Новые флюоресцентные зонды для выявления амилоида Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»



¥>>>>

новые флюоресцентны для выявления амилоида

DOI: 10.17691/stm2017.9.2.11 УДК 547.458.8:616.62-003.821 Поступила 7.12.2015 г.

С.П. Сапожников, д.м.н., зав. кафедрой медицинской биологии с курсом микро П.Б. Карышев, лаборант кафедры медицинской биологии с курсом микробиологи А.И. Шептухина, аспирант медицинского факультета1; о.В. Николаева, ординатор медицинского факультета1;

A.А. Авруйская, аспирант кафедры биологии и химии2; Ю.Н. Митрасов, д.х.н., профессор кафедры биологии и химии2;

B.А. Козлов, д.б.н., к.м.н., профессор кафедры медицинской биологии с курсом микробиологии и вирусологии1

Чувашский государственный университет им. И.Н. Ульянова, Чебоксары, 428015, Московский проспект, 15; 2Чувашский государственный педагогический университет им. И.Я. Яковлева, Чебоксары, 428000, ул. Карла Маркса, 38

На основе представлений о супрамолекулярном неферментативном взаимодействии амилоида с известными флюоресцентными зондами (тиофлавин Т и конго красный) осуществлен поиск веществ, перспективных в качестве флюоресцентных зондов, селективных к амилоиду в ряду производных 4-^арил-3,5-диоксо-1-формил-10-окса-4-азатрицикло [5.2.11.7.02.6]дец-8-енов.

Сухие кристаллы выбранных веществ, имеющих подобное тиофлавину Т строение молекулярного ротора, при возбуждении ультрафиолетом излучали в видимом диапазоне 421,0-435,5 нм. Растворение веществ в 96° этаноле гасит свечение. Водно-спиртовые растворы этих веществ (0,75%; вода:этанол 96°=1:1; рН>7) также практически не излучали (за пределами чувствительности ФЭУ-39). Обработка обезличенных депарафинированных, предварительно окрашенных гематоксилином срезов почки человека с клинически и гистологически доказанным амилоидозом почки спиртовыми растворами исследуемых препаратов не сопровождалась выраженным свечением. Окраска срезов той же почки водно-спиртовыми ощелоченными растворами этих препаратов после заделки в нефлюоресцирующую прозрачную среду сопровождалась выраженным свечением в видимом диапазоне на длине волны 534 нм всех структур почки, с более интенсивным свечением амилоидных депозитов, чем клеточных структур.

Заключение. Полученный результат открывает хорошие перспективы использования исследованных веществ в качестве новых флюорофоров для выявления амилоида.

Ключевые слова: амилоид; флюоресцентные зонды; молекулярные моторы; амилоидное поражение почки; тиофлавин; дец-ены.

Как цитировать: Sapozhnikov S.P., Karyshev P.B., Sheptukhina A.I., Nikolayeva O.V., Avruyskaya A.A., Mitrasov Y.N., Kozlov V.A. Novel fluorescent probes for amyloid detection. Sovremennye tehnologii v medicine 2017; 9(2): 91-98, https://doi.org/10.17691/ stm2017.9.2.11

English

Novel Fluorescent Probes for Amyloid Detection

S.P. Sapozhnikov, MD, DSc, Head of the Department of Medical Biology with the Course of Microbiology and Virology1;

P.B. Karyshev, Laboratory Assistant, Department of Medical Biology with the Course of Microbiology and Virology1;

A.I. Sheptukhina, PhD Student, Faculty of General Medicine1;

O.V. Nikolayeva, Resident, Faculty of General Medicine1;

A.A. Avruyskaya, PhD Student, Department of Biology and Chemestry2;

Y.N. Mitrasov, DSc, Professor, Department of Biology and Chemestry2;

V.A. Kozlov, MD, PhD, DSc, Professor, Department of Medical Biology with the Course

of Microbiology and Virology1

1I.N. Ulianov Chuvash State University, 15 Moskovsky Prospect, Cheboksary, 428015, Russian Federation;

2I.Y. Yakovlev Chuvash State Pedagogical University, 38 Karl Marx St., Cheboksary, 428000, Russian Federation

Для контактов: Козлов Вадим Авенирович, e-mail: [email protected]

Based on the notions of supramolecular nonenzymatic interaction of amyloid with known fluorescent probes (thioflavin T and Congo red) a search for the substances, which may be perspective as fluorescent probes selective to amyloid in the line of 4-N-aryl-3,5-dioxo-1-formyl-10-oxa-4-azatricyclo[5.2.11.7.02.6]des-8-ene derivatives has been undertaken.

