интенсивностью нативного белка.

Использование метода гельфильтрации, дающего информацию об изменении формы белка, позволило более полно охарактеризовать процессы денатурации sfGFP под действием GTC. Полученные с использованием колонки 8иреМех75 РС 3.2/30 профили элюции sfGFP представлены на вставке рис. 4. Нативный белок сходит с колонки одним пиком. При умеренных концентрациях GTC (вплоть до 1,0М GTC) в профилях элюции sfGFP наблюдается единственный пик, отвечающий компактным молекулам. Положение этого пика практически совпадает с положением пика элюции нативного белка. При концентрации денатурирующего агента более 1,0М появляется второй пик, отвечающий состоянию белка с менее компактной структурой. Интенсивность второго пика увеличивается с ростом концентрации GTC и при достижении концентрации порядка 2,0М GTC в профиле элюции белка остаётся только второй пик, отвечающий

о А 2,0М

) \ж 1,7М

¡\]\\ 1,5М ^/а 1,зм

1,0М

0,5М

0,2М

0,1м

0,05М

0,02М

0М

15 20 25 з0 з5 Время элюции, мин

0,9 -"-I-1-1-1-1-Г"1

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

^ТС], М

Рис. 4- Изменение формы sfGFP при денатурации под действием GTC: зависимости изменения положения пиков, отвечающих компактным (кружки) и денатурированным (квадраты) молекулам и усреднённого по всем конформациям белка объёма элюции (треугольники); данные получены в результате анализа профилей элюции sfGFP (вставка); данные получены с использованием колонки Superdex75 PC 3.2/30; растворы нативного sfGFP предварительно инкубировали в присутствии GTC соответствующей концентрации (цифры возле кривых) в течение 24 ч; приготовленный таким образом образец (10 мкл) загружали на колонку, уравновешенную в буфере, содержащем такую же концентрацию денатурирующего агента; скорость элюции

составляла 0,05 мл/мин

менее компактному состоянию белка. Показано, что зависимость объёма элюции от концентрации GTC имеет локальный минимум при 0,1М GTC. На основании представленных данных рассчитаны значения усреднённого объёма элюции sfGFP, характеризующего гидродинамические размеры молекулы, усреднённые по всем конформациям белка. Зависимость усреднённого объёма элюции sfGFP от концентрации GTC имеет сигмоидальный вид (см. рис. 4). Переход от более компактных к менее компактным молекулам происходит в области концентраций денатурирующего агента 1,0-2М GTC.

Обсуждение. Характер денатурационных кривых различных параметров трип-тофановой флуоресценции, флуоресценции хромофора, пиков поглощения хромофора в анионной и нейтральной формах и усреднённого объёма элюции sfGFP позволяет выделить две подобласти концентраций GTC (менее 0,1-0,2М и более 0,9-1,0М), в которых влияние данного денатурирующего агента на структуру sfGFP существенно различается. Очевидно, что в области концентраций выше 0,9-1,0М GTC происходит разрушение нативной глобулярной структуры белка, которое сопровождается синхронным изменением всех регистрируемых характеристик sfGFP: интенсивности триптофановой флуоресценции, параметра А, анизотропии флуоресценции, интенсивности флуоресценции

зелёного хромофора и гидродинамических размеров белка. Измерения спектров поглощения sfGFP в видимой области, наблюдаемые при инкубации белка в присутствии больших концентраций GTC, также согласуются с разрушением структуры белка. Действительно, коротковолновый сдвиг спектра поглощения анионной формы хромофора зелёных флуоресцентных белков связывают с дестабилизацией возбуждённого состояния анионного хромофора при денатурации белка [24, 25].

Процесс денатурации sfGFP является обратимым, при уменьшении концентрации денатуранта наблюдается восстановление всех регистрируемых параметров белка до уровня, характерного для нативного белка. Предполагается, что гистерезис денатура-ционных кривых, измеренных при денатурации и ренатурации зелёного флуоресцентного белка, связан с наличием зрелого хромофора в денатурированном белке и необходимостью упаковки в-бочонка вокруг него [34]. Действительно, для мутантных форм зелёного флуоресцентного белка, в которых хромофор не образуется, явление гистерезиса не наблюдается. Особенностью процесса ренатурации sfGFP является также наличие плато в области 0,5-0,8М GTC на кривых параметра А и анизотропии флуоресценции. При этом интенсивность флуоресценции хромофора sfGFP в этой области концентраций денатурирующего агента, измеренная при ренатурации белка, совпадает со значением этого параметра, измеренным при денатурации белка. Методом молеку-лярно динамической симуляции недавно было показано, что образование практически полностью сформированного в-бочонка вокруг хромофора при ренатурации происходит быстро, весь процесс лимитируется поиском необходимой конформации хромофора [35]. И на последних этапах происходит доупаковка некоторых участков в-ветвей и аминокислотных остатков, расположенных в «верхней» крышке в-бочонка [35, 36]. Следует заметить, что Тгр 57 расположен как раз рядом с такими участками в-ветвей. Вероятно, что при ренатурации sfGFP происходит накопление состояний белка, в которых некоторые участки полипептидной цепи вокруг Тгр 57 не структурированы, в то время как структура вокруг хромофора в основном сформирована.

В области концентраций GTC до 0,1-0,2М наблюдается несколько эффектов: резкое уменьшение таких параметров, как интенсивность триптофановой флуоресценции и флуоресценции зелёного хромофора, существенное изменение соотношения интен-сивностей пиков поглощения анионной и нейтральной форм хромофора sfGFP, что свидетельствует о сдвиге равновесия между молекулами белка, содержащими хромофор в нейтральной и анионной форме. При этом в области концентраций до 1,0М GTC наблюдается изобестическая точка между пиками, обусловленными поглощением хромофора sfGFP в анионной и нейтральной формах. Наличие изобестической точки свидетельствует о том, что денатурант в данном диапазоне концентраций не влияет на спектры поглощения анионной и нейтральной форм хромофора sfGFP, изменяется лишь соотношение этих форм. В то же время небольшие концентрации денатуран-та оказывают существенное влияние на квантовый выход флуоресценции хромофора.

Как известно, переход нейтрального хромофора в возбуждённое состояние сопровождается его депротонированием и образованием возбуждённого состояния I*, в котором анионная форма хромофора не находится в равновесии с его микроокружением. Излучение из состояния I* приводит к формированию спектра флуоресценции, сходного по форме и положению в шкале длины волны со спектром флуоресценции, зарегистрированным при возбуждении анионной формы белка, так как оба возбуждённых состояния имеют близкие уровни энергии [26]. Возможно, значительное уменьшение квантового выхода флуоресценции при возбуждении в области поглощения нейтрального хромофора связано с ингибированием переноса протона при добавлении небольших

концентраций GTC. Существенных изменений структуры sfGFP в этой области концентраций GTC не зарегистрировано, что подтверждается лишь минорными изменениями параметра A и анизотропии флуоресценции. Данные гельфильтрации свидетельствуют о незначительном разрыхлении структуры белка под действием небольших концентраций GTC (0,1—0,2М). Мы полагаем, что данные эффекты могут быть вызваны локальными изменениями структуры sfGFP.

Следует заметить, что подобное действие малых концентраций GTC на структуру зелёного флуоресцентного белка не является чем-то необычным. Ранее подобные эффекты наблюдали для ряда жёлтых флуоресцентных белков, таких как eYFP [27, 28] и E2GFP [29], в присутствии различных анионов (Cl_, галогенов, нитратов и тиосуль-фатов). В случае eYFP было показано наличие специфического сайта связывания анионов, расположенного вблизи остатка Gln69 и хромофора. Сайт связывания галогенов в белке E2GFP имеет несколько другое положение и находится непосредственно над хромофором, рядом с остатком Tyr203. Как полагают, присутствие отрицательного заряда связанного аниона вблизи хромофора белка приводит к ингибированию образования анионной формы хромофора. Возможно, что в случае sfGFP эффекты, обнаруженные в присутствии предденатурационных концентраций GTC, обусловлены также взаимодействием с белком отрицательных ионов тиоционата. С другой стороны, следует учитывать, что положительно заряженные ионы гуанидина GdnH+ могут оказывать и другое действие на белки. Ранее для ряда белков, таких как креатинкиназа, актин, карбоангидраза, одорант-связывающий белок [21, 30-33], нами было показано, что ионы гуанидина GdnH+ при взаимодействии с отрицательно заряженными карбоксильными группами глутаминовой и аспарагиновой кислот и амидными группами глутамина и ас-парагина могут приводить к снятию локальных напряжений в белке и стабилизации его структуры либо иметь агрегирующее действие на структуру белка. Поэтому необходимы дальнейшие исследования механизмов, посредством которых предденатурационные концентрации GTC оказывают влияние на структуру sfGFP.

Литература

1. Wang Y., ShyyJ. Y., ChienS. Fluorescence proteins, live-cell imaging, and mechanobiology: seeing is believing // Annu. Rev. Biomed. Eng. 2008. Vol. 10. P. 1-38.

2. Pakhomov A. A., Martynov V. I. GFP family: structural insights into spectral tuning // Chem. Biol. 2008. Vol. 15. N 8. P. 755-764.

3. WuB., Piatkevich K. D., Lionnet T. et al. Modern fluorescent proteins and imaging technologies to study gene expression, nuclear localization, and dynamics // Curr. Opin. Cell. Biol. 2011. doi:10,1016/j.ceb.2010,12.004.

4. Frommer W. B., Davidson M. W., Campbell R. E. Genetically encoded biosensors based on engineered fluorescent proteins // Chem. Soc. Rev. 2009. Vol. 38. N 10. P. 2833-2841.

5. Chudakov D. M., MatzM. V., Lukyanov S., Lukyanov K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues // Physiol. Rev. 2010. Vol. 90. N 3. P. 1103-1163.

6. Day R. N., Davidson M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging // Chem. Soc. Rev. 2009. Vol. 38. N 10. P. 2887-2921.

7. Baird G. S., Zacharias D. A., Tsien R. Y. Circular permutation and receptor insertion within green fluorescent proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1999. Vol. 96. P. 11241-11246.

8. Bizzarri R., Serresi M., LuinS., Beltram F. Green fluorescent protein based pH indicators for in vivo use: a review // Anal. Bioanal. Chem. 2009. Vol. 393. P. 1107-1122.

9. Hanson G. T., Aggeler R., Oglesbee D. et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators //J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279. P. 13044-13053.

10. Mizuno T., Murao K., Tanabe Y. et al. Metal-ion-dependent GFP emission in vivo by combining a circularly permutated green fluorescent protein with an engineered metal-ion-binding coiled-coil // J. Am. Chem. Soc. 2007. Vol. 129. P. 11378-11383.

11. SouslovaE. A., Belousov V. V., Lock J. G. et al. Single fluorescent protein-based Ca2+ sensors with increased dynamic range // BMC Biotechnol. 2007. Vol. 7. P. 37.

12. Ibraheem A., CampbellR. E. Designs and applications of fluorescent protein-based biosensors // Curr. Opin. Chem. Biol. 2010. Vol. 14. P. 30-36.

13. Shcherbo D., Shemiakina I. I., RyabovaA. V. et al. Near-infrared fluorescent proteins // Nat. Methods. 2010. Vol. 7. P. 827-829.

14. Piatkevich K. D., HulitJ., SubachO.M. et al. Monomeric red fluorescent proteins with a large Stokes shift // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2010. Vol. 107. P. 5369-5374.

15. HeimR., Prasher D. C., TsienR. Y. Wavelength mutations and posttranslational autoxida-tion of green fluorescent protein // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994. Vol. 91 P. 12501-12504.

16. Remington S. J. Fluorescent proteins: maturation, photochemistry and photophysics // Curr. Opin. Struct. Biol. 2006. Vol. 16. P. 714-721.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

17. Pedelacq J. D., Cabantous S., Tran T. et al. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein // Nat. Biotechnol. 2006. Vol. 24. P. 79-88.

18. Verkhusha V. V., OtsunaH., Awasaki T. et al. An enhanced mutant of red fluorescent protein DsRed for double labeling and developmental timer of neural fiber bundle formation //J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276. N 32. P. 29621-29624.

19. Туроверов К. К., Бикташев А. Г., Дорофеюк А. В., Кузнецова И. М. Комплекс аппаратных и программных средств для измерения спектральных, поляризационных и кинетических характеристик флуоресценции в растворе // Цитология. 1998. Т. 40. № 8/9. С. 806-817.

20. Turoverov K. K., Kuznetsova I. M. Intrinsic fluorescence of actin //J. Fluorescence. 2003. Vol. 13. P. 41-57.

21. Kuznetsova I. M., Stepanenko O. V., Stepanenko O. V. et al. The place of inactivated actin and its kinetic predecessor in actin folding-unfolding // Biochemistry. 2002. Vol. 41. P. 13127-13132.

22. Stepanenko O. V., Verkhusha V. V., Kazakov V. I. et al. Comparative studies on the structure and stability of fluorescent proteins EGFP, zFP506, mRFP1, "dimer2" and DsRed // Biochemistry. 2004. Vol. 43. N. 47. P. 14913-14923.

23. Stepanenko O. V., Kuznetsova I. M., Verkhusha V. V. et al. Denaturation of proteins with beta-barrel topology induced by guanidine hydrochloride // Spectroscopy-Biomedical Applications. 2010. Vol. 24. N 3-4. P. 367-373.

24. ZimmerM. Green fluorescent protein (GFP): applications, structure, and related photophy-sical behavior // Chem. Rev. 2002. Vol. 102. P. 759-781.

25. TsienR. Y. The green fluorescent protein // Annu. Rev. Biochem. 1998. Vol. 67. P. 509-544.

26. WeberW., Helms V., McCammon J. A., LanghoffP. W. Shedding light on the dark and weakly fluorescent states of green fluorescent proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999. Vol. 96. P. 6177-6182.

27. Wachter R. M., Remington S. J. Sensitivity of the yellow variant of green fluorescent protein to halides and nitrate // Curr. Biol. 1999. Vol. 9. N 17. P. R628-R629.

28. Seward H. E., Bagshaw C. R. The photochemistry of fluorescent proteins: implications for their biological applications // Chem. Soc. Rev. 2009. Vol. 38. N 10. P. 2842-2851.

29. ArosioD., Garau G., Ricci F. et al. Spectroscopic and structural study of proton and halide ion cooperative binding to gfp // Biophys. J. 2007. Vol. 93. N 1. P. 232-244.

30. BushmarinaN. A., Kuznetsova I. M., Biktashev A. G. et al. Partially folded conformations in the folding pathway of bovine carbonic anhydrase II: a fluorescence spectroscopic analysis // Chem.Bio.Chem. 2001. Vol. 2. P. 813-821.

31. Kuznetsova I. M., Stepanenko O. V., Turoverov K. K. et al. Unravelling multistate unfolding of rabbit muscle creatine kinase // Biochem. Biophys. Acta. 2002. Vol. 1596. P. 138-155.

32. Kuznetsova I. M., Turoverov K. K., Uversky V. N. Use of the phase diagram method to analyze the protein unfolding-refolding reactions: fishing out the "invisible" intermediates //J. Pro-teome Res. 2004. Vol. 3. P. 485-494.

33. Staiano M., D'AuriaS., Varriale A. et al. Stability and dynamics of the porcine odorant-binding protein // Biochemistry. 2007. Vol. 46. N 39. P. 11120-11127.

34. Andrews B. T., Schoenfish A. R., Roy M. et al. The rough energy landscape of superfolder GFP is linked to the chromophore //J. Mol. Biol. 2007. Vol. 373. P. 476-490.

35. Andrews B. T., Gosavi S., Finke J. M. et al. The dual-basin landscape in GFP folding // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2008. Vol. 105. N 34. P. 12283-12288.

36. Andrews B. T., Roy M., Jennings P. A. Chromophore packing leads to hysteresis in GFP // J. Mol. Biol. 2009. Vol. 392. N 1. P. 218-227.

Статья поступила в редакцию 28 июня 2011 г.

Ольга В. Степаненко, Олеся В. Степаненко, А. В. Фонин, Д. М. Щербакова, В. В. Верхуша, И. М. Кузнецова, К. К. Туроверов

D-ГАЛАКТОЗА/D-ГЛЮКОЗА-СВЯЗЫВАЮЩИЙ БЕЛОК КАК ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЙ ЭЛЕМЕНТ СОЦИАЛЬНО ЗНАЧИМОЙ БИОСЕНСОРНОЙ СИСТЕМЫ. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БЕЛКА С ГЛЮКОЗОЙ*

Введение. Диабет — широко распространённое в мире заболевание — имеет ряд очень тяжёлых последствий [1], таких как развитие слепоты, почечной недостаточности, заболеваний сердечно-сосудистой системы. Очевидно, что непрерывный мониторинг уровня глюкозы в крови человека имел бы явное преимущество перед периодическим забором крови из пальца пациента, использующимся в мировой практике в настоящее время [2]. Поэтому создание биосенсорной системы, позволяющей непрерывно отслеживать уровень сахара в крови, является чрезвычайно актуальной задачей [3, 4].

Перспективным на роль чувствительного элемента такой биосенсорной системы является D-галактоза/D-глюкоза-связывающий белок (GGBP) из Escherichia coli, поскольку при его взаимодействии с D-глюкозой наблюдаются значительные перестройки третичной структуры белка [5]. Однако константа диссоциации комплекса GGBP с сахаром очень низка (1 мкМ). Это означает, что использование GGBP дикого типа в качестве чувствительного элемента биосенсорной системы непрерывного действия для определения концентрации глюкозы в крови человека невозможно. Чтобы биосенсорная система работала непрерывно, т. е. чувствовала изменение концентрации сахара, константа диссоциации комплекса белок — глюкоза должна быть численно близка концентрации глюкозы в крови здоровых людей, которая составляет 3-8 мМ [6]. Для этих целей необходимо создавать мутантные формы GGBP с повышенной константой диссоциации комплекса белок — глюкоза, что может быть достигнуто введением мутаций в сайт связывания лиганда [7]. Свойства GGBP дикого типа позволяют использовать его в качестве чувствительного элемента биосенсорной системы на глюкозу в сочетании с трансдермальными методами экстракции сахара из крови или межклеточных и иных жидкостей, сопряжёнными с существенным разбавлением глюкозы. В частности, обратный ионтофорез обеспечивает забор пробы, в которой концентрация глюкозы в тысячу раз меньше её физиологической концентрации [8].

Необходимое качество биосенсорной системы непрерывного действия заключается в устойчивости её чувствительного элемента к различным денатурирующим воздействиям. В представляемой работе мы провели исследования устойчивости GGBP дикого типа к действию химического денатуранта гуанидингидрохлорида (GdnHCl) и нагревания в отсутствие и в присутствии глюкозы, в ходе которых было выявлено существенное влияние вязкости раствора на процессы взаимодействия белка с глюкозой.

Материалы и методы. Плазмиду pET-11d, кодирующую белок GGBP с концевой полигистидиновой меткой, использовали для трансфекции клеток Escherichia coli BL21(DE3). Экспрессию белка в Escherichia coli индуцировали 0,5 мМ IPTG (Nacalai Tesque, Япония). Клеточную массу наращивали в течение 24 ч при 37 °С. Белок

* Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (02.740,11.5141 и 16.512.11.2114), гранта Президента РФ (MK-1181.2010.4).

Ольга В. Степаненко, Олеся В. Степаненко, А. В. Фонин, Д. М. Щербакова, В. В. Верхуша, И.М.Кузнецова, К. К. Туроверов, 2011

очищали с помощью Ni-агарозы (колонки His GraviTrap, GE Healthcare, Швеция). Подробный контроль чистоты полученных белковых препаратов осуществляли с помощью SDS-электрофореза в денатурирующих условиях в 15 %-ном полиакриламидном геле согласно стандартной методике [9]. Измерения проводили в растворах 20 мМ Na-фос-фатного буфера, pH = 8,0. Эксперименты выполнены при концентрации растворов белка 0,2-0,7 мг/мл.

Препараты D-глюкозы (Sigma, США) и гуанидингидрохлорида (GdnHCl) (Nacalai Tesque, Япония) использовали без дополнительной очистки. Концентрацию GdnHCl определяли с помощью рефрактометра «Аббе» (ЛОМО, Россия). Для образования комплекса белок—лиганд в раствор белка добавляли D-глюкозу в концентрации 10 мМ. Ион кальция отщепляли в растворе 1 мМ ЭДТА (Fluka, Швейцария).

Флуоресцентные измерения выполнены с использованием спектрофлуориметра "Cary Eclipse" (Varian, Австралия) и микрокювет (10х 10 мм2; Varian, Австралия). Спектры флуоресценции измеряли при возбуждении светом с длиной волн 280 и 297 нм. Значения параметра A = I320/I365, характеризующего положение спектров флуоресценции (I320 и I365 — интенсивности флуоресценции при длине волн регистрации 320 и 365 нм соответственно; см. [10]), и спектры флуоресценции корректировали на спектральную чувствительность установки. Квазиравновесные зависимости различных флуоресцентных характеристик белков от концентрации GdnHCl измеряли в течение нескольких дней после инкубации белка в растворах GdnHCl соответствующей концентрации при 4 °С. Измерения выполнены при 23 °С. Зарегистрированные зависимости интенсивности флуоресценции анализировали с помощью метода, основанного на параметрическом представлении двух независимых экстенсивных характеристик системы [11]. Термодинамические характеристики рассчитаны согласно Нолтингу [12].

Спектры кругового дихроизма (КД) в дальней и ближней УФ-областях регистрировали на спектрополяриметре J-810 (Jasco, Япония). При работе в дальней УФ-области измерения выполнены в диапазоне 260-190 нм с шагом 0,1 нм с использованием кварцевых кювет (1 мм). При регистрации спектров в ближней УФ-области измерения проводили в диапазоне 320-250 нм с шагом 0,1 нм с использованием кварцевых кювет (10 мм). Для улучшения соотношения сигнал/шум каждый спектр регистрировали 3-5 раз и полученные данные усредняли. Спектры КД белков построены с учётом КД соответствующего буферного раствора.

Калориметрические исследования проводили на дифференциальном сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4М («Биоприбор», Пущино, Россия), как описано ранее [13]. Белок нагревали с постоянной скоростью 1 К/мин при постоянном давлении в 2,4 атм. Для проверки обратимости тепловой денатурации белка после первого сканирования и последующего охлаждения ячеек до исходной температуры образец подвергали повторному нагреванию. Базовую линию записывали, помещая в обе ячейки прибора используемый в эксперименте буферный раствор. Стабильность белков характеризовали температурой максимума теплопоглощения. При исследовании тепловой денатурации белков с помощью метода собственной УФ-флуоресценции регистрировали зависимости интенсивности триптофановой флуоресценции белка от температуры. Скорость нагрева была постоянной и составляла 1 °С/мин.

Результаты. GGBP состоит из двух глобулярных доменов, связанных шарнирной областью, образованной тремя пептидными сегментами [14]. Каждый домен имеет ядро из шести в-тяжей, окружённых с одной стороны двумя a-спиралями, а с другой — тремя. Сайт связывания лиганда расположен в глубокой щели между N- и C-концевым доменами белка. Молекула GGBP имеет в своем составе дополнительный ли-

ганд — 1 ион кальция, локализованный в петле C-концевого домена (остатки 134-142) и образующий координационную связь с атомами кислорода каждого второго остатка этой петли и остатка Glu 205. Структура кальций-связывающего сайта этого белка напоминает структуру мотива «EF-руки», распространённого во внутриклеточных кальций-связывающих белках [14, 15].

Для исследования стабильности GGBP был использован стандартный подход, заключающийся в изучении процессов сворачивания-разворачивания белка под действием GdnHCl в присутствии и в отсутствие лигандов — молекулы глюкозы и иона кальция. Равновесные зависимости различных флуоресцентных характеристик (интенсивности флуоресценции, параметра A и анизотропии флуоресценции; рис. 1, а-в) и эллиптичности при 222 нм (рис. 1, г) GGBP и комплекса GGBP с глюкозой (GGBP/Glc), а также их бескальциевых форм (GGBP-Ca и GGBP-Ca/Glc соответственно) от концентрации денатурирующего агента были измерены в процессе денатурации и ренатурации белка. Стационарные кривые денатурации и ренатурации GGBP, измеренные через 24 ч после инкубации белка в растворах с различной концентрацией GdnHCl, совпадают и имеют сигмоидальную форму. На самом деле равновесие достигается даже быстрее. Кривая денатурации GGBP/Glc, измеренная после 24-часовой инкубации комплекса в присутствии денатурирующего агента, сдвинута в сторону больших концентраций GdnHCl по отношению к равновесной кривой денатурации-ренатурации GGBP. Стационарная кривая ренатурации комплекса GGBP/Glc, зарегистрированная после 24-часовой инкубации белка в присутствии избытка глюкозы в растворах с различной концентрацией GdnHCl, не совпадает с соответствующей кривой денатурации GGBP/Glc, а расположена ближе к равновесной кривой денатурации-ренатурации GGBP (рис. 2). Совпадающие, т. е. равновесные, кривые разворачивания и сворачивания GGBP/Glc были измерены после инкубации белка в растворах денатуранта соответствующей концентрации в течение 10 дней. Равновесные зависимости денатурации-ренатурации комплекса GGBP/Glc имеют сигмоидальный вид и сдвинуты в область больших концентраций GdnHCl по отношению к соответствующей кривой, измеренной при денатурации и ренатурации GGBP. Середина перехода между белком в нативном и развёрнутом состояниях при разворачивании под действием GdnHCl для GGBP/Glc составляет 0,93 ± 0,03М GdnHCl, тогда как для GGBP значение этой величины существенно меньше: 0,36 ± 0,10М GdnHCl.

При отщеплении иона кальция значения флуоресцентных характеристик и эллиптичности при 222 нм GGBP-Ca сильно изменяются даже при небольших денатурирующих воздействиях. Таким образом, уже в области малых концентраций GdnHCl значения всех регистрируемых характеристик GGBP-Ca и GGBP значительно различаются (см. рис. 1). В присутствии молекулы связанной глюкозы отщепление иона кальция практически не влияет на положение равновесной зависимости денатурации-ренату-рации GGBP-Ca/Glc. Следует отметить, что денатурация GGBP-Ca/Glc, как и в случае GGBP/Glc, достигает равновесия через 10 дней, в то время как равновесие при ренатурации GGBP-Ca в присутствии избытка глюкозы устанавливается даже через более длительное время инкубации белка в растворах соответствующей концентрации GdnHCl.

Исследования тепловой денатурации GGBP и его комплекса GGBP/Glc, а также их бескальциевых форм GGBP-Ca и GGBP-Ca/Glc выполнено методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии и собственной УФ-флуоресценции. Кривые теплопоглощения GGBP и GGBP/Glc имеют максимум при температуре 51,3 и 64,7 °С соответственно (рис. 3, а). Зависимости интенсивности триптофановой флуоресценции

1,0 1,5 GdnHCl, M

2,0 0,0

1,0 1,5 GdnHCl, M

Рис. 1. Процессы разворачивания-сворачивания GGBP (кружки) и комплекса GGBP/Glc (квадраты), а также их бескальциевых форм GGBP-Ca (треугольники) и GGBP-Ca/Glc (ромбы) под действием GdnHCl:

а — изменение интенсивности триптофановой флуоресценции при длине волны регистрации 320 нм;

б — изменение анизотропии флуоресценции при длине волны возбуждения 297 нм, длина волны регистрации равна 365 нм; в — изменение параметра A; г — изменение эллиптичности при 222 нм; открытые символы отвечают разворачиванию белка, закрытые — сворачиванию из развёрнутого состояния

GGBP и GGBP/Glc от температуры имеют сигмоидальную форму со значениями температуры плавления, соответствующими максимумам кривых теплопоглощения этих форм белка (рис. 3, б). Отщепление иона кальция от GGBP приводит к заметному сдвигу кривой теплопоглощения в область меньших температур (данные не представлены), и температура плавления для GGBP-Ca составляет 42,7 °С. В то же время отсутствие иона кальция в структуре комплекса GGBP/Glc в меньшей степени сказывается на его устойчивости к действию нагревания, температура плавления бескальциевой формы комплекса GGBP-Ca/Glc равна 61,5 °С. Флуоресцентные характеристики GGBP и его комплекса GGBP/Glc, а также их бескальциевых форм GGBP-Ca и GGBP-Ca/Glc, такие как анизотропия флуоресценции и параметр А, после охлаждения до комнатной

1,0

0,9 0,8 е- 0,7

и

I

!°,6 0,5

0,4

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 GdnHCl, М

Рис. 2. Конформационные переходы GGBP и GGBP/Glc через разное время инкубации белка в присутствии денатурирующего раствора, зарегистрированные по изменению параметра А = 132о/1365: кривые, характеризующие разворачивание белка, измерены через 24 ч после инкубации образца в присутствии GdnHCl для GGBP (штрихпунктирная линия и открытые кружки) и через 24 ч (пунктирная линия и открытые квадраты) и 10 дней (сплошная линия и открытые кружки) после инкубации образца в присутствии GdnHCl для GGBP/Glc; данные, характеризующие ренатурацию белка из развёрнутого состояния, были измерены после инкубации образца в растворах денатуранта соответствующей концентрации через 24 ч для GGBP (штрихпунктирная линия и закрытые кружки) и через 24 ч (закрытые квадраты) и 10 дней (закрытые кружки) для GGBP/Glc; длина волны возбуждения равна 297 нм

20

^ 16 «

л -

8 12

■о <1

1,2

£ 1,0 я о

6 3

0,8

0,6

я а с

ц 0,4

I 0,2

30 40 50 60 Температура, °С

70

0,0

б

\\ \4 \

'''V \

2'-д \ \

10 20 30 40 50 60 70 Температура, °С

Рис. 3. Зависимость избыточной теплоёмкости (а) и интенсивности триптофановой флуоресценции при длине волны регистрации 365 нм (б) белка и его комплекса

с глюкозой от температуры:

линии 1 и 2 — тепловая денатурация GGBP; линии 3 и 4 — тепловая денатурация GGBP/Glc; длина волны возбуждающего света равна 297 нм; два последовательных сканирования (сплошные и пунктирные линии) показаны, чтобы охарактеризовать обратимость тепловой денатурации белка

8

4

0

температуры белков, подвергнутых тепловой денатурации, восстанавливаются до уровня, соответствующего этим белковым формам в исходном состоянии. При нагревании белка до температуры выше окончания денатурационного перехода и продолжительной инкубации белка при высокой температуре наблюдается неполное совпадение кривых плавления белка (см. рис. 3, б), а также уменьшение интенсивности триптофановой флуоресценции и сигнала КД в ближней и дальней УФ-областях белка (данные не представлены).

Обсуждение. Характер равновесных зависимостей денатурации-ренатурации GGBP и GGBP/Glc от концентрации GdnHCl свидетельствует о том, что разворачивание белка в присутствии и в отсутствие глюкозы является обратимым одностадийным процессом. Для проверки этого предположения мы использовали подход, заключающийся в параметрическом представлении равновесных зависимостей двух экстенсивных характеристик белка, используемый для обнаружения скрытых промежуточных состояний белка в процессе его разворачивания [11]. Линейный вид таких зависимостей, построенных на основании равновесных зависимостей интенсивности флуоресценции при длине волны 320 и 365 нм GGBP и GGBP/Glc от концентрации GdnHCl свидетельствует об отсутствии промежуточных состояний на пути разворачивания белка и его комплекса с глюкозой.

Совпадение стационарных зависимостей различных характеристик GGBP при денатурации и ренатурации белка после инкубации белка в присутствии денатурирующего агента менее 24 ч свидетельствует о том, что эти зависимости являются равновесными. Процесс разворачивания-сворачивания GGBP отвечает схеме

ДОВР^^ < ДОВР^^ < ДОВР^

+Са +Са к-2 (1)

ДОВР^^ 1 (GGBP-Ca)N < ^ВР)К 1 (GGBP/Glc)N

+С1с,Са к-1 +С1с,Са к-2 +О1о к-з

Высокая скорость достижения равновесия говорит о том, что связывание кальция с (GGBP-Ca)u является быстрым процессом. Очевидно, что лимитирующей стадией процесса сворачивания в данном случае является образование нативного состояния белка (рис. 4).

Процесс разворачивания-сворачивания GGBP/Glc протекает согласно схеме (1). Поскольку GGBP имеет высокую константу связывания глюкозы — порядка 1 мкМ-1 [14], мы предполагали, что образование комплекса между GGBP и глюкозой не может быть лимитирующей стадией этого процесса. Однако кривые ренатурации и денатурации комплекса GGBP/Glc после 24-часовой инкубации растворов белка в присутствии денатурирующего агента не являются равновесными, более того, кривая ренатурации GGBP/Glc практически совпадает с равновесной кривой разворачивания-сворачивания GGBP. Такая ситуация свидетельствует о том, что формирование комплекса GGBP в нативном состоянии с глюкозой является лимитирующей стадией процесса образования нативного комплекса GGBP/Glc из (GGBP)u в присутствии избытка иона кальция и глюкозы. Равновесие достигается через 10 дней инкубации растворов белка в растворах GdnHCl соответствующей концентрации, когда кривая ренатурации GGBP/Glc совпадает с кривой его денатурации (см. рис. 1, 2). Мы предполагаем, что низкая скорость достижения равновесия между комплексом GGBP/Glc в нативном состоянии и белком в развёрнутом состоянии связана с тем, что присутствие в растворе GdnHCl приводит к увеличению его вязкости. Подобный эффект не наблюдался при тепловой денатурации комплекса GGBP/Glc. Перед установлением равновесия в течение

(ааВР-Са)„

"

(ООВР-Са)м

(ШВР^

А&

Аа

(GGBP/Glc)N

Рис. 4- Наглядное изображение формирования нативного состояния белка в отсутствие и в присутствии глюкозы из развёрнутого состояния белка при разворачивании-сворачивании GGBP и GGBP/Glc под действием химического денатуранта GdnHCl: значение свободной энергии Гиббса АСх и характеризует стабильность GGBP/Glc и GGBP

соответственно; АСз = АСх — ДС2 может быть использовано для определения константы связывания белка с глюкозой в условиях, когда рабочие концентрации глюкозы влияют на равновесные концентрации (GGBP/Glc)^ и (GGBP)^

продолжительного времени существует избыточное количество (по отношению к равновесной величине) молекул комплекса в нативном состоянии (GGBP/Glc)N на пути разворачивания белка и молекул белка в развёрнутом состоянии (GGBP)u на пути ренатурации белка, поскольку в обоих случаях требуется преодоление высокого акти-вационного барьера. На пути разворачивания элементарное событие диссоциации комплекса GGBP с глюкозой не приводит к нарушению конфигурационного соответствия между белком в нативном состоянии и молекулой глюкозы, и вероятность обратной реакции велика. Тогда как на пути сворачивания для образования нативного комплекса GGBP/Glc необходимо не только формирование белка в нативном состоянии, но и возникновение конфигурационного соответствия между (GGBP)N и молекулой глюкозы. Скорость этих процессов изменяется с увеличением/уменьшением концентрации денатурирующего агента. Существенное влияние вязкости раствора на процессы взаимодействия белка с глюкозой, выявленное при изучении процессов его денатурации-ренатурации под действием GdnHCl, было подтверждено в экспериментах по изучению взаимодействия белка с глюкозой с присутствием глицерина (данные не представлены).

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Сдвиг равновесной кривой денатурации-ренатурации GGBP/Glc в область больших концентраций денатурирующего агента по сравнению с аналогичной кривой GGBP свидетельствует о стабилизирующем действии молекулы глюкозы на структуру белка. Мы проанализировали равновесные зависимости интенсивности флуоресценции при длине волны 320 и 365 нм GGBP и GGBP/Glc, а также их бескальциевых форм от концентрации GdnHCl согласно стандартной методике [12] для определения разности свободной энергии Гиббса. Значение свободной энергии для GGBP/Glc (3,37 ± 1,07 ккал/моль) практически в два раза превышает её значение для GGBP (1,92 ± 0,90 ккал/моль). Эти данные подтверждают стабилизирующую роль молекулы глюкозы на структуру белка. Значение свободной энергии Гиббса для бескальциевой формы белка GGBP-Ca надёжно определить не удалось, поскольку невозможно оценить интенсивность флуоресценции для нативного состояния белка (см. рис. 1). Однако очевидно, что эта форма

белка очень нестабильна. В то же время при отщеплении иона кальция от GGBP/Glc значение свободной энергии Гиббса практически не меняется (3,18 ± 1,05 ккал/моль). Эти данные свидетельствуют о том, что ион кальция стабилизирует структуру GGBP в открытой форме, т. е. в отсутствие глюкозы.

Эксперименты по тепловой денатурации GGBP также подтверждают стабилизирующее действие глюкозы на структуру белка и необходимость присутствия иона кальция в связанном виде для поддержания устойчивости GGBP в открытой форме к различным внешним воздействиям. Как и разворачивание под действием химического агента, тепловая денатурация GGBP и его комплекса GGBP/Glc, и их бескальциевых форм является обратимой. Частичная необратимость тепловой денатурации, выражающаяся в неполном совпадении кривых плавления (см. рис. 4) и в уменьшении интенсивности триптофановой флуоресценции и сигнала КД в ближней и дальней УФ-областях белка, возникает при продолжительной инкубации белка при температуре выше окончания денатурационного перехода. Это связано с тем, что тепловая денатурация GGBP в присутствии и в отсутствие лигандов осложнена агрегацией, вызванной продолжительной инкубацией белка в развёрнутом состоянии при высокой температуре. Степень агрегации молекул белка зависит от концентрации белка, температуры и длительности инкубации.

Полученные результаты необходимо учитывать при конструировании биосенсорной системы на глюкозу с GGBP в качестве чувствительного элемента.

Литература

1. Ramachandran A., Moses A., Shetty S. et al. A new non-invasive technology to screen for dysglycaemia including diabetes // Diab. Res. Clin. Pract. 2010. Vol. 88. N 3. P. 302-306.

2. ErvinK. R., KiserE. J. Issues and implications in the selection of blood glucose monitoring technologies // Diabetes Technol. Ther. 1999. Vol. 1. N 1. P. 3-11.

3. Moschou E. A., SharmaB. V., Deo S. K., DaunertS. Fluorescence glucose detection: advances toward the ideal in vivo biosensor //J. Fluoresc. 2004. Vol. 14. N 5. P. 535-547.

