CC BY
57
А. В. Фонин, Ольга В. Степаненко, В. В. Верхуша,
Д. М. Щербакова, И. М. Кузнецова, К. К. Туроверов
ПЕРСПЕКТИВЫ СОЗДАНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОГО ЭЛЕМЕНТА ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО БИОСЕНСОРА НА ГЛЮКОЗУ*
Введение. Прогрессирующее увеличение численности людей, больных диабетом I и II типа, среди населения развитых стран ставит задачу создания устройств, позволяющих непрерывно и неинвазивно измерять уровень глюкозы в крови человека [1]. Существует много подходов к решению этой задачи, основанных на различных физических принципах. Нам представляется многообещающим мониторинг содержания глюкозы в крови человека с помощью биосенсорной системы, в качестве чувствительного элемента которой использовался бы белок, способный к избирательному взаимодействию с молекулой сахара. Поскольку при взаимодействии D-глюкоза/D-галактоза-связывающего белка (GGBP) с глюкозой наблюдаются значительные перестройки его пространственной структуры, этот белок может являться перспективным кандидатом на роль чувствительного элемента биосенсора на глюкозу [2].
Попытки использовать GGBP в качестве чувствительного элемента биосенсорной системы на глюкозу предпринимаются уже около 10 лет. За это время были исследованы различные способы регистрации взаимодействия этого белка с глюкозой. Созданы различные конструкции на основе GGBP, содержащие донорно-акцепторные пары, а также пул меченых разнообразными красителями мутантов D-глюкоза/D-га-лактоза-связывающего белка [3-12]. Так, многообещающей является мутантная форма GGBP/H152C с присоединённым по 152 положению флуоресцентным красителем-баданом. Показано, что в присутствии 150 мМ глюкозы наблюдалось 300 %-ное увеличение интенсивности флуоресценции связанного с белком красителя [8].
Целью представляемой работы являлось изучение перспектив и условий использования мутантной формы GGBP/H152C с присоединённым флуоресцентным красителем-баданом в качестве чувствительного элемента биосенсорной системы на глюкозу. В задачи входило:
1) определение константы диссоциации комплекса GGBP/H152C-Badan с глюкозой;
2) изучение устойчивости GGBP/H152C-Badan в открытой и закрытой формах к действию химического денатуранта — гуанидингидрохлорида (GdnHCl);
3) изучение влияния изменения рН среды на структуру GGBP/H152C и флуоресцентные свойства бадана.
Материалы и методы. Клетки E.coli BL21 (DE3) были трансформированы плазмидой рЕТ-Hd, кодирующей белок GGBP/H152C с гексагистидиновым хвостом. Экспрессию белков в Escherichia coli индуцировали 0,5 мМ IPTG (Nacalai Tesque, Япония). Клеточную массу наращивали в течение 24 ч при 37 °С. Белок очищали с помощью Ni++ -агарозы (колонки His GraviTrap, GE Healthcare, Швеция). Контроль чистоты полученных белковых препаратов осуществляли с помощью SDS-электрофореза в денатурирующих условиях в 15 %-ное полиакриламидном геле согласно стандартной методике [13]. Для подготовки GGBP/H152C к присоединению бадана (Anal. Spec., США)
* Работа выполнена при частичной финансовой поддержке гранта Президента РФ (MK-1181.2010.4) и на основании государственного контракта с Минобрнауки № 16.512.11.2114.
© А.В.Фонин, Ольга В.Степаненко, В.В.Верхуша, Д.М.Щербакова, И.М.Кузнецова, К.К.Ту-роверов, 2011
к исходному раствору в 100-кратном относительно белковой концентрации количестве был добавлен TCEP (Sigma, США). Концентрация красителя, добавленного в полученный раствор, превышала концентрацию белка в 10 раз. Инкубация раствора белка с красителем проходила в течение 12 ч при 4 °С. Не связавшийся с белком бадан был удалён при помощи концентраторов (10 кДа, Sartorius stedim, Германия). Эксперименты выполнены при концентрации растворов белка 0,2 мг/мл. Все эксперименты, за исключением изучения влияния рН на характеристики белка и красителя, выполнены в PBS рН = 7,4.
