Научная статья на тему 'D-галактоза/D-глюкоза-связывающий белок как чувствительный элемент социально значимой биосенсорной системы. Взаимодействие белка с глюкозой'

D-галактоза/D-глюкоза-связывающий белок как чувствительный элемент социально значимой биосенсорной системы. Взаимодействие белка с глюкозой Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

CC BY
4107
105
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
СТАБИЛЬНОСТЬ БЕЛКОВ / БИОСЕНСОРНАЯСИСТЕМА / ВЯЗКОСТЬ / PROTEIN STABILITY / BIOSENSOR SYSTEM / VISCOSITY

Аннотация научной статьи по химическим наукам, автор научной работы — Степаненко Ольга Викторовна, Степаненко Олеся Викторовна, Фонин Александр Владимирович, Щербакова Д. М., Верхуша Владислав Витальевич

Исследовалась устойчивость D-галактоза/D-глюкоза-связывающего белка (GGBP) из Escherichia coli к действию химического денатуранта гуанидингидрохлорида (GdnHCl) и нагреванияв отсутствие и в присутствии глюкозы. Выявлено существенное влияние вязкости раствора на процессы взаимодействиябелк а с глюкозой. Лимитирующей стадией процесса разворачивания-сворачивания комплекса GGBP/Glc под действием GdnHCl является разрушение/возникновение конфигурационного соответствия между белком в нативном состоянии и молекулой глюкозы. Скорость этих процессов изменяетсяс увеличением/уменьшением концентрации денатуранта. Низкая скорость достижения равновесия между нативным комплексом GGBP/Glc и белком в развёрнутом состоянии в растворах денатуранта высокой и средней концентрации связана с тем, что присутствие в растворе GdnHCl приводит к увеличению его вязкости. Подобный эффект не наблюдался при тепловой денатурации GGBP/Glc. Выявлена существенная роль второго лиганда GGBP, иона кальция в стабилизации открытой формы белка. Эксперименты по тепловой денатурации GGBP позволили показать, что необратимость разворачиванияGGBP в присутствии и в отсутствие лигандов вызвана агрегацией молекул белка при его инкубации в развёрнутом состоянии при высокой температуре. Степень агрегации молекул белка зависит от концентрации белка, температуры и длительности инкубации. Полученные данные необходимо учитывать при конструировании биосенсорной системы на глюкозу с GGBP в качестве чувствительного элемента.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по химическим наукам , автор научной работы — Степаненко Ольга Викторовна, Степаненко Олеся Викторовна, Фонин Александр Владимирович, Щербакова Д. М., Верхуша Владислав Витальевич

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

D-Galactose/D-Glucose-binding protein as sensing probe of socially relevant biosensor systems. Protein-ligand interaction

In this work we have studied the stability of D-galactose/D-glucose-binding protein (GGBP) from Escherichia coli to denaturing action of guanidine hydrochloride (GdnHCI) and heating in the presence and in the absence of glucose. The pronounced effect of solution viscosity on processes of protein-ligand interaction is revealed. The limiting step of the unfolding-refolding process of GGBP/Glc complex is the disruption/tuning of configuration fit between protein in the native state and the ligand. The rate of these processes changes with increase/decrease of denaturant concentration. This deceleration of equilibrium acquisition between the native protein in GGBP/Glc complex and the unfolded state of protein is connected with increased viscosity of the solution at moderate and high GdnHCl. This effect is not revealed at heatinduced GGBP/Glc denaturation. We have shown the substantial role of the second ligand of GGBP in the stabilization of protein open form, i.e., when it is in the sugar-free state. Experiments on the heat-induced denaturation of GGBP have shown that irreversibility of unfolding process is caused by the aggregation of protein as a result of incubation of the unfolded protein at high temperature. The amount of protein aggregation depends on protein concentration, temperature and duration of incubation. The obtained data should be taken into account at GGBP using as a sensing probe of glucose biosensor.