4. TolosaL. On the design of low-cost fluorescent protein biosensors // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2009. Vol. 116. P. 143-157.

5. ShiltonB.H., Flocco M. M, NilssonM., Mowbray S. L. Conformational changes of three periplasmic receptors for bacterial chemotaxis and transport: the maltose-, glucose/galactose- and ribose-binding proteins // J. Mol. Biol. 1996. Vol. 264. N 2. P. 350-363.

6. TuraA., MaranA., PaciniG. Non-invasive glucose monitoring: Assessment of technologies and devices according to quantitative criteria // Diabetes Research and Clinical Practice. 2007. Vol. 77. P. 16-40.

7. Amiss T. J., ShermanD. B., Nycz C. M. et al. Engineering and rapid selection of a low-affinity glucose/galactose binding protein for a glucose biosensor // Protein Sci. 2007. Vol. 16. P. 2350-2359.

8. Oliver N. S., Toumazou C., Cass A. E., Johnston D. G. Glucose sensors: a review of current and emerging technology // Diabet. Med. 2009. Vol. 26. N 3. P. 197-210.

9. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacterio-phage T4 // Nature. 1970. Vol. 227. N 5259. P. 680-685.

10. Turoverov K. K., Kuznetsova I. M. Intrinsic fluorescence of actin //J. Fluorescence. 2003. Vol. 13. P. 41-57.

11. Kuznetsova I. M., Turoverov K. K., Uversky V. N. Use of the phase diagram method to analyze the protein unfolding-refolding reactions: fishing out the "invisible" intermediates //J. Pro-teome Res. 2004. Vol. 3. P. 485-494.

12. NoltingB. Protein Folding Kinetics. Biophysical Methods. Berlin; Haidelberg, 1999. 191 p.

13. Levitsky D. I., Rostkova E. V., Orlov V.N. et al. Complexes of smooth muscle tropomyosin with F-actin studied by differential scanning calorimetry // Eur. J. Biochem. 2000. Vol. 267. N 6. P. 1869-1877.

14. Vyas N. K., Vyas M. N., Quiocho F. A. Sugar and signal-transducer binding sites of the Escherichia coli galactose chemoreceptor protein // Science. 1988. Vol. 242. P. 1290-1295.

15. BorrokM. J., KiesslingL. L., Forest K. T. Conformational changes of d-glucose/D-galactose binding protein illuminated by apo and ultrahigh resolution ligand-bound structures // Prot. Sci. 2007. Vol. 16. P. 1032-1041.

Статья поступила в редакцию 28 июня 2011 г.

А. В. Фонин, Ольга В. Степаненко, В. В. Верхуша, Д. М. Щербакова, И. М. Кузнецова, К. К. Туроверов

ПЕРСПЕКТИВЫ СОЗДАНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОГО ЭЛЕМЕНТА ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО БИОСЕНСОРА НА ГЛЮКОЗУ*

Введение. Прогрессирующее увеличение численности людей, больных диабетом I и II типа, среди населения развитых стран ставит задачу создания устройств, позволяющих непрерывно и неинвазивно измерять уровень глюкозы в крови человека [1]. Существует много подходов к решению этой задачи, основанных на различных физических принципах. Нам представляется многообещающим мониторинг содержания глюкозы в крови человека с помощью биосенсорной системы, в качестве чувствительного элемента которой использовался бы белок, способный к избирательному взаимодействию с молекулой сахара. Поскольку при взаимодействии D-глюкоза/D-галактоза-связывающего белка (GGBP) с глюкозой наблюдаются значительные перестройки его пространственной структуры, этот белок может являться перспективным кандидатом на роль чувствительного элемента биосенсора на глюкозу [2].

Попытки использовать GGBP в качестве чувствительного элемента биосенсорной системы на глюкозу предпринимаются уже около 10 лет. За это время были исследованы различные способы регистрации взаимодействия этого белка с глюкозой. Созданы различные конструкции на основе GGBP, содержащие донорно-акцепторные пары, а также пул меченых разнообразными красителями мутантов D-глюкоза/D-га-лактоза-связывающего белка [3-12]. Так, многообещающей является мутантная форма GGBP/H152C с присоединённым по 152 положению флуоресцентным красителем-баданом. Показано, что в присутствии 150 мМ глюкозы наблюдалось 300 %-ное увеличение интенсивности флуоресценции связанного с белком красителя [8].

Целью представляемой работы являлось изучение перспектив и условий использования мутантной формы GGBP/H152C с присоединённым флуоресцентным красителем-баданом в качестве чувствительного элемента биосенсорной системы на глюкозу. В задачи входило:

1) определение константы диссоциации комплекса GGBP/H152C-Badan с глюкозой;

2) изучение устойчивости GGBP/H152C-Badan в открытой и закрытой формах к действию химического денатуранта — гуанидингидрохлорида (GdnHCl);

3) изучение влияния изменения рН среды на структуру GGBP/H152C и флуоресцентные свойства бадана.

Материалы и методы. Клетки E.coli BL21 (DE3) были трансформированы плаз-мидой рЕТ-Hd, кодирующей белок GGBP/H152C c гексагистидиновым хвостом. Экспрессию белков в Escherichia coli индуцировали 0,5 мМ IPTG (Nacalai Tesque, Япония). Клеточную массу наращивали в течение 24 ч при 37 °С. Белок очищали с помощью №++-агарозы (колонки His GraviTrap, GE Healthcare, Швеция). Контроль чистоты полученных белковых препаратов осуществляли с помощью SDS-электрофореза в денатурирующих условиях в 15 %-ное полиакриламидном геле согласно стандартной методике [13]. Для подготовки GGBP/H152C к присоединению бадана (Anal. Spec., США)

* Работа выполнена при частичной финансовой поддержке гранта Президента РФ (MK-1181.2010.4) и на основании государственного контракта с Минобрнауки № 16.512.11.2114.

к исходному раствору в 100-кратном относительно белковой концентрации количестве был добавлен TCEP (Sigma, США). Концентрация красителя, добавленного в полученный раствор, превышала концентрацию белка в 10 раз. Инкубация раствора белка с красителем проходила в течение 12 ч при 4 °С. Не связавшийся с белком бадан был удалён при помощи концентраторов (10 кДа, Sartorius stedim, Германия). Эксперименты выполнены при концентрации растворов белка 0,2 мг/мл. Все эксперименты, за исключением изучения влияния рН на характеристики белка и красителя, выполнены в PBS рН = 7,4.

Препараты D-глюкозы (Sigma, США) и гуанидингидрохлорида (GdnHCl) (Nacalai Tesque, Япония) использовали без дополнительной очистки. Концентрацию GdnHCl определяли с помощью рефрактометра Аббе (ЛОМО, Россия).

Флуоресцентные измерения выполнены с использованием спектрофлуориметра со стационарным возбуждением [14] и Cary Eclipse (Varian, Австралия). Спектры флуоресценции измеряли при возбуждении светом с длиной волн 280, 297, 387 и 400 нм. Для более детального рассмотрения конформационных переходов белка использовали параметр A = /з2о/!зб5, характеризующий положение и форму спектров флуоресценции, а также интенсивность флуоресценции при длине волны 365 и 545 нм.

Анизотропию флуоресценции при длине волны 365 и 545 нм определяли по соотношению

r =(IV - GIV)/(lV + 2GIV),

где IV и IV — вертикальная и горизонтальная компоненты интенсивности флуоресценции, возбуждаемой вертикально поляризованным светом; G — коэффициент, характеризующий различие чувствительности установки к вертикально и горизонтально поляризованному свету (G = IHV/IHH). Длина волн возбуждения была 297 и 387 нм.

Квазиравновесные зависимости различных флуоресцентных характеристик белка от концентрации GdnHCl измеряли после инкубации белка в растворах GdnHCl соответствующей концентрации при 4 °С. Все измерения выполнены при 23 °С.

Исследование влияния рН на флуоресцентные характеристики белка и красителя проведено в буферных растворах, содержащих лимонную кислоту и Na2HPO4 (рН = = 2,8,4,2, 6,0, 7,1), PBS pH = 7,4, TrisHCl pH = 7,2, 9,6.

Результаты. На основе данных собственной УФ-флуоресценции и флуоресценции бадана было исследовано взаимодействие GGBP/H152C-Badan с глюкозой. Константа диссоциации комплекса GGBP/H152C-Badan/Glc составляет 8,7 ± 0,3 мкМ (рис. 1). Такое значение константы диссоциации (GGBP/H152C-Badan/Glc) позволяет использовать мутантную форму GGBP/H152C с присоединённым красителем-баданом в качестве чувствительного элемента биосенсорной системы в трансдермальных методах мониторинга глюкозы, обеспечивающих разбавление концентрации глюкозы в тысячу раз по сравнению с физиологической.

Исследование структурных превращений GGBP/H152C-Badan в открытой и закрытой формах под действием GdnHCl было проведено с помощью совокупного анализа данных собственной УФ-флуоресценции и флуоресценции связанного с белком красителя. Показано, что увеличение концентрации гуанидингидрохлорида в растворах, содержащих белок в открытой форме, приводит к увеличению интенсивности флуоресценции бадана (рис. 2, а). Интенсивность флуоресценции красителя возрастает с увеличением концентрации GdnHCl даже в том случае, когда, согласно данным собственной УФ-флуоресценции, белок находится в полностью развёрнутом состоянии. При разворачивании же комплекса GGBP/H152C-Badan/Glc под действием GdnHCl

40 60 Glc, мкМ

Рис. 1. Зависимость интенсивности флуоресценции бадана в составе GGBP/H152C-Badan от концентрации глюкозы в исследуемых растворах:

100 длина волны возбуждения 297 нм, регистра-

ции — 545 нм

400 500 600

Длина волны, нм

400 500 600

Длина волны, нм

Рис. 2. Спектры флуоресценции GGBP/H152C-Badan (а) (сплошная кривая — в отсутствие GdnHCl, пунктирная кривая — в 0,1М GdnHCl, штрихпунктирная кривая — в 0,5М, два штриха-пунктирная кривая — в 0,8М, кривая 1 — в 1,3М, 2 — в 1,8М, 3 — в 3,3М GdnHCl); GGBP/H152C-Badan/Glc (б) (кривая 1 — в отсутствие GdnHCl, 2 — в 0,1М GdnHCl, 3 — в 0,2М, 4 — в 0,4М, 5 — в 0,6М, 6 — в 0,8М, 7 — в 1М, 8 — в 1,3М, штрихпунктирная кривая — в 1,8М, пунктирная кривая — в 3,3М GdnHCl) в растворах с различным содержанием GdnHCl: длина волны возбуждения 297 нм

б

а

увеличение интенсивности флуоресценции бадана наблюдается лишь до значений концентрации GdnHCl — около 0,6М (рис. 2, б), когда согласно значениям различным флуоресцентных характеристик (параметра А, анизотропии флуоресценции) собственной УФ-флуоресценции (данные не представлены) белок теряет сродство к глюкозе. При денатурации GGBP/H152C-Badan под действием GdnHCl как в открытой, так и в закрытой форме во всех исследуемых растворах наблюдается незначительный сдвиг в фиолетовую область спектра флуоресценции бадана при всех используемых длинах волн возбуждения (см. рис. 2). Для объяснения полученных результатов было исследовано влияние GdnHCl на флуоресцентные свойства бадана. Показано, что при увеличении концентрации GdnHCl в растворах, содержащих свободный краситель, наблюдается значительный сдвиг максимума спектра флуоресценции бадана в фиолетовую область и увеличение квантового выхода флуоресценции бадана (рис. 3).

Рис. 3. Спектры флуоресценции свободного бадана в растворах с различным содержанием GdnHCl (1 — в отсутствие GdnHCl, 2 — в 0,1М GdnHCl, 3 — в 0,2М, 4 — в 0,5М, 5 — в 0,8М, 6 — в 1,3М, 7 — в 1,8М, 8 — в 3,3М GdnHCl):

длина волны возбуждения 297 нм

400

500 600

Длина волны, нм

700

Длина волны, нм Длина волны, нм

Рис. 4• Спектры флуоресценции бадана в связанном с GGBP/H152C состоянии (а) (сплошные кривые — рН = 2,8, пунктирные кривые — рН = 4,2, штрихпунктирные кривые — рН = 6,0, два штриха-пунктирные кривые — рН = 7,1, точки — рН = 7,2, штрих-точечные кривые — рН = 9,6; цифрами обозначены спектры флуоресценции комплекса GGBP/H152C-Badan/Glc: 1 — рН = 2,8, 2 — рН = 4,2, 3 — рН = 6,0, 4 — рН = 7,1, 5 — рН = 7,2, 6 — рН = 7,4, 7 — рН = 9,6); в свободном состоянии (б) (кривая 1 — рН = 2,8, 2 — рН = 4,2, 3 — рН = 6,0, 4 — рН = 7,1, 5 — рН = 7,2, 6 — рН = 7,4, 7 — рН = 9,6) в растворах с различными значениями рН: длина волны возбуждения 297 нм

Было исследовано влияние рН среды на структуру белка и флуоресцентные свойства красителя. Показано, что при кислых значениях рН наблюдается значительное снижение интенсивности как собственной УФ-флуоресценции GGBP/H152C, так и флуоресценции красителя по сравнению с растворами GGBP/H152C-Badan при нейтральных и щелочных рН (рис. 4, а). Кроме того, спектры флуоресценции бадана в составе GGBP/H152C-Badan в кислых рН сдвинуты в фиолетовую область по сравнению со спектрами GGBP/H152C-Badan в растворах с нейтральными и щелочными значениями рН. Комплексообразование с глюкозой не приводит к заметным изменениям в спектрах собственной УФ-флуоресценции GGBP/H152C и флуоресценции бадана в растворах с кислыми значениями рН. Однако при увеличении значений рН исследуемых

растворов наблюдается значительное усиление интенсивности флуоресценции связанного с белком красителя.

Показано, что при увеличении значений рН в растворах, содержащих свободный бадан, интенсивность флуоресценции красителя возрастает при любой используемой длине волны возбуждения (рис. 4, б). В области щелочных рН спектр флуоресценции свободного бадана при возбуждении УФ-излучением сдвинут в фиолетовую область относительно спектров красителя в растворах с кислыми и нейтральными значениями рН. Спектр флуоресценции свободного красителя при возбуждении в УФ-области спектра в растворах при значении рН = 9,6 имеет два выраженных максимума.

Обсуждение. Чувствительность флуоресцентных характеристик бадана к свойствам его микроокружения обусловлена особенностями структуры этого красителя, сформированной тремя фрагментами: диметиламиногруппой, нафталиновым кольцом и карбоксильной группой. По-видимому, такое расположение разноименно заряженных групп обеспечивает возможность перераспределения электронной плотности возбуждённого бадана при изменении свойств микроокружения красителя. В качестве донора электронов выступает диметиламиногруппа красителя, в качестве акцептора — карбоксильная группа. Известно, что интенсивность флуоресценции бадана возрастает при переходе этого красителя из более в менее полярное окружение [15].

На наш взгляд, именно этим обстоятельством объясняется увеличение регистрируемого сигнала связанного с белком бадана при комплексообразовании GGBP/H152C с глюкозой. В этом случае бадан оказывается в существенно менее полярном окружении по сравнению с микроокружением, в котором краситель находился, когда белок был в открытой форме.

Проведённые исследования по изучению устойчивости GGBP/H152C-Badan в открытой и закрытой формах к денатурирующему действию GdnHCl показали, что этот белок обладает стабильностью, достаточной для использования его в качестве чувствительного элемента биосенсора на глюкозу. Увеличение интенсивности флуоресценции бадана при разворачивании GGBP/H152C-Badan в открытой форме объясняется не только конформационными изменениями структуры белка под действием денатуран-та, вследствие чего краситель становится менее доступен растворителю, но и действием GdnHCl на сам бадан. Особенно ярко этот эффект проявляется, когда белок уже находится в развёрнутом состоянии (см. рис. 2, а). По-видимому, присутствие GdnHCl приводит к перераспределению электронной плотности бадана. Возможно, GdnHCl специфически взаимодействует с красителем, образуя с ним водородные связи.

Изменение рН исследуемых растворов также оказывает заметное действие на структуру GGBP/H152C-Badan и флуоресцентные свойства бадана. В растворах с кислыми значениями рН GGBP/H152C-Badan в открытой форме находится в существенно развёрнутом состоянии, о чём свидетельствует уменьшение собственной УФ-флуорес-ценции белка и усиление флуоресценции бадана, а также сдвиг максимума спектра флуоресценции красителя в фиолетовую область по сравнению с белком в растворах с нейтральными рН (см. рис. 4, а). Способность связывать глюкозу восстанавливается у GGBP/H152C-Badan уже при рН = 4,2. В растворах с щелочными значениями рН наблюдается незначительное уменьшение интенсивности флуоресценции бадана в составе GGBP/H152C-Badan в открытой и закрытой формах по сравнению с растворами при нейтральных рН. Характер спектра флуоресценции свободного бадана при возбуждении его в ультрафиолетовой области в растворах с рН = 9,6 обусловлен, по-видимому, диссоциацией диметиламиногруппы красителя и переходом части молекул в локально возбуждённое состояние (см. рис. 4, б).

На основании полученных результатов можно сделать вывод о возможности использования мутантной формы GGBP/H152C с присоединённым красителем-баданом в качестве чувствительного элемента биосенсорной системы на глюкозу. Однако для более надёжного определения глюкозы в крови человека необходим белок, обладающий большей, по сравнению с GGBP, стабильностью.

Литература

1. Oliver N. S., Toumazou C., Cass A. E. G., Johnston D. G. Glucose sensors: a review of current and emerging technology // Diabetic Medicine. 2009. Vol. 26. P. 197-210.

2. PickupJ. C., ZhiZ.-L., KhanF. et al. Nanomedicine and its potential in diabetes research and practice // Diabetes Metab. Res. Rev. 2008. Vol. 24. P. 604-610.

3. Sakaguchi-Mikami A., Taneoka A., Yamoto R. et al. Engineering of ligand specificity of periplasmic binding protein for glucose sensing // Biotechnol. Lett. 2008. Vol. 30. P. 1453-1460.

4. SaxlT., KhanF., Matthews D. R. et al. Fluorescence lifetime spectroscopy and imaging of nano-engineered glucose sensor microcapsules based on glucose/galactose-binding protein // Biosens. Bioelectron. 2009. Vol. 24. P. 3229-3234.

5. Amiss T. J., ShermanD. B., Nycz C. M. et al. Engineering and rapid selection of a low-affinity glucose/galactose-binding protein for a glucose biosensor // Protein Sci. 2007. Vol. 16. P. 2350-2359.

6. HsiehH. V., PfiefferZ. A., Amiss T. J. et al. Direct detection of glucose by surface plasmon resonance with bacterial glucose/galactose-binding protein // Biosensors and Bioelectronics. 2004. Vol. 19. P. 653-660.

7. GeX., TolosaL., Rao G. Dual-Labeled Glucose Binding Protein for Ratiometric Measurements of Glucose // Analytical Chem. 2004. Vol. 76. P. 1403-1410.

8. Khan F., Saxl T., Pickup J. C. Fluorescence intensity- and lifetime-based glucose sensing using an engineered high-Kd mutant of glucose/galactose-binding protein // Analytical Biochem. 2010. Vol. 399. P. 39-43.

9. Thomas K. J., Sherman D. B., Amiss T. J. et al. A longwavelength fluorescent glucose biosensor based on bioconjugates of galactose/glucose binding protein and Nile red derivatives // Diabetes Technology Therapeutics. 2006. Vol. 8. P. 261-268.

10. Thomas K. J., Sherman D. B., Amiss T. J. et al. Synthesis and biosensor performance of a near-IR thiol-reactive fluorophore based on benzothiazolium squaraine // Bioconjugate Chem. 2007. Vol. 18. P. 1841-1846.

11. YeK., SchultzJ. S. Genetic Engineering of an Allosterically Based Glucose Indicator Protein for Continuous Glucose Monitoring by Fluorescence Resonance Energy Transfer // Anal. Chem. 2003. Vol. 75. P. 3451-3459.

12. KhanF., GnudiL., PickupJ. C. Fluorescence-based sensing of glucose using engineered glucose/galactose binding protein: a comparison of fluorescence resonance energy transfer and environmentally sensitive dye labelling strategies // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008. Vol. 365. P. 102-106.

13. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacterio-phage T4 // Nature. 1970. Vol. 227. P. 680-685.

14. Туроверов К. К., Бикташев А. Г., Дорофеюк А. В., Кузнецова И. М. Комплекс аппаратных и программных средств для измерения спектральных, поляризационных и кинетических характеристик флуоресценции в растворе // Цитология. 1998. Vol. 40. C. 806-817.

15. Koehorst R. B. M., Laptenok S., OortB. et al. Profiling of dynamics in protein-lipid-water systems: a timeresolved fluorescence study of a model membrane protein with the label BADAN at specific membrane depths // Eur. Biophys. J. 2010. Vol. 39. P. 647-656.

П. В. Коженков, Р. Р. Рамазанов, О. Н. Шишилов, И. А. Ефименко, Н. А. Касьяненко ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ДНК С K2[PdHGluCl2] in vitro

Введение. Препараты на основе координационных соединений металлов платиновой группы занимают важное место в противоопухолевой терапии. Наиболее успешно применяется препарат цисплатин, хотя серьёзные побочные эффекты (токсическое действие, неспецифичность, развитие резистентности при лечении), сопровождающие его использование, стимулируют поиск новых координационных соединений металлов (платины, палладия, рутения и др.), обладающих высокой противоопухолевой активностью.

Соединения палладия характеризуются значительно меньшей токсичностью по сравнению с комплексами платины. Если соединения платины обладают сильным им-муносупрессорным действием, то для комплексов палладия это несвойственно. Так как основной мишенью действия в клетке для противоопухолевых препаратов на основе платины является молекула ДНК, широко используется изучение действия новых препаратов на уровне модельных систем — водных растворов ДНК. Изучение взаимодействия соединений палладия с ДНК в растворе представляет значительный интерес для понимания механизма образования таких комплексов и выявления их сходства или различия по сравнению с действием известных препаратов платины. Известно, что повреждения ДНК, индуцированные соединениями палладия, репарируются труднее, чем вызванные воздействием цис-ДДП. Содержание воды в биологических структурах велико, поэтому in vivo координационные соединения палладия могут акватировать-ся — на место атома хлора в координационную сферу палладия встраивается молекула воды. Изучение кинетики комплексообразования позволило предположить, что атака комплексными соединениями палладия позиции N7 гуанина в большой бороздке ДНК является первичным химическим актом, а на второй стадии взаимодействия оставшийся лабильный атом хлора (или молекула воды, заместившая его во внутренней координационной сфере) уходит, освобождая место для второй входящей группы молекулы ДНК.

Для определения характера взаимодействия соединений палладия с ДНК и возможных мест связывания препаратов необходимо знать пространственную структуру координационного соединения и его точные размеры: длину связей, углы между ними, расстояния между атомами. Квантово-химические методы дают возможность численного расчёта конформации молекул, а современные вычислительные машины осуществляют этот расчёт сравнительно быстро.

В представляемой работе приведены экспериментальные данные, полученные при изучении влияния на конформацию молекулы ДНК комплекса K2[PdHGluCl2] in vitro, а также результаты теоретического расчёта структуры соединения палладия.

Материалы и методы. Соединения палладия растворяли в дистиллированной воде, 0,005М NaCl или 0,15М NaCl при комнатной температуре. Их комплексы с ДНК готовили, сливая равные объёмы растворов компонентов заданной ионной силы. Взаимодействие компонентов исследовали в растворе физиологической ионной силы (0,15M NaCl) и при малых концентрациях поддерживающего электролита (0,005M NaCl). Выбор такой концентрации NaCl обусловлен тем, что во внутриклеточной жидкости его

концентрация существенно ниже упомянутой физиологической. Использовали коммерческий препарат тимусной ДНК фирмы "Sigma" с молекулярной массой 11 • 106 г/моль, определённой вискозиметрически.

Спектры поглощения соединений изучали на спектрофотометре СФ-56 (Россия). Спектры кругового дихроизма (КД) ДНК регистрировали на приборе "Mark 4" (Jobin Ivon, Франция). АСМ изображения ДНК и продуктов её взаимодействия с соединениями палладия (комплекс ДНК—Pd) были получены с помощью атомного силового микроскопа "NanoScope 4a" (Veeco). При приготовлении образцов использовали способ самопроизвольной адсорбции ДНК из раствора на поверхность слюды в присутствии ионов магния Mg2+ (C[Mg2+j = 5 • 10~4). Раствор MgCl2 добавляли в исследуемые растворы ДНК и её комплексов непосредственно перед фиксацией. После нанесения капли приготовленного раствора ДНК на свежесколотую поверхность слюды и выдержки образца при комнатной температуре в течение 3 мин слюду промывали дистиллированной водой, удаляя незафиксированные компоненты, высушивали струёй воздуха, а затем в вакуумном сушильном шкафу. Использовали метод прерывистого контакта сухих образцов на воздухе.

Квантово-механические расчёты комплексного иона [PdHGluCb]2~ и двух стадий его акватации (поэтапное замещение атомов хлора молекулами воды согласно общепринятой модели) сделаны с использованием программных пакетов HyperChem 8.0 [1] и GAMESS (FireFly 7.1g) [2]. Обязательными входными параметрами являются координаты атомов, их заряды, полный заряд молекулы, мультиплетность. Неэмпирическое исследование при полной оптимизации геометрии комплекса проводилось с использованием неограниченного метода Хартри—Фока—Рутаана [3] и следующих базисных наборов волновых функций: эффективный псевдопотенциал (SBKJC VDZ ECP) [4] — для палладия, DH [5] — для атомов водорода и 6-31G* (с поляризующими функциями) — для всех остальных атомов в молекуле комплекса.

Результаты и обсуждение. На рис. 1 представлены изображения комплексного иона [PdHGluCb]2- после диссоциации используемого в работе соединения палладия, а также продукты его акватации [PdHGlu(H2O)Cl]~ и [PdHGlu(H2O)2]. Их равновесные структуры имеют плоскую квадратную симметрию в окружении атома палладия, а длина связей и углы между лигандами и комплексообразующим металлом близки к таковым в структуре цис-ДДП (таблица) [6]. Уменьшение энергии комплексов, полученных по схеме двухстадийного замещения ацидолигандов Cl на молекулы воды, позволяет (в первом приближении) говорить о выгодности процесса акватации. Следуя общепринятым представлениям о связывании цис -ДДП с молекулой ДНК [7, 8], на основании структуры соединения можно предположить сходный механизм взаимодействия K2[PdHGluCl2] с макромолекулой по позиции N7 гуанина.

Параметры геометрии [PdHGluX2], X = Cl, H2O и цис-ДДП

Y = Pd, Pt [PdHGluXa], X = Cl, H20 Pt(NH3)X2, X = Cl, H20

Y-Cl 2,36 Á 2,31 Á

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Y-ОНз 2,16 Á 2,13 Á

Cl-Y-Cl 96° 94°

H2O-Y-H2O 94° 92°

Экспериментальное исследование взаимодействия комплексов палладия с ДНК проводили в растворах физиологической (0,15М) и малой ионной силы раствора (0,005М

Рис. 1. Молекула [PdHGluCl2]2 в двух ортогональных проекциях (а, б) и структура комплексов [PdHGlu(H20)а]~ (в) и [PdHGlu(H20)2] (г)

^О). Опыт показал, что присутствие соли в водном растворе К2[PdHGluCl2] оказывает влияние на состояние комплекса. На рис. 2 представлены спектры поглощения этого соединения в дистиллированной воде и в растворах NaCl двух концентраций (0,005М и 0,15М). Измерения проводили при комнатной температуре. На рис. 2 видно, что

присутствие соли в растворе приводит к длинноволновому смещению максимума, что может быть связано с изменением координационной сферы комплексного иона.

Спектр K2[PdHGluCl2] в 0,005М NaCl в присутствии ДНК представлен на рис. 3, а. Для систем использовали раствор соединения палладия в 0,005М ^О, приготовленный за сутки до сливания с раствором ДНК. Измерения проводили через 3 ч после приготовления систем и по прошествии недели. Заметим, в рассматриваемой спектральной области ДНК не имеет полосы поглощения, что позволяет следить за состоянием именно комплексного иона палладия в присутствии ДНК. Как видно, в этом случае спектр поглощения соединения в присутствии ДНК отличается от наблюдаемого для свободного соединения палладия, что однозначно свидетельствует о формировании комплекса ДНК с используемым координационным соединением палладия. В комплексе максимум рассматриваемой полосы смещается в область более коротких длин волн. Кроме того, наблюдается возрастание оптической плотности при 300 нм < \ < 350 нм, где нет поглощения у молекулы ДНК. Результаты свидетельствуют также, что комплекс достаточно устойчив во времени, тогда как свободное соединение, возможно, со временем частично выпадает из раствора. Действительно, опыт показал, что даже через 7 дней (при хранении растворов при температуре 4 °С) существенных изменений в спектре соединения в комплексе на наблюдается. На основании полученных данных можно заключить, что присутствие ДНК в растворе стабилизирует состояние комплексного иона палладия.

Влияние концентрации ДНК в растворе на длинноволновую полосу поглощения препарата в 0,005М и 0,15М ^О можно увидеть на рис. 3, б и в. При малой ионной силе раствора взаимодействие компонентов осуществляется, и оно проявляется не только в изменении этой полосы, но и в увеличении оптической плотности растворов в области 300 нм < X < 350 нм (повторим, что в этом диапазоне длин волн ДНК не поглощает). Измерения были проведены спустя сутки после приготовления комплексов. При физиологической ионной силе (0,15М ^О) изменения в спектре поглощения соединения палладия не фиксируется. Таким образом, взаимодействие компонентов осуществляется только при низкой концентрации поддерживающего электролита (^О), что указывает на важную роль электростатических взаимодействий при образовании комплекса.

Спектры КД ДНК в 0,005М ^О (рис. 3, г) при разных концентрациях K2[PdHGluCl2] также указывают на реализацию связывания компонентов в растворе. Так как мы не можем исключить появления наведённого кругового дихроизма у соединения палладия, которое не обладает собственной оптической активностью, но имеет полосу поглощения в используемой области спектра, то представленные данные не позволяют сделать более конкретных выводов о влиянии связывания на вторичную структуру ДНК. Следует отметить, что при увеличении концентрации исследуемого соединения палладия в комплексе спектральные изменения становятся всё значительнее.

Рис. 2. Спектр поглощения K^fPdHGluCh] в воде (1); 0,005M NaCl (2) и 0,15M NaCl (3) через сутки после приготовления растворов Сра = 10~3M

D

0,05

280 320

360 400 Я, нм

440 480

0,00

320

360

400 Я, нм

D 0,15 -

320 360 400 440 Я, нм

240

270

Я, нм

440

300

Рис. 3. Спектры поглощения (для а, б, в) свободного соединения K2[PdHGluCl2] (1, 3) и его комплексов с ДНК (2, 4): в 0,005М NaCl в зависимости а: от времени выдержки растворов спустя 15 мин (1, 2) и через неделю (2, 4) после приготовления растворов Сра = 10~3M, Сднк = 0,004 %; б, в: от концентрации ДнК в растворах 0,005М (б) и 0,15М (в) NaCl при измерении систем на следующий день после приготовления; для (б) и (в): Сра = 5 • 10~4M, Сднк = 0 % (1); 0,000125 % (2); 0,00025 % (3); 0,000375 % (4); 0,0005 % (5); 0,00075 % (б); 0,001 % (7); для (г): спектры КД ДНК в 0,005M NaCl в присутствии соединения палладия; Сра = 0М (1); 0,625 • 10~4М (2); 1,25 • 10~4М (3); 2,5 • 10~4М (4); 5 • 10~4М (5); Сднк = 0,001 %

На рис. 4 представлены АСМ-изображения ДНК и соответствующих комплексов, полученные в режиме прерывистого контакта для кольцевой плазмидной ДНК. Эти результаты демонстрируют фиксацию отдельных молекул ДНК на подложке. Увеличение концентрации соединения в растворе ДНК приводит к заметному изменению конфор-мации макромолекулы. При малых концентрациях соединения заметно формирование структур на макромолекуле, которые можно трактовать либо как определённое «закручивание» цепи ДНК в месте связывания препарата, либо, возможно, как восстановление палладия при связывании с макромолекулой и фиксации на слюде. С увеличением концентрации палладия в растворе таких структур становится больше. Возможно, такие конформационные изменения ДНК и объясняют наблюдаемые при больших концентрациях соединения палладия спектры КД. В этом случае в системе может появиться

"00 1,0 мкм 1 Г0,0 : : 1,5 мкм 1

Рис. 4. АСМ-изображения свободной ДНК (а) и ДНК в комплексе с соединением палладия в 0,005М ^а; Сднк = 0,75 • 10-4 %, Ога = 2 • 10-6М (б), 10-5М (в), 2 • 10-5М (г)

рассеяние из-за нарушения молекулярности раствора. Заметим, что ранее при изучении взаимодействия молекулы ДНК с соединениями палладия иной структуры были получены АСМ-изображения комплексов, которые имеют сходные черты с наблюдаемыми нами [9].

Проведённые расчёты структуры препарата дают основание предполагать, что используемое соединение палладия может образовывать комплексы с молекулой ДНК, аналогичные для платиновых препаратов сходного состава. Экспериментальные данные указывают на формирование комплексов, которые затрагивают координационную сферу палладия. АСМ-изображения демонстрируют образование структур, сходных с наблюдаемыми ранее для соединений палладия.

Литература

1. HyperChem. Release 7.0 for Windows, Molecular Modeling System. 2002.

2. Granovsky A. A. PC GAMESS/Firefly version 7.1.F. URL: http://classic.chem.msu.su/gran/ / gamess/index.htm

3. Клементи Э. Электронная структура ароматических соединений // Журн. структ. химии. 1969. T. 19. № 2. C. 354-399.

4. KraussJ., Stevens W., BaschH. J. // Chem. Phys. 1984. Vol. 81. P. 6026.

5. Hay P. J., Dunning T. H. Modern Theoretical Chemistry / ed. by H. F. Schaefer. New York., 1976. P. 1-28.

6. Рамазанов Р. Р., Щёголев Б. Ф., Сурма С. В., Касьяненко Н. А. Исследование комплексов цис- и транс-ДДП с молекулой ДНК методами молекулярной динамики и квантовой химии // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4: Физика, химия. 2010. Вып. 2. C. 32-39.

7. WangD., LippardS. J. Cellular processing of platinum anticancer drugs // Nat. Rev. Drug. Discov. 2005. Vol. 4. N 4. P. 307-320.

8. КасьяненкоН. А., ФрисманЭ. В., Валуева С. В. и др. Исследование взаимодействия молекулы ДНК с координационными соединениями двухвалентной платины. I. Взаимодействие цис-ДДП с молекулой ДНК //Молекуляр. биология. 1995. T. 29. C. 345-356.

9. Kasyanenko N. A., Levykina E. V., Erofeeva O. S. et al. Study of influence of palladium acido-complexes [Ln] m [Pdx4] on DNA conformation in vitro //J. Struct. Chem. 2009. N 5. P. 1034-1044.

Статья поступила в редакцию 28 июня 2011 г.

Р. Р. Рамазанов, Б. Ф. Щёголев, Н. А. Касьяненко

НЕЭМПИРИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ ЭЛЕКТРОННОГО И ПРОСТРАНСТВЕННОГО СТРОЕНИЯ УРАЦИЛОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ КОМПЛЕКСОВ ПЛАТИНЫ

Введение. Координационные соединения на основе платины широко применяются в онкологии. Их противоопухолевая активность обусловлена способностью образовывать комплексы с молекулой ДНК посредством формирования координационной связи платины с атомом N7 гуанина. При этом реализуются моно- и бифункциональные комплексы [1—6]. Наиболее известное и давно используемое соединение этого класса — цис-диаминодихлорплатина (цис-ДДП) наряду с несомненными достоинствами (в первую очередь, с поразительно высокой эффективностью), имеет и ряд недостатков: действует неизбирательно, при лечении вызывает ряд серьёзных побочных эффектов, её применение довольно быстро приводит к развитию резистентности со стороны организма. Кардинальное решение проблемы побочных эффектов, в том числе и проблемы токсичности препарата, может быть достигнуто в рамках направленного синтеза новых соединений на основе платины, в том числе биядерных соединений [5, 6], обладающих возможностью связываться с ДНК.

При исследовании взаимодействия координационных комплексов платины с ДНК широко применяются методы молекулярного моделирования. Совместное использование методов молекулярной динамики и квантовой химии в таких случаях позволяет получить дополнительную важную информацию для выяснения общей картины механизма их связывания [7, 8], а также последующих конформационных перестроек компонентов. Следует отметить, что при использовании метода молекулярной динамики в рамках выбранного силового поля (эта процедура осуществляется для каждой конкретной системы) необходимо учитывать характерные особенности пространственного и электронного строения исследуемых координационных комплексов. Например, необходимо учитывать эффекты транс-влияния лигандов координационного комплекса, согласно которым лабильность атома хлора (или заместившей его в процессе аквата-ции молекулы воды) определяется инертностью лиганда, находящегося по отношению к нему в транс-положении. В литературе представлены сведения о физико-химических свойствах некоторых производных платины, используемые при моделировании их взаимодействия с молекулой ДНК [9, 10], однако при исследовании каждого нового соединения необходимо проводить дополнительный анализ характерных особенностей его электронного и пространственного строения.

Представляемая работа посвящена квантово-химическому исследованию пространственного и электронного строения ряда комплексов урациловых производных платины: цис-[Р1;(№Нз)2Cl(URA—R)], где R = H, F, Br, NO2, способных образовывать монофункциональные комплексы с молекулой ДНК, при замещении атома Cl на группу N7 гуанина (рис. 1).