Препараты D-глюкозы (Sigma, США) и гуанидингидрохлорида (GdnHCl) (Nacalai Tesque, Япония) использовали без дополнительной очистки. Концентрацию GdnHCl определяли с помощью рефрактометра Аббе (ЛОМО, Россия).
Флуоресцентные измерения выполнены с использованием спектрофлуориметра со стационарным возбуждением [14] и Cary Eclipse (Varian, Австралия). Спектры флуоресценции измеряли при возбуждении светом с длиной волн 280, 297, 387 и 400 нм. Для более детального рассмотрения конформационных переходов белка использовали параметр A = I320/I365, характеризующий положение и форму спектров флуоресценции, а также интенсивность флуоресценции при длине волны 365 и 545 нм.
Анизотропию флуоресценции при длине волны 365 и 545 нм определяли по соотношению
r =(IV - GIH)/(lV + 2GIH),
где IV и I'^ — вертикальная и горизонтальная компоненты интенсивности флуоресценции, возбуждаемой вертикально поляризованным светом; G — коэффициент, характеризующий различие чувствительности установки к вертикально и горизонтально поляризованному свету (G = IV/1^). Длина волн возбуждения была 297 и 387 нм.
Квазиравновесные зависимости различных флуоресцентных характеристик белка от концентрации GdnHCl измеряли после инкубации белка в растворах GdnHCl соответствующей концентрации при 4 °С. Все измерения выполнены при 23 °С.
Исследование влияния рН на флуоресцентные характеристики белка и красителя проведено в буферных растворах, содержащих лимонную кислоту и Na2HPO4 (рН = = 2,8,4,2, 6,0, 7,1), PBS pH = 7,4, TrisHCl pH = 7,2, 9,6.
Результаты. На основе данных собственной УФ-флуоресценции и флуоресценции бадана было исследовано взаимодействие GGBP/H152C-Badan с глюкозой. Константа диссоциации комплекса GGBP/H152C-Badan/Glc составляет 8,7 ± 0,3 мкМ (рис. 1). Такое значение константы диссоциации (GGBP/H152C-Badan/Glc) позволяет использовать мутантную форму GGBP/H152C с присоединённым красителем-баданом в качестве чувствительного элемента биосенсорной системы в трансдермальных методах мониторинга глюкозы, обеспечивающих разбавление концентрации глюкозы в тысячу раз по сравнению с физиологической.
Исследование структурных превращений GGBP/H152C-Badan в открытой и закрытой формах под действием GdnHCl было проведено с помощью совокупного анализа данных собственной УФ-флуоресценции и флуоресценции связанного с белком красителя. Показано, что увеличение концентрации гуанидингидрохлорида в растворах, содержащих белок в открытой форме, приводит к увеличению интенсивности флуоресценции бадана (рис. 2, а). Интенсивность флуоресценции красителя возрастает с увеличением концентрации GdnHCl даже в том случае, когда, согласно данным собственной УФ-флуоресценции, белок находится в полностью развёрнутом состоянии. При разворачивании же комплекса GGBP/H152C-Badan/Glc под действием GdnHCl
Glc, мкМ
Рис. 1. Зависимость интенсивности флуоресценции бадана в составе GGBP/H152C-Badan от концентрации глюкозы в исследуемых растворах:
длина волны возбуждения 297 нм, регистрации — 545 нм
Длина волны, нм
Длина волны, нм
1,4
1,2 Э
ЕЕ
1,0 ° с
0,8 ^
ь о
о н в и
0,4 ё <и I-
н
£
0,6
0,2
0,0
Рис. 2. Спектры флуоресценции GGBP/H152C-Badan (а) (сплошная кривая — в отсутствие GdnHCl, пунктирная кривая — в 0,1М GdnHCl, штрихпунктирная кривая — в 0,5М, два штриха-пунктирная кривая — в 0,8М, кривая 1 — в 1,3М, 2 — в 1,8М, 3 — в 3,3М GdnHCl); GGBP/H152C-Badan/Glc (б) (кривая 1 — в отсутствие GdnHCl, 2 — в 0,1М GdnHCl, 3 — в 0,2М, 4 — в 0,4М, 5 — в 0,6М, 6 — в 0,8М, 7 — в 1М, 8 — в 1,3М, штрихпунктирная кривая — в 1,8М, пунктирная кривая — в 3,3М GdnHCl) в растворах с различным содержанием GdnHCl: длина волны возбуждения 297 нм
