CC BY
62
© Фролов А. К, Литвиненко Р. А., Копейка В. В., Федотов Е. Р. УДК : 577. 27 : [ 615. 811 : 612. 112 ]
ОСОБЕННОСТИ РЕАКЦИИ ВЛАСТНОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ ДОНОРОВ СТИМУЛИРОВАННОЙ РАСТИТЕЛЬНЫМИ ЛЕКТИНАМИ И АНТИГЕНАМИ КОЛЬЧЕЦОВ
Фролов А. К, Литвиненко Р. А., Копейка В. В.,, Федотов Е. Р.
Государственное высшее учебное заведение «Запорожский национальный университет», г. Запорожье
Широкий спектр терапевтичних ефектiв гiрyдоmерапii в основному обумовлюеться ii iMyHomponHUM механз мом, однак конкретн його мехашзми мало вивченi i зовам вiдсymнi у доступнт лimераmyрi вiдомосmi про вплив на iмyнimеm антигенних вiдмiнносmей трьох пiдвидiв медично'1' п'явки (аптечно'1\ укра'тсько1\ схiдно'i), тому вивчення даноi проблеми стало метою нашого до^дження. Обстежено 23 жiнки репродуктивного вi^y, ттактних щодо контакту з бiологiчно активними речовинами медично'1' п'явки. З венозно'1' кровi донорiв отри-мували на градiенmi щiльносmi сyспензiю лiмфоциmiв, яку культивували 24 години i3 додаванням рослинних ле-кmинiв (ФГА, КонА) i антигетв з сольового екстракту трьох пiдвидiв медично'i п'явки (аптечно'1\ украшсько1\ схiдно'i), а також червоного калiфорнiйського хробака, як загального представника класу кшьчастих хробаюв. Показники в ФГА i КонА стимульованих культурах miтин вiдnовiдали Их фiзiологiчним значенням поmенцiйноi пролiфераmивно'i акmивносmi лiмфоциmiв, що свiдчиmь про кондицштсть умов культивування лiмфоциmiв. Pi-вш РБТЛу культурах, стимульованих антигенами медично'i п 'явки, перевищували спонтанний рiвень у 2 - 4 рази при максимyмi в культурах iз антигенами схiдного р1зновиду. У культурах iз антигенами червоного калiфорнiй-ського хробака РБТЛ перевищувала спонтанн рiвнi в 9 разiв, наближаючись до тако'1\ при пол^ональнш ак-тиваци рослинними лектинами. В спонтанних i лектин-стимульованих культурах, в основному, спосmерiгалися продуктивн стадИ iмyногенезy, mодi як в культурах стимульованих антигенами медично'i п'явки, часто зу-сmрiчалися апоптотичн реакцИ] а в культурах iз антигенами червоного калiфорнiйського хробака - о^м апо-птозу перевищував некроз. Збшьшення показнитв РБТЛ в культурах, стимульованих антигенами кiльчецiв, iмовiрно, пов'язанi з наявтстю в Их бiополiмерах гетерофыьних паmернiв.
Ключовi слова: реага^я бластноТ трансформацп лiмфоцитiв, прудотератя, медична п'явка, антигени, лектини
Введение
Гирудотерапия (ГТ), как раздел современной традиционной медицины относящийся к биомедицине, сегодня всё больше пользуется успехом среди населения благодаря её лечебно-профилактической эффективности, особенно при хронических формах заболеваний, а также при коррекции геронтологических признаков. Благодаря возбуждению рефлексогенных зон, медицинская пиявка (МП) благоприятно влияет на физиологию соответствующей метамерной области тела и, соответственно, всего организма [3, 4]. При питании МП впрыскивает в сосательную лакуну вместе с секретом слюнных желез более 100 компонентов биологически активных веществ (БАВ) в оптимальной дозировке и последовательности, наконец дозированное кровоизвлечение способствует перераспределению циркулирующей крови и лимфы, что в совокупности обеспечивает общее гомеостатическое действие [1, 6].