Dry crystals of the chosen substances having the structure of the molecular rotor similar to thioflavin T emitted light in the visible range of 421.0-435.5 nm, when excited by ultraviolet. Dissolution of the substances in 96° ethanol extinguishes fluorescence. water-alcohol solutions of these substances (0.75%; water:ethanol 96°=1:1, pH>7) also did not emitted the light (beyond the sensitivity of photomultiplier FEU-39). Treating with alcohol solutions of the tested preparations the depersonalized deparaffinated, preliminarily stained with hematoxylin, human kidney sections with clinically and histologically proved kidney amyloidosis was not accompanied by a marked fluorescence. Staining of the sections of the same kidney with water-alcohol alkalized solution of these preparations after imbedding into the non-fluorescent transparent medium was accompanied by luminescence of all kidney structures in the visible range at a wavelength of 534 nm with a more intensive luminescence of amyloid deposits than cellular structures.

Conclusion. The result obtained opens good perspectives of using the tested substances as novel fluorophores for detecting amyloid.

Key words: amyloid; fluorescent probes; molecular motors; amyloid kidney damage; thioflavin; azatricyclo-dec-ene.

Сформировавшиеся благодаря работам Жана Мари Лена представления о том, что крупные органические молекулы могут взаимодействовать между собой как макрообъекты без образования сильных химических связей, образуя при этом фактически новое вещество — супрамолекулярную структуру, послужили основой для формирования нового суждения о строении и взаимодействии органических соединений. Один из относительно недавно обнаруженных видов супра-молекулярного взаимодействия заключается в том, что части молекул некоторых органических веществ небелковой природы могут совершать направленное вращение друг относительно друга в результате нарушения р-сопряженных связей внутри молекулы под воздействием внешней энергии [1], что получило название «молекулярный ротор». Такое поведение молекул оставалось бы просто молекулярным курьезом, если бы не свойство роторов при торможении вращения средовым молекулярным окружением переизлучать накопленную потенциальную энергию в видимом световом диапазоне. При этом встраивание молекулярного мотора, если он сам по себе является флюо-рофором, в какую-либо супрамолекулярную структуру сопровождается батохромным смещением. То есть спектр излучения вещества смещается в красную сторону, что является доказательством встраивания. Это свойство позволяет идентифицировать среду, с которой специфично связывается такой флюорофор: есть связывание — есть свечение, нет связывания — нет свечения. Справедливо противоположное утверждение: если какое-то вещество, связываясь с такой средой, начинает флюоресцировать более интенсивно, чем без связывания, и наблюдается батохромный эффект, то оно является молекулярным ротором.

В качестве одного из таких веществ выступает специфичный флюоресцентный лиганд амилоида — тио-флавин. Как полагают, низкий квантовый выход индуцированного ультрафиолетом свечения тиофлавина в маловязких средах обусловлен вращательным движением бензотиазольного и М,М-диметиламинового колец друг относительно друга. При встраивании

тиофлавина в структуру амилоида происходит значительное увеличение квантового выхода [1, 2]. В процессе изучения взаимодействия тиофлавина с амилоидом было установлено, что он служит селективным разрушителем амилоида, по крайней мере in vitro [3]. В связи с этим в ряду производных тиофлавина был начат поиск веществ, перспективных для использования в качестве средства диагностики амило-идоза [4], а также в качестве лекарственных средств для лечения амилоидозов [5], поскольку эффективных методов своевременной диагностики, профилактики и терапии этого заболевания до настоящего времени не разработано. Более того, не выявлено предикторов, позволяющих выделить группы больных, у которых течение основного заболевания осложнится развитием амилоидоза.