Текст научной работы на тему «D-галактоза/D-глюкоза-связывающий белок как чувствительный элемент социально значимой биосенсорной системы. Взаимодействие белка с глюкозой»

УДК 577.322.72, 577.322.23

Вестник СПбГУ. Сер. 4. 2011. Вып. 4

Ольга В. Степаненко, Олеся В. Степаненко, А. В. Фонин, Д. М. Щербакова, В. В. Верхуша, И. М. Кузнецова, К. К. Туроверов

D-ГАЛАКТОЗА/D-ГЛЮКОЗА-СВЯЗЫВАЮЩИЙ БЕЛОК КАК ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЙ ЭЛЕМЕНТ СОЦИАЛЬНО ЗНАЧИМОЙ БИОСЕНСОРНОЙ СИСТЕМЫ. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БЕЛКА С ГЛЮКОЗОЙ*

Введение. Диабет — широко распространённое в мире заболевание — имеет ряд очень тяжёлых последствий [1], таких как развитие слепоты, почечной недостаточности, заболеваний сердечно-сосудистой системы. Очевидно, что непрерывный мониторинг уровня глюкозы в крови человека имел бы явное преимущество перед периодическим забором крови из пальца пациента, использующимся в мировой практике в настоящее время [2]. Поэтому создание биосенсорной системы, позволяющей непрерывно отслеживать уровень сахара в крови, является чрезвычайно актуальной задачей [3, 4].

Перспективным на роль чувствительного элемента такой биосенсорной системы является D-галактоза/D-глюкоза-связывающий белок (GGBP) из Escherichia coli, поскольку при его взаимодействии с D-глюкозой наблюдаются значительные перестройки третичной структуры белка [5]. Однако константа диссоциации комплекса GGBP с сахаром очень низка (1 мкМ). Это означает, что использование GGBP дикого типа в качестве чувствительного элемента биосенсорной системы непрерывного действия для определения концентрации глюкозы в крови человека невозможно. Чтобы биосенсорная система работала непрерывно, т. е. чувствовала изменение концентрации сахара, константа диссоциации комплекса белок — глюкоза должна быть численно близка концентрации глюкозы в крови здоровых людей, которая составляет 3-8 мМ [6]. Для этих целей необходимо создавать мутантные формы GGBP с повышенной константой диссоциации комплекса белок — глюкоза, что может быть достигнуто введением мутаций в сайт связывания лиганда [7]. Свойства GGBP дикого типа позволяют использовать его в качестве чувствительного элемента биосенсорной системы на глюкозу в сочетании с трансдермальными методами экстракции сахара из крови или межклеточных и иных жидкостей, сопряжёнными с существенным разбавлением глюкозы. В частности, обратный ионтофорез обеспечивает забор пробы, в которой концентрация глюкозы в тысячу раз меньше её физиологической концентрации [8].

Необходимое качество биосенсорной системы непрерывного действия заключается в устойчивости её чувствительного элемента к различным денатурирующим воздействиям. В представляемой работе мы провели исследования устойчивости GGBP дикого типа к действию химического денатуранта гуанидингидрохлорида (GdnHCl) и нагревания в отсутствие и в присутствии глюкозы, в ходе которых было выявлено существенное влияние вязкости раствора на процессы взаимодействия белка с глюкозой.

Материалы и методы. Плазмиду pET-11d, кодирующую белок GGBP с концевой полигистидиновой меткой, использовали для трансфекции клеток Escherichia coli BL21(DE3). Экспрессию белка в Escherichia coli индуцировали 0,5 мМ IPTG (Nacalai Tesque, Япония). Клеточную массу наращивали в течение 24 ч при 37 °С. Белок

* Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (02.740,11.5141 и 16.512.11.2114), гранта Президента РФ (MK-1181.2010.4).

Ольга В. Степаненко, Олеся В. Степаненко, А. В. Фонин, Д. М. Щербакова, В. В. Верхуша, И.М.Кузнецова, К. К. Туроверов, 2011

очищали с помощью Ni-агарозы (колонки His GraviTrap, GE Healthcare, Швеция). Подробный контроль чистоты полученных белковых препаратов осуществляли с помощью SDS-электрофореза в денатурирующих условиях в 15 %-ном полиакриламидном геле согласно стандартной методике [9]. Измерения проводили в растворах 20 мМ Na-фос-фатного буфера, pH = 8,0. Эксперименты выполнены при концентрации растворов белка 0,2-0,7 мг/мл.

Препараты D-глюкозы (Sigma, США) и гуанидингидрохлорида (GdnHCl) (Nacalai Tesque, Япония) использовали без дополнительной очистки. Концентрацию GdnHCl определяли с помощью рефрактометра «Аббе» (ЛОМО, Россия). Для образования комплекса белок—лиганд в раствор белка добавляли D-глюкозу в концентрации 10 мМ. Ион кальция отщепляли в растворе 1 мМ ЭДТА (Fluka, Швейцария).