Среди широкого спектра терапевтического действия ГТ, особое место занимает иммунотропный эффект [6], однако конкретные механизмы этого действия бАВ МП мало изучены и уж совсем отсутствуют в доступной литературе сведения о влиянии на иммунитет антигенных (АГ) различий трёх подвидов МП: аптечной украинской, восточной. Данные проблемы явились целью нашего исследования.
Материалы и методы исследования
Материалом служила венозная кровь 23 женщин доноров, средний возраст - 29,3 ± 1,99 лет, стабили-
зированная раствором кристаллического гепарина (2 мг/мл, Спофа). Все женщины раньше не получали ГТ, укусы диких форм МП при купании в природных водоемах отрицают.
Из сепарированных на фиколл-верографиновом градиенте плотности (р = 1,078) лимфоцитов, после их отмывания забуференым раствором Хенкса, получали суспензию в концентрации 2 млн/мл на питательной смеси состава: среда 199, 10 % эмбриональная телячья сыворотка, 0,3 мг/мл глутамина, 0,15 мг/мл аспарагина, 20 мМ Хепес, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 100 мкг/мл канамицина. Суспензию вносили по 250 мкл в микропробирки эппендорф, которые распределяли на следующие виды культур клеток: 1 - контроль, 2 - добавление 20 мкг/мл ФГА-М (Болгария), 3 - добавление 20 мкг/мл КонА (Германия), 4, 5, 6, 7 - добавление АГ 125 мкг/мл в пересчете на белок из солевой вытяжки трёх подвидов МП (аптечной, украинской, восточной) и красного калифорнийского червя (ККЧ). Использование АГ ККЧ в РБТЛ проведено для их филогенетического сравнения с АГ МП, так как они относятся к одному типу кольчатых червей. Митогенную стимуляцию лимфоцитов известными растительными лектинами ФГА и КонА осуществляли с целью определения кондиционности условий культивирования клеток, а также для изучения потенциальной пролиферативной активности основных популяций Т-лимфоцитов. Известно, что ФГА является митогеном для всех Т-лимфоцитов, тогда как КонА - преимущественно для 008-субпопуляции [12]. Водный экстракт из тел кольчецов
получали согласно методу [14] в нашей модификации, заключающейся в использовании живых червей, отмывании от остатков крови крупного рогатого скота от предыдущего кормления, использование в качестве разводящего раствора клеточной суспензии и детрита забуференого физраствора, рН 7,2. Лимфоциты культивировали 24 часа при температуре 37 С. После чего делали мазки, фиксировали метанолом, окрашивали по Паппенгейму с дифференцировкой в подкисленной соляной кислотой дистиллированной воде. РБТЛ оценивали морфологическим методом, при анализе 400 - 600 лимфоцитов начиная от начала «щеточки» до основания препарата, учитывали малые, средние, большие бласты и лимфоциты с признаками апоптоза. Статистическую обработку проводили с использованием программы «БТАПБПОА 6.0».
Результаты и их обсуждение Индивидуальные и средние показатели РБТЛ представлены в таблице, анализ которых показывает, что количество спонтанно стимулированных лимфоцитов в контрольных культурах в среднем составляло 5,5 ± 0,47 % с индивидуальными колебаниями от 2,5 до 10,0 %, что обусловлено разным состоянием исходной активации лимфоцитов, которые завершали её в условиях культуры. Эти результаты несколько превышают данные литературы, 1 - 4 % [13], что мо-
жет происходить за счёт напряжения иммунитета в техногенном регионе Запорожья. Уровень РБТЛ на ФГА и КонА совпадали с данными других исследователей [11, 12] и равнялись в среднем 67,6 ± 2,35 % и 38,8 ± 2,10 %, соответственно, что свидетельствует о кондиционности условий культивирования лимфоцитов.