Тиофлавин не производится в Российской Федерации и закупается за рубежом. В соответствии с технологическим паспортом, предоставляемым вместе с препаратом фирмой-производителем (Santa Cruz Biotechnology, США), ЛД50 тиофлавина при пе-роральном приеме у мышей составляет 151 мг/кг массы. В соответствии с ГОСТ 12.1.007-76 и СанПиН 2.1.4.1074-01 он относится к третьему классу токсичности — умеренно опасным веществам (диапазон 151-5000 мг/кг массы). С учетом разброса вариационного ряда этот препарат может попадать во второй класс токсичности, что исключает возможность его медицинского применения. Данный вывод был подтвержден нами в предварительных исследованиях токсичности тиофлавина [6], в которых подкожное введение мышам препарата в дозе 50 мг/кг сопровождалось 100% летальностью. По этой причине и в связи с малым количеством дорогостоящего реактива было принято решение использовать его только как постмортальный краситель без уточнения токсичности при парентеральном введении. Поскольку антиамилоидный эффект тиофлавина, как предполагается, обусловлен супрамолекулярным взаимодействием с амилоидом [3], его фармакологическая эффективность должна находиться в прямой количественной

//////////////////////^^^^

92 СТМ J 2017 — том 9, №2 С.П. Сапожников, П.Б. Карышев, А.И. Шептухина, О.В. Николаева, А.А. Авруйская, Ю.Н. Митрасов, В.А. Козлов

зависимости от вводимой дозы. По этой причине использование тиофлавина или его близких производных в качестве лекарственных средств кажется бесперспективным.

Тем не менее можно предположить существование веществ, близких по химической структуре к тиофла-вину, не являющихся бензотиазольными производными, однако имеющих аналогичные свойства молекулярных моторов, которые можно использовать в качестве флюорофоров для выявления амилоида.

Цель исследования — поиск флюорофорных меток, селективных к амилоиду, среди веществ, имеющих химическую структуру, близкую к тиофлавину.

Материалы и методы. Сотрудниками кафедры биологии и химии ЧГПУ им. И.Я. Яковлева и медицинского факультета ЧГУ им. И.Н. Ульянова был осуществлен дизайн молекулы молекулярного ротора на основе структуры азатрициклодецена, завершившийся синтезом производных 4-№арил-3,5-диоксо-1-формил-10-окса-4-азатрицикло[5.2.11.7.02.6]дец-8-енов (формула 1а-д), для использования в качестве перспективных флюоресцентных зондов, селективных к амилоиду:

-а-

1а-д

где Y=2 — N0, (а), 3 — N0, (б), 4 — N0, (в), 3 — С00Н (г), 4 — СООН (д).

Синтез исследуемых веществ (1а-д) осуществляли взаимодействием легкодоступных ^арил-2,5-дигидропиррол-,,5-дионов с фуран-,-карбальдеги-дом при эквимольном соотношении реагентов при комнатной температуре [6, 7]. В качестве растворителя использовали абсолютный 1,4-диоксан. Чистоту синтезированных продуктов контролировали по данным тонкослойной хроматографии, а структуру подтверждали методами ИК-, ЯМР 1Н-спектроскопии. Соединения (1а-д) представляют собой кристаллические вещества светло-желтого или оранжевого цвета, константы и данные элементного анализа которых приведены в табл. 1.

Эксперименты с окрашиванием амилоидных депозитов проведены на обезличенных 5 мкм парафиновых срезах почек человека, предоставленных Республиканским бюро судебно-медицинской экспертизы (Чебоксары, Россия), где клинически установленный диагноз амило-идоза был подтвержден патогистологически. Три серии депарафинированных срезов были предварительно окрашены гематоксилином. Контрольная (первая) серия была окрашена тиофлавином Т по Вассару [8].