б
а
увеличение интенсивности флуоресценции бадана наблюдается лишь до значений концентрации GdnHCl — около 0,6М (рис. 2, б), когда согласно значениям различным флуоресцентных характеристик (параметра А, анизотропии флуоресценции) собственной УФ-флуоресценции (данные не представлены) белок теряет сродство к глюкозе. При денатурации GGBP/H152C-Badan под действием GdnHCl как в открытой, так и в закрытой форме во всех исследуемых растворах наблюдается незначительный сдвиг в фиолетовую область спектра флуоресценции бадана при всех используемых длинах волн возбуждения (см. рис. 2). Для объяснения полученных результатов было исследовано влияние GdnHCl на флуоресцентные свойства бадана. Показано, что при увеличении концентрации GdnHCl в растворах, содержащих свободный краситель, наблюдается значительный сдвиг максимума спектра флуоресценции бадана в фиолетовую область и увеличение квантового выхода флуоресценции бадана (рис. 3).
Рис. 3. Спектры флуоресценции свободного бадана в растворах с различным содержанием GdnHCl (1 — в отсутствие GdnHCl, 2 — в 0,1М GdnHCl,
3 — в 0,2М, 4 — в 0,5М, 5 — в 0,8М, 6 — в 1,3М, 7 — в 1,8М, 8 — в 3,3М GdnHCl):
длина волны возбуждения 297 нм
В
ё
в
-&
с
в
к
в
о
в
Щ
Е-
В
£
Длина волны,нм
2,0
1,8
1,6
н
8 1,4
]£ 1,2
но0,8
в
§ 0,6
I 0,4 н
® 0,2 0,0
г4к5 Г\
- Д / /7Л
- гч\ 1 \ Л\ /
//// VI / //2%
|/ 1 1Щ \ г' \\\ /л/ГТл и
-1; ад 1/У\ Л V м, 1; ад яп II \\ 1
' % В? 1} В \
7 \ \ / /// ж % \ / ! /
-/ Л/^1. V
400 500 600 400 500 600
Длина волны, нм Длина волны, нм
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
Рис. 4- Спектры флуоресценции бадана в связанном с GGBP/H152C состоянии (а) (сплошные кривые — рН = 2,8, пунктирные кривые — рН = 4,2, штрихпунктирные кривые — рН = 6,0, два штриха-пунктирные кривые — рН = 7,1, точки — рН = 7,2, штрих-точечные кривые — рН = 9,6; цифрами обозначены спектры флуоресценции комплекса GGBP/H152C-Badan/Glc: 1 — рН = 2,8, 2 — рН = 4,2, 3 — рН = 6,0,
4 — рН = 7,1, 5 — рН = 7,2, 6 — рН = 7,4, 7 — рН = 9,6); в свободном состоянии (б) (кривая 1 — рН = 2,8, 2 — рН = 4,2, 3 — рН = 6,0, 4 — рН = 7,1, 5 — рН = 7,2,
6 — рН = 7,4, 7 — рН = 9,6) в растворах с различными значениями рН: длина волны возбуждения 297 нм
н
Е-
о
В
•&
0,0
б
а
Было исследовано влияние рН среды на структуру белка и флуоресцентные свойства красителя. Показано, что при кислых значениях рН наблюдается значительное снижение интенсивности как собственной УФ-флуоресценции GGBP/Н152С, так и флуоресценции красителя по сравнению с растворами GGBP/H152C-Badan при нейтральных и щелочных рН (рис. 4, а). Кроме того, спектры флуоресценции бадана в составе GGBP/H152C-Badan в кислых рН сдвинуты в фиолетовую область по сравнению со спектрами GGBP/H152C-Badan в растворах с нейтральными и щелочными значениями рН. Комплексообразование с глюкозой не приводит к заметным изменениям в спектрах собственной УФ-флуоресценции GGBP/H152C и флуоресценции бадана в растворах с кислыми значениями рН. Однако при увеличении значений рН исследуемых
растворов наблюдается значительное усиление интенсивности флуоресценции связанного с белком красителя.