Повышенная реакция лимфоцитов на АГ кольчецов также указывает на их поликлональную активацию, как и на растительные лектины. Так, РБТЛ на АГ аптечного и украинского подвидов МП составляла в среднем 10,9 ± 0,90 % и 12,0 ± 1,18 %, р < 0,05, по сравнению с контролем. При этом индивидуальные колебания показателей РБТЛ для украинской МП были выше (6,2 - 31,5 %), чем у аптечного подвида (2,5 - 20,5 %), р < 0,05, при анализе х-квадрата. Стимуляция лимфоцитов АГ восточного подвида МП была ещё выше и в среднем составляла 15,8 ± 1,89 %, при вариациях от 6,0 % до 45,0 % (р < 0,05, от контроля и культур лимфоцитов, стимулированных АГ аптечного и украинского подвида). РБТЛ на АГ ККЧ приближалась к таковой для растительных поликлональных митогенов ФГА и КонА и в среднем составляла 49,4 ± 4,38 %, при индивидуальных колебаниях от 23,8 до 82,0 % и более, что контрастно их отличает от показателей РБТЛ на АГ МП.
Таблица
Показатели реакции бластной трансформации лимфоцитов крови доноров на растительные лектины и антигены кольчецов
Доноры, № п/п Уровни стимуляции лимфоцитов, %
СП ФГА КонА АП УКР ВОСТ ККЧ
1 4,5 59,0 41,0 11,5 / 2,0 6,5 / 1,0 14,5 / 2,0 81,0
2 7,0 59,0 26,0 11,8 / 3,0 18,5 / 2,0 23,5 / 3,0 31,0
3 6,0 78,0 32,0 17,0 / 3,0 13,3 / 3,0 17,5 / 3,0 66,5
4 3,5 59,0 33,0 6,5 / 1,0 7,2 / 1,0 8,5 / 2,0 37,2
5 4,0 77,0 42,0 16,5 / 0,5 10,5 / 2,0 13,0 / 3,0 31,0
6 6,0 51,5 36,0 2,7 / 0,5 14,0 / 4,0 18,0 / 5,0 26,0
7 8,0 79,0 41,0 10,0 / 2,0 12,5 / 2,0 14,0 / 2,0 47,5
8 4,0 73,0 41,0 12,0 / 4,0 10,7 / 0,5 15,8 / 4,0 65,0
9 6,4 71,0 55,0 20,5 / 5,0 9,7 / 1,0 33,0 / 3,0 31,0
10 10,0 69,0 37,0 13,6 / 2,0 10,7 / 2,0 16,0 / 3,0 25,0
11 8,0 70,0 44,0 6,8 / 2,0 9,0 / 2,0 45,0 / 1,0 48,0
12 2,8 82,0 55,0 8,6 / 3,0 31,5 / 5,0 11,7 / 2,0 39,0
13 1,6 76,0 49,0 5,0 / 0,5 10,0 / 1,5 11,3 / 2,5 39,0
14 6,0 57,0 29,5 15,5 / 3,0 7,0 / 2,0 12,3 / 3,0 78,5
15 3,5 74,5 52 6,1 / 1,0 6,2 / 2,0 10,5 / 3,0 82,0
16 7,5 85,0 35,0 12,5 / 2,0 13,5 / 2,0 15,0 / 4,0 80,0
17 8,2 60,0 24,0 11,0 / 3,0 12,5 / 2,0 15,0 / 4,0 70,0
18 2,5 46,5 55,0 7,8 / 0,5 12,8 / 1,0 10,7 / 2,0 41,5
19 7,5 64,0 26,0 12,0 / 2,0 18,5 / 3,0 21,5 / 3,0 40,0
20 5,8 51,0 33,0 12,5 / 0,5 8,8 / 2,0 6,2 / 0,5 23,8
21 6,0 66,0 27,0 11,0 / 1,0 7,0 / 1,0 6,0 / 0,5 33,5
22 3,0 81,0 42,0 10,0 / 2,0 14,0 / 2,0 8,5 / 1,0 71,0
Х 5,5± 0,47 67,6± 2,35 38,8± 2,10 10,9±0,90/ 1,9±0,26 12,0±1,18/ 2,0±0,22 15,8±1,89/ 2,5±0,25 49,4± 4,38
Примечание: условные обозначения, сокращения: СП - спонтанная РБТЛ (контроль), РБТЛ с лектинами ФГА, КонА, с антигенами медицинской пиявки аптечной (АП), украинской (УКР), восточной (ВОСТ) экоформ, красным калифорнийским червем (ККЧ); в числителе - общее количество бласттрансформированых лимфоцитов в культуре клеток; в знаменателе - в том числе с признаками апоптоза, число некротических клеток в таблице отдельно не приведено.