Вторая серия срезов после окраски гема-

токсилином была в течение 3 мин дополнительно обработана спиртовыми растворами исследуемых препаратов 1а-д, третья серия — водно-спиртовыми. Спиртовые 1,5% растворы приготавливали путем растворения навески препаратов при комнатной температуре в 96° спирте, водно-спиртовые — путем разбавления полученного спиртового раствора 1% водным раствором Na0H 1:1 по объему (рН>7), финальная концентрация препаратов составляла 0,75%. После окрашивания срезы были промыты водой, обезвожены и заделаны в полистирол.

Микроскопию срезов проводили на микроскопе «Люмам-4» («Ломо», Россия). Флюориметрию осуществляли с помощью микролюминиметра ФМЭЛ-1А («Ломо», Россия), запирающий светофильтр ЖС18, 1возб=410 нм, светофильтры ФС, БС, СЗС. Электрические параметры на всех замерах были одинаковыми: входное напряжение — 900 В, сопротивление усилителя — 106 Ом. В насадке был установлен зонд 0,5. Для измерения использовали ФЭУ-39, показания снимали с цифрового вольтметра, данные представлены в милливольтах (мВ). Микрофотографии получены с помощью цифровой камеры Levenhuk С800 NG 8М ^еп1пик, США).

Результаты и обсуждение. В соответствии с современными представлениями, амилоид представляет собой нанотрубку, образующуюся в результате агрегации короткоцепочечных (38-42 аминокислотных остатка) мономерных фрагментов, осуществивших дис-фолдинг в р-складчатую конформацию. Образование р-листа в данном частном случае имеет энергетический выигрыш, поскольку физиологическая конформа-ция пептида — предшественника амилоида — мета-стабильна, т.е. имеет некоторый избыток максимума энергии. Сброс избыточной энергии осуществляется в результате самоукладки в р-лист, конформация которого отвечает условию минимума энергии при данных химических условиях среды и потому стабильна [9, 10] (рис. 1).

В результате взаимопараллельной укладки нитей из 38-42 аминокислотных остатков создается регу-

Таблица 1

Выходы, константы и данные элементного анализа

Номер соединения Выход, % Температура Найдено, % Брутто-формула

плавления, Вычислено, %

°С С Н N

1а 6, 95-98 57^ 3,18 8,91 С15Н10М06

Y=2 — N0, 57,40 3^4 9,01

1б 40 ,01^03 57^ 3,18 8,91 С15Н10N206

Y=3 — N0, 57,4, 3^7 9,(Е

1в 51 189-191 57,3, 3,18 8,91 С15Н10М06

Y=4 — N0, 57,43 3^6 8,99

1г 50 215-217 61,34 3,51 4,47 С16Н11N06

Y=3 — СООН 61,45 3,63 4,59

1д 54 223-225 61,34 3,51 4,47 С16Н11N06

Y=4 — СООН 61,45 3,59 4,55

Рис. 1. Модель связывания конго красного [11] и тиофлавина Т [12] с амилоидными фибриллами:

амилоид сворачивается в р-складчатый лист, при этом каждая пятая цепочка белка имеет одинаковое N-C-направление. Длина молекулы конго красного составляет «19 А, поэтому ее отрицательно заряженные сульфатные группы связываются с положительно заряженными остатками аминокислот в первой и пятой полипептидных цепях р-складчатого листа амилоида. Следующая молекула красителя связывается с третьей и седьмой цепочками и т.д. [11]. В молекуле тиофлавина, имеющей линейные размеры: длина — 15,2±0,14 А, ширина бензотиазольной части — 6,1±0,1 А, диметилзамещенной анилиновой части — 4,3±0,1 А, в жидкой среде происходит вращение анилинового кольца относительно бензотиазольного. Вращение осуществляется за счет тепловой энергии внешней среды. Встраивание молекулы тиофлавина в бороздки р-листа амилоида возможно вследствие идеальной комплементарности этих молекулярных структур. Заклинивание молекулы тиофлавина в бороздке р-листа прекращает вращение частей этой молекулы друг относительно друга, но не накопление внешней энергии в р-сопряженных связях. Поскольку возможность преобразования накопленной энергии в механическое вращение в образованной супрамоле-куле невозможна, происходит ее переизлучение в видимом диапазоне. Данная модель объясняет специфичность взаимодействия конго красного и тиофлавина Т с амилоидными фибриллами и демонстрирует различия связывания этих красителей с амилоидом

