CC BY
159
А. И. Сулацкая, И. М. Кузнецова, К. К. Туроверов
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО КРАСИТЕЛЯ ТИОФЛАВИНА Т ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ СТРУКТУРЫ АМИЛОИДНЫХ ФИБРИЛЛ*
Введение. Ряд тяжёлых заболеваний человека и животных, связанных с нарушением фолдинга белков, таких как болезни Альцгеймера и Паркинсона, диабет второго рода, прионные заболевания, сопровождаются образованием амилоидных фибрилл [1-7]. Амилоидные фибриллы представляют собой особое компактное состояние белка, которому отвечает глубокий минимум свободной энергии, обусловленный межмо-лекулярными взаимодействиями макромолекул белка, обогащённых ^-структурами [8]. К настоящему времени известно более 20 белков, которые при определённых условиях могут in vivo переходить в фибриллярную форму и откладываться в виде нерастворимых образований во внеклеточных депозитах. В связи с практической значимостью для медицины выяснение факторов, способствующих образованию амилоидных фибрилл, а также изучение их структуры являются в настоящее время предметом интенсивных исследований.
Результаты последних лет показали, что при определённых условиях белки, никак не связанные с возникновением болезней (а возможно, все белки), могут образовывать амилоидоподобные фибриллы [9-13]. Архитектура амилоидных и амилоидоподобных фибрилл на основе различных белков является сходной — все они представляют собой неразветвлённые фибриллы, образованные в-складчатыми структурами, в-листы которых направлены перпендикулярно оси фибриллы [14, 15]. Однако исследования, в ходе которых были расшифрованы структуры нескольких амилоидоподобных фибрилл с высоким разрешением, показали, что они не являются полностью идентичными [16, 17]. Поскольку фибриллярное состояние белков, обогащённое в-складчатыми структурами, является, по-видимому, одним из основных термодинамически стабильных состояний белковой молекулы, изучение структуры амилоидных фибрилл имеет существенное значение не только для медицины, но и для понимания фундаментальных основ фолдинга белков.
При изучении процессов сворачивания-разворачивания белков и свойств, возникающих при этом промежуточных частично-свёрнутых и неправильно свёрнутых состояний, а также их агрегированных форм широко используется флуоресцентный метод. Он основан на регистрации собственной флуоресценции белков, флуоресценции гидрофобного зонда 1-анилинонафталин-8-сутльфоната (АНС) и бензтиазольного красителя тиофлавина Т (ThT) (рис. 1), который взаимодействует с белками в состоянии амилоидных фибрилл. Связывание ThT с фибриллами высокоспецифично — краситель не взаимодействует с глобулярными белками в нативном состоянии (за исключением ацетилхолинэстеразы и сывороточных альбуминов), с белками в развёрнутом и промежуточных частично-свёрнутых состояниях, а также с аморфными агрегатами белков. Встраивание ThT в амилоидные фибриллы сопровождается существенным возрастанием квантового выхода его флуоресценции (нередко в тысячи раз), тогда как свободный краситель в водном растворе имеет очень низкий квантовый выход (по
* Работа выполнена по программе РАН «Молекулярная и клеточная биология», фонда «Династия» и РФФИ (проект 10-04-90038-Бел.).
© А.И.Сулацкая, И.М.Кузнецова, К.К.Туроверов, 2011
нашим данным, около 0,0001). Несмотря на то, что подход, основанный на изучении взаимодействия ТЬТ с амилоидными фибриллами, является одним из эффективных методов диагностики их возникновения [18-24], механизмы этого взаимодействия, а также причины существенного возрастания квантового выхода флуоресценции, сопровождающего встраивание ТЬТ в фибриллы, недостаточно изучены. Существуют гипотезы, согласно которым спектральные свойства и возрастание квантового выхода флуоресценции ТЬТ, инкорпорированного в амилоидные фибриллы, обусловлены димерами, эксимерами или даже мицеллами, которые якобы образуют молекулы красителя. Одна из задач настоящей работы состояла в том, чтобы определить модель связывания ТЬТ с фибриллами, а также объяснить причины возрастания квантового выхода флуоресценции красителя при инкорпорировании в амилоидные фибриллы.