Материалы и методы. Расчёты всех соединений ряда комплексов урациловых производных платины проводились методом Хартри—Фока—Рутаана [11] с помощью программы PCGAMESS (Firefly, v.7) [12] в газовой фазе с полной оптимизацией их пространственного строения, а также с учётом корреляции электронов в рамках метода

O

HN

N4H3 NH3

3

Pt

У

N

Cl

O

R

O

NH3 NH3

33

II Pt

HN^^N^ N'

OO

R

O

NH

R

Рис. 1. Структура соединений 4uc-[Pt(NH3) 2 Cl(URA-R)], где R = H, F, Br, NO2

теории возмущений второго порядка Мюллера—Плессета. В рамках проводимых расчётов для атома Pt использовался базисный набор волновых функций с эффективным релятивистским потенциалом (SBKJC VDZ ECP) [13], тогда как для остальных атомов N, C, O, H, Br, F, Cl — валентно-расщеплённый 6-31G* [14] базис, дополненный поляризационными функциями. Выбранный базисный набор уже использовался ранее при анализе взаимодействия цис-ДДП с ДНК, а результаты расчётов показали хорошее согласие с данными кристаллографического эксперимента [15]. Стартовые координаты атомов были получены с помощью программы Avogadro [16] с предварительной оптимизацией геометрических параметров с использованием силового поля UFF [17] в рамках молекулярной механики. Для анализа стерических возможностей нековалентного взаимодействия урациловых лигандов с различными группами атомов молекулы ДНК, а также для последующего подбора параметров в рамках силового поля молекулярной механики проводился расчёт энергетического профиля торсионного угла вращения ура-цилового лиганда вокруг связи Pt—Ura.

Результаты и обсуждение. Результаты расчётов показали: все комплексы цис-[Р^№Нз)2Cl(URA—R)] обладают плоской квадратной симметрией в области координирующего атома Pt, что согласуется с общим представлением о структуре таких координационных комплексов платины(11) (рис. 2).

Таблица 1

Параметры пространственного строения некоторых комплексов урациловых производных платины и цис-ДДП

Расчёты показали, что при замене радикала на урациле R = = Н, F, Вг, N02 пространственное строение координационных комплексов практически не изменяется (табл. 1). В то же время распределение зарядовой плотности (эффективные заряды на атомах рассчитаны по Малликену [18] в единицах заряда электрона) незначительно меняется только на близлежащих к радикалу 3-4 атомах в урациловом кольце во всех соединениях, за исключением кольца с N02. В отличие от других производных, в случае с радикалом N02 наблюдается концентрация большого отрицательного заряда на радикале. Кроме того, наличие атомов с неподелёнными электронными парами должно приводить к образованию дополнительный водородной связи/связей с соответствующими атомами ДНК (табл. 2).

Проведённый анализ энергетического профиля торсионного угла вращения ураци-лового лиганда вокруг связи с достоверно показал существование высокого энергетического барьера для всех радикалов. Барьер дополнительно увеличен стабилизацией урацила за счёт предполагаемой водородной связи

Длина, угол цис- [Pt (NH3) 2 Cl(URA-R) ] Pt(NH3)2Cl2

R = H, Br, F R = NO2

Pt-Cl 2,317 А 2,318 А 2,312 А

Pt-N 2,087 А 2,086 А 2,073 А

Pt—N(Ura) 2,021 А 2,021 А -

N—Pt—Cl 98° 97° 90°

N-Pt-N 84° 85° 92°

Рис. 2. Равновесные структуры цис-[Рг(КНз)2а(иЯА-Я)], где Я = Н, F, Вг, N02

и цис-[Р1^Нз)2(URA-N02)2]

Таблица 2

Эффективные заряды на атомах урацила (в ед. заряда электрона) при К = N02, И, Е, Бг

Атом И = N02 Н Г Вг

N1 -0,793 -1,026 -0,786 -0,785

С4 0,660 0,896 0,590 0,665

02 -0,505 -0,531 -0,531 -0,524

СЗ 0,079 -0,324 0,281 0,223

N 0,312 <?(Н) = 0,188 = -0,299 <?(Вг) = 0,012

ОЗ 0,342 - - -

Окончание таблицы 2

Atom R = N02 H F Br

04 -0,351 - - -

C2 0,161 0,197 0,622 0,156

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

N4 -0,640 -0,798 -0,640 -0,637

CI 0,828 1,093 0,820 0,823

Угол, град.

Рис. 3. Энергетический профиль вращения торсионных углов Pt—Ura

кислорода с близлежащей NH3-rpynno^ Пространственное расположение плоскости урацила, близкое к ортогональному плоскости координации Pt относительно его лиган-дов, позволяет сделать предположение о возможности частичного встраивания урацила между ближними парами оснований на ДНК (наподобие частичной интеркаляции). Дальнейшее выяснение механизма связывания этих соединений с ДНК предполагает анализ конформационного пространства ДНК методом молекулярной динамики с использованием полученных данных квантово-химических расчётов.

Литература

1. HuangH., ZhuL., ReidB. R. et al. Solution structure of a cisplatin-induced dna interstrand cross-link // Science. 1995. Vol. 270. N 5243. P. 1842-1845.

2. Kelland L. R., Murrer B. A., AbelG. et al. Ammine/amine platinum(IV) dicarboxylates: a novel class of platinum complex exhibiting selective cytotoxicity to intrinsically cisplatin-resistant human ovarian carcinoma cell lines // Cancer Res. 1992. Vol. 52. N 4. P. 822-828.

3. Fuertes M. A., Castilla J., Alonso C., PirezJ. M. Novel concepts in the development of platinum antitumor drugs // Curr. Med. Chem. Anticancer Agents. 2002. Vol. 2. N 4. P. 539-551.

4. WangD., LippardS. J. Cellular processing of platinum anticancer drugs // Nat. Rev. Drug. Discov. 2005. Vol. 4. N 4. P. 307-320.

5. Reedijk J. New clues for platinum antitumor chemistry: kinetically controlled metal binding to DNA // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2003. Vol. 100. P. 3611-3616.

6. Bose R. N. Biomolecular targets for platinum antitumor drugs // Mini Rev. Med. Chem. 2002. Vol. 2. Vol. 103-111.

7. Sharma S., Peng Gong, Temple B. et al. Molecular dynamic simulations of cisplatin- and oxaliplatin-d(GG) intrastand cross-links reveal differences in their conformational dynamics //J. Mol. Biol. 2007. Vol. 373. N 5. P. 1123-1140.

8. Scheeff E. D., BriggsJ.M, Howell S. B. Molecular modeling of the intrastrand guanine-guanine DNA adducts produced by cisplatin and oxaliplatin // Mol. Pharmacol. 1999. Vol. 6. N 3. P. 633-643.

9. Shijie Yao, Plastaras J. P., MarzillL. G. A Molecular Mechanics AMBER-Type force Field for Modeling Platinum Complexes of Guanine Derivatives // Inorg. Chem. 1994. Vol. 33. P. 6061-6077.

10. WeinerS., Kollman P. A., Case D. A. et al. A new force field for molecular mechanical simulation of nucleic acids and proteins // J. Am. Chem. Soc. 1984. Vol. 106. P. 765-784.

11. Клементи Э. Электронная структура ароматических соединений // Журн. структ. химии. 1969. Т. 19. № 2. С. 354-399.

12. Granovsky A. A. PC GAMESS/Firefly, version 7.1.F. // URL: http://classic.chem.msu.su/ /gran/gamess/index.htm.

13. Stevens W. J., Krauss M., BaschH., Jasien P. G. Relativistic compact effective potentials and efficient shared-exponent basis-sets for the 3rd-row, 4th-row and 5th-row atoms // Can. J. Chem. 1992. Vol. 70. P. 612-629.

14. Dill J. D., Pople J. A. Self-consistent molecular orbital methods. XV. Extended Gaussian-type basis sets for lithium, beryllium and boron //J. Chem. Phys. 1975. Vol. 62. P. 2921-2923.

15. Рамазанов Р. Р., Щёголев Б. Ф., Сурма С. В., КасьяненкоН. А. Исследование комплексов цис- и транс-ДДП с молекулой ДНК методами молекулярной динамики и квантовой химии // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4: Физика, химия. 2010. Вып. 2. C. 32-39.

16. Avogadro: an open-source molecular builder and visualization tool. Version 1. XX. URL: http://avogadro.openmolecules.net/

17. RappeA. K., CasewitC. J., ColwellK. S. et al. UFF, a Full Periodic Table Force Field for Molecular Mechanics and Molecular Dynamics Simulations // J. Am. Chem. Soc. 1992. Vol. 114. P. 10024-10035.

18. Mulliken R. S. Electronic Population Analysis on LCAO-MO Molecular Wave Functions. I // J. Chem. Phys. 1955. Vol. 23. N 10. P. 1831-1833.

Статья поступила в редакцию 28 июня 2011 г.

Г. Б. Белостоцкая, И. С. Елдашев, С. В. Сурма, Б. Ф. Щёголев

MОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ВОЗДЕЙСТВИЯ МАГНИТНЫХ ПОЛЕЙ РАЗНОЙ ИНТЕНСИВНОСТИ НА РЕГУЛЯЦИЮ УРОВНЯ КАЛЬЦИЯ В КУЛЬТИВИРУЕМЫХ МЫШЕЧНЫХ КЛЕТКАX

Введение. Актуальность исследований воздействия слабых магнитных полей на биологические объекты обусловлена в первую очередь значимостью влияния геомагнитного поля (ГМП) на живые системы и их генезис. Несмотря на то, что магнитобио-логические эффекты (МБЭ) магнитных полей (МП) разной напряжённости описаны для многих биологических объектов — от растений [1] и бактерий [2] до клеток [3-7] и целостных организмов, включая человека [8-10], отсутствует понимание сущности биофизических процессов взаимодействия МП с биологическими субстанциями. Однако во многих работах рассматривается возможное влияние МП на процессы, происходящие с участием заряженных частиц — ионов кальция, магния, калия и др. [11, 12], которые, в свою очередь, участвуют в различных биохимических и физиологических процессах на уровне клеток, органов и тканей, тем самым вызывая различные отклонения в функциональном состоянии организмов.

Ранее нами было установлено, что снижение магнитного воздействия до 0,3 мкТл приводит к торможению процессов пролиферации и дифференцировки скелетных мышечных клеток, а слабое постоянное магнитное поле (ПМП) микротеслового диапазона стимулирует формирование многоядерных гипертрофированных миотрубок в первичной культуре [13, 14]. Было также показано, что стимулирующий эффект слабого ПМП обусловлен повышением концентрации внутриклеточного кальция [Ca2+]j в миотруб-ках [15, 16] за счёт индуцируемого МП высвобождения Ca2+ из саркоплазматического ретикулума (СР) через рианодиновые рецепторы (РиР).

В нашей работе впервые исследовано воздействие МП (0,3 и 160-400 мкТл) на Са2+-сигнализацию в культивируемых скелетных мышечных клетках новорождённой крысы. Изучение активности рецепторов наружной мембраны и СР, участвующих в выполнении основной функции мышечных клеток — сокращении, позволило рассмотреть МБЭ, индуцированные гипомагнитным полем и слабым ПМП, на молекулярном уровне и оценить степень их воздействия на функцию скелетной мускулатуры.

Материалы и методы. Сателлитные клетки мышц лапок новорождённых крыс выделяли по методике Бима и Кнадсона [17] в нашей модификации [18]. Изолированные клетки получали разрушением мышечной ткани с помощью коллагеназы IA (2 мг/мл) в растворе Рингера (мМ: 146 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 11 глюкозы, 10 HEPES, pH = 7,4) в течение 40 мин при 37 °С. Для снижения доли немышечных клеток суспензию ферментативно изолированных клеток преинкубировали на стеклянной поверхности в течение 1 ч.

Культивирование сателлитных клеток проводили в среде DMEM с 10 % сыворотки плодов коров (э.с.) и антибиотиками (50 ед./мл пенициллина/50 мкг/мл стрептомицина). На 3-й день культивирования её заменили на среду DMEM с 2 % э.с. и антибиотиками, что позволяло сократить период активной пролиферации миобластов и ускорить процесс слияния миоцитов и дифференцировки миотрубок. Клетки культивировали на полосках покровных стёкол (12 х 24 мм), предварительно покрытых поли-Д-лизином

(Sigma, 0,1 мг/мл) и помещённых в чашки Петри (d = 40 мм, «Медполимер», Россия). Инкубирование клеток проводили в СО2-инкубаторе ("Jouan", Франция) при 5 % СО2, влажности 95 % и температуре 37 °С.

Для ослабления ГМП и экранирования от различных переменных МП изготовлены две экранирующие камеры (ЭК) из аморфного магнитомягкого материала АМАГ 172. Первая камера позволяет ослабить ГМП в 160 раз, доведя значение МП до 0,3 мкТл, а коэффициент ослабления камеры № 2 равняется 26.

Увеличенное до 160-200 мкТл ПМП создавали с помощью постоянного кольцевого магнита (ПМ). Для стабилизации магнитного поля и уменьшения влияния внешних техногенных полей конструкция с кольцевым магнитом помещалась в ЭК № 2. В экспериментах с ПМП более высокой напряжённости (400 мкТл) применяли ПМ в виде кубика с гранями 1 х 1 х 1 см. Все измерения ПМП проводили с помощью однокоорди-натного магнитометра Fluxmaster (Германия), точность измерений которого составляет 1 нТл.

Регистрацию внутриклеточной концентрации кальция ([Ca2+]j) выполняли с помощью компьютерной системы анализа внутриклеточного содержания ионов (Intracellular Imaging & Photometry System, США). Возбуждение образца осуществляли при 340 и 380 нм, а эмиссию регистрировали при 510 нм. С помощью программы InCytIm2 рассчитывали концентрацию ионов кальция как соотношение интенсивностей флуоресценции (F340/F380) с учётом калибровочной кривой [19]. В качестве флуоресцентного зонда использовали Fura-2AM (Sigma) в концентрации 10 мкМ. Для изучения активности рецепторов наружной мембраны и СР применяли ацетилхолин (АцХ), лиганд АцХ-рецепторов в концентрации 10-20 мкМ, раствор Рингера с повышенным содержанием ионов K+ (KCl, 100 мМ) в качестве деполяризующего агента и активатор РиР 4-хлор-м-крезол (4-ХмК, 0,5-1,0 мМ).

Интенсивность нарастания [Ca2+]j под воздействием используемых лигандов и активаторов рецепторов определяли как отношение максимального значения концентрации к исходному уровню Ca2+ в каждой миотрубке и выражали в относительных единицах. Амплитуду Ca2+ ответа в наномолях (нМ) устанавливали как разницу между максимумом (пик) и минимумом (исходное значение) на кальциевых кривых. Скорость кратковременного повышения [Ca2+]j вычисляли путём деления амплитуды в наномолях на время, в течение которого этот процесс происходил, в секундах (с).

При статистической обработке результатов измерения внутриклеточной концентрации кальция усредняли данные измерений на нескольких миотрубках в одном эксперименте и данные нескольких экспериментов. Обработку осуществляли с помощью программы Microsoft Office Excel 2003, определяя среднее ± ошибка среднего (M ± m) в разделе "Data Analysis".

Результаты экспериментов. Основываясь на наших предыдущих исследованиях [15, 16], мы предположили, что эффект нарастания [Ca2+]j может быть обусловлен либо непосредственным воздействием ПМП на РиР, либо возможным взаимодействием модифицированных ПМП дигидропиридиновых рецепторов (ДГПР, L-каналы) с РиР, приводящим к активизации последних. Для проверки этого предположения были поставлены эксперименты по изучению влияния слабого ПМП с напряжённостью 200 и 400 мкТл и гипомагнитного воздействия (ослабление до 0,3 мкТл) на активность рецепторов наружной мембраны и СР. Опыты проводили на 7-8-суточных миотрубках.

Результаты, представленные на рис. 1, б, в, отображают два варианта экспериментов по измерению [Ca2+]j в 7-суточных миотрубках при действии повышенной концентрации калия (KCl) и 4-ХмК непосредственно во время действия ПМП с напряжённостью

n = 2

—>

KCl 4-ХмК

t = 100 с

KCl 4-ХмК

4ws

KCl

4-ХмК

я

0 0

ö

C

vyvi

n = 3

n = 2

KCl

4-ХмК

АцХ

4-ХмК

Рис. 1. Изменение концентрации внутриклеточного кальция ([Ca2+]i) в 7-8-суточных миотрубках новорождённой крысы в ответ на действие KCl (100 мМ), 4-ХмК (1 мМ) и АцХ (20 мкМ) в различных условиях:

а — контроль ГМП (48—50 мкТл); б — в первые 2 мин воздействия ПМП (400 мкТл); в — через 5—8 мин воздействия ПМП (400 мкТл); г — через 10 мин воздействия ПМП (200 мкТл); д — через 2 ч ослабления ГМП (0,3 мкТл)

б

а

в

д

г

400 мкТл. В первом случае (см. рис. 1, б) деполяризация мембраны под воздействием KCl происходила на 1-й минуте, а активизация РиР с помощью 4-ХмК — на 3-й минуте действия ПМП. В другом опыте (см. рис. 1, в) агенты подавали на 5-й минуте (KCl) и 8-й минуте (4-ХмК) воздействия ПМП на фоне индуцируемого им нарастания [Ca2+]j в миотрубках. Сравнивая представленные данные с контролем ГМП (рис. 1, а), убедимся, что ПМП с напряжённостью 400 мкТл в первые минуты воздействия не только не снижает амплитуду нарастания [Ca2+]j в ответ на действие 4-ХмК, но даже несколько усиливает ответ миотрубок на деполяризацию наружной мембраны при подаче раствора Рингера с повышенной концентрацией ионов калия (KCl, 100 нМ). Однако увеличение времени воздействия ПМП с напряжённостью 400 мкТл всего на 5 мин, при котором уровень внутриклеточного Ca2+ повышается в 1,25 ± 0,09 раза по сравнению с исходным значением, вызывает снижение амплитуды Ca^-ответов и скорости нарастания [Ca2+]j (кривая нарастания [Ca2+]j при действии 4-ХмК имеет более пологий вид).

Результаты воздействия этих же агентов на фоне действия ПМП (200 мкТл) меньшей напряжённости представлены на рис. 1, г. Несмотря на то, что в этом случае

уровень [Ca2+]j возрос в 1,51 ± 0,02 раза, амплитуда повышения [Ca2+]j увеличилась по сравнению с контролем с 121 ± 11 нМ до 196 ± 26 нМ для KCl и с 178 ± 2 нМ до 196 ± 10 нМ для 4-ХмК.

Активность АцХ-рецепторов и РиР изучали после длительного (2 ч) ослабления ГМП, снижающего уровень магнитного воздействия до 0,3 мкТл (рис. 1, д). Ослабление практически не изменило активность АцХ-рецепторов. Амплитуда ответа составила 180 ± 16 нМ в контроле (не представлено на графике) и 175 ± 27 нМ после ослабления. Однако действие 4-ХмК в концентрации 1 мМ вызывало большую амплитуду Са2+-от-вета (209 ± 14 нМ), что в 1,17 раза превышает этот показатель в контроле.

Учитывая наблюдаемые эффекты, влияние МП на работу рецепторов наружной мембраны и СР оценивали по интенсивности и скорости Ca2+ -ответов на действие аце-тилхолина (АцХ), KCl (100 мМ) и активатора РиР — 4-хлор-м-крезола (4-ХмК). Гистограммы, представленные на рис. 2, показывают, что интенсивность нарастания [Ca2+]j в ответ на действие деполяризующего агента KCl снижается при увеличении времени воздействия ПМП (рис. 2, а). Амплитуда снижается в 2 раза при напряжённости ПМП 200 мкТл за 3 ч воздействия, а при 400 мкТл для достижения этого же эффекта достаточно 5 мин. Сходная картина наблюдается под воздействием ПМП с напряжённостью 400 мкТл в отношении РиР, активированных 4-ХмК в концентрации 1 мМ (рис. 2, в). Однако при кратковременном действии (10 мин) более слабого ПМП (200 мкТл) интенсивность Ca2+-выброса в ответ на действие 4-ХмК в концентрациях 0,5 и 1,0 мМ снижается, а при длительном (3 ч) пребывании миотрубок в МП этой интенсивности наблюдается повышение интенсивности ответа на действие 4-ХмК в концентрации 0,5 мМ и даже восстановление исходного значения этого показателя при активации РиР с помощью 4-ХмК в концентрации 1,0 мМ. Похожую ситуацию демонстрируют АцХ-рецепторы (рис. 2, б). Интенсивность их ответов на АцХ также снижается при непродолжительном действии ПМП с напряжённостью 200 мкТл и имеет тенденцию к повышению при увеличении времени магнитного воздействия.

При длительном (более 1 ч) гипомагнитном воздействии (0,3 мкТл) интенсивность нарастания [Ca2+]j в ответ на действие активатора повышается (см. рис. 2, в) по сравнению с ответом этих же рецепторов на 4-ХмК в нормальном ГМП (К). Однако для АцХ-рецепторов было зарегистрировано снижение Ca^-ответа по мере увеличения продолжительности пребывания миотрубок в экранируемом ГМП (см. рис. 2, б).

Поскольку в процессе экспериментов было выявлено, что повышение [Ca2+]j в ответ на действие активаторов и лигандов в одних случаях происходило быстрее, чем в других при равной амплитуде Ca2+ -ответов, был выбран дополнительный параметр — скорость нарастания [Ca2+]j. Этот показатель, по нашему мнению, позволяет оценить не только способность достижения максимального уровня концентрации внутриклеточного Ca2+, но также даёт возможность определить влияние МП на активность рецепторов наружной мембраны и СР.

Было установлено, что при кратковременном воздействии усиленного МП (ПМП, 200-400 мкТл) активность АцХ-рецепторов и РиР снижается, а при длительном — восстанавливается (рис. 3). Скорость нарастания [Ca2+]j в ответ на действие KCl, вызывающего деполяризацию наружной мембраны и запускающего электромеханическое сопряжение (ЭМС) между дигидропиридиновыми рецепторами (ДГПР) наружной мембраны и рецепторами СР (РиР), напротив, со временем снижается, что может свидетельствовать о нарушении взаимодействия между рецепторами.

В противоположность этому кратковременное экранирование ГМП снижает скорость нарастания [Ca2+]j в ответ на действие АцХ и 4-ХмК, в то время как увеличение

CS

и

-с

Б о я я

S

в —

KCl 100 мМ

16 12 8 4

0

К 10 мин 3 ч 1 мин 5 мин К 10 мин 3 ч 30 мин 1-3 ч

200 мкТл 400 мкТл 200 мкТл 0,3 мкТл

□ АцХ 10 мМ _г ■ АцХ 20 мМ ГТ!

□ 4-ХмК 0,5 мМ ■ 4-ХмК 1 мМ

К

10 3 ч 1 мин 5 мин 1-3 ч

мин

200 мкТл 400 мкТл 0,3 мкТл

Рис. 2. Изменение интенсивности Ca2+ ответов на действие:

KCl (100 мМ), б — 4-ХмК (0,5-1,0 мМ) и в — АцХ (10—20 мкМ) под воздействием МП разной напряжённости и длительности в 7-8-дневных миотрубках новорождённой крысы

в первичной культуре

в

а

времени гипомагнитного воздействия ускоряет Са2+-ответы АцХ-рецепторов и РиР, вызванные активацией этими агентами. Мы предполагаем, что этот эффект может быть обусловлен концентрацией Ca2+ в СР. Поскольку, как было показано ранее [15, 16], ПМП индуцирует нарастание [Ca2+]j, высвобождая Ca2+ из СР и опустошая при этом его запасы, то при дополнительном открытии РиР с помощью 4-ХмК наблюдается снижение скорости высвобождения Ca2+, а при активации РиР (4-ХмК, 0,5 мМ) в ослабленном ГМП происходит более стремительный выход Ca2+ из наполненного или даже переполненного кальцием СР.

С другой стороны, зависимость амплитуды повышения [Ca2+]j при действии KCl и 4-ХмК от напряжённости ПМП (см. рис. 1) при непродолжительном его воздействии можно объяснить увеличением времени открытого состояния РиР под влиянием ПМП. Однако увеличение времени магнитного воздействия приводит к постепенному истощению запасов Ca2+ в цистернах СР, причём чем больше напряжённость МП, тем быстрее снижается концентрация ионов кальция в депо и, соответственно, амплитуда Ca2+ -ответа.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Обсуждение. На основании собственных результатов [15, 16] и данных других авторов, указывающих на факт влияния повышенной концентрации внутриклеточного кальция на пролиферацию делящихся клеток [20], можно предположить, что в основе стимулирующего эффекта ПМП на пролиферацию и дифференцировку скелетных

35 и 30« 25-

и 20 «

S

3 15 Н

& 10-

О

л

Si и

5

10 мин 3 ч 200 мкТл

Ш АцХ 10 мкМ ■ АцХ 20 мкМ □ 4-ХмК 0,5 мМ 14-ХмК 1,0 мМ Ш KCl 100 мМ

й

1 мин 5 мин 400 мкТл

30 мин 1-3 ч 0,3 мкТл

Рис. 3. Изменение скорости нарастания [Ca2+]i в 7-8-дневных миотрубках новорождённой крысы в ответ на действие АцХ (10-20 мкМ), KCl (100 мМ) и 4-хлор-м-крезола (0,5-1,0 мМ) под воздействием МП разной напряженности и длительности

0

мышечных клеток в культуре лежит индуцируемое им нарастание [Ca2+]i, вызванное высвобождением кальция из СР через открытые РиР. На фоне опустошения СР во время действия ПМП (200-400 мкТл) дополнительная активизация изученных нами рецепторов демонстрирует снижение их активности. Реакция на деполяризующий стимул (KCl, 100 мМ) также снижается. При более длительном пребывании миотрубок в слабом ПМП активность АцХ-рецепторов восстанавливается, однако активность РиР, как и ответ на деполяризацию, остаётся низкой. Причём сопряжённость двух последних параметров, по-видимому, дополнительно свидетельствует в пользу индуцируемого нарушения сопряжения ДГПР и РиР в ЭМС под воздействием ПМП микротеслового диапазона напряжённости.

Вызванное воздействием слабого ПМП нарушение в ЭМС отражается на работе сократительного аппарата сформированных в первичной культуре миотрубок. Причём полностью дифференцированные миотрубки на поздних сроках развития менее чувствительны к воздействию слабого ПМП, демонстрируя постепенное снижение (до 25 %) частоты сокращений, тогда как миотрубки, находящиеся на стадии формирования ЭМС, резко снижают частоту сокращений (вплоть до полного прекращения) уже в первые минуты действия ПМП.

Литература

1. Фомичева В. М., Говорун Р. Д., Данилов В. И. Пролиферативная активность и клеточная репродукция в корневых меристемах гороха, чечевицы и льна в условиях экранирования геомагнитного поля // Биофизика. 1992. Т. 37. № 4. С. 745-749.

2. Horiuchi S., Ishizaki Y., OkunoK. et al. Change in broth culture is associated with significant suppression of Escherichia coli death under high magnetic field // Bioelectrochemistry. 2001. Vol. 53. N 2. P. 149-153.

3. BelyaevI. Ya., Alipov Ye. D., Harms-Ringdahl M. Effects of zero magnetic field on the conformation of chromatin in human cells // Biochim. Biophys. Ada. 1997. Vol. 1336. P. 465-473.

4. SakuraiH., OkunoK., KuboA. et al. Effect of a 7-tesla homogeneous magnetic field on mammalian cells // Bioelectrochem. Bioenerg. 1999. Vol. 49. Iss. 1. P. 57-63.

5. BeischerD. E. Biomagnetics // Ann. NY Acad. Sci. 1965. Vol. 134. N 1. P. 454-458.

6. Beischer D. E. The null magnetic field as reference for the study of geomagnetic directional effects in animals and man // Ann. NY Acad. Sci. 1971. Vol. 188. P. 324-330.

7. Wever R. Human circadian rhythms under the influence of weak electric fields and the different aspects of these studies // Int. J. Biometeor. 1973. Vol. 17. N 3. P. 227-232.

8. Леднёв В. В. Биоэффекты слабых комбинированных постоянных и переменных магнитных полей // Биофизика. 1996. Т. 41. № 1. С. 224-231.

9. LiboffA. R. Electric-field ion cyclotron resonance // Bioelectromagnetics 1997. Vol. 18. N 1. P. 85-87.

10. Teodori L., Gohde W., Valente M. G. et al. Static magnetic fields affect calcium fluxes and inhibit stress-induced apoptosis in human glioblastoma cells // Cytometry. 2002. Vol. 49. P. 143-149.

11. FanelliC., Coppola S., Barone R. et al. Magnetic fields increase cell survival by inhibiting apoptosis via modulation of Ca2+ influx // FASEB J. 1999. Vol. 13. P. 95-102.

12. Агаджанян Н. А., Власова И. Г. Влияние инфранизкочастотного магнитного поля на ритмику нервных клеток и их устойчивость к гипоксии // Биофизика. 1992. Т. 37. № 4. С. 681-689.

13. Eldashev I. S., Shchegolev B. F., Surma S. V., Belostotskaya G. B. The influence of low intensity magnetic field on proliferation and differentiation of new born rat muscle cells in the primary culture // Biological motility: from fundamental achievements to nanotechnologies. Pushchino., 2010. P. 77-80.

14. ЕлдашевИ. С., Щёголев Б. Ф., Сурма С. В., Белостоцкая Г. Б. Влияние слабых магнитных полей на развитие сателлитных клеток новорождённой крысы в первичной культуре // Биофизика. 2010. Т. 55. № 5. С. 868-874.

15. Елдашев И. С., Белостоцкая Г. Б., Щёголев Б. Ф. Возможный механизм действия постоянного магнитного поля слабой интенсивности на физиологические процессы в культивируемых скелетных мышечных клетках // Матер. межд. научно-практ. конф. «XXXIX неделя науки в СПбГПУ». 2010. Ч. XVI. С. 13-15.

16. Белостоцкая Г. Б., Голованова Т. А., ЕлдашевИ. С. и др. Уровень внутриклеточного кальция как показатель физиологического состояния мышечных клеток // Труды 1-й межд. научно-практ. конф. «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» / под ред. А. П. Кудинова, Б. В. Крылова. СПб., 2010. Т. 3. С. 23-26.

17. BeamK. G., Knudson M. Calcium current in embryonic and neonatal mammalian skeletal muscle //J. Gen. Physiol. 1988. Vol. 91. P. 781-798.

18. Белостоцкая Г. Б., Захаров Е. А., ДарашинаИ. В. Дифференцировка скелетных мышечных клеток в культуре сателлитных клеток // Цитология. 2006. Т. 48. № 9. С. 743-744.

19. Grynkiewicz G., PoenieM., TsienR. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties // J. Biol. Chem. 1985. Vol. 260. P. 3440-3450.

20. Замай Т.Н., Замай А. С. Концентрация внутриклеточного кальция в асцитных клетках карциномы эрлиха с разной скоростью пролиферации // Фундаментальные исследования. 2004. № 1. С.122-123.

Статья поступила в редакцию 28 июня 2011 г.

Ю. В. Космотынская, Р. Т. Иманбаев, А. А. Богданов, Н. А. Касьяненко

АНАЛИЗ СОВМЕСТНОГО ДЕЙСТВИЯ РАДИАЦИИ И ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ ПЛАТИНЫ НА СТРУКТУРУ И СВОЙСТВА МОЛЕКУЛЫ ДНК В РАСТВОРЕ

Введение. Одним из первых противоопухолевых соединений на основе платины, нашедшим своё применение в медицине, стала цис-диаминдихлорплатина (цис-ДДП) [1, 2], которая широко используется при лечении, например, рака яичников, карциномы и ряда других опухолей [3, 4]. Однако клинические исследования показали, что, наряду с противоопухолевыми свойствами, цис-ДДП обладает высокой токсичностью и вызывает ряд побочных эффектов [5]. Поэтому большое внимание уделяется поиску и изучению новых соединений платины, обладающих противоопухолевой активностью и оказывающих более щадящее воздействие на организм [6, 7]. Для этого, в частности, широко используется комбинированное действие препаратов платины с веществами, способными улучшить терапевтический эффект [8-10]. Применяется и последовательное лечение пациентов разными препаратами платины, особенно после развития резистентности к одному из соединений. Так как некоторые препараты плохо растворимы в воде, на практике используют различные растворители, хорошо смешиваемые с водой, например ДМСО [11].

В связи с этим представляет интерес исследование взаимодействия препаратов платины с молекулой ДНК при изменении состава растворителя. Совместное использование на практике химиотерапии и у-облучения тканей требует изучения взаимного влияния этих двух факторов на основную мишень — молекулу ДНК. В последнее время большой интерес проявляется к комплексам платины с серосодержащими лигандами. Так как цис-ДДП после введения в плазму крови встречается с большим количеством серосодержащих соединений, они могут играть определённую роль при транспорте препаратов платины в организме [12]. Существует мнение, что модификация комплексов на основе платины путём введения в их первую координационную сферу лигандов, содержащих серу, может уменьшить токсический эффект [13, 14]. Перспективным соединением является ДМСО. Он малотоксичен (используется в пищевой и косметической промышленности), хорошо проникает через биологические мембраны [15].

Методы исследования и материалы.

Вискозиметрия. В представляемой работе использовали модифицированный низкоградиентный вискозиметр типа Зимма—Крозерса [16], а также градиенты скорости g в диапазоне 0,4-2,0 с-1. Характеристическую вязкость определяли экстраполяцией концентрационной зависимости приведённой вязкости к нулевой концентрации ДНК:

[т]] = lim -—= lim 11Т \

g^o n0C g^o C

c^o c^o

где п и по — вязкости раствора и растворителя; C — концентрация раствора, цг — его относительная вязкость. Согласно Флори, характеристическая вязкость макромолекулы связана с её параметрами соотношением

где Фо — константа Флори для данной системы полимер—растворитель (зависит от качества растворителя и жёсткости макромолекул [17-19]); Ы — молекулярная масса; а — коэффициент линейного набухания макромолекулы, равный отношению среднеквадратичных расстояний между концами реальной и идеальной молекулы:

Молекулярную массу ДНК определяли по значению характеристической вязкости в 0,15 М NaCl по формуле [ц] = 6,9 • 10-4M°'7 (дл/г).

Динамическое двойное лучепреломление (ДЛП). В работе использовали установку ДЛП с полутеневым эллиптическим компенсатором [20]. Зависимость двойного лучепреломления Дп растворов ДНК от градиента скорости потока д позволяет найти величину (Дп/(дСп°))д^о. Динамооптическая постоянная определяется из выражения

Дп

п = lim -.

дСцо

о^о

Отношение экспериментально определяемых величин [п]/[п] пропорционально оптической анизотропии макромолекулы (yi — у2), где yi и у2 — главные поляризуемости макромолекулы, которой приписывается одноосная симметрия оптических свойств. При отсутствии эффекта формы величина (Дп/д)д^°/(ц — По), определяемая при конечных концентрациях полимера в растворе, совпадает с отношением характеристических величин [п]/[п] и позволяет определить оптическую анизотропию статистического сегмента.

Спектральные методы. В работе использовали автодихрограф "Mark IV" (Jovin Ivon, Франция). Все измерения проводили в кювете длиной l = 5 см.

Спектральные исследования выполнялись на спектрофотометрах СФ-26, СФ-56, "Specord UV VIS".

Гамма-облучение производилось в аэробных условиях при комнатной температуре на установке ЛМБ-y-I (137Cs) с мощностью дозы облучения 40 Гр/мин и энергией квантов 0,662 МэВ в Институте цитологии РАН (Санкт-Петербург), а также на установке «Исследователь» (60Co) с мощностью дозы 20 Гр/мин и энергией квантов 1,332 МэВ в Санкт-Петербургском институте ядерной физики им. Б. П. Константинова. Концентрация ДНК во всех растворах лежала в пределах от 0,01 до 0,015 %. Доза облучения составила 1 крад.

Материалы. В работе использовалась тимусная ДНК фирмы «Sigma» (M = = 7,5 млн Да (11000 пар оснований)). Соединения платины синтезированы в Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии К. И. Яковлевым и в Санкт-Петербургском технологическом университете В. Н. Спеваком:

NH

NH-

Pt

Cl NH

Xl Cl

Pt

Cl

NH

-nh2 Cl

CH2 ^ zCl I 2 Pt

CH2 / \

NH

Cl

-NH_ CH x

Cl

I 2 ,CH3

NH2 CH3

CH

NO

a

3

(1 — цис-ДДП; 2 — транс-ДДП; 3 — Pten; 4 — Pten^MTO).) 206

Применяли диметилсульфоксид (СНз)280 фирмы «Реактив» (ММ = 78,13), а также соли металлов марки х.ч. Все измерения проводили при температуре 21 °С.

Экспериментальные результаты и их обсуждение. Клиническое использование препаратов платины, как и действие ионизирующего излучения, основано на повреждении ДНК опухолевых клеток. На практике часто встречается последовательное сочетание радиационной терапии с применением противоопухолевых препаратов. В связи с этим представляет большой интерес вопрос о совместном влиянии этих факторов на генетический аппарат клетки. Рассмотрим последовательное и совместное действие гамма-облучения и комплексообразования с координационными соединениями платины на молекулярном уровне, контролируя конформацию молекулы ДНК.

Известно, что соединения цис- и транс-ДДП образуют комплекс с молекулой ДНК только в растворах малой ионной силы [21, 22]. Авторы работы в качестве поддерживающего электролита использовали 0,005М ^С1.

В работах [23, 24] было показано, что при гамма-облучении дозой 1 крад происходит уменьшение объёма молекулы ДНК без изменения её термодинамической жёсткости. Существует мнение, что облучение влияет на зарядовые свойства макромолекулы, уменьшая заряд её фосфатных групп из-за взаимодействия с продуктами радиолиза воды [25, 26]. Это существенно изменяет взаимодействие ДНК с заряженными лиган-дами в растворе. Отсюда, надо полагать, связывание ДНК с цис- и транс-ДДП может измениться, если заряд макромолекулы играет важную роль при взаимодействии компонентов. Действительно, в растворе 1М ^С1 цис- и транс-ДДП с ДНК не взаимодействуют [21, 22]. Однако существует мнение, что большие концентрации ^С1 в растворе препятствуют акватации цис- и транс-ДДП, которая является необходимым звеном для реализации координационной связи платина—ДНК. Таким образом, проведённые исследования интересны не только с точки зрения изучения особенностей применения препаратов платины после поражений ДНК, вызванных гамма-облучением, но и для понимания механизма поражающего действия радиации.