лярная структура — нанотрубка диаметром 10-20 нм и длиной до 1000 нм [13], способная к супрамолеку-лярным взаимодействиям. Она находится в состоянии энергетического минимума и более устойчива к действию пептидаз, чем исходный белок. По этой причине амилоид накапливается в тканях. При классической окраске амилоидных депозитов в тканях конго красным методом световой микроскопии амилоид обнаруживается в виде кирпично-красных образований как в цитоплазме некоторых клеток, так и в межклеточном пространстве (рис. 2, а, б).

Конго красный способен к индуцированной ультра-

фиолетом красной флюоресценции в видимом диапазоне (рис. 2, в). Однако квантовый выход этой флюоресценции настолько низок, что она представляет только теоретический интерес и не нашла широкого практического применения. Установлено, что конго красный встраивается только в торцы амилоидных р-листов (см. рис. 1). Поскольку амилоид представляет собой агрегаты таких р-листов, образующих нано-трубочки, которые связываются с полисахаридами соединительной ткани, трудно ожидать, что конго красный будет взаимодействовать со всеми местами специфичного связывания. Следовательно, трудно ожидать наличия параметрических характеристик такого связывания в ткани. Тем не менее окраска конго красным как достаточно простой и высокоспецифичный метод окрашивания амилоида продолжает оставаться клинически важным эталоном сравнения, позволяющим верифицировать специфичность других методов окраски амилоида.

Второй, редко используемый в Российской Федерации, но высокоспецифичный метод выявления амилоида — флюоресценция с тиофлавинами Т или S (рис. 2, г, д). При окрашивании этим красителем амилоид выглядит как зелено-коричневые флюоресцирующие объекты. На препаратах почки амилоидные депозиты в просвете канальцев и амилоид цитоплазмы эпителия канальцев выглядят как ярко-зеленые, практически однородные объекты. В стенках сосудов и между капиллярными петлями почечных клубочков амилоид светится менее интенсивно-коричневатым оттенком. Участки тканей, не содержащие амилоид, выглядят темно-зелеными, практически черными. Клеточные ядра дифференцируются как округлые несветящиеся объекты.

Встраивание тиофлавина в структуру р-листа амилоида отличается от взаимодействия с амилоидом конго красного (см. рис. 1). Если конго встраивается в торец р-листа, то тиофлавин, возможно, укладывается в складки р-листа (стрелки на рис. 1), что прекращает вращение его диметиламинобензольного кольца относительно бензатиазольного. Максимум

//////////////////////^^^^

94 СТМ | 2017 — том 9, №2 С.П. Сапожников, П.Б. Карышев, А.И. Шептухина, О.В. Николаева, А.А. Авруйская, Ю.Н. Митрасов, В.А. Козлов

Рис. 2. Окраска конго красным: световая микроскопия — амилоидные депозиты в канальцах (а) и почечных клубочках (б); флюоресцентная микроскопия (тот же препарат) — амилоидные депозиты в канальцах (в); *20; окраска тиофлавином Т — амилоидные депозиты в канальцах (г) и клубочке (д); х40.

При флюоресцентном исследовании (в) амилоидные депозиты, меченные конго красным, выглядят как гомогенные объекты темно-красного цвета. Ткани, не содержащие амилоида, не светятся, что свойственно для не имеющих аутофлюоресценции депарафиниро-ванных срезов тканей. Здесь: Кл — клубочки, Кн — канальцы, Э — эпителий канальцев

флюоресценции тиофлавина приходится на 534 нм. Интенсивность свечения интактных тканей составляет 0,014±0,003 мВ, пораженных амилоидом клубочков — 0,046±0,015 мВ, эпителия канальцев — 0,053±0,012 мВ, амилоидных депозитов в просвете канальцев — 0,72±0,20 мВ. Высокий размах вариационного ряда свидетельствует о том, что интенсивность флюоресценции амилоида, меченного тиофлавином, значительно различается в разных участках ткани почки, а это в свою очередь может свидетельствовать о наличии концентрационной зависимости. Сравнение структуры синтезированных нами соединений 1а-д и тиофлавина Т (см. рис. 1) показывает, что они близки.