В настоящее время стало очевидным, что ТЬТ можно использовать не только для диагностики возникновения амилоидных фибрилл, но и для изучения их структуры. В литературе можно найти около десятка работ, в которых предпринимались попытки определения значений констант диссоциации и стехиометрии, характеризующих связывание красителя с фибриллами. Для этого в большинстве из них использовался подход, основанный на измерении зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации красителя и (или) амилоидных фибрилл. В представляемой работе показано, что этот метод в принципе не может быть использован для получения информации о стехиометрии и аффинности связывания красителя с фибриллами. В связи с этим актуальной задачей является разработка универсального подхода для изучения параметров связывания ТЬТ и его аналогов с амилоидными фибриллами. Её решение позволит расширить информативность метода изучения структуры амилоидных фибрилл, в основе которого лежит их взаимодействие с флуоресцентным красителем ТЬТ.
Результаты и обсуждение.
Механизм связывания ThT с амилоидными фибриллами. В первых работах, посвящённых изучению спектральных свойств ТЬТ, было отмечено, что при встраивании красителя в амилоидные фибриллы спектры флуоресценции и возбуждения флуоресценции красителя испытывают значительный длинноволновый сдвиг, а квантовый выход флуоресценции существенно возрастает [20]. В последующих работах для объяснения этого феномена были сделаны предположения, что флуоресцентные свойства ТЬТ, инкорпорированного в амилоидные фибриллы, обусловлены тем, что при встраивании краситель образует димеры [25], эксимеры [26] или даже мицеллы [27].
Для проверки гипотезы об образовании красителем димеров были измерены спектры поглощения (зависимость оптической плотности О от длины волны X) растворов ТЬТ в широком диапазоне концентраций красителя (рис. 2, а), для чего были использованы кюветы, имеющие разную длину оптического пути (0,1, 0,2, 0,5, 1,5 см). Полученные результаты свидетельствуют, что положение и форма спектров поглощения, а также коэффициент молярной экстинкции ТЬТ в диапазоне концентраций от 7,5 • 10-6 до 3,7•Ю-4М не зависят от концентрации красителя. Таким образом, можно заключить, что предположения об образовании димеров ТЬТ необоснованны. Поскольку в основном состоянии краситель не образует димеров, то маловероятно, что за короткое время
Рис. 1. Структура молекулы ТЬТ:
угол ф характеризует ориентацию бензтиазольного и аминобензольного колец красителя относительно друг друга
1,5
ч щ 1,0 ЕВ
<5
0,5
0,0
- Г, _П п
ПН Ы О
- у 1,5 -
1 1,0 - У
- V 0,5 - гр^
,0 0,
1 10 100
Я, нм
30 60
[ТЫ], мкМ
90
Рис. 2. Обоснование модели встраивания 'ГМ в амилоидные фибриллы: а — спектры поглощения ТЬТ в воде для разных концентраций красителя: от 10“6 до 10“
‘М
(кривые 1 —5); б — зависимость интенсивности флуоресценции ТЬТ от концентрации красителя, на вставке эта зависимость представлена в полулогарифмическом масштабе; в — зависимость квантового выхода флуоресценции ТЬТ от температуры и вязкости растворителя, на вставке показан участок зависимости, соответствующий низким температурам и высокой вязкости растворителя
жизни возбуждённого состояния, которое, по нашим данным, в водном растворе не превышает 0,001 нс [28], может произойти образование эксимеров.
Гипотеза об образовании мицелл молекулами красителя выдвинута в работе [27] на основании зависимости интенсивности флуоресценции №Т от его концентрации, построенной в полулогарифмическом масштабе. Было сделано предположение, что возрастание интенсивности флуоресценции красителя связано с образованием мицелл, которые начинают формироваться при концентрации красителя, соответствующей точке перегиба этой зависимости. Авторы статьи предполагают, что с этим эффектом связано и возрастание интенсивности флуоресценции №Т при его взаимодействии с амилоидными фибриллами, т. е. что краситель встраивается в фибриллы в форме мицелл.