Флуоресцентные измерения выполнены с использованием спектрофлуориметра "Cary Eclipse" (Varian, Австралия) и микрокювет (10х 10 мм2; Varian, Австралия). Спектры флуоресценции измеряли при возбуждении светом с длиной волн 280 и 297 нм. Значения параметра A = I320/I365, характеризующего положение спектров флуоресценции (I320 и I365 — интенсивности флуоресценции при длине волн регистрации 320 и 365 нм соответственно; см. [10]), и спектры флуоресценции корректировали на спектральную чувствительность установки. Квазиравновесные зависимости различных флуоресцентных характеристик белков от концентрации GdnHCl измеряли в течение нескольких дней после инкубации белка в растворах GdnHCl соответствующей концентрации при 4 °С. Измерения выполнены при 23 °С. Зарегистрированные зависимости интенсивности флуоресценции анализировали с помощью метода, основанного на параметрическом представлении двух независимых экстенсивных характеристик системы [11]. Термодинамические характеристики рассчитаны согласно Нолтингу [12].

Спектры кругового дихроизма (КД) в дальней и ближней УФ-областях регистрировали на спектрополяриметре J-810 (Jasco, Япония). При работе в дальней УФ-области измерения выполнены в диапазоне 260-190 нм с шагом 0,1 нм с использованием кварцевых кювет (1 мм). При регистрации спектров в ближней УФ-области измерения проводили в диапазоне 320-250 нм с шагом 0,1 нм с использованием кварцевых кювет (10 мм). Для улучшения соотношения сигнал/шум каждый спектр регистрировали 3-5 раз и полученные данные усредняли. Спектры КД белков построены с учётом КД соответствующего буферного раствора.

Калориметрические исследования проводили на дифференциальном сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4М («Биоприбор», Пущино, Россия), как описано ранее [13]. Белок нагревали с постоянной скоростью 1 К/мин при постоянном давлении в 2,4 атм. Для проверки обратимости тепловой денатурации белка после первого сканирования и последующего охлаждения ячеек до исходной температуры образец подвергали повторному нагреванию. Базовую линию записывали, помещая в обе ячейки прибора используемый в эксперименте буферный раствор. Стабильность белков характеризовали температурой максимума теплопоглощения. При исследовании тепловой денатурации белков с помощью метода собственной УФ-флуоресценции регистрировали зависимости интенсивности триптофановой флуоресценции белка от температуры. Скорость нагрева была постоянной и составляла 1 °С/мин.

Результаты. GGBP состоит из двух глобулярных доменов, связанных шарнирной областью, образованной тремя пептидными сегментами [14]. Каждый домен имеет ядро из шести в-тяжей, окружённых с одной стороны двумя a-спиралями, а с другой — тремя. Сайт связывания лиганда расположен в глубокой щели между N- и C-концевым доменами белка. Молекула GGBP имеет в своем составе дополнительный ли-

ганд — 1 ион кальция, локализованный в петле C-концевого домена (остатки 134-142) и образующий координационную связь с атомами кислорода каждого второго остатка этой петли и остатка Glu 205. Структура кальций-связывающего сайта этого белка напоминает структуру мотива «EF-руки», распространённого во внутриклеточных кальций-связывающих белках [14, 15].