В работе использовали тимусную ДНК (11000 пар оснований). При облучении растворов концентрация ДНК составляла 0,01-0,015 %. Мы использовали одинаковые концентрации препаратов платины С = 5 • 10~5М.

Эксперимент показал, что гамма-облучение растворов приводит к уменьшению величины [п]. Эти данные хорошо согласуются с результатами работы [22]. Образование комплексов цис-ДДП и транс-ДДП с необлучённой ДНК приводит к одинаковому падению значения характеристической вязкости макромолекулы [21, 22]. Комплексооб-разование соединений платины с облучённой ДНК вызывает падение её объёма для цис- и транс-ДДП. Следовательно, соединения платины так же хорошо связываются с гамма-облучённой ДНК, как и с нативной. Если изменение зарядовых свойств ДНК и происходит, это не отражается на взаимодействии макромолекулы с препаратами платины. Степень связывания, по-видимому, также одинакова для взаимодействия цис- и транс-ДДП с облучённой и необлучённой ДНК. Таким образом, мы не можем говорить о полном подавлении электростатических взаимодействий в рассматриваемых условиях, так как для реализации координационной связи соединения платины должны с помощью электростатических сил приблизиться к макромолекуле на расстояние, при котором возможно вовлечение группы ДНК в первую координационную сферу платины. Изучение влияния у-облучения на сформированный комплекс ДНК с цис-и транс-ДДП показало, что связывание препарата платины не препятствует действию облучения на ДНК, хотя характеристическая вязкость при этом падает меньше, чем при облучении свободной ДНК (рис. 1; таблица).

2-1 Де

-■- ДНК необл. -о- ДНК обл. -о- ДНК необл. + Р1еп (ДНК + Ргеп) обл. -лл ДНК обл. + Ргеп

Я, нм

220

240

260

280

300

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Рис. 1. Спектры КД ДНК в комплексах с препаратом Р1еп в 0,005М МаС1 при совместном и последовательном действии комплексообразова-ния и гамма-облучения

1

0

Результаты гидродинамических исследований комбинированного действия препаратов платины и гамма-облучения на молекулу ДНК в растворе 0,005М ^С!

Комплекс [л], дл/г Дп 8 2 , • 10® см • с"/г

(Мднк = 7,5 млн. Да) д{Лг - 1)ло

ДНК необл. 78 ±3 23 ± 2

ДНК обл. 1 крад 33 ±3 23 ± 2

(ДНК+цмс-ДДП) необл. 60 ±2 15 ±2

(ДНК обл. 1 крад + цис-ДДП) 25 ±2 15 ±2

(ДНК+цмс-ДДП)обл. 1 крад 36 ±3 -

(ДНК+тора.мс-ДДП) необл. 60 ±2 28 ± 2

(ДНК обл. 1 крад + тора.мс-ДДП) 25 ±3 30 ± 2

(ДНК+тора.мс-ДДП) обл. 1 крад 36 ±3 -

(ДНК обл. 1 крад + Р1еп обл. 1 крад) 24 ±2 -

(ДНК обл. 1 крад + Р1еп) 24 ±2 15 ±2

(ДНК обл. 1 крад + Р1епДМСО) 24 ±2 20 ± 2

(ДНК + Р1епДМСО) обл. 1 крад 37 ±3 22 ±2

(ДНК + Р1еп) обл. 1 крад 34 ±3 19 ±2

(ДНК + Р1еп) необл. 62 ±2 15 ±2

(ДНК + Р1епДМСО) необл. 60 ±2 19 ±2

При использовании соединений Р1еп и Р1еп(ДМСО) были получены аналогичные результаты. В таблице приведены также данные для комплексов облучённой ДНК с облучённым заранее той же дозой препаратом Р1еп и результат облучения сформированных комплексов ДНК с Р1еп и Р1еп(ДМСО). Эти данные совпали с рассмотренными выше зависимостями. Следовательно, облучение не влияет на возможность соединений платины связываться с ДНК. При облучении комплексов ДНК с Р1еп(ДМСО) величина [п] падает несколько меньше, что отличается от рассмотренных выше результатов для цис- и транс-ДДП, а также от результата действия облучения на свободную ДНК.

Исследования показали, что спектры УФ-поглощения соединений меняются незначительно при облучении, так же как и спектр УФ-поглощения ДНК и её комплексов с препаратами платины. Дестабилизации ДНК при гамма-облучении её комплексов не

происходит. Результаты, полученные методом КД, подтверждают выводы, сделанные при анализе данных спектрофотометрии. Ранее было показано [25, 26], что Р1еп образует две координационные связи с ДНК, а Р1еп(ДМСО) связывается монодентатно. Облучение не влияет на вид спектров КД ДНК, тогда как связывание ДНК с Р1еп при используемых концентрациях платины приводит к увеличению и сдвигу положительного максимума, а связывание с Р1еп(ДМСО) — к его понижению без сдвига. Спектры КД ДНК при комплексообразовании с Р1еп и Р1еп(ДМСО) различаются, что отражает разный способ связывания этих соединений с макромолекулой. Предварительное облучение ДНК не меняет характер взаимодействия изучаемых препаратов с ДНК, облучение комплексов также существенно не меняет вид спектров КД ДНК. И эти данные согласуются с результатами, полученными для препаратов цис- и транс-ДДП.

В работах [23, 24] с помощью методов ДЛП в потоке и вискозиметрии подробно исследованы конформационные изменения молекулы ДНК при гамма-облучении её растворов в области ионных сил 0,003М ^ ц ^ 0,1М ^С1. Было показано, что отношение динамооптической постоянной [и] к характеристической вязкости [п] ДНК, облучённой дозами 10-30 Гр, оставалось постоянным и равным значению, полученному для необлучённой ДНК, что указывало на неизменность жёсткости и вторичной структуры макромолекулы. Мы получили результаты, согласующиеся с этими выводами. Комплексообразование ДНК с соединениями платины вызывает изменение оптической анизотропии ДНК, зависящее от типа препарата. Облучение комплексов, как и взаимодействие соединений с облучённой ДНК, вызывают такие же изменения оптической анизотропии ДНК.

Ионизирующая радиация может вызывать различные структурные повреждения ДНК, наиболее опасными из них являются двунитевые разрывы [27]. Введение в биологические объекты перед облучением молекул-примесей, способных конкурировать с макромолекулами за активные продукты радиолиза воды, приводит к снижению радиационного поражения макромолекул. Существует мнение, что ДМСО является одним из таких соединений, — он способен перехватывать ОН-радикалы и в меньшей степени гидратированные электроны, несмотря на то, что взаимодействие ДМСО с ОН-ра-дикалами может привести к образованию СНз-радикалов [28, 29]. Как было показано выше, при облучении комплексов ДНК с препаратами платины меньшее падение характеристической вязкости фиксируется при использовании Р1еп(ДМСО). Это косвенным образом может указывать на протекторные свойства диметилсульфоксида, входящего в состав первой координационной сферы платины.

Мы провели изучение влияния облучения на молекулу ДНК в присутствии ДМСО. На рис. 2 показана зависимость от С (ДМСО) характеристической вязкости необлучён-ной ДНК 1 и ДНК 2, облучённой дозой 1 крад, при разных концентрациях ДМСО в растворе. Ионная сила растворов составляла 0,005М ^С1. Видно, что при облучении растворов ДНК, содержащих ДМСО, наблюдается защита макромолекулы от действия радиации. Об этом свидетельствует совпадение значений характеристической вязкости необлучённой и облучённой в присутствии ДМСО ДНК в некоторой области С(ДМСО). При этом оптическая анизотропия ДНК, облучённой дозой 1 крад в присутствии разных концентраций ДМСО, совпадает со значением, полученным для необлучённой ДНК в присутствии ДМСО. Исследования показали, что ДМСО связывается с облучённой ДНК в растворе, но вызывает меньшее изменение объёма ДНК. Зависимость характеристической вязкости растворов облучённой ДНК с последующим добавлением разных концентраций ДМСО сходна с зависимостью для необлучённых растворов. Таким образом, наши исследования подтвердили предположение о том, что

Рис. 2. Зависимость характеристической вязкости необлучённой ДНК в присутствии разных концентраций ДМСО (l) и ДНК в присутствии разных концентраций ДМСО после облучения дозой 1 крад (2) от концентрации ДМСО в растворе; зависимость характеристической вязкости ДНК облучённой дозой 1 крад, с последующим добавлением разных концентраций ДМСО от С(ДМСО) в растворе (5)

ДМСО является перехватчиком свободных радикалов, образующихся при радиолизе воды, и защищает ДНК от поражающего действия радиации.

Литература

1. Rosenberg B., Van CampL., Krigas T. Inhibition of cell division in Escherichia Coli by electrolysis products from a platinum electrode // Nature. 1965. Vol. 205. P. 698-699.

2. Rosenberg B., Van CampL., Trosko J. E, Mansour V. N. Platinum compounds: a new class of potent antitumour agents // Nature. 1969. Vol. 222. P. 385-386.

3. Oliver T, MeadG. Testicular cancer // Curr. Opin. Oncol. 1993. Vol. 5. P. 559-567.

4. Stathopoulos G. P., Rigatos S., MalamosN. A. Paclitaxel combined with cisplatin as second-line treatment in patients with advanced non-small cell lung cancers refractory to cisplatin // Oncol. Rep. Vol. 6. 1999. P. 797-800.

5. Hill J. M., SpeerR. J. Organo-platinum complexes as antitumor agents (review) // Anticancer Res. Vol. 2. 1982. P. 173-186.

6. Wong E, Giandomenico C. M. Current status of platinum-based antitumor drugs // Chem. Rev. 1999. Vol. 99. P. 2451-2466.

7. WeissR. B., ChristianM. C. New cisplatin analogs in development: a review // Drugs. 1993. Vol. 46. P. 360-377.

8. Overgaard J., Khan A. R. Selective enhancement of radiation responce in a C3H mammary carcinoma by cisplatin // Cancer Treat. Rep. 1981. Vol. 65. P. 501-503.

9. BartelinkH., KallmanR. F., Rapacchietta D., Hart G. A. M. Therapeutic enhancement in mice by clinically relevant dose and fractionation schedules of cis-diamminedichloroplatinum(II) and irradiation // Radiother. Oncol. 1985. Vol. 6. P. 61-74.

10. Kallman R. F., Bedarida G., Rapacchietta D. Experimental studies on shedule dependence in the treatment of cancer with combinations of chemotherapy and radiotherapy // Radiotherapy/chemotherapy interactions in cancer therapy / ed. by J.L.Meyer, J. M. Vaeth. Karger., 1992.

11. Yakovlev G. M., Vinogradsky O. V., Pekshev A. P. New medications // Express information. 1980. Vol. 10. P. 2-5.

12. Barnham K. J., DjuranM. I., Murdoch P. S. et al. l-Methionine increases the rate of reaction of 5-guanosine monophosphate with anticancer drug cisplatin: mixed-ligand adducts and reversible methionine binding //J. Chem. Soc. Dalton Trans. 1995. P. 3721-3726.

13. Reedijk J. Why does cisplatin reach guanine-N7 with competing S-donor ligands available in the cell? // Chem. Rev. 1999. Vol. 99. P. 2499-2510.

[П], дл/г

С(ДМСО), М

14. ReedijkJ., Teuben J. M. Platinum-sulfur interactions involved in antitumor drugs, rescue agents, and biomolecules in cisplatin // Chemistry and Biochemistry of a Leading Anticancer Drug / ed. by B. Lippert. Zurich, 1999. P. 339-362.

15. Busby W. F. Jr., Ackermann J. M., Crespi C. L. Effect of methanol, ethanol, dimethyl sul-foxide, and acetonitrile on in vitro activities of cDNA-expressed human cytochromes P-450 // Drug Metab. and DISP. 1998. Vol. 27. P. 246-249.

16. Frisman E. V., Schagina L. V., Vorobyev V. I. A glass rotation viscometer // Biorheology. 1965. Vol. 2. P. 189-194.

17. ПтицынО. Б., Эйзнер Ю. Е. Гидродинамика растворов полимеров. IV. О влиянии объёмных эффектов на рассеяние света и константу трения макромолекул в растворе // Высоко-мол. соед. 1959. Т. 1. № 7. С. 966-977.

18. ПтицынО. Б., Эйзнер Ю. Е. Гидродинамика растворов полимеров. II. Гидродинамические свойства макромолекул в хороших растворителях // Журн. техн. физики. 1959. Т. 29. С. 1117-1134.

19. YamakawaH., FujiiM. Intrinsic viscosity of wormlike chains determination of the salt factor // Macromol. 1974. Vol. 7. № 1. P. 128-135.

20. Цветков В. Н., ЭскинВ. Е., Френкель С. Я. Структура макромолекул в растворах. М., 1964.

21. Касьяненко Н. А., Карымов М. А., Дьяченко С. А. и др. Исследование взаимодействия молекулы ДНК с координационными соединениями двухвалентной платины(П). Влияние природы и расположения лигандов в первой координационной сфере платины // Молекуляр. биология. 1995. Т. 29. С. 585-594.

22. КасьяненкоН. А., Фрисман Э. В., Валуева С. В. и др. Исследование взаимодействия молекулы ДНК с координационными соединениями двухвалентной платиныД). Взаимодействие цис-ДДП с молекулой ДНК // Молекуляр. биология. 1995. Т. 29. С. 345.

23. Зарубина О. П. Влияние у-излучения на молекулярные параметры ДНК в водно-солевых растворах: дис. ... канд. физ.-мат. наук. Л., 1987.

24. Frisman E. V., Zarubina O. P. Effect of y-irradiation on the conformation of the native DNA molecule // Biophys. Chem. 1993. Vol. 46. P. 37-46.

25. Космотынская Ю. В. Влияние состава растворителя и гамма-облучения на взаимодействие молекулы ДНК с координационными соединениями платины: дис. ... канд. физ.-мат. наук. СПб., 2006.

26. КасьяненкоН. А., Богданов А. А., КосмотынскаяЮ. В, СпевакВ.Н. Комплексы ДНК с соединениями двухвалентной платины в присутствии диметилсульфоксида // Журн. физ. химии. 2002. Т. 76. № 11. С. 2043-2048.

27. ГазиевИ. Повреждение ДНК в клетках под действием ионизирующей радиации // Радиационная биология. Радиоэкология. 1999. Т. 39. № 6. С. 630-638.

28. LimoliC., Kaplan M., Giedzinski E., Morgan W. F. Attenuation of radiation-induced genomic instability by free radical scavengers and cellular proliferation // Free Radical Biol. and Med. 2001. Vol. 31. N 1. P. 10-19.

29. Bardouki H., Barcellos da RosaM., Mihalopoulos N. et al. Kinetics and mechanism of the oxidation of dimethylsulfoxide (DMSO) and methanesulfinate (MSI-) by OH radicals in aqueous medium // Atmospheric Environment. 2002. Vol. 36. P. 4627-4634.

Статья поступила в редакцию 28 июня 2011 г.

И. А. Силантьева, П. Н. Воронцов-Вельяминов

ИССЛЕДОВАНИЕ РЕШЁТОЧНЫХ МОДЕЛEЙ ПОЛИМЕРНЫХ ЦЕПЕЙ И ЗВЁЗД МЕТОДОМ МОНТЕ-КАРЛО С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АЛГОРИТМА ВАНГА—ЛАНДАУ

Введение. В последнее время полимерные звёзды являются предметом многочисленных теоретических и экспериментальных исследований [1—3]. Это связано с возможностью использования данных молекул для доставки лекарственных веществ и ДНК в клетки [4, 5]. Полимерные звёзды — простейший пример модели разветвлённых макромолекул. Поэтому знание их равновесных свойств и структуры может быть важно для исследования макромолекул более сложной архитектуры.

Целью представляемой работы является применение метода Монте-Карло (МК) с использованием алгоритма Ванга—Ландау (В-Л) для вычисления плотности состояний полимерных цепей и звёзд. Полученные распределения дают возможность рассмотреть в широком диапазоне температур равновесные свойства исследуемых макромолекул, такие как внутренняя энергия, энтропия, теплоёмкость. В поле зрения оказались цепи длиной N ^ 120 мономеров и звёзды с шестью лучами длиной Nл = 5,12, 20 сегментов каждый (общее число сегментов в звезде N = 30, 72,120). Аналогичная задача была успешно решена для полимерных цепей и колец в работах [6, 7]. Исследование полимерных цепей может быть полезно, несмотря на то, что они подробно исследованы ранее. Во-первых, сравнение результатов даёт уверенность в правильности работы алгоритма, во-вторых, возможность сопоставить результаты для цепей и для звёзд.

В атермическом случае рассчитана доля самонепересекающихся конформаций исследуемых молекул. В термическом случае отбирались самонепересекающиеся конфор-мации и вычислялись распределения по числу контактов между мономерами.

Метод. Для выполнения работы использовался метод энтропического моделирования [8, 9] (одна из модификаций метода Монте-Карло) по алгоритму В-Л, который был предложен в 2001 г. [10] и постепенно нашёл широкое применение для исследования полимерных и других систем. Алгоритм В-Л является реализацией метода энтропического моделирования. Он решает проблему подбора подходящих вероятностей перехода для получения требуемого при энтропическом моделировании равномерного посещения энергетических состояний и, соответственно, позволяет получить плотность состояний П(Е). В общем случае диапазон изменения энергии системы Ет1П ^ Е ^ Етах разбивается на конечное число (^ь) равных отрезков («ящиков»). Заводится массив плотности состояний П, состоящий из элементов, каждый из которых соответствует отрезку разбиения энергии. Изначально все элементы П берутся равными единице. Процедуру можно сделать более удобной для машинного счёта, если перейти к энтропии состояний Б(Е) = 1пП(Е) (начальные состояния Б, = 0). В процессе вычислительного эксперимента на каждом МК-шаге происходит изменение конформации системы. Пусть Е, и Е^ — энергии системы до и после изменения. Каждая из них попадает в свой «ящик» — г-й и ]-й соответственно (номера г и ] могут совпадать). В таком случае изменения в системе принимаются с вероятностью

р(Е, ^ Ез) = шш(1, ) = тт(1,е^"^).

В случае отказа система возвращается в исходное состояние.

После принятия или непринятия новой конформации системы всё повторяется на новом МК-шаге. Каждый раз при посещении к-го «ящика» (в случае принятия изменений системы к = ], при отказе к = г) проводится изменение к-го элемента массива Б: к добавляется слагаемое ДБ. Ряд таких элементарных шагов составляет серию. На протяжении серии МК-шагов величина ДБ остаётся неизменной. На каждой последующей серии ДБ уменьшается: ДБ ^ с ДБ с инкрементом 0 < с < 1. Одновременно с массивом Б заводится массив посещений и, элементы которого изначально равны нулю. На каждом МК-шаге в ячейку , соответствующую посещению к-го «ящика», добавляется единица. Во время счёта необходимо следить, чтобы гистограмма посещений оставалась равномерной с достаточной степенью точности. В результате использования этого алгоритма происходит автоматическая настройка весов вероятности перехода, которые одновременно являются плотностями состояний. По окончании расчёта вычисляется массив 0.(Е) = ехр(Б(Е)) и нормируется на единицу. В качестве величины, по которой мы находим распределение, может выступать не обязательно энергия, а любая величина, зависящая от конформации системы, например число самопересечений.

Отметим, что за последние примерно пять лет резко возросло число работ, в которых данный алгоритм использовался для изучения полимеров [11-14]. Особенно эффективен он для исследования фазовых переходов, так как позволяет получить характеристики в широком диапазоне температур и при этом функция плотности состояний рассчитывается только один раз.

Модель. В рамках решёточной модели полимерная цепь представляется как случайное блуждание на 3-мерной решётке. Различают фантомное и полуфантомное блуждания [7]. В нашей работе использовалось полуфантомное блуждание. Преимущество полуфантомного блуждания состоит в том, что доля самонепересекающихся конфор-маций среди полуфантомных существенно больше, чем среди фантомных. Под цепью длиной N будем понимать цепь, имеющую N связей и N +1 мономер. Полимерная звезда из шести лучей представляет собой 6 полимерных цепей длиной Nл, закреплённых одним концом в центре. В нашем моделировании полимер описывается набором координат (хг, уг, хг), где г = [0,Ж]. В случае цепи её начальная точка и первый сегмент неподвижны, в случае звезды — центр и первый сегмент каждого луча звезды остаются неподвижными. Остальные сегменты генерируются с помощью случайного полуфантомного блуждания на решётке.

Чтобы изменить конформацию цепи, мы выбираем одну из точек от 1 до N — I (точку ко) и строим новый кусок полуфантомной цепи между точками ко и ко + I [6], где I — число сегментов в модифицируемом куске длиной [N/20]-[N/10]. Проверяется, не пересекается ли этот участок сам с собой и с участком цепи до точки ко. Оставшийся участок цепи подвергаем параллельному переносу, учитывая, что после сдвига цепь должна оставаться полуфантомной. Далее проверяем, нет ли самопересечений в модифицированной цепи. Если есть, то модифицируем заново тот же самый кусок, пока не получим конформацию без самопересечений. Таким образом, для отбора самонепересекающихся траекторий мы используем алгоритм безусловных случайных блужданий.

Для изменения конформации звезды сначала выбирался один из шести лучей, затем выбирался сегмент ко этого луча и производилась его модификация подобно тому, как это было проделано для цепи. В термическом случае для упрощения алгоритма луч модифицировался от сегмента ко + 1 до конца. После изменения конформации полимера вычисляем число контактов в полученной молекуле и производим процедуру согласно алгоритму В-Л. В большинстве случаев вычисления включают 30-60 серий (для цепи 30 серий) с начальными значениями Бг = 0, ДБг = 0,001 + 0,1 и инкрементом 0,9. Длина

серии зависит от длины цепи и составляет 1-10 млн шагов для N =12 + 120. Время каждого расчёта составляло не более 15 ч на стандартном 4-ядерном процессоре.

Результаты.

Атермический случай. В атермическом случае взаимодействие сводится к запрету на самопересечение мономеров. Целью является вычисление доли самонепересекающихся конформаций в зависимости от числа N мономеров в молекуле. Для отбора самонепересекающихся конформаций мы использовали сначала два «ящика»: конфор-мации без самопересечений и все остальные. Таким образом удалось получить долю самонепересекающихся конфромаций для цепей длиной N ^ 100 с погрешностью менее 1 %, а с использованием пяти «ящиков» (т. е. самопересекающиеся конформации складывались в несколько «ящиков») — до N ^ 300 с погрешностью 1 %. Погрешность вычислялась по отношению к результатам, рассчитанным с использованием формулы скейлинга. Известно, что число самонепересекающихся конфигураций для цепи длиной N на решётке определяется соотношением скейлинга [6]

Ск = Ац^ N

Для простой кубической решётки А = 1,2079, константа связи ц = 4,684043, восприимчивость у = 1,1568. Полное число конформаций для полуфантомной цепи длиной N есть х(х — 1)№-1, где х — число ближайших соседей на решётке. Для трёхмерной ПК решёти 2 = 6. Тогда доля самонепересекающихся конформаций для полуфантомной цепи

о- У^1 (!)

Стоит отметить, что долю самонепересекающихся траекторий для свободной цепи можно вычислять помимо алгоритма В-Л, например методом ветвления траекторий [15] или используя Р^с^-алгоритм [16].

Рассмотрим полимерную звезду. Если длина луча N < 10 звеньев (т. е. менее 60 звеньев в звезде), то долю самонепересекающихся конформаций По можно найти по алгоритму В-Л, используя только 2 «ящика»: для конформаций с пересечениями и без. Для N > 10 двух «ящиков» становится недостаточно. В этом случае используется следующий способ. С помощью алгоритма безусловного блуждания определяется граница иь диапазона [0, иь], в который попадает не менее 99 % событий от всего распределения по самопересечениям. Далее на отрезке [0,иь] проводится процедура В-Л (100 серий, по 0,5-1 млн шагов в серии, начальное значение ДБ = 0,1, с = 0,9) и, таким образом, определяется По. Конформации с числом самопересечений, превышающим иь, не учитываются (доля таких случаев < 3 %), полагается, что они не оказывают существенного влияния на конечный результат.

Данный алгоритм был протестирован в ситуации, когда не учитывалось взаимопересечение лучей. Результат сравнивался с формулой По = Пол, где Пол — доля самонепересекающихся конформаций для цепи длиной Nл, вычисленная по формуле (1). Данные представлены в табл. 1.

Как видно из табл. 1, данные математического эксперимента хорошо согласуются с формулой скейлинга. Это даёт уверенность в том, что программу можно использовать для дальнейших исследований модели звезды. Затем было включено атермиче-ское взаимодействие между лучами (учёт взаимных пересечений) и рассчитана доля

0 г

-0,1 -0,2 -0,3 -0,4 -0,5 -0,6 -0,7

0

0,02

0,04 0,06

1/N

0,08

0,1

Рис. 1. Удельная избыточная энтропия (относительно энтропии фантомной цепи) в зависимости от обратного числа сегментов для звезды из шести лучей (закрашенные точки) — данные, полученные по алгоритму В-Л, аппроксимированные по методу наименьших квадратов (сплошная кривая); для цепи (длинный пунктир) — зависимость, рассчитанная по формуле (1); для колец [7] (короткий пунктир) — приведена для сравнения:

крестики — данные для одного луча звезды (алгоритм В-Л) при условии, что лучи не взаимодействуют между собой; Пол = (По)1/6; точки хорошо ложатся на кривую, построенную по формуле скейлинга; предельные значения при N ^ те, —0,2476 для свободной цепи, —0,2494 для звезды, —0,2495 для колец

самонепересекающихся конформаций по описанному алгоритму для звёзд с суммарной длиной сегментов N ^ 720 ^ 120). Зная долю самонепересекающихся конформаций, можно получить зависимость удельной избыточной энтропии ДS/N от 1/N (1). Полное число конформаций полуфантомной звезды с шестью лучами есть г\(г — 1)№-1)6 =

Таблица 1

Доля самонепересекающихся конформаций для полимерной

звезды при отсутствии взаимодействия между лучами

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

= z!(z - 1)

N-6

Тогда энтропия звезды в атермиче-

ском случае может быть сведена к формуле

По, В-Л пъ По, скейлинг

12 9,74Е-02 30 9,78Е-02

30 2,010Е-04 60 2,01Е-04

50 1,326Е-07 90 1,323Е-07

S = - 1Г~ЬПП) = In z +(N- 1) In - + In

6

5 (z - 2) !

(z - 1)4

ln Пп

где N — полное число сегментов в звезде; По — доля самонепересекающихся конформаций среди полуфантомных. Первое слагаемое — энтропия фантомной цепи длиной N, второе слагаемое — энтропия полуфантомной цепи длиной N относительно фантомной цепи, третье слагаемое — добавка, связанная с тем, что первые 6 сегментов закреплены в центре. Удельная избыточная энтропия звезды относительно энтропии фантомной цепи

ДБ Л 1 \ , 5 1,0* — 2)! 1 — = ( 1 " - ) 1п - + - 1п

N

6 N (z - 1)4

+ tt In ПС

N

На рис. 1 представлена зависимость AS/N от 1/N для звезды, полученная в результате численного эксперимента, для цепей — построенная на основе формулы скейлинга

и колец — из работы [7]. Зависимость для звезды мы аппроксимировали по методу наименьших квадратов функцией / (х) = Ах 1п(х) + Вх + С, х = N-1. И получили для коэффициентов следующие значения: А = 0,7399, В = —1,4837, С = -0,2494. Предельное значение удельной избыточной энтропии при N ^ ж для звёзд С = —0,2494 с достаточной точностью совпадает с аналогичным значением для свободных цепей С8с = —0,2476 (скейлинг) и колец Ст-те = —0,2495. Таким образом, можно утверждать, что при N ^ ж удельная избыточная энтропия для звёзд, колец и цепей стремится к одному и тому же пределу.

Термический случай. В термическом случае полагается, что каждой паре несоседних по цепи мономеров, находящихся в контакте, отвечает некоторая энергия (е > 0 или е < 0). Конфигурационная энергия полимера есть Е = ет. Задача состоит в том, чтобы найти распределение самонепересекающихся конформаций полимера по числу контактов т. Число контактов полимерной молекулы меняется в пределах [0,ттах]. Максимальное число контактов ттах для цепи оценивалось по формуле, приведённой в работе [17]:

ттах = т8р;га1 < — + 1)Лс + ¿С],

Таблица 2 Максимальное число контактов

для самонепересекающихся конформаций полимерной цепи, полученное в процессе моделирования по алгоритму В-Л и рассчитанное по формуле (2)

(2)

N пгтах, В-Л пгтах, расчёт

12 9 10

20 18 20

30 32 33

50 59 61

100 133 137

Таблица 3 Максимальное число контактов

для самонепересекающихся конформаций полимерной цепи, полученное методом ветвления и рассчитанное по формуле (2)

N гпщах, ветвление пгтах, расчёт

50 59 61

100 136 137

150 216 217

200 297 300

300 460 468

где N — длина цепи; с! =3 — размерность пространства; ас = с! — 1, Дс = (! — 1)/!. В табл. 2 приведены данные для ттах, полученные в численном эксперименте и по вышеприведённой формуле. Данные моделирования не превышают значений расчёта, а значит, не противоречат ей.

Максимальное число контактов для более длинных цепей было оценено независимым методом ветвления траекторий [15]. Результаты приведены в табл. 3. Формула (2) даёт немного завышенное значение относительно численного эксперимента. Как отмечено в работе [17], максимальное число контактов важно как техническая стартовая точка в тестировании моделей самонепересекающихся блужданий и так как оно определяет внутреннюю энергию компактных полимеров (например, белков). Несоответствие между ттах и численной оценкой ттах может служить критерием, насколько хорошо смоделированы эти компактные конфигурации.

Максимальное число контактов для

звезды меньше либо равно максимальному числу контактов для цепей. Так, например, для цепи длиной N = 30 ттах = 32, в то время как для звезды с тем же суммарным количеством сегментов (^л = 5) ттах = 29. Разница связана с ограничениями, наложенными на сегменты в звезде, — пришивка лучей в общей точке. На рис. 2 приведено распределение по числу контактов для цепей длиной 12, 30, 50, 100 сегментов. Можно отметить, что вероятность генерации самонепересекающейся конформации со значениями т, близкими к ттах, достаточно мала

1,Е+00 1,Е-02 1,Е-04 1,Е-06 1,Е-08 1,Е-10 1,Е-12 1,Е-14 1,Е-16 1,Е-18 С? 1,Е-20 1,Е-22 1,Е-24 1,Е-26 1,Е-28 1,Е-30 1,Е-32 1,Е-34 1,Е-36 1,Е-38 1,Е-40

Рис. 2. Распределение самонепересекающихся конформаций по числу контактов для цепей длиной 12, 30, 50, 100 сегментов, полученное по алгоритму В-Л (закрашенные точки), и аналогичные данные из работы [6]: круги (М = 12), квадраты (М = 30), треугольники (М = 50), ромбы (М = 100)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130

т

Рис. 3. Диаграмма посещений, полученная при вычислении распределения по числу контактов для N = 30 (1), 50 (2), 100 (3):

для М = 12 диаграмма полностью плоская и здесь не приведена

0,04 0,035 0,03 0,025 - 0,02 0,015 0,01 0,005 0

10 30 50 70 90 110 130

т

и для N = 100 не удаётся уравновесить «ящики» посещений этих конформаций (в них попадает очень мало) (рис. 3). Так что на рис. 3 участок графика 2 для т > 128 N = 100) подлежит специальному рассмотрению. И даже для для N = 30 и 50 последняя точка диаграммы 3 сильно выбивается из равномерного посещения, т. е. сложно моделировать компактные конформации. Компактные конформации вносят существенный вклад в конфигурационную энергию при низких температурах и е < 0. В остальных случаях «хвост» распределения не будет оказывать значительного влияния на

1,E+01 1,E-01 1,E-03 1,E-05 1,E-07 1,E-09 1,E-11 1,E-13 1,E-15 1,E-17 1,E-19 cf 1'E-21 1,E-23 1,E-25 1,E-27 1,E-29 1,E-31 1,E-33 1,E-35 1,E-37 1,E-39 1,E-41 1,E-43 1,E-45

Рис. 4- Распределение по числу контактов для звёзд (чёрные точки) с длиной лучей 5, 12, 20 сегментов и цепей с таким же (как и в звезде) числом сегментов N = 30 (круги), 72 (квадраты), 120 (треугольники):

вертикальные пунктирные линии соответствуют максимальному числу контактов для цепей, полученному в процессе моделирования

результат для конфигурационной энергии. На рис. 2 для сравнения также представлены данные, полученные в работе [6] с помощью фантомного блуждания. Видно, что использование фантомных цепей не позволило получить информацию о распределении по числу контактов в маловероятных случаях. Особенно сильно результаты различаются для длинных цепей (N = 100).

На рис. 4 показано распределение по числу контактов для звёзд с длиной лучей N = 5,12, 30 и для цепей с таким же числом сегментов, как и у звёзд, т. е. N = = 30, 72,120. Зависимости для звёзд и цепей различаются, но достаточно близки друг к другу. Для звёзд, как и для цепей, распределение имеет один максимум.

Литература

1- Romiszowski P., Sikorski A. Temperature dependence of properties of star-branched polymers: a computer simulation study //J- Chem. Phys. 1998- Vol. 109- N 7- P. 2912-2920.

2. Cameron D. J. A., Shaver M. P. Aliphatic polyester polymer stars: synthesis, properties and applications in biomedicine and nanotechnology // Chem. Soc. Rev. 2011. Vol. 40. P. 1761-1776.

3. Бирштейн Т. М., Меркурьева А. А., Лирмэйкерс Ф. А. М., Рудь О. В. Конформации полимерных и полиэлектролитных звёзд // Высокомол. соединения. (А). 2008. Т. 50. № 8. C. 1-18.

L_l_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_и_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_1_L

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170

4. AryalS., Prabaharana M., PillaS., GongaS. Biodegradable and biocompatible multi-arm star amphiphilic block copolymer as a carrier for hydrophobic drug delivery // Int. J. Biol. Macro-molecules. 2009. Vol. 44. P. 346-352.

5. Georgiou T. K, VamvakakiM., Phylactou L. A., Patrickios C. S. Synthesis, characterization and evaluation as transfection reagents of double-hydrophilic star copolymers: effect of star architecture // Biomacromolecules. 2005. Vol. 6. N 6. P. 2290-2997.

6. Vorontsov-Velyaminov P. N., VolkovN. A., Yurchenko A. A. Entropic sampling of simple polymer models within Wang—Landau algorithm //J. Phys. (A). 2004. Vol. 37. P. 1573-1588.

7. Volkov N. A., Yurchenko A. A., Lyubartsev A. P., Vorontsov-Velyaminov P. N. Entropic sampling of free and ring polymer chains // Macromol. Theory and Simul. 2005. Vol. 14. P. 491-504.

8. BergB. A., Neuhaus T. Multicanonical ensemble: a new approach to simulate first-order phase transitions // Phys. Rev. Lett. 1992. Vol. 68. P. 9-12.

9. Lee J. New Monte Carlo algorithm: entropic sampling // Phys. Rev. Lett. 1993. Vol. 71. P. 211-214.

10. WangF., Landau D. P. Efficient, multiple-range random walk algorithm to calculate the density of states // Phys. Rev. Lett. 2001. Vol. 86. P. 2050-2053.

11. Parsons D. F., Williams D. R. M. An off-lattice Wang—Landau study of the coil-globule and melting transitions of a flexible homopolymer // J. Chem. Phys. 2006. Vol. 124. P. 221103.

12. Parsons D. F., Williams D. R. M. Globule transitions of a single homopolymer: A Wang—Landau Monte Carlo study // Phys. Rev. (E). 2006. Vol. 74. P. 041804.

13. SeatonD. T., Wust T., Landau D. P. A Wang—Landau study of the phase transitions in a flexible homopolymer // Computer Phys. Communications. 2009. Vol. 180. P. 587-589.

14. SeatonD. T., Wust T., Landau D. P. Collapse transitions in a flexible homopolymer chain: application of the Wang—Landau algorithm // Phys. Rev. (E). 2010. Vol. 81. P. 011802.

15. Melas V. B. Optimal Simulation Design by Branching Technique // Model-Oriented Data Analysis / ed. by W.G.Mueller, H. P. Wynn, A. A. Zhygliavsky. Heidelberg, 1993. P. 113-127.

16. ClisbyN. Efficient Implementation of the Pivot Algorithm for Self-avoiding Walks //J. Stat. Phys. 2010. Vol. 140. P. 349-392.

17. Douglas J., Ishinabe T. Self-avoiding-walk contacts and random-walk self-intersections in variable dimensionality // Phys. Rev. (E). 1997. Vol. 51. P. 1791-1817.

Статья поступила в редакцию 28 июня 2011 г.

А. В. Струц, М. Ф. Браун

СТРУКТУРНАЯ ДИНАМИКА РЕТИНАЛЯ В ПРОЦЕССЕ АКТИВАЦИИ РОДОПСИНА*

Введение. Родопсин, ответственный за сумеречное зрение позвоночных, является представителем класса мембранных белков, так называемых рецепторов, сопряжённых с G-белком (англ. G protein-coupled receptors, GPCRs), регулирующих множество важнейших функций организма. Более трети лекарств, разрабатываемых в настоящее время, направлены на лечение заболеваний, связанных с нарушениями работы данных белков. Структура большинства GPCRs сегодня неизвестна. Это связано со сложностью их кристаллизации для рентгеноструктурного анализа и плохой растворимостью в воде вследствие наличия значительной гидрофобной поверхности, что затрудняет структурный анализ методами ЯМР высокого разрешения. Несмотря на последние результаты рентгеноструктурного анализа родопсина в активном состоянии (мета II) [1, 2], механизм активации рецептора остаётся невыясненным, что обусловлено, в частности, противоречивостью полученных структурных данных. В представляемой работе показано, как спектроскопия ядерного магнитного резонанса на дейтерии (ЯМР-2Н) позволяет исследовать локальную трёхмерную структуру, а также динамику родопсина и тем самым предоставляет данные, дополняющие результаты рентгеноструктурного анализа и необходимые для понимания активации рецептора.