Нами измерена интенсивность флуоресценции №Т в водных растворах в широком диапазоне концентраций красителя (рис. 2, б). Оказалось, что на начальном участке зависимости наблюдается отсутствие роста интенсивности флуоресценции красителя, что можно объяснить сопоставимостью интенсивности свечения №Т с интенсивностью свечения примесей воды при низких концентрациях красителя. После достижения концентраций, при которых интенсивность флуоресценции №Т начинает превышать интенсивность флуоресценции примесей растворителя, на графике наблюдается постепенный
в
рост интенсивности флуоресценции с увеличением концентрации красителя (что можно объяснить постепенным увеличением количества флуоресцирующих молекул). Далее происходит выход зависимости на плато. Таким образом, зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации №Т, построенная в обычных координатах, ничем не отличается от зависимостей для любого другого флуоресцирующего вещества, которые в полулогарифмическом масштабе аналогично будут состоять из двух участков, имеющих существенно различный наклон (см. рис. 2, б, вставка). Можно заключить, что характер зависимости, представленной в работе [27], связан с особенностями не красителя, а представления экспериментальных данных, а значит, представления об образовании красителем мицелл в водном растворе и при связывании с амилоидными фибриллами необоснованны.
Кроме того, несостоятельность предложенных гипотез подтверждается тем фактом, что коротковолновый спектр возбуждения флуоресценции №Т в воде не совпадает с длинноволновой полосой спектра поглощения красителя, как это должно быть, а сдвинут относительно длинноволновой полосы поглощения в коротковолновую область так, что максимум спектра возбуждения приходится на минимум в спектре поглощения. При возбуждении в области длинноволновой полосы поглощения №Т в воде флуоресцирует в той же спектральной области, что и №Т, инкорпорированный в амилоидные фибриллы. Спектры флуоресценции свободного и связанного с амилоидными фибриллами красителя в воде сами по себе и в составе амилоидных фибрилл сдвинуты в длинноволновую сторону относительно длинноволновой полосы поглощения, как это и должно быть. Таким образом, необходимо дать специальное объяснение не флуоресцентным свойствам №Т в фибриллах, а существованию «коротковолновых» полос флуоресценции и возбуждения флуоресценции красителя в водном растворе.
Квантово-химические расчёты молекулы №Т показали, что в основном состоянии энергетически выгодной является такая конфигурация молекулы №Т, при которой бензтиазольное и аминобензольное кольца красителя повёрнуты относительно друг друга на угол ф = 37° (или 145, 217, 325°). Формированию плоской структуры молекулы препятствует наличие метильной группы, связанной с атомом азота бензтиазольного кольца, что определяет существование барьера энергии при угле ф = 0° (180°). Существование энергетического барьера при угле ф = 90° (270°) связано с нарушением сопряжения между бензтиазольным и аминобензольным кольцами №Т. Энергетические барьеры, разделяющие состояния молекулы красителя, отвечающие минимумам энергии, относительно низкие, что определяет присутствие в растворе молекул №Т с нарушенной системой п-сопряжённых связей бензтиазольного и аминобензольного колец. Увеличение размера системы п-связей, как известно, сопровождается длинноволновым сдвигом спектра. Поэтому любой изолированный фрагмент №Т должен иметь более коротковолновое положение спектров поглощения и флуоресценции по сравнению с целой молекулой №Т. Таким образом, появление коротковолновых спектров возбуждения флуоресценции и спектров флуоресценции №Т может быть обусловлено существованием в основном состоянии фракции молекул №Т с углами ф, близкими к 90° (270°). Коротковолновую флуоресценцию можно зарегистрировать только в растворах с низкой вязкостью, когда интенсивность длинноволновой флуоресценции №Т низка. При встраивании в амилоидные фибриллы происходит существенное увеличение квантового выхода длинноволновой флуоресценции, на фоне которой коротковолновая флуоресценция становится незаметной.