Нами обнаружен факт, что РБТЛ в ФГА, КонА, а также в контроле, с одной стороны, и с АГ кольчецов - с другой стороны, в культурах морфологически от-
личалась. В первых образцах стимулированных культур - наблюдались типичные бласты, которые свидетельствуют о продуктивном лимфогенезе. При стиму-
ляции АГ кольчецов бласты имели недостаточно развитую цитоплазму, снижение её базофильности, как результат недостаточности развития белок-синтетической системы, в частности гранулярного эн-доплазматического ретикулума. В культурах с АГ МП значительная часть (1 - 8 %) стимулированных лимфоцитов имела признаки апоптоза: цитопикноз, ка-риопикноз, вакуолизация ядра и цитоплазмы, дисперсию хроматина, цейозис плазмалеммы. В таких культурах также часто встречались некротические лимфоциты в виде диффузных эозинофильных пятен. Признаки апоптоза и некроза были особенно выражены в культурах лимфоцитов с АГ ККЧ, доля которых часто превышала большую часть стимулированных клеток.
Индукция непродуктивного иммуногенеза АГ кольчецов, приводящая к апоптозу и некрозу лимфоцитов в культуре клеток для АГ МП in vivo в условиях ГТ, вероятно, является ведущим механизмом противовоспалительного действия БАВ слюны МП. Последние в виде антиэнзимного комплекса выделены среди БАВ МП [6]. Вместе с тем увеличение уровня РБТЛ выше спонтанного под влиянием АГ кольчецов у доноров, в анамнезе которых отсутствует контакт с ними, можно объяснить наличием общих паттернов в структурной организации всех видов Царств органического Мира: Дробянок, Растений, Грибов, Животных. По современным представлениям структурные паттерны (образцы) [15] представляют собой филогенетически стабильные, ограниченные 8 - 10 - 20 мономерами последовательности биополимеров (ФСПБ) сходные у представителей разных филогенетических групп. Видовое разнообразие молекулярных паттернов также ограничено - около 20 [5]. Их наличие описывается как гетерофильные АГ [7].
За различие молекулярных паттернов (ФСПБ) ответственны специфические паттернраспознающие рецепторы (ПРР), которые имеются на большинстве компартментов клетки (плазмолемные и цитоплазма-тические), преимущественно на клетках врождённого иммунитета и в меньшей мере на лимфоцитах [10]. ПРР находят и в других клетках различных тканей. В настоящее время подробно изучена роль взаимодействия ФСПБ-ПРР в противоинфекционной защите [17] и иммунопатологии по типу аллергии и аутоаллергии [2, 8]. Естественно эти взаимодействия принимают участие и в регуляции онтогенетического развития и регуляции, на что указывает факт первого открытия одного из видов ПРР - То11-подобных рецепторов (TLR) при эмбриогенезе дрозофилы [16].
Обнаруженные количественные различия РБТЛ под влиянием АГ кольчецов можно объяснить следующим образом: ККЧ обитает в почве, питается гумусом, растительными остатками, насыщенными разнообразными микроорганизмами. От их защиты и для регуляции онтогенеза данный вид имеет разнообразие ФСПБ и ПРР к ним. Это обеспечивает их эффективную физиологическую и репаративную регенерацию, сильный иммунитет. Так, спонтанный уровень естественных гемагглютининов у дождевого червя (дикие формы ККЧ) составляет 1 : 1280 [9]. Поэтому АГ ККЧ в культуре проявляют сильный апопто-тический и некротический эффект.