В работе исследовали родопсин, регенерированный с ретиналем, селективно дейте-рированным по метильным группам в позициях С5, С9 и С13 (рис. 1, а). Затем белок был рекомбинирован с фосфолипидными мембранами, которые ориентировали на ультратонких стеклянных пластинах. Для приготовления темнового состояния и мета-родопсина I применяли 1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (POPC) в молярном соотношении белок — липиды 1:50 [3]. Для метародопсина II использовали смесь из 25 % POPC и 75 % 1,2-диолеоил^п-глицеро-3-фосфатидилэтаноламина (DOPE)

а б

Рис. 1. Определение структуры и динамики лиганда ретиналя родопсина с использованием селективно дейтерированных метильных групп: а — химическая структура ретиналя с нумерованными атомами углерода; б — преобразование систем координат для тензора квадрупольных взаимодействий при расчёте теоретических спектров ЯМР-2Н и времени релаксации

* Работа выполнена при поддержке Американского национального института здоровья (иЯ ШН), гранты № ЕУ012049 и ЕУ018891. © А. В. Струц, М. Ф. Браун, 2011

Рис. 2. Спектры ЯМР-2Н ретиналя в связывающем кармане родопсина в темновом (а) и мета I (б) состоянии родопсина и структуры ретиналя, рассчитанные из спектров ЯМР-2Н в темновом состоянии (в) и метародопсине I (г): спектры получены при ориентации мембранной нормали параллельно по отношению к магнитному полю при температурах —150 и —100 °С для родопсина и метародопсина I соответственно

в соотношении 1:75 с фосфолипидами [4]. Использование различного липидного состава мембран, а также рН и температур позволило стабилизировать предактивное (мета I) и активное (мета II) состояния рецептора. В результате анализа спектров ЯМР-2Н определена структура лиганда ретиналя в темновом состоянии родопсина и метародоп-сине I. Измерение времени ЯМР-релаксации выявило динамику ретиналя во всех трёх исследованных состояниях: темновом, мета I и мета II.

Расчёт структуры ретиналя в родопсине из формы линий ЯМР-2^ Использование ориентированных мембран, содержащих родопсин, позволяет определить ориентацию тензора квадрупольных взаимодействий ядер дейтерия относительно нормали к поверхности мембраны (вектор по на рис. 1, б). Для дейтерированных ме-тильных групп, испытывающих быструю переориентацию (вращение) вокруг их оси симметрии, направление этого тензора совпадает с осью вращения (осью симметрии) метильной группы М, т. е. определяется среднее значение угла Омв(^) между векторами М и по. На рис. 2, а, б представлены спектры ЯМР-2Н родопсина и метародопсина I, полученные для образцов с различными дейтерированными метильными группами.

При расчёте теоретических спектров ЯМР-2Н и их подгонке к экспериментальным спектрам варьируются следующие параметры: ориентация связи С-С2Нз метильной группы, ширина распределения локальных мембранных нормалей по ориентациям, остаточные квадрупольные взаимодействия ядер дейтерия и уширение линии ЯМР. Распределение мембранных нормалей по ориентациям, учитывающее неполное (несовершенное) ориентирование мембран на стеклянных пластинках, моделировалось распределением Гаусса. Уменьшение квадрупольных взаимодействий ядер дейтерия ме-тильной группы с градиентом электрического поля в молекуле происходит за счёт быстрого вращения метильных групп и их переориентации. В расчёте также учитывается осевая симметрия распределения молекул родопсина относительно их собственной длинной оси, которая совпадает с направлением нормали к поверхности мембраны. Форма линий ЯМР-2Н была получена путём случайной генерации угла поворота

родопсина вокруг длинной оси и угла отклонения локальной мембранной нормали от среднего значения в соответствии с их функциями распределения и последующего усреднения спектров по ориентациям. Ранее такая методика применялась для определения ориентации молекулярных групп в бактериородопсине в пурпурных мембранах, а также ориентированных нитях ДНК [5]. В результате анализа спектров ЯМР-2Н получены следующие ориентации метильных групп по отношению к длинной оси родопсина: 70, 52 и 68° в темновом состоянии и 72, 53 и 59° в метародопсине I для позиций С5, С9 и С13 соответственно (см. рис. 1) [3, 6].

Моделирование структуры ретиналя проводилось в рамках модели с тремя плоскостями А, В и С (см. рис. 2, в, г), в пределах которых отклонениями торсионных углов связей от идеальной транс-конфигурации пренебрегали (т. е. полиеновая цепочка считалась плоской в рамках плоскостей), и рассчитывались торсионные углы только для связей на границах плоскостей. Как показало последующее сравнение с кристаллографическими данными для темнового состояния, такая модель хорошо соответствует реальной структуре ретиналя в связывающем кармане родопсина. Следует заметить, что ориентации самих метильных групп никак не связаны с использованной моделью ретиналя, а получаются непосредственно из спектров ЯМР и могут быть сопоставлены с результатами рентгеноструктурного анализа [3]. Сравнение показывает, что данные ЯМР хорошо согласуются с большинством кристаллографических данных. Особенно хорошее совпадение (в пределах погрешности измерений) получено с последней наиболее точной кристаллографической структурой родопсина, определённой с разрешением 2,2 А [7], что указывает на крайне высокую точность определения ориентации метильных групп в мембранных белках с помощью использованной методики, во многих случаях превосходящей точность, достигаемую рентгеноструктурным анализом. Три плоскости, применяемые для анализа конформации ретиналя, заключали в себе в-ионное кольцо (плоскость А) и полиеновые цепочки, включающее атомы углерода по обе стороны связи С12—С13 (плоскости В и С). Ориентации метильных групп, полученные в результате расчётов спектров ЯМР-2Н, позволяют рассчитать двугранные углы между плоскостями, а также определить ориентацию самого лиганда ретиналя относительно родопсина.

Ориентация плоскостей А, В и С относительно нормали к мембране определяется ориентацией двух произвольных векторов, лежащих в каждой плоскости (не параллельных друг другу), и может быть задана двумя угловыми параметрами (которым соответствуют две степени свободы). В общей сложности для определения структуры ретиналя необходимо 4 независимых параметра, соответствующих четырём степеням свободы: по два на каждую плоскость (3 х 2 = 6) и минус два из-за наличия у каждой пары сопряжённых плоскостей (А—В и В—С) общей связи. Для модели с тремя торсионными углами (см. рис. 2, в) требуется на один параметр больше. В качестве трёх угловых параметров использовались ориентации метильных групп С5, С9 и С13, в качестве четвёртого — ориентация переходного дипольного момента молекулы ретиналя, известная из литературы [8-10]. В модели с тремя торсионными углами дополнительный геометрический параметр определялся подгонкой расстояний между атомами углерода С10-С20 и С11-С20, также известных из литературы [11]. В результате получается несколько решений для двугранных углов между плоскостями А, В, С в ретинале, которые соответствуют экспериментальным ориентациям метильных групп.

В общей сложности возможны 64 комбинации для относительных ориентаций плоскостей А, В, С и 128 конфигураций и ориентаций ретиналя. Большинство из этих конфигураций может быть отброшено, поскольку они не удовлетворяют ЯМР-данным

по расстояниям между атомами углерода С8-С18, С8-С16/С17, С10-С20 и С11-С20 [11, 12], а также знакам торсионных углов в молекуле ретиналя, полученным методом кругового дихроизма [13, 14]. В результате имеем структуру ретиналя в темновом состоянии, изображённую на рис. 2, в. Одной из её особенностей является кручение молекулы вокруг связи С11=С12. Отметим, что попытка рассчитать конфигурацию рети-наля без такого кручения оказалась безуспешной: молекула ретиналя не укладывалась в связывающую полость. Таким образом оказалось, что молекула ретиналя является предварительно скрученной в темновом состоянии в направлении фотоизомеризации. В противоположном направлении изомеризация невозможна из-за стерических ограничений. По-видимому, этим и объясняется крайне быстрая изомеризация ретиналя. Вышеуказанное скручивание также наблюдается в кристаллографической структуре ретиналя, определённой с разрешением 2,2 А [7]. В целом конфигурация ретиналя, рассчитанная из спектров ЯМР, и его ориентация в связывающем кармане родопсина очень хорошо согласуются с данными рентгеноструктурного анализа, что свидетельствует о перспективности использования методики для исследования мембранных белков, где спектроскопия ЯМР высокого разрешения не может быть применена.

Структура ретиналя в метародопсине I. При сравнении метародопсина I и тем-нового состояния наибольшие различия в спектрах ЯМР-2Н были найдены для метиль-ной группы С9-Ме (рис. 2, б), а наибольшее изменение в ориентации — для группы С13-Ме. Такое несогласование обусловлено неодинаковой степенью ориентирования мембран в различных образцах. В состоянии мета I возможные решения для ориентации в-ионного кольца (плоскости А) к плоскости В ±32 и ±57°, а для угла между плоскостями В и С ±173°. Итого — 8 возможных комбинаций и структур. Встраивание лиганда со структурой, полученной с помощью ЯМР-2Н в состоянии мета I, в структуру родопсина в темновом состоянии показывает, что большинство возможных конфор-маций ретиналя можно отбросить из-за неправильного положения в-ионного кольца в связывающем кармане, так как, по данным криоэлектронной микроскопии, в-ионное кольцо в мета I находится в том же положении, что и в темновом состоянии [15]. Исключение составили две структуры: первая с углами между плоскостями А-В и В-С -32 и 173° соответственно, как показано на рис. 2, г, и вторая, полученная из неё при зеркальном отражении в вертикальной плоскости с углами 32 и -173°. Если форма связывающего кармана в мета I почти такая же, как и в темновом состоянии, что опять находится в соответствии с результатами криоэлектронной микроскопии [15], не обнаружившей существенных различий в расположении трансмембранных спиралей в темновом и мета I состояниях, то первая структура является наиболее вероятной, потому что встраивается в связывающую полость лишь с одним тесным стерическим контактом полиеновой цепочки ретиналя с боковой цепью Тгр265. С другой стороны, зеркальная ей структура имеет многочисленные стерические столкновения с боковыми цепями аминокислот, и её можно считать маловероятной.

Основными изменениями структуры ретиналя в состоянии мета I являются поворот части полиеновой цепи с метильной группой С13-Ме вокруг оси молекулы по направлению к метильной группе С9-Ме, выпрямление полиеновой цепи и, как результат, смещение в-ионного кольца вдоль оси ретиналя.

Динамика ретиналя в родопсине. Дополнительные возможности для исследования механизма активации родопсина предоставляет метод ЯМР-релаксации, позволяющий получать информацию о характере молекулярного движения в белке и внутримолекулярных взаимодействиях. Методом ЯМР-2Н-релаксации была исследована динамика метильных групп ретиналя в темновом, мета I и мета II состояниях родопсина.

г, °с

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

37 0 50 100 150 37 0 50 100 150

Рис. 3. Температурные зависимости времени ЯМР-2Н-релаксации зеемановского (зашрихованные символы) и квадрупольного (пустые символы) порядка для метильных групп С5-Ме (а, б), С9-Ме (в) и С13-Ме (г) ретиналя в темновом состоянии родопсина:

теоретические зависимости представлены сплошными и пунктирными линиями, экспериментальные — символами

Температурные зависимости времени ЯМР-2Н-релаксации зеемановского Tlz и квадрупольного Тщ порядка приведены на рис. 3.

Время зеемановской (спин-спиновой) релаксации Tlz определяется спектральными плотностями тепловых флуктуаций (г = 1, 2) тензора квадрупольных взаимодействий вблизи частоты резонанса:

3

1/Т1г = -хЦЫшо)+и2(2Шо)Ъ (1)

где ю0 — частота ларморовской прецессии ядер дейтерия и ^ — константа ядерных квадрупольных взаимодействий. Для времени релаксации квадрупольного порядка Тхц справедливо выражение

9

1/Т1Я = -х1Мш0). (2)

Для интерпретации температурных зависимостей Tlz и Тхц были применены две модели описания вращательной динамики метильных групп ретиналя. Первая модель

соответствует быстрым (мгновенным) скачкам вокруг оси симметрии третьего порядка (константа скорости вращательной переориентации к). В этой модели изменение ориентации оси симметрии метильной группы отсутствует. Вторая модель соответствует непрерывной диффузии c коэффициенами диффузии Дци для осевого вращения и переориентации оси симметрии метильных групп. В принципе измерение Tiz ориентированных образцов при различных ориентациях или неориентированных на различных частотах позволяет определить механизм вращательной подвижности. Модель переориентации посредством случайных прыжков предсказывает 20 %-ное изменение в угловой зависимости Tiz, в то же время в модели аксиальной диффузии ЯМР-релаксация не зависит от ориентации. В эксперименте с неориентированными образцами мы измеряли Tiz для спектральных пиков, которые соответствуют 90° ориентации метильных групп по отношению к магнитному полю Во, а ориентированные образцы исследовались при ориентации 0° к Во. Мы не обнаружили различий во времени релаксации для разных ориентаций, что свидетельствует в поддержку вращательной диффузии.

Однако точность измерения не позволяет сделать однозначный вывод о механизме переориентации. Поэтому мы использовали обе модели для анализа экспериментальных данных. В темновом, мета I и мета II состояниях родопсина теоретические зависимости Tiz можно подогнать к экспериментальным в пределах погрешности измерений как для модели сказкообразных переориентаций, так и для непрерывной диффузии, причём получено хорошее совпадение с экспериментальными данными для любого соотношения D^/D\\ в интервале от 0 до 1. Но одновременная подгонка температурных зависимостей Tiz и Tiq показала, что совпадение с экспериментальными результатами достигается только для модели аксиальной диффузии с D± = 0. Таким образом, измерение релаксации зеемановского и квадрупольного порядка позволяет получать информацию об анизотропии молекулярного движения.

Время корреляции вращательной подвижности находится в диапазоне от 2-12 пс при 30 °С и 3-45 пс при —60 °С. Наклон температурных зависимостей Tiz и Tiq соответствует энергии активации вращательной подвижности, определяемой высотой потенциальных барьеров метильных групп. Следовательно, время ЯМР-релаксации является инструментом изучения внутримолекулярных взаимодействий. В таблице приведены значения энергии активации Ea вращательной подвижности метильных групп ретиналя, рассчитанные из времён ЯМР-2Н -релаксации. Анализ экспериментальных данных показывает, что динамика метильных групп определяется в основном их взаимодействиями с ближайшими атомами водорода внутри молекулы ретиналя. В этой связи очень низкая энергия активации для группы С9-Ме обусловлена компенсацией взаимодействий с атомами водорода в позициях 7 и 11 (см. рис. 1), так как потенциалы этих взаимодействий сдвинуты по фазе на 180° относительно друг друга. Более высокие энергии активации для групп С5-Ме и С13-Ме являются результатом взаимодействий этих метильных групп с водородами в позициях 8 и 10 соответственно. При этом относительно высокая энергия активации для группы С5-Ме свидетельствует о 6-s-цис-конформации в-ионного кольца. Вклад во взаимодействие метильных групп с боковыми цепями аминокислот в сайте связывания ретиналя представляется незначительным в силу их удалённости от метильных групп на 4 A и более (рис. 4).

Динамика ретиналя в метародопсине I и метародопсине II. Значительные различия в динамике метильных групп ретиналя наблюдаются в состояниях мета I и II после фотоизомеризации. Наибольшие светоиндуцированные изменения происходят в метильной группе C9-Me, которая имеет определяющее значение для процесса активации родопсина. Энергия активации вращательной подвижности Ea для метильной

РЬе|08

ШШ

шея207

С1и113

^296

G1u1|2

Ш

Рис. 4. Изменение конфигурации ретина-ля в процессе активации родопсина по данным спектроскопии ЯМР 2Н:

ретиналь в состоянии мета I представлен как более светлая структура в связывающем кармане родопсина в темновом состоянии

Энергии активации (кДж/моль) вращательной подвижности метильных групп ретиналя в различных состояниях родопсина для моделей случайных аксиальных прыжков и вращательной диффузии с 0± = 0

Метильная группа Темновое Мета I Мета II

С5-Ме 11,4 ±0,3 10,0 ±0,3 15,0 ±0,4 10,3 ±0,3

С9-Ме 1,4 ±0,1 3,7 ±0,1 4,3 ±0,1

С13-Ме 7,3 ± 0,2 4,6 ±0,2 2,8 ±0,1

группы С9-Ме заметно возрастает от темнового состояния до мета II. В то же время значение Еа для метильной группы С13-Ме уменьшилось в мета I и мета II состояниях, и значения Еа и Т^ метильных групп С9-Ме и С13-Ме становятся близкими. Это логично, поскольку после изомеризации эти метильные группы находятся на той же стороне молекулы ретиналя и имеют аналогичный потенциал взаимодействия с протонами внутри лиганда, как это очевидно из пространственной структуры транс-ретиналя. Сокращение энергии активации метильной группы С13-Ме в мета II состоянии объясняется компенсацией находящихся в противофазе потенциалов (1, 6) взаимодействий внутри ретиналя между С13-Ме и водородами Н11 и Н15. Существенное ограничение подвижности для метильной группы С9 после изомеризации может быть связанно с большей плотностью окружения, например из-за ван-дер-ваальсовых взаимодействий с Туг268, в результате поворота метильной группы С9-Ме к фенильному кольцу тирозина в ходе изомеризации.

Для метильной группы С5-Ме заметные изменения наблюдаются в температурной зависимости времени релаксации Т^ в мета I состоянии. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о наличии двух компонент молекулярного движения с разными энергиями активации Еа. Две компоненты могут соответствовать, например, либо вращению метильной группы С5-Ме и её переориентации, либо наличию двух 6-Б-^^с-конформеров ретиналя с положительными и отрицательными углами кручения для связи С6-С7. В целом энергия активации С5-Ме мало меняется при переходе от темнового к активному состоянию, что позволяет сделать вывод об отсутствии существенных изменений для р-ионного кольца в процессе активации.

Комбинируя данные ЯМР-релаксации и ранее полученные результаты структурных и биохимических исследований [1-4, 7, 11-15], можно предложить следующий механизм активации родопсина. После изомеризации метильная группа С13-Ме поворачивается по направлению к р4-шпильке на внутридисковой петле Е2, при этом вращение метильной группы С9-Ме и центральной части полиенной цепочки в противоположном

направлении блокируется Tyr268. В результате стерических взаимодействий C13-Me и в4 происходит разрыв водородных связей вокруг петли Е2, стабилизирующих тем-новое состояние, и смещение Е2 к внутридисковой поверхности мембраны. Вращение C13-Me также дестабилизирует ионную связь между протоном основания Шиффа и его противоионом Glu113, следствием чего являются разрыв данной ионной связи, депро-тонирование основания и переход протона к Glu113. Этот переход способствует образованию активного состояния. Выпрямление молекулы ретиналя после изомеризации приводит, с одной строны, к стерическому столкновению с Trp265, а с другой — в результате стерического взаимодействия между метильной группой С5 и Glu122 к разрыву старой и образованию новой водородной связи между Glu122 на Н3 и His211 на Н5. Последнее наряду со смещением Е2 «освобождает» спираль Н5 и позволяет её ци-топлазменному концу приблизиться к спирали Н6, что дестабилизирует ионную связь между спиралями Н3 и Н6. В результате происходит поворот Н6, формирующий центр для связывания трансдуцина.

Заключение. Физико-химические особенности сопряжённых с G-белком рецепторов (сложность кристаллизации, нерастворимость в воде) требуют комплексного подхода к их изучению. Очевидно, что ни один метод в отдельности не позволяет сделать однозначных выводов об их структуре и механизме действия. Это, в частности, подтверждается противоречивостью последних данных о структуре родопсина в активном состоянии [1, 2]. Как показано в нашей работе, методы ЯМР являются необходимым дополнением к рентгеноструктурному анализу. Они не только позволяют подтвердить или опровергнуть структурные данные, поскольку исследуют белки в естественном мембранном окружении, но, кроме того, предоставляют дополнительную информацию о структуре и динамике мембранных белков, недоступную другими методами.

Литература

1. ChoeH. W., Kim Y. J., Park J. H. et al. Crystal structure of metarhodopsin II // Nature. 2011. Vol. 471. P. 651-656.

2. Standfuss J., Edwards P. C., D'AntonaA. et al. The structural basis of agonist-induced activation in constitutively active rhodopsin // Nature. 2011. Vol. 471. P. 656-660.

3. Struts A. V., Salgado G. F J., TanakaK. et al. Structural analysis and dynamics of retinal chromophore in dark and Meta I states of rhodopsin from 2H NMR of aligned membranes //J. Mol. Biol. 2007. Vol. 372. Iss. 1. P. 50-66.

4. Struts A. V., Salgado G. F J., Martinez-Mayorga K., Brown MF. Retinal dynamics underlie its switch from inverse agonist to agonist during rhodopsin activation // Nat. Struct. Mol. Biol. 2011. Vol. 18. Iss. 3. P. 392-394.

5. Nevzorov A. A., MoltkeS., HeynM. P., Brown M. F., Solid-state NMR line shapes of uniaxially oriented immobile systems // J. Am. Chem. Soc. 1999. Vol. 121. P. 7636-7643.

6. Salgado G.FJ., Struts A. V., TanakaK. et al. Solid-State 2H NMR Structure of Retinal in Metarhodopsin I // J. Am. Chem. Soc. 2006. Vol. 128. P. 11067-11071.

7. Okada T., SugiharaM., BondarA. -N. et al. The retinal conformation and its environment in rhodopsin in light of a new 2.2 A crystal structure //J. Mol. Biol. 2004. Vol. 342. P. 571-583.

8. Michel-Villaz M., Roche C., Chabre M. Orientational changes of the absorbing dipole of retinal upon the conversion of rhodopsin to bathorhodopsin, lumirhodopsin, and isorhodopsin // Biophys. J. 1982. Vol. 37. P. 603-616.

9. Jager T., Lewis J. W., Zvyaga T. A. et al. Chromophore structural changes in rhodopsin from nanoseconds to microseconds following pigment photolysis // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1997. Vol. 94. P. 8557-8562.

10. Chabre M., Breton J. The orientation of the chromophore of vertebrate rhodopsin in the "meta" intermediate states and the reversibility of the meta II-meta III transition // Vision Res. 1979. Vol. 19. P. 100б-1018.

11. Verdegem P. J. E., Bovee-Geurts P. H. M., de Grip W. J. et al. Retinylidene ligand structure in bovine rhodopsin, metarhodopsin-I, and 10-methylrhodopsin from internuclear distance measurements using 13C-labeling and 1-D rotational resonance MAS NMR // Biochemistry. 1999. Vol. 38. P. 1131б-11324.

12. Spooner P. J. R., Sharples J. M., Verhoeven M. A. et al. Relative orientation between the ß-ionone ring and the polyene chain for the chromophore of rhodopsin in native membranes // Biochemistry. 2002. Vol. 41. P. 7б49-7ббб.

13. Fujimoto Y., Sharples J. M., Verhoeven M. A. et al. On the bioactive conformation of the rhodopsin chromophore: absolute sense of twist around the б-s-cis bond // Chem. Eur. J. 2002. Vol. 7. P. 4198-4204.

14. Fujimoto Y., FishkinN., Pescitelli G. et al. Solution and biologically relevant conformations of enantiomeric 11-cis-locked cyclopropyl retinals // J. Am. Chem. Soc. 2002. Vol. 124. P. 7294-7302.

1б. Ruprecht J. J. MielkeT., Vogel R. et al. Electron crystallography reveals the structure of metarhodopsin I // EMBO J. 2004. Vol. 23. P. 3б09-3б20.

Статья поступила в редакцию 28 июня 2011 г.

А. В. Титов, М. С. Варшавский, К. Г. Лопатько, Н. А. Касьяненко

ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА С МОЛЕКУЛОЙ ДНК В ВОДНО-СОЛЕВОМ РАСТВОРЕ

Введение. В последнее время интерес к изучению наноразмерных частиц металлов существенно возрос, так как открылись новые возможности их использования в современных технологиях (для получения эффективных и избирательных катализаторов, для создания элементов наноэлектронных и оптических устройств, для синтеза новых материалов и т. п.) [1]. Наноплазмоника с использованием биологических систем может найти применение как для разработки новых подходов и способов лечения в современной медицине, так и в области информационных технологий. Наночастицы серебра интересны своими замечательными оптическими свойствами: их коллоидные растворы имеют специфическую полосу поглощения в видимой области спектра, обусловленную плазмонным резонансом [2]. Изменение этой полосы под действием различных факторов даёт возможность следить за состоянием наночастиц в растворе.

Целью нашей работы являлось исследование влияния низкомолекулярных электролитов на спектральные свойства серебряных наночастиц в водном растворе, а также изучение возможности взаимодействия наночастиц с молекулой ДНК и синтетическим поликатионом полиаллиламином (ПАА).

Материалы и методы. Использовали наночастицы серебра, полученные методом объёмного электроискрового диспергирования [3]; коммерческий препарат ДНК тимуса телёнка (Sigma) с молекулярной массой 11 • 106 Да, определённой вискозиметриче-ски. Полиаллиламин M = 25000 Да был синтезирован и охарактеризован в ИВС РАН О. В. Назаровой.

Применяли методы спектрофотометрии (СФ—56), атомной силовой микроскопии (NanoScope 4a, Veeco) в режиме прерывистого контакта, низкоградиентной вискозиметрии (ротационный вискозиметр типа Зимма—Крозерса с градиентами скорости 1-4 с-1). Измерения проводили при температуре 21 °С.

Результаты и обсуждение. На рис. 1 приведены результаты спектральных исследований растворов наночастиц при разных концентрациях NaCl. Ионную силу растворов наночастиц изменяли, сливая с водными растворами NaCl соответствующей концентрации.

С увеличением концентрации NaCl до 0,1М пик, соответствующий плазмонному резонансу (400 ± 1 нм в водном растворе), увеличивается по интенсивности и смещается в коротковолновую область на 10 ± 1 нм. При дальнейшем увеличении концентрации соли он становится менее интенсивным, уширяется, несколько меняет форму и смещается в красную область. Такие изменения могут быть связаны с возрастающей полидисперсностью системы из-за агрегации наночастиц при значительных концентрациях соли. Подчеркнём существенное различие во влиянии большой (> 0,1M) и малой (< 0,1M) концентрации NaCl на спектральные свойства наночастиц. Сдвиг максимума полосы плазмонного поглощения обычно связывают с изменением размеров нано-частиц. В нашем случае это может быть обусловлено их взаимодействием с ионами. Действительно, существуют данные [4], что наночастицы могут сорбировать как отрицательные, так и положительные ионы из раствора. Такое изменение поверхности

D

0,6

300 400 500 600 700 800 900 Я, нм

C^cP M

Рис. 1. Спектры поглощения наночастиц серебра в водно-солевых растворах

различной ионной силы (а) и зависимость оптической плотности в максимуме плазмонного поглощения Дтах от концентрации соли С^ага (б):

1 — 0М; 2 — 0,001М; 3 — 0,002М; 4 — 0,003М; 5 — 0,005М; 6 — 0,01М; 7 — 0,03М; 8 — 0,05М; 9 — 0,1М; 10 — 0,15М; 11 — 0,3М; 12 — 0,5М; 13 — 1М NaCl

D 0,6-,

D

1 0,6-

2 0,5-

3

0,4-

4

0,3-

0,2-

0,1-

0,0-

300 400 500 600 700 800 900 Я, нм

1 2

3

4

300 400 500 600 700 800 900 Я, нм

Рис. 2. Спектры поглощения серебряных наночастиц в водных растворах соляной кислоты (а) и гидроксида натрия (б): 1 — 0М; 2 — 0,001М; 3 — 0,01М; 4 — 0,05М HCl (а) (NaOH (б))

наночастиц способствует их отталкиванию друг от друга, что уменьшает вероятность агрегации, уширяющей полосу и сдвигающей её максимум за счёт изменения средних размеров частиц. Последнее мы наблюдаем при больших концентрациях NaCl. В области же малых ионных сил полоса плазмонного поглощения сужается по сравнению с таковой в воде. Эти растворы стабильны, тогда как при больших концентрациях NaCl со временем (около недели) в растворе появляется осадок.

Добавление HCl или NaOH в водный раствор наночастиц также вызывает изменение в их спектре поглощения (рис. 2). Влияние HCl в концентрациях 0,001М и 0,01М сходно с влиянием 0, 005М и 0,15М NaCl соответственно. Однако при концентрации кислоты

в растворе 0, 05М можно увидеть радикальное изменение спектра (рис. 2, о), которое мы не можем объяснить в настоящее время.

Добавление ^ОН в раствор наночастиц тоже влияет на их спектральные свойства (рис. 2, б). Если действие кислоты в концентрациях менее 0,01М близко по характеру к влиянию ^С1, то добавление тех же концентраций ^ОН в водный раствор не приводит к заметным изменениям полосы плазмонного поглощения, но несколько увеличивает оптическую плотность в длинноволновой области. Это даёт основание предположить, что влияние ионов хлора в подобном случае более существенно, чем влияние Отметим, что при концентрации щёлочи 0,05М пик плазмонного поглощения становится менее интенсивным, раствор меняет цвет, а в спектре наблюдается тенденция к появлению нового пика. Можно осторожно предположить, что последний обусловлен появлением частиц другого размера или, например, в случае образования вытянутых структур проявлением продольного плазмонного резонанса. Этот результат, безусловно, требует дальнейшего исследования. Заметим, что частота плазмонного резонанса зависит от размера частиц и от их формы.

Присутствие в растворе наночастиц полиионов также влияет на полосу плазмонного резонанса. В работе использовали отрицательно заряженную ДНК и положительно заряженный синтетический полимер полиаллиламин. Эти системы готовили сливанием равных объёмов растворов компонентов. Интересно отметить, что оба полииона влияют на спектр поглощения наночастиц (рис. 3). Возможно, в какой-то степени это влияние обусловлено конкуренцией между полиионами и наночастицами за ионы натрия или хлора. Рассмотренные эксперименты указывают на важную роль электростатических взаимодействий в исследуемых системах.

Добавление ДНК изменяет интенсивность полосы плазмонного резонанса и стабилизирует раствор наночастиц (при больших концентрациях соли в этом случае осадка не наблюдается). При больших концентрациях соли добавление ДНК в раствор на-ночастиц приводит к возрастанию интенсивности рассматриваемой полосы (рис. 3, о), а в 0,003М ^С1 — её уменьшает (рис. 3, б). Падение оптической плотности при увеличении концентрации ДНК в 0,0025М ^С1 продолжается до достижения СоМа = 6 • 10~5М пар оснований (рис. 3, в), затем интенсивность полосы сохраняет постоянное значение вплоть до Сома = 3,6 • 10~4М пар оснований. Заметим, что при малой ионной силе раствора полоса плазмонного резонанса уже, чем при большой концентрации ^С1, как уже отмечалось выше. В последнем случае форма спектра может указывать на наличие неразрешённой полосы.

Данные, полученные методом низкоградиентной вискозиметрии, демонстрируют, что объём молекулы ДНК в присутствии серебряных наночастиц уменьшается (таблица), что может свидетельствовать об уменьшении полиэлектролитного набухания ДНК из-за электростатического взаимодействия наночастиц с фосфатными группами макромолекулы. Это предположение, однако, требует более тщательного экспериментального изучения.

Мы изучили системы методом атомной силовой микроскопии. Опыт показал, что при стандартной процедуре фиксации ДНК на поверхность слюды с добавлением в раствор MgCl2 макромолекул на подложке не наблюдается, если в растворе присутствуют

Относительное изменение удельной вязкости раствора ДНК в 0,0025М NaCl в присутствии наночастиц разной концентрации Cnp, C = 100 мг/л

Cdna,% Cnp Ov - i)/0v - 1)о

0,006 0 1,00

0,01 0 1,00

0,006 0,25 • С 0,90

0,01 0,484 • С 0,86

Б

0,15 -

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

0,10

400

600 Я, нм

800

400

500 600 Я, нм

700

Б 0,

тах "

05

10

15 20

,., 10-3 %

25

30

Рис. 3. Спектры поглощения растворов наночастиц серебра в 0,15М МаС1 (а) и 0,003М ШС1 (б) без добавок (1) и в присутствии ДНК (2) и ПАА (3); зависимость оптической плотности в максимуме плаз-монного поглощения Втах от концентрации ДНК Сома (в)

в

С

наночастицы. Следовательно, наночастицы препятствуют ионам магния связываться с фосфатными группами ДНК. Можно предположить также, что наночастицы конкурируют с молекулами ДНК за ионы магния, препятствуя тем самым их взаимодействию с ДНК. Первое предположение об участии фосфатных групп ДНК во взаимодействии с наночастицами находит свое подтверждение в описанных выше экспериментальных данных, полученных с помощью метода вискозиметрии. Иными словами, электростатическое взаимодействие магния с ДНК, необходимое для фиксации макромолекулы, в этом случае не реализуется. Вместе с тем частично денатурированная ДНК высаживается из раствора с наночастицами (рис. 4, а). На рис. 4, б приведено АСМ-изобра-жение наночастиц, размер которых равен 35 ± 10 нм.

Таким образом, вся совокупность экспериментальных данных, полученных в работе разными методами, свидетельствует о влиянии на состояние наночастиц низкомолекулярных ионов и полиионов. Это выражается в изменении полосы плазмонного поглощения используемых в работе наночастиц серебра. С другой стороны, присутствие наночастиц серебра в водно-солевом растворе ДНК влияет на объём макромолекулы. То обстоятельство, что при добавлении наночастиц в раствор ДНК макромолекула

Рис. 4. АСМ-изображения частично денатурированной ДНК (а) и наночастиц серебра (б) на слюдяной подложке

практически не фиксируется на поверхности слюды по стандартной процедуре в присутствии MgCl2, свидетельствует о том, что фосфатные группы в этом случае недоступны для ионов магния.

Литература

1. Ершов Б. Г. Наночастицы металлов в водных растворах: электронные, оптические и каталитические свойства // Рос. хим. журн. (Журн. Рос. хим. об-ва им. Д. И. Менделеева). 2001. Т. XLV. № 3. С. 20-30.

2. Ясная М. А., Воронков Г. П., Хорошилова С. Э. Оптические свойства наночастиц серебра в водных растворах //Материалы XXXVII научно-техн. конф. по итогам работы профессорско-преподавательского состава СевКавГТУ за 2007 год. Т. 1. Естественные и точные науки. Технические и прикладные науки. Ставрополь, 2008.

3. ЩербаА. А., Захарченко С. Н, ЛопатькоК. Г. и др. Разрядно-импульсные системы производства наноколлоидных растворов биологически активных металлов методом объёмного электроискрового диспергирования // Пращ 1ЕД НАНУ. 2010. Вип. 26. С. 152-160.

4. Климов В. В. Наноплазмоника. М., 2009. 480 с.

Статья поступила в редакцию 28 июня 2011 г.

Е. В. Титов, Л. А. Лысякова, Ю. Закревский, Н. Ломадзе, И. М. Зырянова, Е. А. Божкова, С. Сантер, Н. А. Касьяненко

ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ДНК С ТРИМЕТИЛАММОНИУМ БРОМИДОМ, СОДЕРЖАЩИМ АЗОБЕНЗОЛЬНУЮ ГРУППУ

Введение. Используемое в работе соединение, содержащее азобензольную группу, относится к поверхностно-активным веществам (ПАВ). Обычно такие соединения содержат неполярные и полярные группы. Ионогенные ПАВ в водном растворе диссоциируют на ионы. Положительно заряженные группы ПАВ могут взаимодействовать с отрицательно заряженной молекулой ДНК. В настоящее время изучение конформа-ционных изменений молекулы ДНК, индуцированных присутствием в растворе кати-онных ПАВ, представляет большой интерес. Комплексы ДНК с соединениями этого класса находят применение в новых технологиях для создания структур, которые могут быть использованы в медицине и фармакологии. Такие комплексы могут содержать фоточувствительные метки на основе флюоресцирующих лигандов. Эти системы представляют интерес для создания высокочувствительных зондов. Кроме того, ионогенные ПАВ способны компактизовать ДНК, что открывает новые перспективы для создания эффективных генных векторов, а также для конструирования различных наноструктур.

В последние годы в научной литературе растёт число публикаций, посвящённых исследованию физико-химических свойств комплексов ДНК с ПАВ (см., например, [1]). Активно проводятся разработки по модификации ПАВ с использованием дополнительных включений. Особый интерес вызывает создание светочувствительных препаратов, к которым относится используемое в настоящей работе соединение. Вместе с тем в настоящее время всё ещё нет ясности в понимании молекулярного механизма взаимодействия таких соединений с ДНК, отсутствует модель связывания. В какой-то мере это обусловлено тем, что в водном растворе ПАВ могут образовывать различные надмолекулярные структуры. В частности, при достижении определённой концентрации ПАВ в растворе, называемой критической концентрацией мицеллообразования (ККМ), формируются мицеллы. ККМ зависит от химической структуры ПАВ и определяется физико-химическими свойствами раствора (ионной силой, рН, присутствием дополнительных низко- и высокомолекулярных компонентов). При концентрациях меньше ККМ в растворе могут образовываться димеры и иные ассоциаты. Кроме того, возможно неравномерное распределение молекул ПАВ по объёму раствора (например, гидрофобные группы таких соединений могут провоцировать преимущественное расположение части молекул у поверхности раствора).

В системах полиэлектролит—ионогенный ПАВ существенную роль играют электростатические взаимодействия [1]. При определённых условиях в растворе может произойти фазовое разделение, причём одна из фаз содержит оба компонента, а другая — только разбавленный раствор ПАВ, т. е. так называемое ассоциативное фазовое разделение [2]. Существует точка зрения, что связывание полиэлектролит—противоположно заряженный ПАВ кооперативно [1], и это объясняется гидрофобными взаимодействиями между молекулами ПАВ при связывании. При определённых

концентрациях компонентов в растворе появляется осадок [3]. Добавление соли к системе оказывает значительное влияние на комплексообразование [1].

В работе [1] обсуждается характер взаимодействия ПАВ с ДНК. Согласно мнению авторов, при малых концентрациях ПАВ происходит связывание его отдельных молекул с ДНК, не оказывающее значительного влияния на конформацию макромолекулы. При достижении определённой концентрации ПАВ происходит компактизация ДНК. Если её концентрация высока, то в растворе наблюдается выпадение осадка.