Для объяснения существенного увеличения квантового выхода флуоресценции красителя при встраивании в амилоидные фибриллы были изучены флуоресцентные
свойства ThT в водно-глицериновых смесях. Измерена зависимость квантового выхода флуоресценции ThT (q) от вязкости (п) и температуры (T) растворителя. Содержание глицерина в водно-глицериновых смесях изменяли от 13 до 99 %, а температуру растворов — от 3 до 50 °C. Экспериментальные данные в координатах (1/q — 1) от T/п представляют собой прямую (рис. 2, в), пересекающую ось ординат в точке ~ 2,6 (см. рис. 2, в, вставка). Полученные результаты свидетельствуют о том, что нагревание раствора или уменьшение его вязкости (увеличение соотношения вода/глицерин) сопровождаются существенным уменьшением квантового выхода флуоресценции ThT. Это означает, что существует процесс дезактивации возбуждённого состояния молекулы ThT, константа которого зависит от температуры и вязкости растворителя. Мы полагаем, что причиной этого процесса является переход молекулы в возбуждённом состоянии к конформации с углами ф, близкими к 90° (270°), при котором уменьшается сопряжение п-электронной системы бензтиазольного и аминобензольного колец молекулы ThT. Таким образом, существенное увеличение квантового выхода флуоресценции красителя при его встраивании в амилоидные фибриллы обусловлено ограничением подвижности бензтиазольного и аминобензольного колец относительно друг друга. Наряду с этим существует, по крайней мере, ещё одна причина безызлучательной дезактивации возбуждённого состояния ThT, приводящая к тому, что даже в условиях твёрдого раствора, не допускающего существование крутильных колебаний колец относительно друг друга, квантовый выход этого красителя существенно меньше единицы. С нашей точки зрения, причиной этого может быть неплоскостность молекулы ThT в основном состоянии, обусловленная наличием массивной метильной группы, связанной с атомом азота бензтиазольного кольца.
Основываясь на вышесказанном, можем заключить, что гипотезы об образовании димеров, эксимеров и мицелл ThT при его встраивании в амилоидные фибриллы необоснованны. Наиболее убедительной, с нашей точки зрения, является модель, согласно которой ThT связывается с амилоидными фибриллами в мономерной форме. Краситель встраивается в «бороздки», образованные боковыми цепями аминокислотных остатков, ориентированные вдоль оси волокна амилоидных фибрилл перпендикулярно ß-листам. Если сопоставить ширину «бороздок» (6,7± 0,2 А) и ширину молекулы ThT (4,3 ± 0,1 А), можно заметить, что боковые цепи ß-листов и краситель находятся в непосредственной близости, которая обусловливает возможность их стерических взаимодействий. Эти взаимодействия могут влиять на конформацию молекулы красителя в основном и возбуждённом состоянии и, следовательно, на его квантовый выход флуоресценции. Поскольку длина молекулы ThT составляет 15,2 ± 0,1 А, а ширина ß-листа ~ 4,7 А, то для встраивания красителя необходимы по крайней мере 4 ß-ли-ста. Таким образом, данная модель позволяет объяснить, почему ThT избирательно взаимодействует только с амилоидными фибриллами, обогащёнными ß-складчатыми структурами.