МП питается относительно стерильной пищей (тканевая жидкость, кровь) водных и наземных позво-
ночных, во всяком случае, у наземных позвоночных (в основном копытные пойменные животные, а также человек). Облигатный паразитизм МП филогенетически эволюционировал в мутуалистические взаимоотношения, в ходе которых патогенные ФСПБ отсекались отбором, что и привело к умеренной индукции апоптоза и противовоспалительного эффекта. Можно считать, что аптечная и украинская разновидности МП имеют более раннее филогенетическое взаимодействие с позвоночными, чем их восточная разновидность, на что указывает достоверно большие апоптотические и некротические эффекты АГ этой разновидности по сравнению с первой.
Таким образом, впервые обнаружено нами разнообразие РБТЛ в культурах с АГ кольчецов является основанием для экспериментального изучения имму-нотропного действия БАВ кольчецов, клинического обоснования ГТ. Данное исследование может быть также использовано в видовых, популяционных и эколого-географических исследованиях.
Выводы
1. Показатели РБТЛ в ФГА- и КонА-стимулированных культурах клеток являлись 67,6 ± 2,35% и 38,8 ± 2,10 %, соответственно, что равнялись физиологическим значениям потенциальной проли-феративной активности лимфоцитов.
2. Уровни РБТЛ в культурах, стимулированных АГ аптечной, украинской, восточной разновидностей МП превышали их контрольные (5,5 ± 0,47 %) и равнялись, соответственно, 10,9 ± 0,90 %, 12,0 ± 1,18 %, 15,8 ± 1,89 % (при р < 0,05) с максимумом в культурах с АГ восточной разновидности МП, а в культурах с АГ ККЧ - в 9 раз (49,4 ± 4,38 %), приближаясь к таковой для поликлональной активации лимфоцитов растительными лектинами.
3. В спонтанных и лектин-стимулированных культурах, в основном, наблюдались продуктивные стадии иммуногенеза, тогда как в АГ МП стимулированных культурах часто (0,5 - 5 %) встречались апопто-тические реакции, а в культурах с АГ ККЧ - кроме апоптоза превосходил некроз.
4. Увеличение показателей РБТЛ в культурах, стимулированных АГ кольчецов, вероятно, связано с наличием в их биополимерах гетерофильных паттернов.
Литература
1. Баскова И. П. Гирудотерапия. Наука и практика / И. П. Баскова, Г. С. Исаханян. — М. : 2004. — 508 с.
2. Белоглазова К. В. Полиморфизм гена Toll-like рецептора 4 ASP299GLY у больных ревматоидным артритом / К. В. Белоглазова, О. А. Шлыкова, О. В. Измайлова, И. П. Кайдашев // Проблеми екологп та медицини. - 2009.
- Т. 13, № 5 - 6. - С. 15-17.
3. Береснев В. А. Метамерiя / В. А. Береснев. - К. : СМП «АВЕРС», 2003. - 264 с.
4. Гирудотерапия : руководство / под ред. В. А. Савинова.
— М. : ОАО «Издательство «Медицина», 2004. — 432 с.
5. Дранник Г. Н. Клиническая иммунология и аллергология : пособие / Г. Н. Дранник, А. Г. Дранник ; 5-е изд., доп. — К. : Полиграф-плюс, 2011. — 561 с.
6. Каменев О. Ю. Лечение пиявками: теория и практика гирудотерапии : руководство для врачей / О. Ю. Каменев, А. Ю. Барановский. — СПб. : ИГ «Весь», 2006. — 304 с.
7. Кантемирова М. Г. Состояние сердечно-сосудистой системы и спектр гетерофильных антикардиальных
антител у детей с соматическими заболеваниями на 13. фоне хламидийной и микоплазменной инфекций / М. Г. Кантемирова, Е. А. Дегтярева, Л. Г. Кузьменко и др. // Педиатрия. Журнал имени Г. Н. Сперанского : Научно- 14. практический двухмесячный медицинский журнал. -2008. - Т. 87, № 2. - С. 41-46.