Показано, что при увеличении значений рН в растворах, содержащих свободный бадан, интенсивность флуоресценции красителя возрастает при любой используемой длине волны возбуждения (рис. 4, б). В области щелочных рН спектр флуоресценции свободного бадана при возбуждении УФ-излучением сдвинут в фиолетовую область относительно спектров красителя в растворах с кислыми и нейтральными значениями рН. Спектр флуоресценции свободного красителя при возбуждении в УФ-области спектра в растворах при значении рН = 9,6 имеет два выраженных максимума.
Обсуждение. Чувствительность флуоресцентных характеристик бадана к свойствам его микроокружения обусловлена особенностями структуры этого красителя, сформированной тремя фрагментами: диметиламиногруппой, нафталиновым кольцом и карбоксильной группой. По-видимому, такое расположение разноименно заряженных групп обеспечивает возможность перераспределения электронной плотности возбуждённого бадана при изменении свойств микроокружения красителя. В качестве донора электронов выступает диметиламиногруппа красителя, в качестве акцептора — карбоксильная группа. Известно, что интенсивность флуоресценции бадана возрастает при переходе этого красителя из более в менее полярное окружение [15].
На наш взгляд, именно этим обстоятельством объясняется увеличение регистрируемого сигнала связанного с белком бадана при комплексообразовании GGBP/H152C с глюкозой. В этом случае бадан оказывается в существенно менее полярном окружении по сравнению с микроокружением, в котором краситель находился, когда белок был в открытой форме.
Проведённые исследования по изучению устойчивости GGBP/H152C-Badan в открытой и закрытой формах к денатурирующему действию GdnHCl показали, что этот белок обладает стабильностью, достаточной для использования его в качестве чувствительного элемента биосенсора на глюкозу. Увеличение интенсивности флуоресценции бадана при разворачивании GGBP/H152C-Badan в открытой форме объясняется не только конформационными изменениями структуры белка под действием денатуран-та, вследствие чего краситель становится менее доступен растворителю, но и действием GdnHCl на сам бадан. Особенно ярко этот эффект проявляется, когда белок уже находится в развёрнутом состоянии (см. рис. 2, а). По-видимому, присутствие GdnHCl приводит к перераспределению электронной плотности бадана. Возможно, GdnHCl специфически взаимодействует с красителем, образуя с ним водородные связи.
Изменение рН исследуемых растворов также оказывает заметное действие на структуру GGBP/H152C-Badan и флуоресцентные свойства бадана. В растворах с кислыми значениями рН GGBP/H152C-Badan в открытой форме находится в существенно развёрнутом состоянии, о чём свидетельствует уменьшение собственной УФ-флуорес-ценции белка и усиление флуоресценции бадана, а также сдвиг максимума спектра флуоресценции красителя в фиолетовую область по сравнению с белком в растворах с нейтральными рН (см. рис. 4, а). Способность связывать глюкозу восстанавливается у GGBP/H152C-Badan уже при рН = 4,2. В растворах с щелочными значениями рН наблюдается незначительное уменьшение интенсивности флуоресценции бадана в составе GGBP/H152C-Badan в открытой и закрытой формах по сравнению с растворами при нейтральных рН. Характер спектра флуоресценции свободного бадана при возбуждении его в ультрафиолетовой области в растворах с рН = 9,6 обусловлен, по-видимому, диссоциацией диметиламиногруппы красителя и переходом части молекул в локально возбуждённое состояние (см. рис. 4, б).