Процесс компактизации ДНК под действием различных агентов изучается на протяжении многих лет. Интерес к таким исследованиям обусловлен необходимостью понимания молекулярных основ способности жёсткой и сильно заряженной ДНК сворачиваться в компактную структуру в хроматине и необходимостью формирования компактных структур на основе ДНК in vitro для нужд генной инженерии и молекулярной медицины. Существует несколько способов формирования дискретных компактных структур, содержащих ДНК. Эти способы основаны на нейтрализации отрицательного заряда ДНК положительно заряженными агентами, среди которых можно выделить мультивалентные ионы [4], полимеры [5-7], и на создании невыгодных контактов с растворителем (полиэтиленгликоль, спирт). В некоторых случаях разбавление или добавление конкурирующих агентов может привести к декомпактизации ДНК [8-10]. Контроль над процессами компактизации и декомпактизации ДНК возможен посредством изменения физико-химических свойств раствора. Например, pH-чувствительное поверхностно-активное вещество додецилдиметиламиноксид (DDAO) может существовать в неионной или в катионной (протонированной) форме в зависимости от pH водного раствора (pK ~ 5,0). Изменяя pH раствора, можно контролировать процесс ком-пактизации ДНК [11].

В условиях постоянства химического состава раствора возможно компактизо-вать/декомпактизовать ДНК, применяя светочувствительные катионные ПАВ [12, 13]. Такое вещество мы используем в работе. Состояние ДНК контролировали различными методами. Изучалось гидродинамическое поведение молекулы ДНК в присутствии ПАВ и рассматривались спектральные свойства систем. Использовался также метод атомной силовой микроскопии для непосредственного наблюдения формируемых структур.

Интересной особенностью вещества является его способность менять конформацию под действием света в определённом диапазоне длин волн. При естественном освещении и в темноте азосоединение имеет транс-конформацию, а при облучении светом в ультрафиолетовом диапазоне переходит в цис-конформацию. При этом изменяется и сродство соединения с растворителем (водой). Таким образом, в работе изучалось взаимодействие молекулы ДНК с азосоединением, способным изменять свою конфор-мацию при УФ-освещении растворов.

Материалы и методы. Использовали коммерческий препарат ДНК тимуса телёнка фирмы "Sigma" с молекулярной массой M =11 • 10~6 Да, определённой по значению характеристической вязкости в 0,15М NaCl. Концентрацию ДНК в растворе измеряли спектрофотометрически [14]. Контроль нативности ДНК осуществляли по молярному коэффициенту экстинкции £26o(P).

Светочувствительное катионное поверхностно-активное вещество триметиламмони-ум бромид, содержащее азобензольную группу, (AzoTMAB), было синтезировано в университете Потсдама. Азобензольная группа подвергается транс—цис-изомеризации при облучении УФ-светом (365 нм). Для облучения систем использовали УФ-лампу VL-4.L. Время жизни цис-изомера составляет около 48 часов [16].

Рис. 1. Спектры поглощения А2оТМАБ в 0,005М МаС1 до (1) и после (2) трёхминутного УФ-облучения на длине волны 365 нм с расстояния 2 см от лампы и структура соединения в транс- (а) и цис- (б) конформациях, соответствующих необлучённой и облучённой формам

Использовали спектрофотометры СФ-56 и СФ-2000.

Для изучения систем методом вискозиметрии сливали равные объёмы растворов ДНК и ПАВ заданных концентраций при постоянной концентрации поддерживающего электролита ^аС1). В работе следили за относительным изменением приведённой вязкости раствора ДНК ппр. = (п — 1)/С (здесь цг — относительная вязкость, С — концентрация раствора ДНК) при увеличении концентрации ПАВ и постоянной концентрации ДНК С = 0,0084 % (2,55 • 10~4М (Р)). Использовали низкоградиентный вискозиметр типа Зимма—Крозерса [15]. Измерения проводили при температуре 21°С.

АСМ-изображения исследуемых систем получали с помощью атомного силового микроскопа '^апоБсоре ^а" (Уеесо) сканированием в режиме прерывистого контакта. Образцы готовили путём самопроизвольной адсорбции ДНК из раствора на поверхность слюды в присутствии ионов магния Mg2+, которые добавляли в раствор ДНК непосредственно перед фиксацией. Каплю раствора наносили на свежесколотую поверхность слюды, выдерживали 10 мин, затем промывали дистиллированной водой для удаления незафиксированных компонентов, высушивали струёй воздуха и в вакуумном шкафу. Для приготовления комплексов ДНК с ПАВ в каплю раствора ДНК с MgC12 (концентрация ДНК 5 • 10~5 % (1,5 • 10~6М (Р))), нанесённую на свежесколотую слюду, после десятиминутного ожидания добавляли AzoTMAB (5,78 мМ в 0,005М ^С1). Ещё через 10 мин образец промывали и высушивали.

Результаты и обсуждение. На рис. 1 приведены спектры поглощения ПАВ до и после УФ-облучения. Известно, что такое воздействие на ПАВ индуцирует переход из транс- в ^ис-конформацию. После облучения растворов ПАВ УФ-светом (с длиной волны 365 нм) более интенсивная полоса сдвигается в коротковолновую область, её амплитуда уменьшается, а «плечо» в области между 400 нм и 500 нм оформляется в максимум.

Б

0,9

0,6

0,3

Рис. 2. Спектры поглощения А2оТМАБ в воде (1) ив 1М ШС1 (2),

зарегистрированные сразу после приготовления растворов:

0,0

С^оТМАВ) = 3,5 • 10~БМ (1) и С^оТМАВ) = 3 • 10-БМ (2)

300

Я, нм

400

500

В работе было проведено исследование влияния концентрации соли ^аС1) на спектральные свойства необлученного ПАВ. На рис. 2 представлены для примера спектры поглощения AzoTMAB в воде и в 1М ^С1, которые демонстрируют различие в состоянии вещества в этих условиях. Опыт показал, что при малых концентрациях ^С1 (0,005М) спектр поглощения практически совпадает с наблюдаемым в водном растворе. В используемом спектральном диапазоне интенсивная полоса поглощения соединения в воде симметрична и имеет максимум при Хтах = 352 ± 2 нм, а между 400 нм и 500 нм наблюдается «плечо». Ещё одна полоса в спектре поглощения имеет максимум при Хтах = 240 ± 2 нм. В области \ > 600 нм ПАВ не поглощает. С увеличением концентрации ^С1 в растворе соединения максимум интенсивной полосы смещается в коротковолновую область (Хтах = 342 ± 2 нм в 0,15М ^С1 и Хтах = 337 ± 2 нм в 1М ^С1). Таким образом, в условиях физиологической ионной силы (0,15М ^С1) и при больших концентрациях соли в системе электронное состояние молекул ПАВ отлично от реализуемого в воде и в 0,005М ^С1. Опыт показал, что изменения при этом сходны с наблюдаемыми при транс—цис-переходе, индуцированном УФ-облучением. Таким образом, возможно, что раствор с большой концентрацией соли выгоден для цис-конформации соединения. Вероятно, это отражает и различие в межмолекулярных взаимодействиях в системе. Например, экранировка заряда катионной группы ПАВ создаёт благоприятные условия для образования ассоциатов в растворе. Это могут быть, в частности, димеры.

При использовании больших концентраций соли в растворе ПАВ спектр поглощения меняется существенно по сравнению с наблюдаемым для водного раствора. Помимо смещения главного максимума можно увидеть изменение формы обсуждаемой полосы — главный пик смещается и становится более острым, отчётливо прослеживается максимум на 352 нм, проявляется тенденция оформления «плеча» в области более 400 нм в отдельный максимум. Как уже отмечалось выше, это может отражать существование цис-изомеров в растворе, а также появление димеров и других ассоциатов из-за экранировки заряженных групп ПАВ, обеспечивающих расталкивание молекул с гидрофобными участками в воде. То обстоятельство, что при этом в растворе одновременно присутствуют и неассоциированные молекулы, отражается в спектре поглощения наличием неразрешённого максимума, совпадающего с наблюдаемым в воде (в водном растворе электростатическое расталкивание препятствует сближению молекул). Таким

Рис. 3. Спектры поглощения свободного ПАВ (1, 4) и ПАВ в комплексе с ДНК в 0,005М ШС1 для необлу-чённых систем (1, 2, 3), комплексов ДНК с предварительно облучённым ПАВ (7, 8) и УФ-облучён-ных комплексов ПАВ с ДНК (5, 6) при С (ДНК) = 0,0027 % (2, 5, 7) и С (ДНК) = 0,0108 % (3, 6, 8):

концентрация ПАВ для всех систем 2,5 • 10~БМ

образом, присутствие соли существенно влияет на состояние системы, что отражается в различии спектральных свойств ПАВ.

Рассмотрим взаимодействие молекулы ДНК с используемым ПАВ в 0,005М ^С1 (рис. 3). Для этого выберем полосу поглощения ПАВ с максимумом 352 нм, так как диапазон длин волн менее 300 нм неудобен для анализа взаимодействия соединения с ДНК из-за перекрывания полос поглощения ПАВ и ДНК. На рис. 3 видно, что в присутствии ДНК в 0,005М ^С1 наблюдается увеличение максимума спектра поглощения ПАВ с тенденцией к исчезновению «плеча» в области более 400 нм.

В 1М ^С1 (рис. 4) также наблюдаются изменения, но они незначительны. Интересно отметить, что наличие «плеча» для ПАВ при малой концентрации соли может быть связано с существованием в растворе определённого количества цис-изомера. Отсюда следует, что взаимодействие ДНК с ПАВ в 0,005М ^С1 провоцирует уменьшение в растворе фракции цис-изомера (одновременно увеличивается амплитуда полосы с максимумом 352 нм). Действительно, даже взаимодействие ДНК с предварительно облученным ПАВ приводит к характерному возрастанию интенсивности главной полосы, что мы связываем с дополнительным появлением транс-изомеров. Иными словами, связывание с ДНК провоцирует цис—транс-переход (для всех систем практически исчезает «плечо» при длинах волн более 400 нм.) Напротив, облучение систем, содержащих и не содержащих ДНК, приводит к характерному изменению спектра поглощения, связанному с увеличением доли цис-изомера. При этом облучение комплекса, сформированного перед облучением, приводит к уменьшению доли транс-изомера в системе. Заметим, что при этом цис-изомеры могут оставаться в связанном с ДНК состоянии (действительно, хотя и наблюдается тенденция к увеличению амплитуды полосы с максимумом 435 нм, характерной для цис -формы ПАВ, её полного восстановления не наблюдается). Таким образом, взаимодействие с ДНК в растворе провоцирует стабилизацию трансформы ПАВ и, возможно, индуцирует цис—транс-переход.

При использовании большой концентрации поддерживающего электролита (1М ^С1) картина наблюдается иная. Добавление ДНК в раствор ПАВ лишь немного уменьшает интенсивность полосы поглощения ПАВ (она, как было указано выше, несколько отличается от наблюдаемой в 0,005М ^С1). Поскольку изменения совершенно не зависят от концентрации ДНК в системе, этот результат может свидетельствовать об отсутствии взаимодействия компонентов. Возможно, влияние ДНК на спектр поглощения ПАВ осуществляется без непосредственного контакта. Обратимся к результатам гидродинамических исследований.

Рис. 4. Спектры поглощения свободного ПАВ (1, 5) и ПАВ в комплексе с ДНК в 1М МаС1 для необлучён-ных систем (1, 2, 3, 4) и УФ-об-лучённых комплексов ПАВ с ДНК (6, 7, 8) при С(ДНК) = 0,0054 % (2, 6), С(ДНК) = 0,0081 % (3, 7) и С (ДНК) = 0,0108 % (4, 8):

концентрация ПАВ для всех систем 2,5 • 10-БМ

При возрастании концентрации AzoTMAB в растворе ДНК наблюдается падение вязкости, свидетельствующее об уменьшении объёма макромолекулы (рис. 5, а). Это связано не только с дополнительной экранировкой заряда ДНК в растворе при добавлении катионного ПАВ, так как используются весьма малые концентрации соединения (эксперимент показал, что если увеличить концентрацию ^С1 до суммарной концентрации катионов в изучаемых системах ДНК—ПАВ, то падения вязкости в рамках погрешности метода практически не наблюдается). Падение вязкости раствора ДНК при добавлении ПАВ, хотя и существенно меньшее, наблюдается и в 1М ^С1, когда осуществляется практически полная экранировка заряда ДНК (полиэлектролитное набухание в этих условиях полностью подавлено [17]). Остаётся предположить, что либо в растворе реализуется связывание ПАВ с ДНК уже при малых концентрациях соединения, либо присутствие ПАВ изменяет качество растворителя, вследствие чего объёмные эффекты снижаются. Так как в растворе ДНК (а это типичный жёсткоцепной полимер) объёмные эффекты неэлектролитной природы достаточно малы [17], их изменение не может объяснить столь значительного падения вязкости. Таким образом, остаётся предположить, что в растворе реализуется комплексообразование ДНК—ПАВ. Об этом же свидетельствуют и спектральные данные, описанные выше.

В зависимости приведённой вязкости растворов ДНК в 0,005М ^С1 от концентрации AzoTMAB можно выделить три области. При концентрациях ПАВ менее 2, 5-10~4М (область I) происходит падение приведённой вязкости раствора с ростом C(AzoTMAB). При концентрациях ПАВ более 2, 5 • 10~4М, но менее 4, 5 • 10~4М (область II) в растворе появляются хлопья — ДНК агрегирует и выпадает в осадок, визуально наблюдаемый в растворах. При больших концентрациях AzoTMAB (область III) осадка не наблюдается, но растворы становятся мутными. Их приведённая вязкость при этом близка к нулю, что может быть связано с образованием компактных частиц. Действительно, методом атомной силовой микроскопии было показано, что в этой области происходит формирование компактных структур.

Изображения свободной ДНК, представленные на рис. 6, а, существенным образом отличаются от АСМ-изображений ДНК в присутствии AzoTMAB на поверхности слюды (рис. 6, б). Это свидетельствует, что при определённых условиях возможно формирование структур ДНК-ПАВ на подложке с компактизацией макромолекулы.

При значительных концентрациях ^С1 в растворе наблюдается иной характер поведения вязкости: с увеличением концентрации ПАВ приведённая вязкость раствора сначала падает, причём существенно меньше, чем это наблюдается в 0,005М ^С1,

Я, нм

1,0

0,5

0,0

'*—■•-1-ш"

5 10 15 20

С(АоТМАВ)^ 104М

0,0

0

15

20

0 4 8 12 16 г, мин

Рис. 5. Относительное изменение приведённой вязкости растворов ДНК (а) в 1М МаС1 (а) и 0,005М МаС1 (в) от концентрации А2оТМАБ до (1) и после (2) облучения; справа (б) зависимость оптической плотности одной из систем в 0,005М МаС1 (С^оТМАБ) = 8 • 10~4М, Z = 3,1) на длине волны 800 нм от времени облучения

а затем перестаёт меняться — это наблюдается при условии, когда на каждую фосфатную группу ДНК в растворе приходится более двух молекул ПАВ. Как видно на рис. 6, в используемой области концентраций ПАВ не происходит качественного изменения состояния системы (фазового разделения в системе в диапазоне используемых концентраций ПАВ и ДНК не наблюдается).

Таким образом, состояние системы ДНК—ПАВ определяется ионной силой раствора и концентрацией ПАВ, точнее, по-видимому, состоянием ПАВ в растворах разной концентрации. На основании всей совокупности полученных данных можно полагать, что в 0,005М ^С1 в области I (см. рис. 5, а) реализуется электростатическое притяжение молекул ПАВ к отрицательно заряженной ДНК, в результате чего вблизи макромолекулы образуется локальное увеличение их концентрации. Это, в частности, может ухудшить взаимодействие полимер—растворитель и, как следствие, привести к уменьшению объёмных эффектов за счёт экранировки заряда ДНК и вследствие локального изменения качества растворителя. При определённой концентрации ПАВ (граница областей I и II) происходит агрегация и выпадение ДНК в осадок. В описываемом эксперименте эта граница соответствует равенству концентраций ПАВ и ионогенных групп ДНК (параметр Е = С(AzoTMAB)/C(Р) = 1). Интересно отметить, что условия, при которых начинается конденсация ДНК, при использовании низкомолекулярных конденсирующих агентов определяются их концентрацией в растворе, а в случае полика-тионных агентов — отношением ионогенных групп поликатион/ДНК. В связи с этим можно осторожно сделать предположение, что граница областей II и III, соответствующая появлению малых дискретных частиц, должна быть связана с концентрацией ми-целлообразования ПАВ (ККМ). Предварительные данные, полученные в Потсдамском университете методом изотермического калориметрического титрования, показали, что в воде ККМ равна приблизительно 5 • 10~4М. Так как мы используем довольно малую ионную силу (0,005М ^С1), можно ожидать, что эта величина имеет примерно то же значение, что прекрасно согласуется с высказанным выше предположением. В области же II, по-видимому, происходит локальное ассоциирование ПАВ вблизи ДНК. Это

3,0 нм и 10,0 нм

Рис. 6. АСМ-изображения свободной ДНК (а) и ДНК в комплексе с AzoTMAB (б)

может привести к формированию внутри- и межмолекулярных контактов сегментов ДНК. С учётом формирования гидрофобного окружения вблизи ДНК легко понять, почему в рассматриваемой области происходит агрегация и выпадение полимера в осадок (само состояние ПАВ в этой системе гетерогенно — сосуществуют отдельные молекулы в растворе и появляющиеся ассоциаты ПАВ вблизи ДНК). Использование чрезвычайно малых концентраций ДНК в области II в таком случае также может привести к ком-пактизации ДНК с появлением малых дискретных частиц.

После облучения систем УФ-светом 365 нм в течение 10 мин с расстояния 2 см от лампы в области I значительного изменения размеров молекулярного клубка не происходит: вязкость оставалась практически неизменной в пределах погрешности измерений. Если предположить, что в этой области непосредственного контакта ПАВ с ДНК не происходит (иными словами, не реализуется образования устойчивого комплекса), то изменение конформации молекулы ПАВ и не должно заметно повлиять на объёмные эффекты в системе.

Облучение же растворов ДНК с ПАВ из области III приводит к появлению хлопьев и осадка в растворе (т. е. система переходит в область II). Облучение системы из области II приводит к некоторому уменьшению количества хлопьев, но это чисто качественные наблюдения, требующие более тщательного изучения. Таким образом, УФ-облучение систем из области III приводило к образованию видимых глазом агрегатов, которые со временем выпадали в осадок. При этом наблюдалось увеличение оптической плотности растворов из-за рассеяния, фиксируемого по увеличению оптической плотности растворов при X > 600 нм вне полос поглощения компонентов (рис. 5, б). Осаждением агрегатов со временем можно объяснить последующее уменьшение рассеяния.

В заключение следует подчеркнуть, что полученные в работе с помощью разных методов экспериментальные данные согласуются между собой, и вся совокупность их приводит к выводу, что характер взаимодействия AzoTMAB с ДНК зависит от состояния ПАВ в растворе, которое, в свою очередь, определяется его концентрацией, ионной силой и может быть изменено УФ-облучением.

Литература

1. Dias R. S., Lindman B. DNA interactions with polymers and surfactants. Hoboken, 2008. 432 p.

2. Thalberg K., Lindman B., Karlstrom G. Phase diagram of a system of cationic surfactant and anionic polyelectrolyte: tetradecyltrimethylammonium bromide-hyaluronan-water //J. Phys. Chem. 1990. Vol. 94. Iss. 10. P. 4289-4295.

3. Goddard E. D. Polymer-surfactant interaction. Part 2. Polymer and surfactant of opposite charge // Coll. Surf. 1986. Vol. 19. P. 301-329.

4. Bloomfield V. A. DNA condensation by multivalent cations // Biopolymers. 1997. Vol. 44. Iss. 3. P. 269-282.

5. Huang W.-H., Zinchenko A. A., Pawlak C. et al. Dynamic conformational behavior and molecular interaction discrimination of DNA/binder complexes by single-chain stretching in a microdevice // ChemBioChem. 2007. Vol. 8. Iss. 15. P. 1771-1774.

6. Kasyanenko N., Afanasieva D., Dribinsky B. et al. DNA interaction with synthetic polymers in solution // Struct. Chem. 2007. Vol. 18. Iss. 4. P. 519-525.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

7. SlitaA. V., Kasyanenko N. A., Nazarova O. V. et al. DNA-Polycation Complexes. Effect of Polycation Structure on Physico-chemical and Biological Properties // J. Biotechnology. 2007. Vol. 127. Iss. 4. P. 679-693.

8. Dias R. S., Lindman B., Miguel M. G. Interactions between DNA and surfactants // Prog. Coll. Polym. Sci. 2001. Vol. 118. P. 163-167.

9. Dias R. S., Lindman B., Miguel M. G. Compaction and decompaction of DNA in the presence of catanionic amphiphile mixtures // J. Phys. Chem. (B). 2002. Vol. 106. Iss. 48. P. 12608-12612.

10. Gonzalez-Perez A., DiasR.S., NylanderT., Lindman B. Cyclodextrin-surfactant complex: a new route in DNA decompaction // Biomacromolecules. 2008. Vol. 9. Iss. 3. P. 772-775.

11. Mel'nikova Y. S., Lindman B. pH-controlled DNA condensation in the presence of dode-cyldimethylamine oxide // Langmuir. 2000. Vol. 16. Iss. 14. P. 5871-5878.

12. LeNy A.-L. M., Lee Jr. C. T. Photoreversible DNA condensation using light-responsive surfactants //J. Am. Chem. Soc. 2006. Vol. 128. Iss. 19. P. 6400-6408.

13. DiguetA., ManiN.K., Geoffroy M. et al. Photosensitive surfactants with various hydrophobic tail lengths for the photocontrol of genomic DNA conformation with improved efficiency // Chem. Eur. J. 2010. Vol. 16. Iss. 39. P. 11890-11896.

14. Спирин А. С. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот // Биохимия. 1958. Т. 23. № 5. С. 656-662.

15. Frisman E. V., SchaginaL. V., Vorobiev V.I. A glass rotation viscometer // Biorheology. 1965. Vol. 2. P. 189-194.

16. Zakrevskyy Y., Kopyshev A., Lomadze N. et al. DNA compaction by azobenzene-containing surfactant // Phys. Rev. (E). 2011. Vol. 84. Iss. 2. P. 021909-1-021909-9.

17. ФрисманЭ. В., КасьяненкоН. А. Гидродинамическое и оптическое поведение молекулы ДНК в области больших ионных сил // Молек. биология. 1990. Vol. 24. P. 318-324.

Статья поступила в редакцию 28 июня 2011 г.

АННОТАЦИИ

УДК 53:51, 530.145.1, 517.9

Б а г а е в А. А. Об устранении квадратичной по импульсу расходимости нелинейной сигма-модели в формализме фонового поля // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4. 2011. Вып. 4. С. 4-7.

Обсуждаются проблемы использования неинвариантной регуляризации введением ультрафиолетового обрезания импульса применительно к теориям, обладающим калибровочной симметрией. В формализме фонового поля показана возможность модификации действия нелинейной сигма-модели (главного кирального поля) таким образом, что двухпетлевое эффективное действие оказывается свободным от квадратичных расходимостей, а структура логарифмических расходимостей исходной теории сохраняется. Библиогр. 21 назв. Ил. 1.

Ключевые слова: регуляризация по импульсу, нелинейная сигма-модель, расходимости, формализм фонового поля, теорема Вика.

УДК 539.17.01

ГридневК. А., Мальцев Н. А. Изучение реакции 160 + 12С в фолдинг-модели, моделях передачи кластера и отталкивающего кора // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4. 2011. Вып. 4. С. 8-23.

Целью работы было изучение реакции упругого рассеяния 16 О + 12 С в широком диапазоне энергий в рамках оптической модели с ¿—зависимым кором и с потенциалом двойной свёртки, зависящим от плотности перекрывающихся ядер. Для воспроизведения сечения в задней полусфере учитывались канал упругой передачи а-кластера и его связь с каналом неупругой передачи. Определены коэффициенты сжимаемости ядерной материи, которые согласуются с величиной, полученной из данных гигантского монопольного резонанса. Библиогр. 6 назв. Ил. 11. Табл. 6.

Ключевые слова: упругое рассеяние, модель двойной свёртки, передача кластера, DWBA, коэффициент сжимаемости.

УДК 541.123.31/33:(546.791.6+547.464.2)

Мягкова-Романова М. А., Тимофеев С. А. Компьютерное моделирование радиометрического метода экстракционного разделения радиоактивных изотопов // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4. 2011. Вып. 4. С. 24-35.

Разработана математическая модель и на её основе компьютерная программа для моделирования радиометрического метода экстракционного разделения материнского и дочернего изотопов. Программа позволяет рассчитать активность выделенного дочернего изотопа в зависимости от времени его накопления, исходной активности материнского изотопа и предполагаемой эффективности метода разделения. Приведены результаты моделирования для эксперимента по экстракционному разделению «безносительных» количеств изотопов 212 РЬ и 212 В1, находящихся между собой в радиоактивном равновесии. Показано, что данные компьютерного моделирования соответствуют реальным процессам радиоактивного распада и накопления изотопов, адекватно отражают случайный характер этих процессов. Библиогр. 9 назв. Ил. 3. Табл. 3.

Ключевые слова: компьютерное моделирование, обучающие программы, экстракция, радиометрия, изотопы.

УДК 541.64:536.7

Юдович В. М., Юдович М. Е., Пономарёв А. Н., Тойкка А. М. Эффекты синергизма при модификации эпоксиноволачных композитов фуллероидными наночастицами тороидальной формы // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4. 2011. Вып. 4.

С. 36-42.

Методом инфракрасной спектроскопии исследовано влияние различных количеств углеродных наномодификаторов фуллероидной природы — астраленов — на реакцию полимеризации эпоксино-волачной смолы. Доказано принципиальное изменение результатов реакции при введении в систему межфазных границ. Данный эффект объясняется гигантским усилением ван-дер-ваальсовых взаимодействий, которое обеспечивает наличие на границах раздела использованных в работе наночастиц тороидальной формы. Библиогр. 13 назв. Ил. 7.

Ключевые слова: смола, эпоксиноволачная, астралены, наночастица, нанокомпозит, спектроскопия.

УДК 06.54.31

Летенко Д. Г., Никитин В. А., Семёнов К. Н., Чарыков Н. А., Золотарёв А. А., Иванов А. С. Механизм переноса электричества и кластеризации в водных растворах фуллеренола^ // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4. 2011. Вып. 4. С. 43-51.

Изучена зависимость удельной электропроводности и водородного показателя от концентрации растворов фуллеренола^, полученного методом прямого гетерогенно-каталитического окисления фул-лерена Сбо при 25 °С, а также в смешанных водных растворах фуллеренола^ и серной кислоты. Предложен качественный механизм переноса заряда в водно-фуллеренольных растворах. Библиогр. 12 назв. Ил. 4. Табл. 2.

Ключевые слова: фуллеренол^, электропроводность, водородный показатель.

УДК 547.512

Молчанов А. П., Костиков Р. Р. О взаимодействии а-хлор-, а, а-дихлор-и а, а, а-трихлортолуолов с этилмагнийбромидом в присутствии тетраизопропок-сида титана // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4. 2011. Вып. 4. С. 52-54.

При взаимодействии хлоридов РЬСЯЯ'С1 (Я = Я' = Н; Я = Н, Я' = С1; Я = Я' = С1) с этилмаг-нийбромид/тетраизопропоксидом титана получены продукты сдваивания — соответствующие производные 1,2-дифенилэтана. Предложена схема образования продуктов реакции. Библиогр. 14 назв.

Ключевые слова: бензилхлорид, бензальхлорид, бензотрихлорид, тетраизопропоксид титана, этил-магнийбромид, 1,2-дифенилэтан.

УДК 543.544

Москвин А. Л., Мельниченко А. Н., Диченко О. Ю. Фотометрическое определение аммиака в воздухе рабочей зоны с хроматомембранным концентрированием // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4. 2011. Вып. 4. С. 55-60.

Разработана схема определения концентрации аммиака в воздухе рабочей зоны с хроматомем-бранным концентрированием. В ходе исследования показана одинаковая эффективность поглощения аммиака при использовании массообменных блоков двух типов: бипористого и поликапиллярного, которому отдаётся предпочтение вследствие меньшего сопротивления движению жидкой фазы и, как результат, меньшего давления в системе и в 2 раза лучшей сходимости получаемых результатов. Разработанная схема позволяет определять концентрации аммиака в воздухе рабочей зоны с частотой анализа 1 раз в 6 мин. Библиогр. 7 назв. Ил. 4. Табл. 2.

Ключевые слова: жидкостная абсорбция, хроматомембранный массообменный процесс.

УДК 543.544.32

Морозова Т. Е., Зенкевич И. Г. Новые варианты метода стандартной добавки. Газохроматографическое определение камфоры в фармацевтических препаратах // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4. 2011. Вып. 4. С. 61-68.

Для повышения точности результатов количественного газохроматографического анализа гете-рофазных систем методом стандартной добавки рекомендовано использовать дополнительный внутренний стандарт и экстраполяцию на нулевую величину добавки. Все модификации метода проверены на примере определения активных компонентов некоторых фармацевтических препаратов. Библиогр. 10 назв. Ил. 1. Табл. 6.

Ключевые слова: метод стандартной добавки, камфора, фармацевтические препараты.

УДК 547.484 + 547.447

Пакальнис В. В., Зерова И. В., Алексеев В. В., Якимович С. И. Взаимодействие этиловых эфиров 4-гетарил-2,4-диоксобутановых кислот с гидразида-

ми // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4. 2011. Вып. 4. С. 69-75.

Реакция этиловых эфиров 4-(2'-тиенил)- и 4-(3'-пиридил)-2,4-диоксобутановых кислот с гидрази-дами бензойной и пиколиновой кислот осуществляется по связи С=О, соседней со сложноэфирной группировкой. В растворах продукты конденсации существуют как таутомерные смеси гидразонной, енгидразинной и 5-гидрокси-2-пиразолиновой форм. Библиогр. 5 назв. Табл. 1.

Ключевые слова: гидразид, гидразон, енгидразин, кетокислота, конденсация, пиразолин, таутомерия.

УДК 54.01

Поваров В. Г., ЛисовенкоГ. Б., Фальк А. А. Кислоторастворимые сорбенты в обзорном хроматографическом анализе органических примесей воды и воздуха // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4. 2011. Вып. 4. C. 76-82.

В работе рассмотрен новый метод предварительного концентрирования труднолетучих органических соединений из воды и воздуха. Измерены константы сорбции ряда органических соединений на ряде кислоторастворимых сорбентов, построена модель проточного концентрирования и представлены результаты газохроматографического анализа выхлопных газов автомобиля и модельного раствора к-алканов. Библиогр. 5 назв. Ил. 5. Табл. 2.

Ключевые слова: кислоторастворимый сорбент, концентрирование, анализ.

УДК 548.12

Маркин В. Н. Дифракционное повышение симметрии и гомометрические структуры // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4. 2011. Вып. 4. C. 83-86.

Теория гомометрических структур используется для вывода условий, при которых возникает дифракционное повышение симметрии. С этой целью вводится понятие разностной системы двух дискретных точечных множеств и доказывается теорема о гомометрическом сдвиге. Теорема иллюстрируется на примере циклотомических наборов Паттерсона. Библиогр. 4 назв. Ил. 4.

Ключевые слова: дифракционное повышение симметрии, гомометрические структуры, циклотоми-ческие наборы, разностные системы.

УДК 541.183

Бобрышева Н. П., Козин А. О., Селютин А. А. Магнитное разбавление сложных оксидов Sr2MnSbOe и Sr2CrSbOe // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4. 2011. Вып. 4. C. 87-88.

Измерена магнитная восприимчивость твёрдых растворов Sr2M^Ali_^SbO+6 (M = Mn, Cr) в интервале концентраций ed-элемента от 1 до 8 мол. %. Установлено, что атомы Cr(III) находятся в нетипичном низкоспиновом состоянии в интервале температур 80—400 К. Для атомов Mn(III) наблюдается переход из низкоспинового в высокоспиновое состояние при T = 250 K. Магнитные свойства обсуждаются на основании данных о наличии кристаллографических искажений в структуре двойных пе-ровскитов, что позволяет с новых позиций объяснить реализацию низкоспиновых состояний Mn(III) и Cr(III). Библиогр. 3 назв.

Ключевые слова: магнитное разбавление, твёрдые растворы, эффективный магнитный момент, спиновые состояния.

УДК 544.723.54

Земцова Е. Г., Кириченко С. О., Абдрашитов Г. О., Смирнов В. М. Синтез и исследование устойчивости водных суспензий аэросила с поверхностными титанкислородными группами // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4. 2011. Вып. 4.

C. 89-92.

Представлены результаты синтеза титанкислородных наноструктур на поверхности аэросила и исследований устойчивости суспензий на подложках оксида кремния (аэросила) с двухкомпонентными наноструктурами в широком диапазоне концентраций фонового электролита (KCl). Синтез титанкис-лородных групп на поверхности непористой подложки осуществляли методом молекулярного наслаивания (ML-ALD) в газовой фазе. Сопоставление результатов измерений устойчивости золей исходного оксида кремния (аэросила) и синтезированных образцов показывает, что нанесение титанкислород-ных групп на поверхность аэросила приводит к уменьшению порога коагуляции золей на порядок по сравнению с исходной подложкой. Библиогр. 4 назв. Ил. 3. Табл. 3.

Ключевые слова: наноструктуры оксида титана, аэросил, устойчивость водных суспензий.

УДК 543.544:541.123

Родинков О. В., Журавлёва Г. А. Повышение эффективности адсорбционного концентрирования полярных органических веществ при анализе влажного воздуха // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4. 2011. Вып. 4. C. 93-96.

С целью повышения эффективности сорбционного концентрирования полярных органических веществ из влажного воздуха предложен сорбент-осушитель на основе диатомитового носителя и фторида калия. Последний селективно поглощает водяной пар и не удерживает низшие спирты и кетоны.

Использование подобного осушителя позволяет в 2—7 раз увеличить параметры удерживания определяемых веществ. Библиогр. 11 назв. Ил. 2. Табл. 1.

Ключевые слова: сорбция, газовая фаза, летучие органические вещества, сорбенты, угольно-фторопластовые, поверхностно-слойные, фторид калия, осушка.

УДК 532.74:661.105

Кочурова Н. Н., Абдулин Н. Г., Тихомиров И. А., Гермашева И. И. Влияние концентрации водных растворов алкилсульфатов натрия на их триболо-гические свойства // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4. 2011. Вып. 4. C. 97-100.

Работа посвящена изучению динамического поверхностного натяжения водных растворов алкилсульфатов натрия. Особый интерес при этом вызывает появление максимума на зависимости поверхностного натяжения от возраста поверхности. Этот эффект связан с существованием трибологических свойств исследуемых растворов. Измерения поверхностного натяжения растворов проводились методом максимального давления в газовом пузырьке. Библиогр. 7 назв. Ил. 3.

Ключевые слова: динамическое поверхностное натяжение, трибологический эффект, метод максимального давления в газовом пузырьке.

УДК 001.92, 929

Касьяненко Н. А. Вклад Э. В. Фрисман в науку о полимерах и молекулярную биофизику // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4. 2011. Вып. 4. C. 103-113.

Статья посвящена научной деятельности доктора физико-математических наук, профессора Эмилии Вениаминовны Фрисман. Рассмотрена роль Э. В. Фрисман в становлении отечественной школы физики полимеров и молекулярной биофизики. Обсуждается значение научных трудов Э. В. Фрисман в контексте развития представлений о структуре и свойствах биополимеров. Библиогр. 85 назв. Ил. 1.

Ключевые слова: Э. В. Фрисман, динамическое двойное лучепреломление, оптическая анизотропия макромолекул, персистентная длина ДНК, полиэлектролиты.

УДК 537.323.2

Морошкина Е. Б. Интеркаляция как способ связывания биологически активных соединений с двуспиральной ДНК // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4. 2011. Вып. 4. C. 114-123.

Представлен обзор результатов, полученных при исследовании взаимодействия ДНК с различными низкомолекулярными биологически активными соединениями в лаборатории молекулярной биофизики физического факультета под руководством профессора Э. В. Фрисман. В лаборатории была разработана оригинальная методика по определению способа связывания гетероциклических соединений различной структуры с двухспиральной молекулой ДНК, позволившая обнаружить ряд закономерностей в зависимости способа связывания от структуры соединения. Библиогр. 33 назв. Ил. 7.

Ключевые слова: ДНК, гетероциклические соединения, интеркаляция, вискозиметрия, динамическое двойное лучепреломление.

УДК 541.64:539.2:536.7

Дадиванян А. К., Пашинина Ю. М., Ноа О. В., Чаусов Д. Н., Королёв Б. А. Ближний ориентационный порядок и гидрофобные взаимодействия в растворах биологических и синтетических полимеров // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4. 2011. Вып. 4. C. 124-130.

Установлено существование ближнего ориентационного порядка в водных растворах. Рассчитан вклад корреляции ориентаций в термодинамические величины, характеризующие процесс растворения. На основе концепции ближнего ориентационного порядка объяснена природа гидрофобных взаимодействий. Библиогр. 19 назв. Ил. 6. Табл. 1.

Ключевые слова: гидрофобные взаимодействия, ближний ориентационный порядок, метод атом-атом потенциалов, энтропия смешения, свободная энергия смешения, нижняя критическая температура растворения.

УДК 536.4.033

Евлампиева Н. П., Добродумов А. В., Окатова О. В., Коттэ Э. Молекулярные свойства полилизинов дендритной архитектуры // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4. 2011. Вып. 4. C. 131-138.

Образцы четырёх последовательных генераций дендриграфтов поли-Ь-лизина исследованы методами поступательной изотермической диффузии, вискозиметрии и 1H ЯМР в двух буферных

растворителях и диметилформамиде. Получены соотношения Марка—Куна—Хаувинка для коэффициентов диффузии и характеристической вязкости. Значения скейлинговых индексов, установленные для исследованного ряда генераций, подобны аналогичным индексам для рядов генераций известных водорастворимых дендримеров. Однако гидродинамические размеры молекул полилизинов новой архитектуры в заряженном и незаряженном состояниях существенно различаются, что нетипично для классических дендримеров и связано с особенностями строения дендриграфтов. Библиогр. 15 назв. Ил. 4. Табл. 1.