Методика определения параметров связывания ThT с амилоидными фибриллами. В литературе можно найти около десятка работ, в которых предпринимались попытки определения констант диссоциации и стехиометрии, характеризующих связывание ThT с амилоидными фибриллами (см., например, [29]). Все существующие данные об этих параметрах связывания (кроме данных, полученных в статье [30]) основываются исключительно на измерениях зависимостей интенсивности флуоресценции ThT от его концентрации в растворах, содержащих амилоидные фибриллы. Во всех этих работах авторы допустили одну и ту же ошибку — для определения констант связывания и числа мест связывания они использовали суммарную концентрацию ThT,
1,6
ч и 1,2
а <3 0,8
<3 0,4
0,0
350 400
450 Я, нм
500 550
Я, нм
Рис. 3. Спектры поглощения ТЬТ, инкорпорированного в фибриллы, полученные на основе лизоцима:
а — спектр поглощения свободного ТЬТ (1), наложение спектров поглощения свободного, связанного с фибриллами ТЬТ и светорассеяния (2), оптическая плотность, которая определяется светорассеянием (3), спектр поглощения свободного и связанного с фибриллами красителя после исключения вклада светорассеяния (4); на вставке проиллюстрирована процедура вычитания светорассеяния; б — спектр поглощения связанного с фибриллами красителя (1) и спектр поглощения свободного красителя в концентрации, равной концентрации связанного красителя (2)
а не концентрацию свободного, не связанного с фибриллами, красителя. Использование флуоресцентного метода в принципе позволяет определить лишь зависимость интенсивности флуоресценции связанного с фибриллами №Т от общей концентрации красителя в растворе. Кроме того, авторы работ, приведённых в обзоре [29], основывались на предположении, что измеренная интенсивность флуоресценции всегда пропорциональна концентрации связанного с фибриллами красителя и что максимум интенсивности флуоресценции достигается, когда все сайты связывания заняты. На самом деле интенсивность флуоресценции отнюдь не линейно связана с концентрацией флуоресцирующего вещества. Поэтому данные, полученные с использованием флуоресцентного метода, должны быть пересмотрены.
Для определения параметров связывания №Т с амилоидными фибриллами мы предлагаем подход, основанный на использовании метода абсорбционной спектрофо-тометрии растворов, полученных с помощью метода равновесного микродиализа. Приспособление для равновесного микродиализа представляет единую тефлоновую конструкцию, в которой две камеры равного объёма разделены мембраной, проницаемой для №Т и непроницаемой для фибрилл. В камеру № 1 помещался раствор красителя с концентрацией (Со), в камеру № 2 — амилоидные фибриллы в том же растворителе. Фибриллы на основе лизоцима получали путём инкубирования лизоцима (2 мг/мл) в 0,05М буфере КН2Р04—^0Н в присутствии 3М GdnHCl (рН = 6,3) при температуре 50 °С и интенсивном перемешивании в течение 24 ч [31]. Содержание амилоидных фибрилл в камере № 2 можно охарактеризовать концентрацией раствора белка, используемого для получения фибрилл, с учётом последующего разведения (Ср). Спектр поглощения раствора в камере № 1 после достижения равновесия представлял собой спектр поглощения свободного №Т, а спектр поглощения раствора в камере № 2 — суммарный спектр поглощения свободного №Т и связанного с фибриллами красителя на фоне «кажущегося поглощения», обусловленного светорассеянием фибрилл (рис. 3, а). Учёт влияния светорассеяния проводился с помощью стандартной процедуры [32].
Предлагаемый нами подход позволил впервые определить спектр поглощения №Т, инкорпорированного в фибриллы на основе лизоцима (рис. 3, б). Полученные данные свидетельствуют о том, что встраивание красителя в фибриллы сопровождается
СьЮр ми фибриллами на основе лизоцима
длинноволновым сдвигом спектра поглощения и возрастанием коэффициента молярной экстинкции. Коротковолновое положение спектра поглощения свободного №Т в водном растворе является проявлением существенного ориентационного диполь-дипольного взаимодействия молекул красителя с молекулами полярного растворителя в основном состоянии.
Для каждого эксперимента по микродиализу были определены концентрации свободного (Cf) и связанного с фибриллами (Сь) красителя. Зависимость Скетчарда, построенная с использованием экспериментальных данных, даёт наглядное представление о количестве мод связывания красителя с фибриллами (рис. 4). Нелинейность полученной зависимости свидетельствует о существовании двух или более мод связывания (г) с различными значениями констант связывания (Кы) и числом мест связывания (щ) (в то время как её линейность могла бы свидетельствовать об идентичности центров связывания и существовании одной моды). Величины констант связывания и числа мест связывания, адекватно описывающие экспериментальные данные, были определены в предположении существования двух мод связывания методом множественной нелинейной регрессии с использованием уравнения:
Сь = Е
щСрС{ КсЫ + с.