Для исследования стабильности GGBP был использован стандартный подход, заключающийся в изучении процессов сворачивания-разворачивания белка под действием GdnHCl в присутствии и в отсутствие лигандов — молекулы глюкозы и иона кальция. Равновесные зависимости различных флуоресцентных характеристик (интенсивности флуоресценции, параметра A и анизотропии флуоресценции; рис. 1, а-в) и эллиптичности при 222 нм (рис. 1, г) GGBP и комплекса GGBP с глюкозой (GGBP/Glc), а также их бескальциевых форм (GGBP-Ca и GGBP-Ca/Glc соответственно) от концентрации денатурирующего агента были измерены в процессе денатурации и ренатурации белка. Стационарные кривые денатурации и ренатурации GGBP, измеренные через 24 ч после инкубации белка в растворах с различной концентрацией GdnHCl, совпадают и имеют сигмоидальную форму. На самом деле равновесие достигается даже быстрее. Кривая денатурации GGBP/Glc, измеренная после 24-часовой инкубации комплекса в присутствии денатурирующего агента, сдвинута в сторону больших концентраций GdnHCl по отношению к равновесной кривой денатурации-ренатурации GGBP. Стационарная кривая ренатурации комплекса GGBP/Glc, зарегистрированная после 24-часовой инкубации белка в присутствии избытка глюкозы в растворах с различной концентрацией GdnHCl, не совпадает с соответствующей кривой денатурации GGBP/Glc, а расположена ближе к равновесной кривой денатурации-ренатурации GGBP (рис. 2). Совпадающие, т. е. равновесные, кривые разворачивания и сворачивания GGBP/Glc были измерены после инкубации белка в растворах денатуранта соответствующей концентрации в течение 10 дней. Равновесные зависимости денатурации-ренатурации комплекса GGBP/Glc имеют сигмоидальный вид и сдвинуты в область больших концентраций GdnHCl по отношению к соответствующей кривой, измеренной при денатурации и ренатурации GGBP. Середина перехода между белком в нативном и развёрнутом состояниях при разворачивании под действием GdnHCl для GGBP/Glc составляет 0,93 ± 0,03М GdnHCl, тогда как для GGBP значение этой величины существенно меньше: 0,36 ± 0,10М GdnHCl.

При отщеплении иона кальция значения флуоресцентных характеристик и эллиптичности при 222 нм GGBP-Ca сильно изменяются даже при небольших денатурирующих воздействиях. Таким образом, уже в области малых концентраций GdnHCl значения всех регистрируемых характеристик GGBP-Ca и GGBP значительно различаются (см. рис. 1). В присутствии молекулы связанной глюкозы отщепление иона кальция практически не влияет на положение равновесной зависимости денатурации-ренату-рации GGBP-Ca/Glc. Следует отметить, что денатурация GGBP-Ca/Glc, как и в случае GGBP/Glc, достигает равновесия через 10 дней, в то время как равновесие при ренатурации GGBP-Ca в присутствии избытка глюкозы устанавливается даже через более длительное время инкубации белка в растворах соответствующей концентрации GdnHCl.

Исследования тепловой денатурации GGBP и его комплекса GGBP/Glc, а также их бескальциевых форм GGBP-Ca и GGBP-Ca/Glc выполнено методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии и собственной УФ-флуоресценции. Кривые теплопоглощения GGBP и GGBP/Glc имеют максимум при температуре 51,3 и 64,7 °С соответственно (рис. 3, а). Зависимости интенсивности триптофановой флуоресценции

1,0 1,5 GdnHa, М

2,0 0,0

1,0 1,5 GdnHa, М

Рис. 1. Процессы разворачивания-сворачивания GGBP (кружки) и комплекса GGBP/Glc (квадраты), а также их бескальциевых форм GGBP-Cа (треугольники) и GGBP-Ca/Glc (ромбы) под действием GdnHCl:

а — изменение интенсивности триптофановой флуоресценции при длине волны регистрации 320 нм;

б — изменение анизотропии флуоресценции при длине волны возбуждения 297 нм, длина волны регистрации равна 365 нм; в — изменение параметра А; г — изменение эллиптичности при 222 нм; открытые символы отвечают разворачиванию белка, закрытые — сворачиванию из развёрнутого состояния

GGBP и GGBP/Glc от температуры имеют сигмоидальную форму со значениями температуры плавления, соответствующими максимумам кривых теплопоглощения этих форм белка (рис. 3, б). Отщепление иона кальция от GGBP приводит к заметному сдвигу кривой теплопоглощения в область меньших температур (данные не представлены), и температура плавления для GGBP-Ca составляет 42,7 °С. В то же время отсутствие иона кальция в структуре комплекса GGBP/Glc в меньшей степени сказывается на его устойчивости к действию нагревания, температура плавления бескальциевой формы комплекса GGBP-Ca/Glc равна 61,5 °С. Флуоресцентные характеристики GGBP и его комплекса GGBP/Glc, а также их бескальциевых форм GGBP-Ca и GGBP-Ca/Glc, такие как анизотропия флуоресценции и параметр А, после охлаждения до комнатной