Ключевые слова: полилизин, синтетические полипептиды, дендримеры, молекулярная гидродинамика.

УДК 53.047

Конькова Е. П., Затрудина Р. Ш. Уширение и сдвиг длинноволновой полосы поглощения аминокислот в полярном растворителе // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4. 2011. Вып. 4. C. 139-144.

Проведён количественный анализ влияния сольватации на энергии первых л-л*-переходов некоторых аминокислот при различных концентрациях. Результаты для Pro, Phe, His, Gly, Met и Glu получены с использованием полуэмпирического метода. Неэмпирическим методом рассчитан спектр поглощения коллагена. Библиогр. 6 назв. Ил. 4.

Ключевые слова: аминокислоты, первый л-л*-переход, сольватация.

УДК 53.047

Конькова Е. П., Затрудина Р. Ш. Влияние воды на проявления внутримолекулярных взаимодействий в молекуле NADH // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4. 2011. Вып. 4. C. 145-151.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

С использованием квантово-химических методов исследовано влияние растворителя на внутримолекулярные взаимодействия фрагментов NADH. Значительное уменьшение энергии л-л*-перехода интерпретируется как передача возбуждения от аденина никотинамиду. Сообщаемые результаты подтверждают возможность внутримолекулярного взаимодействия этих фрагментов. Библиогр. 6 назв. Ил. 4.

Ключевые слова: NADH, внутримолекулярное взаимодействие, влияние растворителя.

УДК 577.32

Сулацкая А. И., Кузнецова И. М., ТуроверовК. К. Использование флуоресцентного красителя тиофлавина Т для изучения структуры амилоидных фибрилл // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4. 2011. Вып. 4. C. 152-160.

Приведён анализ различных моделей связывания бензтиазольного красителя тиофлавина Т с амилоидными фибриллами. Показано, что модель, предполагающая связывание красителя с фибриллами в мономерной форме, объясняет существенное возрастание квантового выхода флуоресценции красителя при его инкорпорировании в фибриллы. Разработан подход для определения параметров связывания тиофлавина Т с амилоидными фибриллами и спектральных свойств связанного красителя, основанный на использовании абсорбционной спектрофотометрии растворов, полученных с помощью метода равновесного микродиализа. Предложенный подход открывает новые перспективы использования тиофлавина Т для исследования структуры амилоидных фибрилл. Библиогр. 32 назв. Ил. 4.

Ключевые слова: амилоидные фибриллы, тиофлавин Т, равновесный микродиализ, абсорбционная спектрофотометрия.

УДК 577.322.72, 577.322.23

Степаненко Олеся В., Степаненко Ольга В., Кузнецова И. М., Верхуша В. В., Туроверов К. К. Структурные переходы зелёного флуоресцентного белка (sfGFP) под действием гуанидинтиоцианата // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4. 2011. Вып. 4. C. 161-170.

Изучались процессы разворачивания-сворачивания sfGFP под действием гуанидинтиоцианата. Показано, что разрушение нативной структуры sfGFP при денатурации гуанидинтиоцианатом происходит в области концентраций денатуранта от 0,9 до 2,5М и сопровождается синхронным изменением всех регистрируемых характеристик sfGFP. В области небольших концентраций гуанидинтиоцианата

(менее 0,1—0,2М) было зарегистриовано несколько эффектов. Существенное уменьшение интенсивности флуоресценции хромофора и триптофанового остатка sfGFP при переводе в раствор с небольшой концентрацией денатуранта не сопровождалось заметным изменением пространственной структуры белка, о чём свидетельствует измерение параметра А и анизотропии флуоресценции. Согласно данным гельфильтрации, в этой подобласти концентраций GTC происходит незначительное увеличение гидродинамических размеров sfGFP. Заметно также изменяется полоса поглощения sfGFP в видимой области спектра. Эти данные свидетельствуют о сдвиге равновесия между молекулами белка, содержащими хромофор в нейтральной и анионной формах. Библиогр. 36 назв. Ил. 4. Ключевые слова: флуоресцентные белки, фолдинг белков, гуанидинтиоцианат.

УДК 577.322.72, 577.322.23

Степаненко Ольга В., Степаненко Олеся В., Ф о н и н А. В., Щербакова Д. М., Верхуша В. В., Кузнецова И. М., Туроверов К. К. О-галактоза/О-глюкоза-связывающий белок как чувствительный элемент социально значимой биосенсорной системы. Взаимодействие белка с глюкозой // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4. 2011. Вып. 4. C. 171-179.

Исследовалась устойчивость D-галактоза/D-глюкоза-связывающего белка (GGBP) из Escherichia coli к действию химического денатуранта гуанидингидрохлорида (GdnHCl) и нагревания в отсутствие и в присутствии глюкозы. Выявлено существенное влияние вязкости раствора на процессы взаимодействия белка с глюкозой. Лимитирующей стадией процесса разворачивания-сворачивания комплекса GGBP/Glc под действием GdnHCl является разрушение/возникновение конфигурационного соответствия между белком в нативном состоянии и молекулой глюкозы. Скорость этих процессов изменяется с увеличением/уменьшением концентрации денатуранта. Низкая скорость достижения равновесия между нативным комплексом GGBP/Glc и белком в развёрнутом состоянии в растворах денатуран-та высокой и средней концентрации связана с тем, что присутствие в растворе GdnHCl приводит к увеличению его вязкости. Подобный эффект не наблюдался при тепловой денатурации GGBP/Glc. Выявлена существенная роль второго лиганда GGBP, иона кальция в стабилизации открытой формы белка. Эксперименты по тепловой денатурации GGBP позволили показать, что необратимость разворачивания GGBP в присутствии и в отсутствие лигандов вызвана агрегацией молекул белка при его инкубации в развёрнутом состоянии при высокой температуре. Степень агрегации молекул белка зависит от концентрации белка, температуры и длительности инкубации. Полученные данные необходимо учитывать при конструировании биосенсорной системы на глюкозу с GGBP в качестве чувствительного элемента. Библиогр. 15 назв. Ил. 4.

Ключевые слова: стабильность белков, биосенсорная система, вязкость.

УДК 577.322.72, 577.322.23

Фонин А. В., Степаненко О. В., Верхуша В. В., Щербакова Д. М., Кузнецова И. М., Туроверов К. К. Перспективы создания чувствительного элемента флуоресцентного биосенсора на глюкозу // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4. 2011. Вып. 4. C. 180-185.

Исследованы физико-химические свойства и стабильность потенциального чувствительного элемента биосенсорной системы на глюкозу мутантной формы D-глюкоза/D-галактоза-связывающего белка GGBP/H152C с присоединённым флуоресцентным красителем-баданом (6-бромацетил-2-диме-тиламинонафталин). Изучен процесс комплексообразования GGBP/H152C-Badan c D-глюкозой. Показано, что флуоресцентные свойства бадана, присоединённого к GGBP/H152C, зависят от динамики структуры молекулы белка как целого и от изменения свойств микроокружения красителя. Биб-лиогр. 15 назв. Ил. 4.

Ключевые слова: биосенсорные системы, диабет, флуоресцентные красители, лиганд-связывающие белки.

УДК 541.64

Коженков П. В., Рамазанов Р. Р., Шишилов О. Н., Ефименко И. А., Касьяненко Н. А. // Взаимодействие ДНК с K2[PdHGluCl2] in vitro // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4. 2011. Вып. 4. C. 186-192.

Представлены результаты экспериментального изучения in vitro взаимодействии молекулы ДНК с K2 [PdHGluCl2] в 0,15М и 0,005М NaCl методами спектрофотометрии, кругового дихроизма и атомной

молекулярной микроскопии. Проведён квантово-механический расчёт структуры соединения палладия при изменении его координационной сферы в результате акватации с использованием программных пакетов НурегСЬет 8.0 и GAMESS (FiгeFly 7.1g). При расчёте молекул использован неограниченный метод Хартри—Фока и базисы: SBKJC VDZ ЕСР для палладия, DH для атомов водорода и 6,31+G* для всех остальных атомов в молекуле комплекса. Показано, что соединение палладия взаимодействует с молекулой ДНК в растворе малой ионной силы, тогда как при физиологических условиях (в 0,15М ^С1) взаимодействия ДНК с соединением палладия не наблюдается. Библиогр. 9 назв. Ил. 4. Табл. 1. Ключевые слова: ДНК, комплексы палладия, атомная силовая микроскопия.

УДК 577.323.23

РамазановР. Р., Щёголев Б. Ф., Касьяненко Н. А. Неэмпирическое исследование свойств электронного и пространственного строения урациловых производных комплексов платины // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4. 2011. Вып. 4. С. 193-197.

Проведено исследование электронного и пространственного строения координационных комплексов урациловых производных платины(П) [Pt(NHз)2C1(URA—И.)] методом Хартри—Фока—Рутаана с учётом корреляции электронов в рамках теории возмущений второго порядка Мюллера—Плессета. Проанализирована возможность монодентатного координационного связывания платиновых комплексов с ДНК с частичной интеркаляцией урацилового лиганда. Показано отличие электронного строения в ряду замещения радикалов на урациле, способное вызвать разные эффекты при взаимодействии с молекулой ДНК. Библиогр. 18 назв. Ил. 3. Табл. 2.

Ключевые слова: неэмпирическое исследование, координационные комплексы платины(П), ураци-ловые производные платины, взаимодействие с ДНК.

УДК 577.353: 616.12-007.61

БелостоцкаяГ. Б., Елдашев И. С., Сурма С. В., Щёголев Б. Ф. Молекулярные механизмы воздействия магнитных полей разной интенсивности на регуляцию уровня кальция в культивируемых мышечных клетках // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4. 2011. Вып. 4. С. 198-204.

Впервые исследовано воздействие МП (0,3; 160—400 мкТл) на Са2+-сигнализацию в культивируемых скелетных мышечных клетках новорождённой крысы. Изучение активности рецепторов наружной мембраны и саркоплазматического ретикулума, участвующих в выполнении основной функции мышечных клеток — сокращении, позволило рассмотреть МБЭ, индуцированные гипомагнитным полем и слабым ПМП, на молекулярном уровне и оценить степень их воздействия на функцию скелетной мускулатуры. Библиогр. 20 назв. Ил. 3.

Ключевые слова: постоянное магнитное поле, экранирование геомагнитного поля, сателлитная культура скелетных мышечных клеток, миотрубки, Са2+ L-каналы наружной мембраны, дигидро-пиридиновые рецепторы, рианодиновые рецепторы.

УДК 541.64

Космотынская Ю. В., Иманбаев Р. Т., Богданов А. А., Касьяненко Н. А. Анализ совместного действия радиации и противоопухолевых препаратов платины на структуру и свойства молекулы ДНК в растворе // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4. 2011. Вып. 4. С. 205-211.

На уровне модельных систем (водно-солевых растворов ДНК) проведено исследование гидродинамических и спектральных свойств молекулы ДНК при комбинированном действии у-облучения и координационных соединений платины (цис-ДДП, транс-ДДП, Pten и Pten(ДМСО)). Показано, что гамма-облучение дозой 1 крад не влияет на последующее связывание исследуемых в работе соединений платины с макромолекулой, а образование комплексов ДНК с изучаемыми препаратами платины не препятствует действию гамма-облучения на ДНК. Сделан вывод о том, что присутствие ДМСО в растворе ДНК при гамма-облучении дозой 1 крад частично защищает макромолекулу от поражающего действия радиации. Проведённые исследования свидетельствуют о возможном совместном использовании у-облучения и химиотерапии с применением препаратов платины. Библиогр. 29 назв. Ил. 2. Табл. 1.

Ключевые слова: диметилсульфоксид, высокомолекулярная ДНК, вискозиметрия, гамма-облучение, круговой дихроизм, координационные соединения платины.

УДК 536.756, 538.953, 519.245

Силантьева И. А., Воронцов-Вельяминов П. Н. Исследование решёточных моделей полимерных цепей и звёзд методом Монте-Карло с использованием алгоритма Ванга—Ландау // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4. 2011. Вып. 4. C. 212-219.

Представлено численное исследование полимерных цепей и звёзд методом Монте-Карло с использованием алгоритма Ванга—Ландау. Рассмотрены решёточные модели полимерных цепей длиной до 120 сегментов и звёзд из шести лучей. Рассчитаны доля самонепересекающихся конформаций и удельная избыточная энтропия в зависимости от числа сегментов в молекуле полимера. Получено распределение самонепересекающихся конформаций по числу контактов. Библиогр. 17 назв. Ил. 4. Табл. 3. Ключевые слова: полимерная звезда, алгоритм Ванга—Ландау, энтропия.

УДК 577.322.4

С т р у ц А. В., Б р а у н М. Ф. Структурная динамика ретиналя в процессе активации родопсина // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4. 2011. Вып. 4. C. 220-228.

Значительный прогресс, достигнутый в последнее время в изучении структуры рецептора, сопряжённого с G-белком, родопсина, не позволил однозначно установить механизм его активации. В работе показано, что методы твердотельного ядерного магнитного резонанса на дейтерии предоставляют уникальные данные о локальной структуре, динамике и молекулярных взаимодействиях лиганда ре-тиналя в связывающем кармане родопсина, недоступные другим методам и являющиеся ключевыми для понимания активации белка. Библиогр. 15 назв. Ил. 4. Табл. 1.

Ключевые слова: мембраны, родопсин, ядерный магнитный резонанс.

УДК 539.21, 541.182, 577.323

Титов А. В., Варшавский М. С., Лопатько К. Г., Касьяненко Н. А. Изучение взаимодействия наночастиц серебра с молекулой ДНК в водно-солевом растворе // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4. 2011. Вып. 4. C. 229-233.

Изучено влияние концентрации соли на спектральные свойства серебряных наночастиц в водном растворе. Рассмотрена возможность взаимодействия наночастиц с молекулой ДНК и синтетическим поликатионом полиаллиламином (ПАА). Вся совокупность полученных экспериментальных данных свидетельствует о влиянии на состояние наночастиц в растворе полиионов (ДНК и ПАА), а также низкомолекулярных электролитов (NaCl, HCl, NaOH). В частности, полоса плазмонного поглощения наночастиц претерпевает изменение под действием указанных компонентов. Присутствие наночастиц серебра в водно-солевом растворе ДНК вызывает уменьшение объёма макромолекулы, как это следует из данных по вискозиметрии. Добавление наночастиц в раствор ДНК препятствует фиксации макромолекулы на поверхности слюды при проведении стандартной процедуры с добавлением в раствор MgCl2, что в какой-то мере может указывать на недоступность фосфатных групп ДНК для ионов магния. АСМ-изображения изучаемых систем позволили оценить размер наночастиц. Библиогр. 4 назв. Ил. 4. Табл. 1.

Ключевые слова: наночастицы серебра, плазмонный резонанс, ДНК.

УДК 577.323.23

Титов Е. В., Лысякова Л. А., Закревский Ю., Ломадзе Н., Зырянова И. М., Божкова Е. А., СантерС., Касьяненко Н. А. Изучение взаимодействия ДНК с триметиламмониум бромидом, содержащим азобензоль-ную группу // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4. 2011. Вып. 4. C. 234-242.

Изучалось взаимодействие высокомолекулярной ДНК с триметиламмониум бромидом, содержащим азобензольную группу (AzoTMAB), относящимся к поверхностно-активным веществам (ПАВ). Соединение AzoTMAB может менять свою конформацию (транс—ч"с-переход) под действием УФ-об-лучения. Использовались методы спектрофотометрии, низкоградиентной вискозиметрии, атомной силовой микроскопии. Показано, что взаимодействие ДНК с ПАВ существенно зависит от ионной силы раствора и концентрации AzoTMAB. На основании данных вискозиметрии в растворе ДНК малой ионной силы (концентрация NaCl 0,005M) можно условно выделить три области концентраций AzoTMAB. При малых концентрациях наблюдается уменьшение размеров клубка ДНК из-за связывания с ПАВ, при увеличении концентрации AzoTMAB визуально наблюдается появление осадка в растворе из-за агрегации. Однако дальнейшее увеличение концентрации ПАВ приводит к образованию компактных структур. В условиях большой ионной силы (концентрация NaCl 1M) поведение системы кардинально отличается от реализуемого в 0,005M NaCl — наблюдается лишь незначительное падение вязкости ДНК. Библиогр. 17 назв. Ил. 6.

Ключевые слова: ДНК, светочувствительное катионное поверхностно-активное вещество.

ABSTRACTS

Bagaev A. A. On eliminating quadratic momentum divergence for a non-linear sigma-model in background field formalism // Vestnik St.Petersburg University. Ser. 4. 2011. Issue. 4. P. 4-7.

Some difficulties of non-invariant momentum cutoff regularization in gauge symmetric theories are studied. An action of the non linear sigma-model (a principal chiral field) is modified in background field formalism in such a way that the effective action in two-loop approximation didn't content quadratic divergences. The logarithmic divergences of theory with new action and of initial one coincide.

Keywords: momentum cutoff regularization, non-linear sigma-model, divergences, background field formalism, Wick theorem.

Gridnev K. A., Maltsev N. A. Investigation of 16O + 12C reaction in the frame of a double folding model, a cluster transfer model and a repulsive core model // Vestnik St.Petersburg University. Ser. 4. 2011. Issue. 4. P. 8-23.

The aim of the work was to describe the reactions of elastic scattering 16 O + 12 C in the wide range energies in the frame of the optical model with an ¿-dependent core and a double folding model. In the back hemisphere we took into account the elastic transfer channel and coupling of elastic and inelastic transfer channels. The value of the compressibility coefficient which was extracted from the experiments occurred in agreement with the value obtained from the position of nuclear monopole resonance.

Keywords: elastic scattering, double folding model, cluster transfer, DWBA, compressibility coefficient.

Myagkova-Romanova M. A., Timofeev S. A. Computer simulation of radiometric for radioactive isotope extraction // Vestnik St.Petersburg University. Ser. 4. 2011. Issue. 4. P. 24-35.

A mathematical model and a computer program are developed for simulation of isotope extraction radiometry. The program is designed to calculate activity of a separated daughter isotope according to the time of its accumulation, the initial activity of a parent isotope and assumed efficiency of a separation method. Calculation results are presented for simulation of radiometry control of separation of unalloyed isotopes 212Pb and 212Bi being at radioactive equilibrium. Calculation results are compared with experimental data. It is shown that a mathematical model and a computer program suggested for simulation of radiometry control correspond to real radioactive decay and isotope storage processes and are adequately reflect random nature of these processes.

Keywords : computer modeling, e-learning, extraction, radiometry, isotopes.

Yudovitch V. M., Yudovitch M. E, Ponomarev A. N., ToikkaA. M. Synergetic effects in epoxy no-volac systems modified by fulleroid nanoparticles of toroidal form // Vestnik St.Petersburg University. Ser. 4. 2011. Issue. 4. P. 36-42.

The influence of different quantities of carbon nanomodifiers of fulleroid nature — Astralens — on the reaction of epoxy novolac resin polymerization was investigated by the IR-spectroscopy method. Principal change of the reaction results in including interface into the system was proved. Such effect is explained by the giant intensification of van-der-vaals interactions that arise by including the interface modified by nanoparticles of toroidal shape into the reaction system.

Keywords: resin, epoxynovolac, astralens, nanoparticle, nanocomposite, spectroscopy.

Letenko D. G., NikitinV. A., Semenov K. N., Charykov N. A., Zolotarev A. A., Ivanov A. S. Mechanism of electricity and clusterization transfer in fullerenol-d water solutions // Vestnik St.Petersburg University. Ser. 4. 2011. Issue. 4. P. 43-51.

The dependence of electrical conductivity and hydrogen indicator on the concentration of — fullerenol-d water solutions (in water and water-sulfuric acid solutions) was investigated. Fullerenol-d was synthesized by the method of direct heterogeneous catalyst oxidation of individual fullerene C60. Mechanism of electricity transfer in fullerenol-d water solutions was suggested.

Keywords: fullerenols, electrical conductivity, hydrogen indicator.

Molchanov A. P., Kostikov R. R. On the reaction of a-chloro-, a, a-dichloro- and a, a, a-trichloroto-luenes with ethylmagnesium bromide in presence of titanium(IV) isopropoxide // Vestnik St.Pe-tersburg University. Ser. 4. 2011. Issue. 4. P. 52-54.

The reaction of PhCRR'Cl (R = R' = H; R = H, R' = Cl; R = R' = Cl) chlorides with ethyl magnesium bromide in presence of titanium(IV) isopropoxide carried out with formation of the products of dimerization — corresponding of 1,2-diphenylethane derivatives. The scheme of product formation is suggested.

Keywords: benzyl chloride, benzal chloride, benzotrichloride, titanium(IV) isopropoxide, ethylmagne-sium bromide, 1,2-diphenylethane.

Moskvin A. L., Melnichenko A. N., Dichenko O. Yu. Photometrical determination of ammonia in working area air with chromatomembrane preconcentration // Vestnik St.Petersburg University. Ser. 4. 2011. Issue. 4. P. 55-60.

This work is devoted to developing the scheme of determination of ammonia in working area air with chromatomembrane preconcentration. Similar efficiency of preconcentration with biporous and polycapillary mass-transfer blocks was shown. However the preference is given to polycapillary blocks due to their less resistance to liquid phase flowing and better reproducibility of measurements. The scheme developed allows to provide determination of ammonia concentration in working area air once for 6 minutes. Keywords: liquid absorption, chromatomembrane mass-transfer process.

Morozova T. E, Zenkevich I. G. New modifications of the standard addition method. Determination of camphor in some pharmaceuticals // Vestnik St.Petersburg University. Ser. 4. 2011. Issue. 4. P. 61-68.

To improve the accuracy of quantitative gas chromatographic analysis, new modifications of the standard addition method using internal standard and extrapolation of results to "zero" addition is suggested. All modifications were tested by the way of analysis of active constituents of some pharmaceuticals. Keywords: standard addition method, camphor, pharmaceutical drugs.

Pakal'nis V. V., Zeroval. V., Alekseyev V. V., Yakimovich S. I. Interaction of ethyl esters of 4-hete-roaryl-2,4-dioxobutanoic acids with hydrazides // Vestnik St.Petersburg University. Ser. 4. 2011. Issue. 4. P. 69-75.

The reaction of ethyl 4-(2'-thienyl)- and 4-(3'-pyridyl)-2,4-dioxobutanoates with hydrazides of benzoic and picolinic acids is carried out on bond C=0 adjacent with an ester group. Condensation products in solutions exist as tautomeric mixture of hydrazone, enhydrazine and 5-hydroxy-2-pyrazoline forms. Keywords: hydrazide, hydrazone, enhydrazine, pyrazoline, condensation, keto acid, tautomerism.

Povarov V. G., Lisovenko G. B., FalkA. A. // Vestnik St.Petersburg University. Ser. 4. 2011. Issue. 4. P. 76-82.

The new method of concentration of non-volatile organic compounds (NVOC) from water and air are discussed. Constants of sorbtion of some NVOC were meagured, produced model of concentration in stream mode and presented results of GC analisys of exhaust gases of engine and model solution of n-alkanes in water.

Keywords: acid-dissolved sorbent, concentrating, analysis.

Markin V. N. Diffraction enhancement of symmetry and homometric structures // Vestnik St.Petersburg University. Ser. 4. 2011. Issue. 4. P. 83-86.

An attempt has been made to deduce the conditions necessary for diffraction enhancement of symmetry. The aim of the present paper is to deal with the theory of the diffraction enhancement of symmetry in a more general way and to show that the theory of homometric structures is basic for structure analysis.

Keywords: diffraction enhancement of symmetry, homometric structures, cyclotomic sets, difference systems.

BobryshevaN. P., KozinA. O., Selyutin A. A. Magnetic dilution of complex oxides Sr2MnSbO6 and Sr2CrSbO6 // Vestnik St.Petersburg University. Ser. 4. 2011. Issue. 4. P. 87-88.

Magnetic susceptibility of S^M^Ali—^SbO+e (M = Mn, Cr) solid solutions was measured in the range of 3d-element concentration from 1 to 8 mol %. It was established that Cr(III) atoms are in untypical lowspin state over the temperature interval 80—400 K. For Mn(III) atoms the transfer from lowspin to a high state is observed at 250 K. Based on a data of the presence of crystallographic distortion in the double perovskite structure the magnetic properties of solid solutions are discussed. It allows to explain realization of low spin states of Mn(III) and Cr(III) from the new positions.

Keywords: magnetic dilution, solid solutions, effective magnetic moment, spin states.

Zemtsova E. G., Kirichenko S. O., Abdrashitov G. O., Smirnov V. M. Synthesis and study of stability of aerosil aqueous suspensions with surface titanium-oxide groups // Vestnik St.Petersburg University. Ser. 4. 2011. Issue. 4. P. 89-92.

The results of synthesis of titanium-oxide nanostructures on the surface of aerosil and the analysis of stability of suspensions of the non-porous silicon oxide substrate (aerosol) with two-component nanostructures in a wide range of background electrolyte (KCl) concentration are presented. The comparison of measurement results of stability of the initial substrate sols and sols of synthesized samples shows that deposition of titanium-oxide groups on the surface of aerosil leads to substantial decrease in the coagulation threshold of sols compared with the original aerosil substrate.

Keywords: nanostructure titan oxide, nonporous silica, stability of water suspensions.

Rodinkov O. V., Zhuravleva G. A. Efficiency enhancement of adsorptive concentration of polar organic compounds in the analysis of moist air // Vestnik St.Petersburg University. Ser. 4. 2011. Issue. 4. P. 93-96.

The sorbent-desiccant on the basis of diatomite carrier and potassium fluoride to improve the efficiency of sorption concentration of polar organic substances from the moist air is suggested. Potassium fluoride selectively absorbs water vapor and does not retain lower alcohols and kytones. The use of this desiccant allows a 2—7 fold increase in the retention parameters of the determined substances.

Keywords: sorption, gaseous phase, volatile organic substances, sorbents, coal-teflon, surface-layer, fluoride potassium, dewatering.

Kochurova N. N., AbdulinN. G., Tikhomirov I. A., Germasheva 1.1. The influence of concentration of sodium alkyl sulfate aqueous solutions on their dynamic surface tension tribological properties // Vestnik St.Petersburg University. Ser. 4. 2011. Issue. 4. P. 97-100.

The paper is devoted to studying the dynamic surface tension of sodium alkyl sulfates aqueous solutions. The appearance of maximum surface tension vs. the surface age dependence invokes a particular interest. This effect is associated with the existence of tribological properties of investigated solutions. The surface tension measurements were realized by the maximum bubble pressure method.

Keywords: dynamic surface tension, tribological effect, maximum bubble pressure tensiometry.

Moroshkina E. B. Intercalation as a mode of biological active compound binding with double-stranded DNA // Vestnik St.Petersburg University. Ser. 4. 2011. Issue. 4. P. 114-123.

The present work is a review of the results obtained at the Laboratory of Molecular Biophysics headed by Professor E. V. Frisman when studying DNA interaction with various low-molecular biological active compounds. A novel technique to determine a mode of binding of the heterocyclic compounds of different structure with double-stranded DNA was developed to reveal a series of laws concerning the binding mode dependence on compound structure.

Keywords: DNA, heterocyclic compounds, intercalation, viscometry, dynamical birefringence.

Dadivanyan A. K., Pashinina Yu. M., Noah O. V., Chausov D. N., Korolev B. A. Short-range orienta-tional order and hydrophobic interactions in solutions of biological and synthetic polymers // Vest-nik St.Petersburg University. Ser. 4. 2011. Issue. 4. P. 124-130.

Existence of the short-range orientation order in aqueous solutions is shown. Contribution of orientation correlation to thermodynamic characteristics of dissolution is calculated. The nature of hydrophobic interactions is explained from the viewpoint of the short-range orientation order concept.

Keywords: hydrophobic interactions, short-range orientation order, atom-atom potentials method, entropy of mixing, free energy of mixing, lower critical solution temperature.

YevlampievaN. P., Dobrodumov A. V., OkatovaO. V., CottetH. Molecular properties of dendritic architecture polylysines // Vestnik St.Petersburg University. Ser. 4. 2011. Issue. 4. P. 131-138.

Four serial generations of dendrigraft poly-L-lysine have been studied in dimethylformamide and in two aqueous buffers by translation diffusion, viscometry and XH NMR methods. The Mark-Kuhn-Houwink relationships for diffusion coefficients and intrinsic viscosity were obtained. It was shown that the scaling index values of dendrigrafts' series correlate with the scaling indices of water soluble dendrimers of similar chemical structure. In contrast to classical dendrimers, a significant change of hydrodynamic dimensions of dendrigraft poly-L-lysine in protic and aprotic solvents was detected as the specific feature of dendrigrafts architecture in comparison with dendrimers.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Keywords: polylysine, synthetic polypeptides, dendrimers, molecular hydrodynamics.

KonkovaE.P., Zatrudina R. Sh. Broadening and shift of the first singlet transition of acids on exposure of a polar solvent // Vestnik St.Petersburg University. Ser. 4. 2011. Issue. 4. P. 139-144.

The quantitative analysis of the influence of solvation on the n-n*-transition energies of some acids is carried out at various concentrations. The results for Pro, Phe, His, Gly, Met and Glu are obtained by a semiempirical method. Absorption spectra of collagen is calculated by an ab initio method.

Keywords: acids, the first n-n* transition, solvation.

Konkova E. P., Zatrudina R. Sh. Solvent effect on manifestation of intramolecular interactions in NADH // Vestnik St.Petersburg University. Ser. 4. 2011. Issue. 4. P. 145-151.

Solvent effect on intramolecular interactions of NADH fragments is studied by a quantum-chemical methods. Significant decrease of the n-n*-transition energy is interpreted as the excitation transfer from adenine to nicotinamid. The reported results confirm possibility of the intramolecular interaction of these fragments.

Keywords: NADH, intramolecular interaction, solvent effect.

Sulatskaya A. I., Kuznetsova I. M., Turoverov K. K. The use of fluorescent dye thioflavin T for studying amyloid fibrils structure // Vestnik St.Petersburg University. Ser. 4. 2011. Issue. 4. P. 152-160.

Different models of benzothiazole dye thioflavin T binding to amyloid fibrils were analyzed. It was shown that the model assuming thioflavin T binding to amyloid fibrils in monomer form explains the increase of fluorescence quantum yield accompanying the incorporation of this dye into fibrils. The approach was elaborated to determine ThT — amyloid fibril binding parameters and spectral properties of bound dye by absorption spectrophotometry of solutions prepared by equilibrium microdialysis. The proposed approach enables new ways to use ThT for amyloid fibrils structural examination.

Keywords: amyloid fibrils, thioflavin T, equilibrium microdialysis, absorption spectrophotometry.

Stepanenko OlesyaV., Stepanenko OlgaV., Kuznetsova I. M, Verkhusha V. V., Turoverov K. K. Structural dynamics of super-folder GFP induced by guanidine thiocyanate // Vestnik St.Petersburg University. Ser. 4. 2011. Issue. 4. P. 161-170.

Structural changes of sfGFP induced by guanidine thiocyanate were studied. Unfolding sfGFP structure occurs in the range of guanidine thiocyanate concentrations from 0.9 to 2.5M as indicated by simultaneous changes of all recorded parameters of protein. The addition of small GTC concentrations (less then 0.1—0.2M) results in substantial decrease of chromophore and tryptophan fluorescence intensity while parameters sensing the tertiary structure such as fluorescence anisotropy and parameter A remain practically unchanged. Nevertheless slight loosening of sfGFP structure was observed in this subrange of GTC concentrations by gel filtration. We also recorded pronounced changes in visible absorption spectra of sfGFP induced by small GTC concentrations: sharp drop of absorption band corresponding to the anionic form of chromophore with concomitant rise of absorption band corresponding to neutral chromophore. This data indicate that the small addition of GTC leads to shift in equilibrium between neutral and anionic form of chromophore. We suppose that these changes can be triggered by local structural reorganization of sfGFP.

Keywords: fluorescent proteins, protein folding, guanidine thiocyanate.

Stepanenko OlgaV., Stepanenko OlesyaV., FoninA. V., Shcherbakova D. M., Verkhusha V. V., Kuznetsova I. M., Turoverov K. K. D-Galactose/D-Glucose-binding protein as sensing probe of socially relevant biosensor systems. Protein—ligand interaction // Vestnik St.Petersburg University. Ser. 4. 2011. Issue. 4. P. 171-179.

In this work we have studied the stability of D-galactose/D-glucose-binding protein (GGBP) from Es-cherichia coli to denaturing action of guanidine hydrochloride (GdnHCI) and heating in the presence and in the absence of glucose. The pronounced effect of solution viscosity on processes of protein—ligand interaction is revealed. The limiting step of the unfolding-refolding process of GGBP/Glc complex is the

disruption/tuning of configuration fit between protein in the native state and the ligand. The rate of these processes changes with increase/decrease of denaturant concentration. This deceleration of equilibrium acquisition between the native protein in GGBP/Glc complex and the unfolded state of protein is connected with increased viscosity of the solution at moderate and high GdnHCl. This effect is not revealed at heat-induced GGBP/Glc denaturation. We have shown the substantial role of the second ligand of GGBP in the stabilization of protein open form, i.e., when it is in the sugar-free state. Experiments on the heat-induced denaturation of GGBP have shown that irreversibility of unfolding process is caused by the aggregation of protein as a result of incubation of the unfolded protein at high temperature. The amount of protein aggregation depends on protein concentration, temperature and duration of incubation. The obtained data should be taken into account at GGBP using as a sensing probe of glucose biosensor.

Keywords: protein stability, biosensor system, viscosity.

FoninA. V., Stepanenko OlgaV., Verkhusha V. V., Shcherbakova D. M., Kuznetsova I. M., Turoverov K. K. Prospects of fluorescence glucose biosensor response element creation // Vestnik St.Petersburg University. Ser. 4. 2011. Issue. 4. P. 180-185.

Physicochemical properties and stability of possible glucose biosensor response element GGBP/H152C-Badan were investigated. GGBP/H152C-Badan with D-glucose ligand binding was studied. It was shown that badan fluorescent properties depend on both protein dynamic structure and dye microenvironment property changing.

Keywords: biosensors, diabetes, fluorescent dye, ligand-binding proteins.

Kozhenkov P. V., Ramazanov R. R., Shishilov O. N., Efimenko I. A., Kasyanenko N. A. DNA interaction with K2 [PdHGluCl2] in vitro // Vestnik St.Petersburg University. Ser. 4. 2011. Issue. 4. P. 186-192.

The experimental results for DNA interaction in vitro with K2 [PdHGluCl2] in 0.15M and 0.005M NaCl were obtained by the methods of spectrophotometry, circular dichroism and atomic force microscopy. The quantum-chemical calculation of Palladium compound structure at the alteration of its coordination sphere as a result of aquatation was done. HyperChem 8.0 and GAMESS (FireFly 7.1g) software were used. For the calculation of molecular structure the Hartree—Fock method and SBKJC VDZ ECP bases: for palladium, DH for hydrogen atoms and 6.31+G* for all other atoms in the molecule of the complex were explored. It was shown that the palladium compound under study interacts with DNA in the solution of low ionic strength and does not form any complexes in physiological conditions (0.15M NaCl).

Keywords: DNA, coordination compounds of Pd(II), atomic force microscopy.

Ramazanov R. R., Shchegolev B. F., Kasyanenko N. A. Non-empirical research of electronic structures and geometry properties of uracil derivatives of platinum(II) // Vestnik St.Petersburg University. Ser. 4. 2011. Issue. 4. P. 193-197.

The research of electronic and geometric structures of uracil derivatives of platinum(II) by an ab initio HF method at MP2 level of theory is conducted. Possibility of monodentate coordination binding and partial ntercalation of uracil ligand of platinum complexes with DNA is analysed. Electronic structure differences among replacement of radicals on uracil capable to cause different effects at interaction with DNA are shown.

Keywords: ab initio calculations, coordination complexes of platinum(II), uracil derivatives of platinum, interaction with DNA.

Belostotskaya G. B., Eldashev I. S., Surma S. V., Shchegolev B. F. Molecular mechanisms of the action of different intensity magnetic field on regulation of calcium level in cultured muscle cells // Vestnik St.Petersburg University. Ser. 4. 2011. Issue. 4. P. 198-204.

For the first time the action of magnetic fields (0.3; 160—400 ^T) on Ca2+ signalization in cultured new born rat skeletal muscle cells was investigated. The study of the outer membrane and sarcoplasmic reticulum receptor activity which take part in the main muscle function — contraction allowed to consider magnetobiological effects induced by a hypomagnetic field and a low static magnetic field at the molecular level and estimate the degree of their action on the skeletal muscles function.

Keywords: static magnetic field, shielding of geomagnetic field, satellite culture of the skeletal muscle cells, myotubes, Ca2+ L-channels of the outer membrane, dihydropyridine receptors, ryanodine receptors.

Kosmotynskaya Yu. V., Imanbaev R. T., Bogdanov A. A., Kasyanenko N. A. Analysis of combined activity of radiation and antitumoral platinum preparations on structure and properties of DNA molecule in solution // Vestnik St.Petersburg University. Ser. 4. 2011. Issue. 4. P. 205-211.

At the level of model systems (water-salt DNA solutions) the examination of hydrodynamic and spectral properties of DNA was conducted under the combined activity of y-irradiation and platinum coordination compounds (cis-DDP, trance-DDP, Pten and Pten (DMSO)). It was shown that gamma irradiation by

1 krad dose does not influence on subsequent complexation of platinum with a macromolecule and the formation of DNA complexes with studied drugs of platinum does not interfere with irradiation. The deduction that DMSO presence in DNA solution at gamma irradiation by 1 krad dose particularly protects a macro-molecule from radiation is drawn. The conducted examinations testify of possible sharing y-irradiation and chemotherapy with application of platinum drugs.

Keywords: dimethyl sulfoxide, high-molecular DNA, viscometry, y-irradiation, circular dichroism, coordination compounds of platinum.

Silantieval. A., Vorontsov-Velyaminov P. N. Investigation of lattice models of polymer chains and stars by Monte Carlo method within Wang—Landau algorithm // Vestnik St.Petersburg University. Ser. 4. 2011. Issue. 4. P. 212-219.