где К л = К—1 — константа диссоциации. Полученные значения Км, Кь2, п\ и п2 приведены на рис. 4.
Заключение. Результаты нашей работы способствуют формированию правильных представлений о спектральных свойствах и характеристиках флуоресцентного красителя №Т. Кроме того, разработка специальной методики, позволяющей получать информацию о параметрах связывания №Т с амилоидными фибриллами, а также о спектральных свойствах и характеристиках связанного красителя, является важным шагом на пути изучения и сравнения структуры амилоидных фибрилл. Исследование структуры белков в состоянии амилоидных фибрилл может дать важнейшую информацию для выяснения факторов, способствующих их образованию. Поскольку фибриллярное состояние белков является, по-видимому, одним из основных термодинамически стабильных состояний белковой молекулы, проведённые исследования способствуют пониманию фундаментальных основ фолдинга белков.
Изучение взаимодействия №Т с амилоидными фибриллами может рассматриваться как перспективный подход для создания биосенсорных систем для ранней диагностики
заболеваний, проявлением которых являются различного рода амилоидозы. Разработка методов раннего выявления таких заболеваний является чрезвычайно актуальной задачей, поскольку в настоящее время диагноз удаётся поставить, когда течение заболевания уже необратимо. Нужно заметить, что предлагаемый подход универсален — он может быть использован для нейтральных аналогов ThT, которые могут проникать через гематоэнцефалический барьер, что может найти свое применение в диагностике и терапии нейродегенеративных заболеваний. Кроме того, этот метод может быть использован для анализа взаимодействия химических веществ (в том числе нефлуоресцирующих), которые способны подавлять процесс образования амилоидных фибрилл. Таким образом, полученные результаты имеют существенное практическое значение для медицины.
Литература
1. Harper J. D., Lieber C. M., Lansbury P. T. Jr. Atomic force microscopic imaging of seeded fibril formation and fibril branching by the Alzheimer’s disease amyloid-beta protein // Chem. Biol. 1997. Vol. 4. P. 951-959.
2. Kelly J. W. Amyloid fibril formation and protein misassembly: a structural quest for insights into amyloid and prion diseases // Structure. 1997. Vol. 5. P. 595-600.
3. Carrell R. W., GooptuB. Conformational changes and disease-serpins, prions and Alzheimer’s // Curr. Opin. Struct. Biol. 1998. Vol. 8. P. 799-809.
4. Hashimoto M., Masliah E. Alpha-synuclein in Lewy body disease and Alzheimer’s disease // Brain Pathol. 1999. Vol. 9. P. 707-720.
5. Koo E. H., Lansbury P. T. Jr., Kelly J. W. Amyloid diseases: abnormal protein aggregation in neurodegeneration // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1999. Vol. 96. P. 9989-9990.
6. Uversky V. N., TalapatraA., Gillespie J. R., Fink A. L. Protein deposits as the molecular basis of amyloidosis. Part I. Systemic amyloidoses // Med. Sci. Monitor. 1999. Vol. 5. P. 1001-1012.
7. Uversky V. N., TalapatraA., Gillespie J. R., Fink A. L. Protein deposits as the molecular basis of amyloidosis. II. Localized amyloidosis and neurodegenerative disorders // Med. Sci. Monitor. 1999. Vol. 5. P. 1238-1254.
8. Jahn T. R., Radford S. E. The Yin and Yang of protein folding // FEBS J. 2005. Vol. 272. P. 5962-5970.
9. Dobson C. M. Protein misfolding, evolution and disease // Trends Biochem. Sci. 1999. Vol. 24. P. 329-332.
10. Uversky V. N., Fink A. L. Conformational constraints for amyloid fibrillation: the importance of being unfolded // Biochim. Biophys. Acta 2004. Vol. 1698. P. 131-153.
11. ChitiF., DobsonC. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease // Annu. Rev. Biochem. 2006. Vol. 75. P. 333-366.
12. FandrichM., Fletcher M. A., Dobson C. M. Amyloid fibrils from muscle myoglobin // Nature. 2001. Vol. 410. P. 165-166.