Кл

Кн /

Если в тиофлавине функцию «якоря» выполняет ме-тильная группа при азоте бензотиазольного кольца, то в наших соединениях — метилальдегидная группа.

У исследованных препаратов 1а-д в сухом кристаллическом виде максимум флюоресценции отмечался в диапазоне 421,0-436,5 нм (рис. 3).

Ни спиртовой, ни водно-спиртовой растворы этих веществ в диапазоне концентраций от 0,75 до 1,5% регистрируемой флюоресценции с помощью ФЭУ-39 не обнаруживали. После обработки срезов амилоидной почки препаратами 1а-д наблюдается интенсивная флюоресценция с максимумом в области 534 нм, т.е. связывание этих веществ с амилоидными депо-

Рис. 3. Сопоставление флюоресценции сухих кристаллов исследуемых флюорофоров (левая шкала) и связанных с амилоидом на препаратах почки (правая шкала). Наблюдается выраженный батохромный сдвиг флюоресценции при связывании с амилоидом

Рис. 4. Результаты окрашивания парафиновых срезов амилоидной почки препаратами (1а-д), х40:

препарат 1а — амилоидные депозиты в канальцах (а) и клубочках (б); препараты 1б (в), 1в (г), 1г (б) — амилоидные депозиты в клубочках; препарат 1д — амилоидные депозиты в канальцах (б, е)

//////////////////////^^^^

96 СТМ | 2017 — том 9, №2 С.П. Сапожников, П.Б. Карышев, А.И. Шептухина, О.В. Николаева, А.А. Авруйская, Ю.Н. Митрасов, В.А. Козлов

60,0 m

ии,

е

1 40,0 р

о

2

£ 30'° ь

но

в и

о

ент

0,0

1в :«.io ^Лл»«

TSLj

/ \ #1 ' N lr l 1 Ь \\

/ 16 \ Ii \\ \\

/ • \ / •* 1в 'Л /•> 1г чЧ\ ___ j f \

V ' —/

0,06

397 421 436,5 456 466,5 484 507

ш

0,05

е

0,04 о

е р

о

0,03 !

0,02

ет нт

0,0

1а

16

1б

523 534 552 569 Длина волны, нм

1г -1д

Таблица 2

Интенсивность флюоресценции исследуемых препаратов 1а-д, мВ

Объект Препараты

1а 1б 1в 1г 1д

Клубочки 0,028±0,003 0,038±0,004 0,044±0,014 0,029±0,004 0,041±0,009

Депозиты 0,038±0,006 0,065±0,020 0,057±0,004 0,037±0,016 0,051±0,013

Эпителий канальцев 0,044±0,015 0,068±0,008 0,060±0,006 0,047±0,007 0,060±0,010

зитами сопровождается выраженным батохромным сдвигом (рис. 4).

Меньшее по интенсивности свечение обнаруживалось в клубочках с хорошо выявляемым париетальным листком капсулы и темно-зелеными депозитами амилоида, расположенными между петель клубочка, эпителием канальцев и эндотелием артериол. Обнаруживаемое свечение равномерно располагалось в цитоплазме клеток. Клеточные ядра выглядели как темные нефлюоресцирующие овальные объекты.

Интенсивность флюоресценции исследуемых препаратов в структурах почки (табл. 2) значительно не различается, что объясняется близостью их химического строения.

Все препараты 1а-д предположительно должны иметь низкую токсичность, поскольку ранее проведенное исследование острой токсичности азатрициклоде-ценов [6] позволило отнести эту группу соединений к четвертому классу токсичности.