1,0

0,9 0,8 е- 0,7

и

I

!°,6 0,5

0,4

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 GdnHa, М

Рис. 2. Конформационные переходы GGBP и GGBP/Glc через разное время инкубации белка в присутствии денатурирующего раствора, зарегистрированные по изменению параметра А = 132о/1365: кривые, характеризующие разворачивание белка, измерены через 24 ч после инкубации образца в присутствии GdnHCl для GGBP (штрихпунктирная линия и открытые кружки) и через 24 ч (пунктирная линия и открытые квадраты) и 10 дней (сплошная линия и открытые кружки) после инкубации образца в присутствии GdnHCl для GGBP/Glc; данные, характеризующие ренатурацию белка из развёрнутого состояния, были измерены после инкубации образца в растворах денатуранта соответствующей концентрации через 24 ч для GGBP (штрихпунктирная линия и закрытые кружки) и через 24 ч (закрытые квадраты) и 10 дней (закрытые кружки) для GGBP/Glc; длина волны возбуждения равна 297 нм

20

^ 16 «

л -

8 12

■о <1

1,2

£ 1,0 я о

6 3

0,8

0,6

я а с

ц 0,4

I 0,2

30 40 50 60 Температура, °С

70

0,0

б

\\ \4 \

'''V \

2'-д \ \

10 20 30 40 50 60 70 Температура, °С

Рис. 3. Зависимость избыточной теплоёмкости (а) и интенсивности триптофановой флуоресценции при длине волны регистрации 365 нм (б) белка и его комплекса

с глюкозой от температуры:

линии 1 и 2 — тепловая денатурация GGBP; линии 3 и 4 — тепловая денатурация GGBP/Glc; длина волны возбуждающего света равна 297 нм; два последовательных сканирования (сплошные и пунктирные линии) показаны, чтобы охарактеризовать обратимость тепловой денатурации белка

8

4

0

температуры белков, подвергнутых тепловой денатурации, восстанавливаются до уровня, соответствующего этим белковым формам в исходном состоянии. При нагревании белка до температуры выше окончания денатурационного перехода и продолжительной инкубации белка при высокой температуре наблюдается неполное совпадение кривых плавления белка (см. рис. 3, б), а также уменьшение интенсивности триптофановой флуоресценции и сигнала КД в ближней и дальней УФ-областях белка (данные не представлены).

Обсуждение. Характер равновесных зависимостей денатурации-ренатурации GGBP и GGBP/Glc от концентрации GdnHCl свидетельствует о том, что разворачивание белка в присутствии и в отсутствие глюкозы является обратимым одностадийным процессом. Для проверки этого предположения мы использовали подход, заключающийся в параметрическом представлении равновесных зависимостей двух экстенсивных характеристик белка, используемый для обнаружения скрытых промежуточных состояний белка в процессе его разворачивания [11]. Линейный вид таких зависимостей, построенных на основании равновесных зависимостей интенсивности флуоресценции при длине волны 320 и 365 нм GGBP и GGBP/Glc от концентрации GdnHCl свидетельствует об отсутствии промежуточных состояний на пути разворачивания белка и его комплекса с глюкозой.

Совпадение стационарных зависимостей различных характеристик GGBP при денатурации и ренатурации белка после инкубации белка в присутствии денатурирующего агента менее 24 ч свидетельствует о том, что эти зависимости являются равновесными. Процесс разворачивания-сворачивания GGBP отвечает схеме

ДОВР^^ < ДОВР^^ < ДОВР^

+Са +Са к-2 (1)

ДОВР^^ 1 (GGBP-Ca)N < ^ВР)К 1 (GGBP/Glc)N

+С1с,Са к-1 +С1с,Са к-2 +О1о к-з

Высокая скорость достижения равновесия говорит о том, что связывание кальция с (GGBP-Ca)u является быстрым процессом. Очевидно, что лимитирующей стадией процесса сворачивания в данном случае является образование нативного состояния белка (рис. 4).