13. Pertinhez T. A., Bouchard M., Tomlinson E. J. et al. Amyloid fibril formation by a helical cytochrome // FEBS Lett. 2001. Vol. 495. P. 184-186.
14. Dobson C. M. Protein folding and misfolding // Nature. 2003. Vol. 426. P. 884-890.
15. Dobson C. M. Experimental investigation of protein folding and misfolding // Methods. 2004. Vol. 34. P. 4-14.
16. Makin O. S., Serpell L. C. Structures for amyloid fibrils // FEBS J. 2005. Vol. 272. P. 5950-5961.
17. Nelson R., Eisenberg D. Recent atomic models of amyloid fibril structure // Curr. Opin. Struct. Biol. 2006. Vol. 16. P. 260-265.
18. NaikiH., Higuchi K., Hosokawa M., Takeda T. Fluorometric determination of amyloid fibrils in vitro using the fluorescent dye, thioflavin T1 // Anal. Biochem. 1989. Vol. 177. P. 244-249.
19. NaikiH., HiguchiK., Matsushima K. et al. Fluorometric examination of tissue amyloid fibrils in murine senile amyloidosis: use of the fluorescent indicator, thioflavine T // Lab. Invest. 1990. Vol. 62. P. 768-773.
20. LeVineH. 3rd. Thioflavine T interaction with synthetic Alzheimer’s disease beta-amyloid peptides: detection of amyloid aggregation in solution // Protein Sci. 1993. Vol. 2. P. 404-410.
21. LeVineH. 3rd. Soluble multimeric Alzheimer beta(1-40) pre-amyloid complexes in dilute solution // Neurobiol. Aging. 1995. Vol. 16. P. 755-764.
22. LeVine H. 3rd. Thioflavine T interaction with amyloid-sheet structures // Amyloid: Int. J. Exp. Clin. Invest. 1995. Vol. 2. P. 1-6.
23. LeVineH. 3rd. Stopped-flow kinetics reveal multiple phases of thioflavin T binding to Alzheimer beta (1-40) amyloid fibrils // Arch. Biochem. Biophys. 1997. Vol. 342. P. 306-316.
24. LeVineH. 3rd. Quantification of beta-sheet amyloid fibril structures with thioflavin T // Methods Enzymol. 1999. Vol. 309. P. 274-284.
25. Groenning M., OlsenL., van de Weert M. et al. Study on the binding of Thioflavin T to beta-sheet-rich and non-beta-sheet cavities // J. Struct. Biol. 2007. Vol. 158. P. 358-369.
26. Raj C. R., Ramaraj R. R. g-Cyclodextrin inducted intermolecular eximer formation of thioflavin T // Chem. Phys. Letters. 1997. Vol. 273. P. 285-290.
27. KhuranaR., Coleman C., Ionescu-Zanetti C. Mechanism of thioflavin T binding to amyloid fibrils // J. Struct. Biol. 2005. Vol. 151. P. 229-238.
28. Sulatskaya A. I., Maskevich A. A., Kuznetsova I. M. et al. Fluorescence quantum yield of thioflavin T in rigid isotropic solution and incorporated into amyloid fibrils // PLoS ONE. 2010. Vol. 5. Iss. 10. P. e15385-1-e15385-7.
29. Groenning M. Binding mode of Thioflavin T and other molecular probes in the context of amyloid fibrils-current status // J. Chem. Biol. 2009.
30. Groenning M., NorrmanM., FlinkJ. M. et al. Binding mode of Thioflavin T in insulin amyloid fibrils // J. Struct. Biol. 2007. Vol. 159. P. 483-497.
31. Vernaglia B. A., Huang J., Clark E. D. Guanidine hydrochloride can induce amyloid fibril formation from hen egg-white lysozyme // Biomacromolecules. 2004. Vol. 5. P. 1362-1370.
32. Владимиров Ю. А., Литвин Ф. Ф. Фотобиология и спектральные методы исследования. М., 1964.
Статья поступила в редакцию 28 июня 2011 г.