На основании полученных результатов можно сделать вывод о возможности использования мутантной формы GGBP/H152C с присоединённым красителем-баданом в качестве чувствительного элемента биосенсорной системы на глюкозу. Однако для более надёжного определения глюкозы в крови человека необходим белок, обладающий большей, по сравнению с GGBP, стабильностью.
Литература
1. Oliver N. S., Toumazou C., Cass A. E. G., Johnston D. G. Glucose sensors: a review of current and emerging technology // Diabetic Medicine. 2009. Vol. 26. P. 197-210.
2. PickupJ. C., ZhiZ.-L., KhanF. et al. Nanomedicine and its potential in diabetes research and practice // Diabetes Metab. Res. Rev. 2008. Vol. 24. P. 604-610.
3. Sakaguchi-Mikami A., Taneoka A., Yamoto R. et al. Engineering of ligand specificity of periplasmic binding protein for glucose sensing // Biotechnol. Lett. 2008. Vol. 30. P. 1453-1460.
4. SaxlT., KhanF., Matthews D. R. et al. Fluorescence lifetime spectroscopy and imaging of nano-engineered glucose sensor microcapsules based on glucose/galactose-binding protein // Biosens. Bioelectron. 2009. Vol. 24. P. 3229-3234.
5. Amiss T. J., Sherman D. B., Nycz C. M. et al. Engineering and rapid selection of a low-affinity glucose/galactose-binding protein for a glucose biosensor // Protein Sci. 2007. Vol. 16. P. 2350-2359.
6. HsiehH. V., PfiefferZ. A., Amiss T. J. et al. Direct detection of glucose by surface plasmon resonance with bacterial glucose/galactose-binding protein // Biosensors and Bioelectronics. 2004. Vol. 19. P. 653-660.
7. GeX., TolosaL., RaoG. Dual-Labeled Glucose Binding Protein for Ratiometric Measurements of Glucose // Analytical Chem. 2004. Vol. 76. P. 1403-1410.
8. KhanF., Saxl T., Pickup J. C. Fluorescence intensity- and lifetime-based glucose sensing using an engineered high-Kd mutant of glucose/galactose-binding protein // Analytical Biochem. 2010. Vol. 399. P. 39-43.
9. Thomas K. J., Sherman D. B., Amiss T. J. et al. A longwavelength fluorescent glucose biosensor based on bioconjugates of galactose/glucose binding protein and Nile red derivatives // Diabetes Technology Therapeutics. 2006. Vol. 8. P. 261-268.
10. Thomas K. J., Sherman D. B., Amiss T. J. et al. Synthesis and biosensor performance of a near-IR thiol-reactive fluorophore based on benzothiazolium squaraine // Bioconjugate Chem. 2007. Vol. 18. P. 1841-1846.
11. YeK., Schultz J. S. Genetic Engineering of an Allosterically Based Glucose Indicator Protein for Continuous Glucose Monitoring by Fluorescence Resonance Energy Transfer // Anal. Chem. 2003. Vol. 75. P. 3451-3459.
12. KhanF., GnudiL., PickupJ. C. Fluorescence-based sensing of glucose using engineered glucose/galactose binding protein: a comparison of fluorescence resonance energy transfer and environmentally sensitive dye labelling strategies // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008. Vol. 365. P. 102-106.
13. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 227. P. 680-685.
14. Туроверов К. К., Бикташев А. Г., Дорофеюк А. В., Кузнецова И. М. Комплекс аппаратных и программных средств для измерения спектральных, поляризационных и кинетических характеристик флуоресценции в растворе // Цитология. 1998. Vol. 40. C. 806-817.
15. Koehorst R. B. M., Laptenok S., OortB. et al. Profiling of dynamics in protein-lipid-water systems: a timeresolved fluorescence study of a model membrane protein with the label BADAN at specific membrane depths // Eur. Biophys. J. 2010. Vol. 39. P. 647-656.
Статья поступила в редакцию 28 июня 2011 г.