Процесс разворачивания-сворачивания GGBP/Glc протекает согласно схеме (1). Поскольку GGBP имеет высокую константу связывания глюкозы — порядка 1 мкМ-1 [14], мы предполагали, что образование комплекса между GGBP и глюкозой не может быть лимитирующей стадией этого процесса. Однако кривые ренатурации и денатурации комплекса GGBP/Glc после 24-часовой инкубации растворов белка в присутствии денатурирующего агента не являются равновесными, более того, кривая ренатурации GGBP/Glc практически совпадает с равновесной кривой разворачивания-сворачивания GGBP. Такая ситуация свидетельствует о том, что формирование комплекса GGBP в нативном состоянии с глюкозой является лимитирующей стадией процесса образования нативного комплекса GGBP/Glc из (GGBP)u в присутствии избытка иона кальция и глюкозы. Равновесие достигается через 10 дней инкубации растворов белка в растворах GdnHCl соответствующей концентрации, когда кривая ренатурации GGBP/Glc совпадает с кривой его денатурации (см. рис. 1, 2). Мы предполагаем, что низкая скорость достижения равновесия между комплексом GGBP/Glc в нативном состоянии и белком в развёрнутом состоянии связана с тем, что присутствие в растворе GdnHCl приводит к увеличению его вязкости. Подобный эффект не наблюдался при тепловой денатурации комплекса GGBP/Glc. Перед установлением равновесия в течение

(GGBP-Ca)U

" ^AG2

(GGBP-Ca)N

(GGBP)N(

А&

Аа

(GGBP/Glc)N

Рис. 4- Наглядное изображение формирования нативного состояния белка в отсутствие и в присутствии глюкозы из развёрнутого состояния белка при разворачивании-сворачивании GGBP и GGBP/Glc под действием химического денатуранта GdnHCl: значение свободной энергии Гиббса АСх и ДС2 характеризует стабильность GGBP/Glc и GGBP соответственно; АСз = АСх — Д02 может быть использовано для определения константы связывания белка с глюкозой в условиях, когда рабочие концентрации глюкозы влияют на равновесные концентрации (GGBP/Glc)^ и (GGBP)^

продолжительного времени существует избыточное количество (по отношению к равновесной величине) молекул комплекса в нативном состоянии (GGBP/Glc)N на пути разворачивания белка и молекул белка в развёрнутом состоянии (GGBP)u на пути ренатурации белка, поскольку в обоих случаях требуется преодоление высокого акти-вационного барьера. На пути разворачивания элементарное событие диссоциации комплекса GGBP с глюкозой не приводит к нарушению конфигурационного соответствия между белком в нативном состоянии и молекулой глюкозы, и вероятность обратной реакции велика. Тогда как на пути сворачивания для образования нативного комплекса GGBP/Glc необходимо не только формирование белка в нативном состоянии, но и возникновение конфигурационного соответствия между (GGBP)N и молекулой глюкозы. Скорость этих процессов изменяется с увеличением/уменьшением концентрации денатурирующего агента. Существенное влияние вязкости раствора на процессы взаимодействия белка с глюкозой, выявленное при изучении процессов его денатурации-ренатурации под действием GdnHCl, было подтверждено в экспериментах по изучению взаимодействия белка с глюкозой с присутствием глицерина (данные не представлены).

Сдвиг равновесной кривой денатурации-ренатурации GGBP/Glc в область больших концентраций денатурирующего агента по сравнению с аналогичной кривой GGBP свидетельствует о стабилизирующем действии молекулы глюкозы на структуру белка. Мы проанализировали равновесные зависимости интенсивности флуоресценции при длине волны 320 и 365 нм GGBP и GGBP/Glc, а также их бескальциевых форм от концентрации GdnHCl согласно стандартной методике [12] для определения разности свободной энергии Гиббса. Значение свободной энергии для GGBP/Glc (3,37 ± 1,07 ккал/моль) практически в два раза превышает её значение для GGBP (1,92 ± 0,90 ккал/моль). Эти данные подтверждают стабилизирующую роль молекулы глюкозы на структуру белка. Значение свободной энергии Гиббса для бескальциевой формы белка GGBP-Ca надёжно определить не удалось, поскольку невозможно оценить интенсивность флуоресценции для нативного состояния белка (см. рис. 1). Однако очевидно, что эта форма

белка очень нестабильна. В то же время при отщеплении иона кальция от GGBP/Glc значение свободной энергии Гиббса практически не меняется (3,18 ± 1,05 ккал/моль). Эти данные свидетельствуют о том, что ион кальция стабилизирует структуру GGBP в открытой форме, т. е. в отсутствие глюкозы.