Заключение. Исследованные препараты 1а-д, растворенные в водно-спиртовой среде, при рН>7, проявляют свойства селективных к амилоиду флюоро-форов. Связывание препаратов 1а-д с амилоидными депозитами сопровождается резким увеличением интенсивности флюоресценции по сравнению с их водно-спиртовыми растворами и выраженным батохромным сдвигом. Данное обстоятельство позволяет утверждать, что механизм реализации флюоресцентных свойств новых изученных веществ реализуется аналогично тио-флавину Т. Учитывая дешевизну исходных веществ, необходимых для синтеза препаратов 1а-д, простоту и дешевизну самого синтеза, высокий квантовый выход, простоту окрашивания препаратов, а также вероятную низкую токсичность, можно утверждать, что все предлагаемые вещества имеют хорошую перспективу использования в качестве новых флюорофоров для выявления амилоида.

Финансирование исследования. Работа поддержана грантом Фонда содействия развитию малых форм предприятий, договор 0004043.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Литература/References

1. Сулацкая А.И. Взаимодействие тиофлавина Т с амилоидными фибриллами: механизм встраивания, параметры связывания, изменение фотофизических характеристик

красителя. Автореф. дис. ... докт. биол. наук. СПб; 2013. Sulatskaya A.I. Vzaimodeystvie tioflavina T s amiloidnymi fibrillami: mekhanizm vstraivaniya, parametry svyazyvaniya, izmenenie fotofizicheskikh kharakteristik krasitelya. Avtoref. dis. ... dokt. biol. nauk [Interaction of thioflavin T with amyloid fibrils: mechanism of incorporation, parameters of binding, alteration of photochemical characteristics of the stain. DSc Thesis]. Saint Petersburg; 2013.

2. Кузнецова И.М. Механизмы возникновения и свойства промежуточных, неправильно свернутых и агрегированных форм белков. Автореф. дис. ... докт. биол. наук. СПб; 2006. Kuznetsova I.M. Mekhanizmy vozniknoveniya i svoystva promezhutochnykh, nepravi'no svernutykh i agregirovannykh form belkov. Avtoref. dis. ... dokt. biol. nauk [Mechanisms of formation and properties of intermediate, misfolded, and aggregated forms of proteins. DSc Thesis]. Saint Petersburg; 2006.

3. Liu R., Su R., Qi W., He Z. Photo-induced inhibition of insulin amyloid fibrillation on online laser measurement. Biochem Biophys Res Commun 2011; 409(2): 229-234, https://doi.org/10.10167j.bbrc.2011.04.132.

4. Ван Я., Кланк У.Э., Матис Ч.Э. мл. Производные тиофлавина, связывающие амилоид, способ обнаружения in vivo отложений амилоида и способ распознавания болезни Альцгеймера. Патент РФ 2324686 С2. 2008. Van J., Klank U.Eh., Matis Ch.Eh. ml. Proizvodnye tioflavina, svyazyvayushchie amiloid, sposob obnaruzheniya in vivo otlozheniy amiloida i sposob raspoznavaniya bolezni Al'tsgeymera [Amyloid-binding thioflavin derivatives, method of in vivo detection of amyloid deposit and method of diagnosis of Alzheimer's disease]. Patent RU 2324686 С2. 2008.

5. Фрeштль В., Сринивасачари Н., Ломанн С., Лопес-Дебер М.-П., Мус А., Пильгрен-Бош М. Новые соединения для лечения заболеваний, связанных с амилоидом или амилоидподобными белками. Патент РФ 2469026 C2. 2012. Freshtl' V., Srinivasachari N., Lomann S., Lopes-Deber M.-P., Mus A., Pil'gren-Bosh M. Novye soedineniya dlya lecheniya zabolevaniy, svyazannykh s amiloidom ili amiloidpodobnymi belkami [New compounds for treating amyloid or amyloid-like protein associated diseases]. Patent RU 2469026 C2. 2012.