Monte Carlo method within Wang—Landau algorithm is used for studying free polymer chains and polymer stars. Lattice models of polymer chains with length up to N = 120 monomers and stars with six arms with their length up to Narm = 20 monomers are considered. The ratio of self-avoiding walks among semi-phantom walks and specific excess entropy dependency on N are calculated. The distribution of self-avoiding walks over the number of contacts for calculation of thermal properties is obtained.

Keywords: polymer star, Wang—Ladau algorithm, entropy.

Struts A. V., Brown M. F. Retinal structural dynamics in rhodopsin activation // Vestnik St.Petersburg University. Ser. 4. 2011. Issue. 4. P. 220-228.

The latest progress in X-ray crystallography of the active state of rhodopsin does not allow one to unequivocally establish the mechanism of receptor activation. In this work it is shown that solid-state 2H NMR spectroscopy provides unique data on local structure, dynamics, and molecular interactions of the retinal ligand in the binding pocket of rhodopsin. This knowledge is unavailable by other techniques and is crucial for understanding rhodopsin activation.

Keywords: membranes, rhodopsin, nuclear magnatic resonance.

Titov A. V., Varshavskii M. S., Lopatko K. G., Kasyanenko N. A. Study of DNA interaction with silver nanoparticles in water (salt solution) // Vestnik St.Petersburg University. Ser. 4. 2011. Issue. 4. P. 229-233.

The influence of salt concentration on spectral properties of silver nanoparticles in the solution was investigated. The interaction of silver nanoparticles with DNA and synthetic polycation polyallylamine (PAA) was considered. Experimental data obtained by various methods indicate the influence of polyions (DNA and PAA) and low molecular electrolytes (NaCl, HCl, NaOH) on the state of nanoparticles. In particular, the band of plasmon absorption is changed by the influence of these components. The presence of silver nanoparticles decrease DNA volume in the solution. Adding nanoparticles into the solution prevents DNA fixation on mica surface during standard procedure in the presence of MgCl2. Thus DNA phosphate groups are inaccessible for magnesium ions. The size of the silver nanoparticles (about 35 nm) was estimated from the AFM images.

Keywords: silver nanoparticles, plasmon resonance, DNA.

Titov E. V., Lysyakova L. A., Zakrevskyy Yu., Lomadze N., Zyryanova I. M., Bozhkova E. A., San-terS., Kasyanenko N. A. Study of DNA interaction with azobenzene containing trimethylammonium bromide // Vestnik St.Petersburg University. Ser. 4. 2011. Issue. 4. P. 234-242.

Highmolecular DNA interaction with azobenzene containing trimethylammonium bromide (AzoTMAB) surfactant was studied. The AzoTMAB compound can change its conformation (trans—cis transition) under irradiation by UV light. Spectrophotometry, low gradient viscometry and atomic force microscopy techniques were used. It was shown that DNA interaction with the surfactant strongly depends on the ionic strength of the solution and the AzoTMAB concentration. On the base of viscometry data for DNA solution under low ionic strength (NaCl concentration is 0.005M) three ranges of the AzoTMAB concentrations can be marked out. Under low concentrations decrease of DNA coil size due to DNA—surfactant binding is observed, under higher concentrations precipitation formation in the solution due to aggregation can be visually observed while further increase of AzoTMAB concentrations results in compact structures formation. Under high ionic strength (NaCl concentration is 1M) the behaviour of the system is completely different from the one realized in 0.005M NaCl — only slight drop of DNA viscosity is observed.

Keywords: DNA, photosensitive cationic surfactant.

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ

Абдрашитов Георгий Олегович, Санкт-Петербургский государственный университет, студент.

Абдулин Наиль Гарифович, Санкт-Петербургский государственный университет, инженер; e-mail: [email protected]

Алексеев Валерий Владимирович, доктор химических наук, Военно-медицинская академия, профессор, заведующий кафедрой; e-mail: [email protected]

Багаев Алексей Анатольевич, кандидат физико-математических наук, Санкт-Петербургский государственный университет, научный сотрудник; e-mail: [email protected]

Белостоцкая Галина Борисовна, кандидат биологических наук, ИЭФБ им. И. М. Сеченова РАН, старший научный сотрудник; e-mail: [email protected]

Бобрышева Наталья Петровна, доктор химических наук, Санкт-Петербургский государственный университет, профессор.

Богданов Алексей Александрович, кандидат физико-математических наук, Санкт-Петербургский государственный университет, доцент; e-mail: [email protected]

Божкова Евгения Александровна, Санкт-Петербургский государственный университет, студентка.

Браун Майкл Фредерик, доктор философии (PhD), университет Аризоны, США, профессор; e-mail: [email protected]

Варшавский Михаил Сергеевич, Санкт-Петербургский государственный университет, студент.

Верхуша Владислав Витальевич, кандидат химических наук, медицинский колледж им. А.Эйнштейна, Нью-Йорк, США, заведующий лабораторией; e-mail: vladislav.verkhusha@ einstein.yu.edu

Воронцов-Вельяминов Павел Николаевич, доктор физико-математических наук, Санкт-Петербургский государственный университет, профессор; e-mail: [email protected]

Гермашева Ираида Ивановна, кандидат химических наук, Санкт-Петербургский государственный университет, научный сотрудник; e-mail: [email protected]

Гриднев Константин Александрович, доктор физико-математических наук, Санкт-Петербургский государственный университет, профессор, заведующий кафедрой; e-mail: [email protected]

Дадиванян Артём Константинович, доктор физико-математических наук, Московский государственный областной университет, профессор; e-mail: [email protected]

Диченко Ольга Юрьевна, Санкт-Петербургский государственный университет, студентка.

Добродумов Анатолий Владимирович, кандидат физико-математических наук, Институт высокомолекулярных соединений РАН, старший научный сотрудник.

Евлампиева Наталья Петровна, кандидат физико-математических наук, Санкт-Петербургский государственный университет, доцент; e-mail: [email protected]

Елдашев Иван Сергеевич, Санкт-Петербургский государственный политехнический университет, студент; e-mail: [email protected]

Ефименко Инесса Александровна, доктор химических наук, Институт общей и неорганической химии им. Н. С. Курнакова РАН, профессор, заведующая лабораторией.

Журавлёва Галина Александровна, Санкт-Петербургский государственный университет, студентка.

Закревский Юрий, доктор философии (PhD), университет Потсдама (Германия); e-mail: [email protected]

Затрудина Римма Шикрулловна, кандидат физико-математических наук, Волгоградский государственный университет, доцент, докторантка.

Земцова Елена Георгиевна, кандидат химических наук, Санкт-Петербургский государственный университет, старший научный сотрудник; e-mail: [email protected]

Зенкевич Игорь Георгиевич, доктор химических наук, Санкт-Петербургский государственный университет, профессор, заведующий лабораторией; e-mail: [email protected]

Зерова Ирина Владимировна, кандидат химических наук, Санкт-Петербургский государственный университет, научный сотрудник.

Золотарёв Андрей Александрович, Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет), аспирант; e-mail: [email protected]

Зырянова Ирина Михайловна, Санкт-Петербургский государственный университет, инженер.

Иванов Алексей Сергеевич, Северо-Западный заочный государственный технический университет, инженер; e-mail: [email protected]

Иманбаев Ренат Талгатович, Институт высокомолекулярных соединений РАН, младший научный сотрудник; e-mail: [email protected]

Касьяненко Нина Анатольевна, доктор физико-математических наук, Санкт-Петербургский государственный университет, профессор; e-mail: [email protected]

Кириченко Сергей Олегович, Санкт-Петербургский государственный университет, студент.

Коженков Павел Владимирович, Санкт-Петербургский государственный университет, студент; e-mail: [email protected]

Козин Андрей Олегович, кандидат химических наук, Санкт-Петербургский государственный университет, доцент; e-mail: [email protected]

Конькова Елена Петровна, Волгоградский государственный университет, ассистент, аспирантка; e-mail: [email protected]

Королёв Борис Александрович, кандидат химических наук, Московский государственный университет, доцент; e-mail: [email protected]

Космотынская Юлия Валерьевна, кандидат физико-математических наук, Санкт-Петербургский государственный университет, ассистент; e-mail: [email protected]

Костиков Рафаэль Равилович, доктор химических наук, Санкт-Петербургский государственный университет, профессор; e-mail: [email protected]

Коттэ Эрвэ, доктор философии (PhD), Институт биомолекул Макса Муссерона (Франция), профессор.

Кочурова Наталья Николаевна, доктор химических наук, Санкт-Петербургский государственный университет, профессор; e-mail: [email protected]

Кузнецова Ирина Михайловна, доктор биологических наук, Институт цитологии РАН, ведущий научный сотрудник; e-mail: [email protected]

Летенко Дмитрий Григорьевич, кандидат технических наук, Северо-Западный заочный государственный технический университет, доцент, [email protected]

Лисовенко Глеб Борисович, Санкт-Петербургский государственный университет, аспирант; e-mail: [email protected]

Ломадзе Нино, доктор философии (PhD), университет Потсдама (Германия).

Лопатько Константин Георгиевич, кандидат технических наук, Национальный университет биоресурсов и природопользования Украины, доцент.

Лысякова Людмила Андреевна, Санкт-Петербургский государственный университет, студентка; e-mail: [email protected]

Мальцев Николай Александрович, Санкт-Петербургский государственный университет, аспирант; e-mail: [email protected]

Маркин Виталий Никитич, Санкт-Петербургский государственный университет, старший преподаватель; e-mail: [email protected]

Мельниченко Артём Николаевич, Санкт-Петербургский государственный университет, аспирант; e-mail: [email protected]

Молчанов Александр Павлович, доктор химических наук, Санкт-Петербургский государственный университет, профессор, руководитель лаборатории; e-mail: [email protected]

Морозова Татьяна Евгеньевна, Санкт-Петербургский государственный университет, аспирантка; e-mail: [email protected]

Морошкина Евгения Борисовна, кандидат физико-математических наук, Санкт-Петербургский государственный университет, доцент; e-mail: [email protected]

Москвин Алексей Леонидович, доктор технических наук, Санкт-Петербургский государственный университет, профессор; e-mail: [email protected]

Мягкова-Романова Марина Анатольевна, кандидат химических наук, Санкт-Петербургский государственный университет, научный сотрудник; e-mail: [email protected]

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Никитин Владимир Александрович, кандидат химических наук, Северо-Западный заочный государственный технический университет, доцент; e-mail: [email protected]

Ноа Ольга Викторовна, кандидат химических наук, Московский государственный университет, старший научный сотрудник; e-mail: [email protected]

Окатова Ольга Всеволодовна, кандидат физико-математических наук, Институт высокомолекулярных соединений РАН, старший научный сотрудник.

Пакальнис Виктория Валерьевна, кандидат химических наук, Санкт-Петербургский государственный университет, ассистент; e-mail: [email protected]

Пашинина Юлия Михайловна, Московский государственный областной университет, аспирантка; e-mail: [email protected]

Поваров Владимир Глебович, доктор химических наук, Санкт-Петербургский государственный университет, профессор; e-mail: [email protected]

Пономарёв Андрей Николаевич, кандидат физико-математических наук, ООО «НТЦ прикладных нанотехнологий», генеральный директор; e-mail: [email protected]

Рамазанов Руслан Рафядинович, Санкт-Петербургский государственный университет, аспирант; e-mail: [email protected]

Родинков Олег Васильевич, доктор химических наук, Санкт-Петербургский государственный университет, профессор; e-mail: [email protected]

Сантер Светлана, доктор философии (PhD), университет Потсдама (Германия), профессор; e-mail: [email protected]

Селютин Артём Александрович, кандидат химических наук, Санкт-Петербургский государственный университет, доцент.

Семёнов Константин Николаевич, кандидат химических наук, Санкт-Петербургский государственный университет, ассистент; e-mail: [email protected]

Силантьева Ирина Александровна, Санкт-Петербургский государственный университет, аспирантка; e-mail: [email protected]

Смирнов Владимир Михайлович, доктор химических наук, Санкт-Петербургский государственный университет, профессор; e-mail: [email protected]

Степаненко Олеся Викторовна, кандидат биологических наук, Институт цитологии РАН, старший научный сотрудник; e-mail: [email protected]

Степаненко Ольга Викторовна, кандидат биологических наук, Институт цитологии РАН, научный сотрудник; e-mail: [email protected]

Струц Андрей Владимирович, кандидат физико-математических наук, Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия, заведующий кафедрой; e-mail: [email protected]

Сулацкая Анна Игоревна, Институт цитологии РАН, аспирантка; e-mail: [email protected]

Сурма Сергей Викторович, кандидат технических наук, Институт физиологии им. И. П. Павлова РАН, научный сотрудник; e-mail: [email protected]

Тимофеев Сергей Александрович, кандидат химических наук, Санкт-Петербургский государственный университет, доцент; e-mail: [email protected]

Титов Арсений Валерьевич, Санкт-Петербургский государственный университет, студент; e-mail: [email protected]

Титов Евгений Валерьевич, Санкт-Петербургский государственный университет, студент; e-mail: [email protected]

Тихомиров Илья Александрович, Санкт-Петербургский государственный университет, студент; e-mail: [email protected]

Тойкка Александр Матвеевич, доктор химических наук, Санкт-Петербургский государственный университет, профессор, заведующий кафедрой; e-mail: [email protected]

Туроверов Константин Константинович, доктор биологических наук, Институт цитологии РАН, профессор, заместитель директора; e-mail: [email protected]

Фальк А. А., Санкт-Петербургский государственный университет, студентка.

Фонин Александр Владимирович, Институт цитологии РАН, аспирант; e-mail: [email protected]

Чаусов Денис Николаевич, кандидат физико-математических наук, Московский государственный областной университет, доцент; e-mail: [email protected]

Чарыков Николай Александрович, доктор химических наук, ЗАО «Инновации ленинградских институтов и предприятий» (Санкт-Петербург), главный научный сотрудник, профессор; e-mail: [email protected]

Шишилов Олег Николаевич, кандидат химических наук, Институт общей и неорганической химии им. Н. С. Курнакова РАН.

Щ^ёголев Борис Фёдорович, кандидат химических наук, Институт физиологии им. И.П.Павлова РАН, старший научный сотрудник; e-mail: [email protected]

Юдович Вадим Михайлович, Санкт-Петербургский государственный университет, аспирант, [email protected]

Юдович Михаил Евгеньевич, кандидат химических наук, ООО «НТЦ прикладных нанотехнологий», старший научный сотрудник, заместитель генерального директора, [email protected]

Якимович Станислав Иванович, доктор химических наук, Санкт-Петербургский государственный университет, ведущий научный сотрудник.

ПЕРЕЧЕНЬ СТАТЕЙ, ОПУБЛИКОВАННЫХ В ЖУРНАЛЕ «ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА»

в 2011 году

СЕРИЯ 4: ФИЗИКА, ХИМИЯ

Вып. Стр.

Физика

Артамонова И. В., Веретененко С. В. Влияние вариаций галактических космических лучей на динамические процессы в нижней атмосфере.... 2 15-23 Багаев А. А. Об устранении квадратичной по импульсу расходимости нелинейной сигма-модели в формализме фонового поля....................................4 4-7

Барабан А. П., Бондаренко А. С., Бондаренко В. П., Петров Ю. В., Тимофеева К. А. Особенности люминесценции слоёв ЯЮ2 на кремнии в УФ-области

спектра..............................................................................................................................2 24-29

Габдулсадыкова Г. Ф., Усольцева Н. В., Жарова М. А., СоцкийВ. В. Мезомор-физм и надмолекулярная организация СТ-комплексов производных

бензоламина с акцепторами электронов............................................................1 9-16

Головин А. В., Лагодинский В. М. Релятивистское уравнение Шрёдингера со

ступенчатым потенциалом........................................................................................2 3-14

Гончаров Л. И., Яфясов А. М. Особенности рассеяния волновых пакетов

в двумерных квантовых сетях................................................................................3 27-32

Гриднев К. А., Мальцев Н. А. Изучение реакции 160 + 12С в фолдинг-моде-

ли, моделях передачи кластера и отталкивающего кора..........................4 8-23

Долматова О. А., Анисимова Г. П., Цыганкова Г. А. Параметризация энергетических спектров и зеемановское расщепление конфигураций 4р2

Ge I и 5р2 Яп I................................................................................................................2 30-34

ЗиппаА. И. Оценка критической напряжённости электрического поля..........3 21-26

Кондратьев В. П., Феофилов Г. А. Анализ выходов и спектров странных частиц в РЬ + РЬ-столкновениях при энергии 160А ГэВ в рамках

партонно-струнной модели......................................................................................2 35-42

Неверов В. С., Комолкин А. В., Волкова Т. Г. Исследование влияния структурной изомерии на молекулярную подвижность жидких кристаллов

методом молекулярной динамики........................................................................1 34-53

Никитченко А. Н. Построение изображения рассеивающих объектов по данным межскважинных наблюдений........................................................................1 17-23

Прохоров Л. В. Гамильтонова механика, микроканоническое распределение

и свойство эргодичности............................................................................................3 33-36

Прохоров Л. В. О физике на планковских расстояниях. Пространство и материя....................................................................................................................................3 3-12

Пучков А. М. Метод вычисления матричных элементов для уравнения Дирака в кулоновском поле............................................................................................1 24-33

Пучков А. М. Обобщённые вириальные соотношения для многоэлектронного

атома..................................................................................................................................2 43-48

Пучкова А. О., Касьяненко Н. А. Изучение взаимодействия молекулы ДНК с ионами двухвалентных металлов в присутствии катехина, эпикате-

хина и кофеина..............................................................................................................2 96-102

Ромаданов В. М., Лутченко Л. Н. Численное моделирование распространения электромагнитных волн СДВ-диапазона в волноводном канале

Земля—ионосфера в ближней области источника........................................2 76-87

Сасунов Ю. Л., Семёнов В. С., Еркаев Н. В., ХейнМ. Ф., Бирнат Х. К. Асимметричное магнитное пересоединение: сравнение результатов МГД-

моделирования с аналитическим решением....................................................2 88-95

Торилов С. Ю., Жеребчевский В. И., Гриднев К. А., Лазарев В. В. Моделирование распада ядерных систем, образующихся в реакциях с тяжёлыми ионами..........................................................

Хайдаров Г. Г., Хайдаров А. Г., Машек А. Ч. Физическая природа поверхностного натяжения жидкости............................................

Цуриков Д. Е., Яфясов А. М. Расчёт б'-матрицы квантовой сети в терминах

^-матриц её узлов....................................................

Шигапов Р. А. Колебания жидкого слоя между различными упругими полупространствами.......................................................

Химия

Бахшиев Н. Г., Акопян С. Х. К 50-летию создания межкафедральной лаборатории спектрохимии................................................

Бессонова Е. А., Поликарпов Н. А., КарцоваЛ. А., ПотолицынаВ. Е. Исследование возможностей новых сверхразветвлённых полимеров в качестве псевдостационарных фаз в электрокинетической хроматографии

при определении белков..............................................

Золотарёв А. А., Чарыков Н. А., Семёнов К. Н., Намазбаев В. И., Летен-коД.Г., Никитин В. А., Пухаренко Ю. В., Скачков С. В., ЛушинА.И. Бетон, наноструктурированный водорастворимыми фуллеренолами . . . Иваненко Н. Б., Иваненко А. А., Носова Е. Б., Соловьев Н. Д. Определение бериллия и никеля в крови атомно-абсорбционным методом с электротермической атомизацией и зеемановской модуляционной поляризационной коррекцией фона . . . .......................................

КонаковВ.Г., Курапова О. Ю., Борисова Н. В., Голубев С. Н., Соловьёва Е. Н., Ушаков В. М. Зависимость физико-химических свойств и размеров прекурсоров оксидной керамики на основе твёрдых растворов диоксида циркония от способа синтеза . . . .................................

Кучек А. Э., ВасютинО.А., Кашкаров А. А., Грибанова Е. В., Шутке-вич В. В. Влияние модификации поверхности марганец-цинковой феррошпи-

нели на её адсорбционные свойства...................................

ЛетенкоД.Г., НикитинВ.А., СемёновК.Н., ЧарыковН.А., Золотарёв А. А., Иванов А. С. Механизм переноса электричества и кластеризации

в водных растворах фуллеренола^...................................

Литвинова Т. Е., ЛуцкийД. С., ЧиркстД. Э., Лобачёва О. Л. Энергия Гибб-са образования карбоксилатов лантана и иттрия в процессе экстракции нафтеновой кислотой . ............................................

Литвинова Т. Е., ЧиркстД. Э., Лобачёва О. Л., ЛуцкийД. С., Луцкая В. А. Термодинамическое описание экстракции иттрия и эрбия олеиновой

кислотой при стехиометрическом расходе реагента ..................

Мариничев А. Н. Предельные значения коэффициентов активности компонентов в тройных растворах. . . .......................................

Матвеев С. М., Тимошкин А. Ю., Стабников П. А. Оценка энтальпии сублимации комплексов галогенидов элементов 13 группы с О^-донор-

ными лигандами......................................................

Матусевич О. В., Глуздиков И. А., Титов М. И. Синтез фрагментов субъединицы РВ1 РНК-полимеразы вирусов гриппа А.......................

Молчанов А. П., Костиков Р. Р. О взаимодействии а-хлор-, а, а-дихлор-и а, а, а-трихлортолуолов с этилмагнийбромидом в присутствии тет-раизопропоксида титана..............................................

2 49-56

1 3-8

3 13-20

2 57-75

1 54-66

1 103-109

3 72-79

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

3 96-102

3 48-59

1 75-82

4 43-51

2 134-141

3 80-86 3 66-71

3 37-47 2 150-156

4 52-54

Морозова Т. Е., Зенкевич И. Г. Новые варианты метода стандартной добавки. Газохроматографическое определение камфоры в фармацевтических

препаратах............................................................ 4 61-68

Москвин А. Л., Мельниченко А. Н., Диченко О. Ю. Фотометрическое определение аммиака в воздухе рабочей зоны с хроматомембранным концентрированием....................................................... 4 55-60

Москвин А. Л., Мельниченко А. Н., Диченко О. Ю., Москвин Л. Н. Влияние структуры массообменных матриц и фазоразделительных мембран на «эффект памяти» хроматомембранных ячеек в парофазном анализе ................................................................... 1 94-102

Мягкова-Романова М. А., Тимофеев С. А. Компьютерное моделирование радиометрического метода экстракционного разделения радиоактивных изотопов......................................................... 4 24-35

Пакальнис В. В., ЗероваИ.В., Алексеев В. В., Якимович С. И. Взаимодействие этиловых эфиров 4-гетарил-2,4-диоксобутановых кислот с гид-

разидами.............................................................. 4 69-75

Панов М. Ю. Неидеальная кинетика реакций первого порядка в растворах.

Применение уравнений Маргулеса для коэффициентов активности . 3 60-65 Панов М. Ю. Об использовании термодинамических активностей в химической кинетике......................................................... 1 67-74

Петров Ю. Ю., Волкова А. В., Тарабукина Е. А., Ермакова Л. Э., Мерку-шев О. М. Электрокинетические свойства оксидных плёнок, нанесённых

золь-гель методом на поверхность кварцевого стекла................ 2 103-111

Поваров В. Г., Лисовенко Г. Б., Фальк А. А. Кислоторастворимые сорбенты в обзорном хроматографическом анализе органических примесей воды и воздуха.......................................................... 4 76-82

Руденко А. О., Карцова Л. А., Краснов К. А. Новые возможности сверхсши-того полистирольного сорбента при определении эрготамина в крови крыс методом обращённо-фазовой ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием ........................................................ 2 142-149

Уколов А. И., Зенкевич И. Г. Установление структуры изомерных алкиларе-нов с использованием аддитивных схем оценки газохроматографиче-

ских индексов удерживания.......................................... 1 83-93

УколоваЕ. С., Зенкевич И. Г. Повышение воспроизводимости определения газохроматографических индексов удерживания с использованием

капиллярных колонок................................................ 2 157-164

ЧухноА. С., Дмитриева И. Б., Колодеева С. С., Мартынов Д. В. Адсорбция

ионов Н+ и ОН~ на коллагене........................................ 3 87-95

ЧухноА. С., Дмитриева И. Б., Мартынов Д. В. Изоэлектрическая точка

белков в водных растворах азолов.................................... 2 124-133

Юдович В. М., Юдович М. Е., Пономарёв А. Н., ТойккаА.М. Эффекты синергизма при модификации эпоксиноволачных композитов фуллеро-

идными наночастицами тороидальной формы........................ 4 36-42

Яковлева М. А., Приходько И. В., Пукинский И. Б., Смирнова Н. А. Фазовое поведение бинарных и многокомпонентных смесей 2,2-диме-тил-1,3-диоксолан-4-метанола с гептаном, этанолом и водой......... 2 112-123

Краткие научные сообщения

Арбенин А. Ю., Земцова Е. Г., Мукконен И. Н., Смирнов В. М. Синтез ферромагнитного материала с упорядоченной системой железных нано-частиц на основе мезопористого кремнезёма......................... 1 136-140

Беляев В. Б., Зандхас В., Шлык И. И. Малочастичные мезон-ядерные кластеры ..................................................................

Бобрышева Н. П., Козин А. О., СелютинА. А. Магнитное разбавление сложных оксидов 8г2МпЯЬ06 и 8г2Сг8Ь06................................

Булатов А. В., Михайлова Е. А., Тимофеева И. И., Москвин А. Л., Москвин Л. Н. Фотометрическое определение фенолов в природных водах с концентрированием в процессе пробоотбора.............................

Зайцев С. А., Попов Ю. В., Кныр В. А. Решение задачи двукратной иони-

зации атома гелия быстрым электроном в 7-матричном подходе .... ЗемцоваЕ. Г., Кириченко С. О., Абдрашитов Г. О., Смирнов В. М. Синтез и исследование устойчивости водных суспензий аэросила с поверхностными титанкислородными группами.............................

Казаров А. Г., Колос С. Е., Рябов Ю. Ф., Соловьёв И. Б. Организация управляющего программного обеспечения системы сбора данных эксперимента АТЛАС.........................................................

Карасёв В. Ю. О механическом состоянии уединённых пылевых гранул

в магнитном поле.....................................................

Карасёв В. Ю., ДзлиеваЕ. С., Ермоленко М. А., Павлов С. И. Пылевые волчки в слабом магнитном поле..........................................

Кочурова Н. Н., Абдулин Н. Г., Тихомиров И. А., Гермашева И. И. Влияние концентрации водных растворов алкилсульфатов натрия на их три-

бологические свойства................................................

Лялинов М. А., Полянская С. В. Асимптотика амплитуды рассеяния сферической волны, расходящейся от вершины тонкого акустически прозрачного конуса.......................................................

Маркин В. Н. Дифракционное повышение симметрии и гомометрические

структуры ............................................................

Морозов П. Е., Власова М. В., Порецкий М. С., Земцова Е. Г., Цыганен-ко А. А., Смирнов В. М. Особенности протекания химических реакций при синтезе методом ML-ALD квазиодномерных наноструктур на поверхности кремнезёма.....................................................

ПисьмакД. Ю., Письмак Ю. М. Электромагнитные волны в пространстве

с неоднородностью, сосредоточенной на плоскости...................

Родинков О. В., Журавлёва Г. А. Повышение эффективности адсорбционного концентрирования полярных органических веществ при анализе

влажного воздуха.....................................................

Слюсарева И. В., Козин А. О., Дементьев И. А., Кондратьев Ю. В. Калориметрическое определение энтальпии сублимации тетратрифторацета-

та димолибдена(П) и тетраформиата димолибдена(П)...............

Шеляпина М. Г., Сирецкий М. Ю., Харченко К. А., Скрябина Н. Е., Фрю-шар Д. Неэмпирические расчёты стабильности гидридов интерметаллических соединений — материалов для хранения водорода..............

110-114

87-88

110-113 115-119

89-92

124-128 106-109 103-105

97-100

173-178 83-86

133-135 165-172

93-96

129-132

120-123

4

1

Памяти учёного

Мандельштам Т. В. Век Дьяконова..................................................................................2 179-188

Разин В. В., Костиков Р. Р. О синтезе малых циклов в работах И. А. Дьяконова......................................................................................................................................2 189-203

Хроника

85 лет Валентину Альфредовичу Франке (БраунМ. А.)..........................................2 204, 205

Материалы III международной конференции «Современные проблемы молекулярной биофизики»

Белостоцкая Г. Б., Елдашев И. С., Сурма С. В., Щёголев Б. Ф. Молекулярные механизмы воздействия магнитных полей разной интенсивности

на регуляцию уровня кальция в культивируемых мышечных клеткаx 4 198-204 Дадиванян А. К., ПашининаЮ. М., Ноа О. В., Чаусов Д. Н., Королёв Б. А. Ближний ориентационный порядок и гидрофобные взаимодействия

в растворах биологических и синтетических полимеров............................4 124-130

ЕвлампиеваН. П., Добродумов А. В., Окатова О. В., КоттэЭ. Молекулярные свойства полилизинов дендритной архитектуры..................................4 131-138

КасьяненкоН. А. Вклад Э. В. Фрисман в науку о полимерах и молекулярную

биофизику........................................................................................................................4 103-113

Коженков П. В., Рамазанов Р. Р., Шишилов О. Н., Ефименко И. А., Касьяненко Н. А. Взаимодействие ДНК с K2[PdHGluCl2] in vitro..................................4 186-192

Конькова Е. П., Затрудина Р. Ш. Влияние воды на проявления внутримолекулярных взаимодействий в молекуле NADH................................................4 145-151

Конькова Е. П., Затрудина Р. Ш. Уширение и сдвиг длинноволновой полосы

поглощения аминокислот в полярном растворителе....................................4 139-144

Космотынская Ю. В., Иманбаев Р. Т., Богданов А. А., Касьяненко Н. А. Анализ совместного действия радиации и противоопухолевых препаратов

платины на структуру и свойства молекулы ДНК в растворе................4 205-211

Морошкина Е. Б. Интеркаляция как способ связывания биологически активных соединений с двуспиральной ДНК..............................................................4 114-123

Рамазанов Р. Р., Щёголев Б. Ф., Касьяненко Н. А. Неэмпирическое исследование свойств электронного и пространственного строения урацило-

вых производных комплексов платины..............................................................4 193-197

Силантьева И. А., Воронцов-Вельяминов П. Н. Исследование решёточных моделей полимерных цепей и звёзд методом Монте-Карло с использованием алгоритма Ванга—Ландау....................................................................4 212-219

Степаненко Олеся В., Степаненко Ольга В., Кузнецова И. М., Верхуша В. В., Туроверов К. К. Структурные переходы зелёного флуоресцентного

белка (sfGFP) под действием гуанидинтиоцианата......................................4 161-170

Степаненко Ольга В., Степаненко Олеся В., ФонинА. В., Щербакова Д. М., Верхуша В. В., Кузнецова И. М., Туроверов К. К. D-Галактоза/D-глюкоза-связывающий белок как чувствительный элемент социально значимой биосенсорной системы. Взаимодействие белка с глюкозой..............4 171-179

СтруцА. В., БраунМ. Ф. Структурная динамика ретиналя в процессе активации родопсина............................................................................................................4 220-228

Сулацкая А. И., Кузнецова И. М., Туроверов К. К. Использование флуоресцентного красителя тиофлавина Т для изучения структуры амилоидных фибрилл..............................................................................................................4 152-160

Титов А. В., Варшавский М. С., Лопатько К. Г., Касьяненко Н. А. Изучение взаимодействия наночастиц серебра с молекулой ДНК в водно-

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

солевом растворе..........................................................................................................4 229-233

Титов Е. В., Лысякова Л. А., Закревский Ю., ЛомадзеН., Зырянова И. М., БожковаЕ. А., Сантер С., КасьяненкоН. А. Изучение взаимодействия ДНК

с триметиламмониум бромидом, содержащим азобензольную группу 4 234-242 ФонинА. В., Степаненко ОльгаВ., Верхуша В. В., Щербакова Д. М., Кузнецова И. М., Туроверов К. К. Перспективы создания чувствительного элемента флуоресцентного биосенсора на глюкозу....................................................4 180-185

CONTENTS

Physics

Bagaev A. A. On eliminating quadratic momentum divergence for a non-linear sigma-model

in background field formalism................................................ 4

Gridnev K. A., Maltsev N. A. Investigation of 16O + 12C reaction in the frame of a double

folding model, a cluster transfer model and a repulsive core model............ 8

Chemistry

Myagkova-Romanova M. A., Timofeev S. A. Computer simulation of radiometric for radioactive isotope extraction....................................................... 24

Yudovitch V. M., Yudovitch M. E, Ponomarev A. N., ToikkaA. M. Synergetic effects in epoxy

novolac systems modified by fulleroid nanoparticles of toroidal form.......... 36

Letenko D. G, NikitinV. A., SemenovK.N., Charykov N. A., Zolotarev A. A., Ivanov A. S.

Mechanism of electricity and clusterization transfer in fullerenol-d water solutions ......................................................................... 43

Molchanov A. P., Kostikov R. R. On the reaction of а-chloro-, a, a-dichloro- and a, a, a-tri-chlorotoluenes with ethylmagnesium bromide in presence of titanium(IV) isopropoxide .................................................................... 52

MoskvinA. L., Melnichenko A. N., Dichenko O. Yu. Photometrical determination of ammonia

in working area air with chromatomembrane preconcentration................ 55

Morozova T. E., Zenkevich I. G. New modifications of the standard addition method. Determination of camphor in some pharmaceuticals................................ 61

Pakal'nis V. V., Zeroval. V., Alekseyev V. V., Yakimovich S. I. Interaction of ethyl esters of

4-heteroaryl-2,4-dioxobutanoic acids with hydrazides......................... 69

Povarov V. G., Lisovenko G. B., FalkA. A.................................................. 76

Brief scientific notes

Markin V. N. Diffraction enhancement of symmetry and homometric structures............ 83

Bobrysheva N. P., Kozin A. O., Selyutin A. A. Magnetic dilution of complex oxides

Sr2MnSbO6 and Sr2CrSbO6.................................................. 87

Zemtsova E. G., Kirichenko S. O., Abdrashitov G. O., Smirnov V. M. Synthesis and study of

stability of aerosil aqueous suspensions with surface titanium-oxide groups.... 89 Rodinkov O. V., Zhuravleva G. A. Efficiency enhancement of adsorptive concentration of polar

organic compounds in the analysis of moist air............................... 93

KochurovaN. N., AbdulinN. G., TikhomirovI. A., Germasheva 1.1. The influence of concentration of sodium alkyl sulfate aqueous solutions on their dynamic surface tension tribological properties................................................... 97

Materials of III International conference "Modern problems of molecular biophysics"

Moroshkina E. B. Intercalation as a mode of biological active compound binding with double-

stranded DNA............................................................... 114

DadivanyanA. K., Pashinina Yu. M., NoahO. V., Chausov D. N., Korolev B. A. Short-range orientational order and hydrophobic interactions in solutions of biological and

synthetic polymers........................................................... 124

YevlampievaN. P., Dobrodumov A. V., Okatova O. V., CottetH. Molecular properties of dendritic architecture polylysines................................................ 131

Konkova E. P., Zatrudina R. Sh. Broadening and shift of the first singlet transition of acids

on exposure of a polar solvent................................................ 139

Konkova E. P., Zatrudina R. Sh. Solvent effect on manifestation of intramolecular interactions

in NADH.................................................................... 145

Sulatskaya A. I., Kuznetsova I. M., Turoverov K. K. The use of fluorescent dye thioflavin T

for studying amyloid fibrils structure......................................... 152

Stepanenko Olesya V., Stepanenko Olga V., Kuznetsova I. M., Verkhusha V. V., Turoverov K. K. Structural dynamics of super-folder GFP induced by guanidine thiocyanate 161 Stepanenko OlgaV., Stepanenko Olesya V., FoninA.V., Shcherbakova D. M., Verkhusha V. V., Kuznetsova I. M., Turoverov K. K. D-Galactose/D-Glucose-binding protein as sensing probe of socially relevant biosensor systems. Protein—ligand interaction.. 171 FoninA. V., Stepanenko OlgaV., Verkhusha V. V., Shcherbakova D. M., Kuznetsova I. M.,

Turoverov K. K. Prospects of fluorescence glucose biosensor response element creation..... 180

Kozhenkov P. V., Ramazanov R. R., Shishilov O. N., Efimenko I. A., Kasyanenko N. A. DNA

interaction with K^fPdHGluCh] in vitro..................................... 186

Ramazanov R. R., Shchegolev B. F., Kasyanenko N. A. Non-empirical research of electronic

structures and geometry properties of uracil derivatives of platinum(II)....... 193

Belostotskaya G. B., Eldashev I. S., Surma S. V., Shchegolev B. F. Molecular mechanisms of the action of different intensity magnetic field on regulation of calcium level in

cultured muscle cells......................................................... 198

Kosmotynskaya Yu. V., Imanbaev R. T., Bogdanov A. A., Kasyanenko N. A. Analysis of combined activity of radiation and antitumoral platinum preparations on structure

and properties of DNA molecule in solution.................................. 205

SilantievaI. A., Vorontsov-Velyaminov P. N. Investigation of lattice models of polymer chains

and stars by Monte Carlo method within Wang—Landau algorithm........... 212

Struts A. V., Brown M. F. Retinal structural dynamics in rhodopsin activation............. 220

Titov A. V., Varshavskii M. S., Lopatko K. G., Kasyanenko N. A. Study of DNA interaction

with silver nanoparticles in water (salt solution).............................. 229

Titov E. V., Lysyakova L. A., Zakrevskiy Yu., Lomadze N., Zyryanova I. M., Bozhkova E. A., Santer S., Kasyanenko N. A. Study of DNA interaction with azobenzene containing

trimethylammonium bromide................................................ 234

Abstracts............................................................................... 243

Authors................................................................................. 257

List of articles

262

Об устранении квадратичной по импульсу расходимости нелинейной сигма-модели в формализме фонового поля Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

Аннотация научной статьи по химическим наукам, автор научной работы — Багаев Алексей Анатольевич

Похожие темы научных работ по химическим наукам , автор научной работы — Багаев Алексей Анатольевич

On eliminating quadratic momentum divergence for a non-linear sigma-model in background field formalism

Текст научной работы на тему «Об устранении квадратичной по импульсу расходимости нелинейной сигма-модели в формализме фонового поля»