Эксперименты по тепловой денатурации GGBP также подтверждают стабилизирующее действие глюкозы на структуру белка и необходимость присутствия иона кальция в связанном виде для поддержания устойчивости GGBP в открытой форме к различным внешним воздействиям. Как и разворачивание под действием химического агента, тепловая денатурация GGBP и его комплекса GGBP/Glc, и их бескальциевых форм является обратимой. Частичная необратимость тепловой денатурации, выражающаяся в неполном совпадении кривых плавления (см. рис. 4) и в уменьшении интенсивности триптофановой флуоресценции и сигнала КД в ближней и дальней УФ-областях белка, возникает при продолжительной инкубации белка при температуре выше окончания денатурационного перехода. Это связано с тем, что тепловая денатурация GGBP в присутствии и в отсутствие лигандов осложнена агрегацией, вызванной продолжительной инкубацией белка в развёрнутом состоянии при высокой температуре. Степень агрегации молекул белка зависит от концентрации белка, температуры и длительности инкубации.

Полученные результаты необходимо учитывать при конструировании биосенсорной системы на глюкозу с GGBP в качестве чувствительного элемента.

Литература

1. Ramachandran A., Moses A., Shetty S. et al. A new non-invasive technology to screen for dysglycaemia including diabetes // Diab. Res. Clin. Pract. 2010. Vol. 88. N 3. P. 302-306.

2. ErvinK. R., KiserE. J. Issues and implications in the selection of blood glucose monitoring technologies // Diabetes Technol. Ther. 1999. Vol. 1. N 1. P. 3-11.

3. Moschou E. A., SharmaB. V., Deo S. K., DaunertS. Fluorescence glucose detection: advances toward the ideal in vivo biosensor //J. Fluoresc. 2004. Vol. 14. N 5. P. 535-547.

4. TolosaL. On the design of low-cost fluorescent protein biosensors // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2009. Vol. 116. P. 143-157.

5. Shilton B. H., Flocco M. M., Nilsson M., Mowbray S. L. Conformational changes of three periplasmic receptors for bacterial chemotaxis and transport: the maltose-, glucose/galactose- and ribose-binding proteins // J. Mol. Biol. 1996. Vol. 264. N 2. P. 350-363.

6. Tura A., Maran A., Pacini G. Non-invasive glucose monitoring: Assessment of technologies and devices according to quantitative criteria // Diabetes Research and Clinical Practice. 2007. Vol. 77. P. 16-40.

7. Amiss T. J., ShermanD. B., Nycz C. M. et al. Engineering and rapid selection of a low-affinity glucose/galactose binding protein for a glucose biosensor // Protein Sci. 2007. Vol. 16. P. 2350-2359.

8. Oliver N. S., Toumazou C., Cass A. E., Johnston D. G. Glucose sensors: a review of current and emerging technology // Diabet. Med. 2009. Vol. 26. N 3. P. 197-210.

9. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacterio-phage T4 // Nature. 1970. Vol. 227. N 5259. P. 680-685.

10. Turoverov K. K., Kuznetsova I. M. Intrinsic fluorescence of actin //J. Fluorescence. 2003. Vol. 13. P. 41-57.

11. Kuznetsova I. M., Turoverov K. K., Uversky V. N. Use of the phase diagram method to analyze the protein unfolding-refolding reactions: fishing out the "invisible" intermediates //J. Pro-teome Res. 2004. Vol. 3. P. 485-494.

12. NoltingB. Protein Folding Kinetics. Biophysical Methods. Berlin; Haidelberg, 1999. 191 p.

13. Levitsky D. I., Rostkova E. V., Orlov V.N. et al. Complexes of smooth muscle tropomyosin with F-actin studied by differential scanning calorimetry // Eur. J. Biochem. 2000. Vol. 267. N 6. P. 1869-1877.

14. Vyas N. K., Vyas M. N., Quiocho F. A. Sugar and signal-transducer binding sites of the Escherichia coli galactose chemoreceptor protein // Science. 1988. Vol. 242. P. 1290-1295.

15. BorrokM. J., KiesslingL. L., Forest K. T. Conformational changes of d-glucose/D-galactose binding protein illuminated by apo and ultrahigh resolution ligand-bound structures // Prot. Sci. 2007. Vol. 16. P. 1032-1041.

Статья поступила в редакцию 28 июня 2011 г.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.