6. Козлов В.А., Митрасов Ю.Н., Кондратьева О.В., Гордеева И.В., Полякова О.Б., Груздев С.Е., Федорова М.Л., Борзова А.А. Острая токсичность 4-аза-1-гидроксиметил-10-окса-3,5-диоксо-4-фенилтрицикло[5,2,11,7,02,6]дец-8-ена. В кн.: Материалы 8-й международной научной школы «Наука и инновации — 2013». Йошкар-Ола; 2013; с. 264-265. Kozlov V.A., Mitrasov Yu.N., Kondrat'eva O.V., Gordeeva I.V., Polyakova O.B., Gruzdev S.E., Fedorova M.L., Borzova A.A. Ostraya toksichnost' 4-aza-1-gidroksimetil-10-oksa-3,5-diokso-4-feniltritsiklo[5,2,11,7,02,6]dets-8-ena. V kn.: Materialy 8-y mezhdunarodnoy nauchnoy shkoly "Nauka i

•штшттштшттштшттштштт

Флюоресцентные зонды для выявления амилоида СТМ J 2017 — том 9, №2 97

£

innovatsii — 2013" [Acute toxicity of 4-aza-1-hydroxymethyl-10-oxa-3,5-dioxo-4-phenyltricyclo [5,2,11,7,02,6]dez-8-yena. In: Materials of VIII International Scientific School "Science and Innovations — 2013"]. Yoshkar-Ola; 2013; p. 264-265.

7. Козлов В.А., Сапожников С.П., Митрасов Ю.Н., Ав-руйская А.А., Карышев П.Б., Шептухина А.И., Николаева О.В. Способ флуоресцентного гистологического выявления амилоида. Патент РФ 2611408. 2017. Kozlov V.A., Sapozhnikov S.P., Mitrasov Yu.N., Avruyskaya A.A., Karyshev P.B., Sheptukhina A.I., Nikolaeva O.V. Sposob fluorestsentnogo gistologicheskogo vyyavleniya amiloida [Method of fluorescent histological detection of amyloid]. Patent RU 2611408. 2017.

8. Burns J., Pennock C.A., Stoward P.J. The specificity of the staining of amyloid deposits with thioflavine T. J Pathol Bacteriol 1967; 94(2): 337-344, https://doi.org/10.1002/ path.1700940211.

9. Knowles T.P.J., Vendruscolo M., Dobson C.M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nat Rev Mol Cell Biol 2014; 15(6): 384-396, https:// doi.org/10.1038/nrm3810.

10. Krebs M.R., Bromley E.H., Donald A.M. The binding of thioflavin-T to amyloid fibrils: localisation and implications. J Struct Biol 2005; 149(1): 30-37, https://doi.org/10.1016/j. jsb.2004.08.002.

11. Klunk W.E., Pettegrew J.W., Abraham D.J. Quantitative evaluation of congo red binding to amyloid-like proteins with a beta-pleated sheet conformation. J Histochem Cytochem 1989; 37(8): 1273-1281, https://doi.org/10. 1177/37.8.2666510.

12. Held P., Becker K. Analysis of a-synuclein fibril formation in vitro. Using fluorescence to monitor protein aggregation in microplates. Biotek; 2014. URL: http://www. biotek.com/resources/articles/analysis-of-synuclein-fibril-formation-in-vitro.html.

13. Baldwin A.J., Knowles T.P., Tartaglia G.G., Fitzpatrick A.W., Devlin G.L., Shammas S.L., Waudby C.A., Mossuto M.F., Meehan S., Gras S.L., Christodoulou J., Anthony-Cahill S.J., Barker P.D., Vendruscolo M., Dobson C.M. Metastability of native proteins and the phenomenon of amyloid formation. J Am Chem Soc 2011; 133(36): 14160-14163, https://doi.org/10.1021/ja2017703.

//////////////////////^^^^

98 СТМ J 2017 — TOM 9, №2 С.П. Сапожников, П.Б. Карышев, А.И. Шептухина, О.В. Николаева, А.А. Авруйская, Ю.Н. Митрасов, В.А. Козлов