8. Крючко Т. О. Генетичний полiморфiзм Toll-подiбного рецептора 4 у дтей з атотчною бронхiальною астмою / Т. О. Крючко, I. П. Кайдашев, Ю. О. Вовк та Ы. // Клиническая иммунология. Аллергология. Инфектология. -2011. - № 5. - с. 52-54. 15.
9. Купер Э. Сравнительная иммунология / Э. Купер ; пер. с англ., под ред. Н. Г. Хрущова. - М. : Мир, 1980. - 422 с.
10. Лебедев К. А. Иммунограмма в клинической практике / 16. К. А. Лебедев. - М. : Наука. - 1990. - 388 с.
11. Лебедев К. А. Новая иммунология - иммунология об-разраспознающих рецепторов / К. А Лебедев, И. Д. По-някина // Известия РАН. Серия биологическая. - 2006. 17. - № 5. - С. 517-529.
12. Лимфоциты : Методы ; пер. с англ. / Под ред. Дж. Клауса. - М. : Мир, 1990. - 395 с.
Summary
REACTION'S OF LYMPHOCYTES' BLAST TRANSFORMATION PECULIARITIES OF DONORS' BLOOD STIMULATED BY PLANT LECTINS AND ANNELIDS' ANTIGENS
A.K. Frolov, R.A. Litvinenko, V.V. Kopeika, E.R. Fedotov
Key words: reaction's of lymphocytes' blast transformation, hirudotherapy, medicinal leech, antigens, lectins
A wide range of hirudotherapy's therapeutic effects mainly driven by its immunotropic mechanism, but its specific mechanisms are poorly understood, and data on the effect on the immunity of antigenic differences of the three subspecies of the medicinal leech (pharmacy, Ukrainian, eastern) are completely absent in the available literature, so the study of this problem has been the goal of our research. A total of 23 women of reproductive age have been examined, all intact for contact with biologically active substances of the medical leech. Lymphocytes were isolated by density gradient from donors' venous blood, which set out the cell culture with the addition of plant lectins (PGA, ConA) and antigens of the salt extract from the three subspecies of the medical leech (pharmaceutical, Ukrainian, eastern), as well as the California red worm, as a general representative of a class of annelid worms. Data in the PGA and ConA-stimulated cell cultures were equal to their physiological values of the potential proliferative activity of lymphocytes, indicating conditionity of lymphocytes' culture conditions. RBTL levels in cultures stimulated with of the medical leech's antigens, exceeded the spontaneous level by 2-4 times, with a maximum in cultures with antigens of the eastern species. In cultures with antigens of red Californian worm RBTL spontaneous levels exceed 9 times, approaching that of, for polyclonal activation of plant lectins. The productive stages of immunogenesis were mainly observed in spontaneous and lectin-stimulated cultures, whereas in cultures stimulated with antigens of the medicinal leech frequent apoptotic response was observed, and in cultures with antigens of red Californian worm - necrosis occurred in addition to apoptosis. Increased values of RBTL in cultures stimulated with annelids' antigens, probably occurred due to the presence of heterophile patterns in their biopolymers.
State Higher Education Institution "Zaporizhzhya National University," Ministry of Education and Science, Youth and Sports of Ukraine, Zaporizhzhya
Mamepiaл надшшов до редакцн 03.09.2012р.
Назаренко Г. И. Клиническая оценка результатов лабораторных исследований / Г. И. Назаренко, А. А. Киш-кун. - М. : Медицина, 2000. - 544 с. Споаб отримання антипрокоагулянтного препарату з медичних п'явок. Патентотримач: Медична науково-упроваджувальна колективна фiрма «Бюкон». Автори: Ыконов Г. I., Ттова О. О., Селезньов К. Г. (RU) Номер патента: 20240 А. 1ндекси МПК: 6 А61 К35/62. Дата по-дання заявки: 06.09.94. Дата вступу в силу патента: 15.07.97.
Хаитов Р. М. Роль паттернраспознающих рецепторов во врождённом и адаптивном иммунитете / Р. М. Хаитов, М. В. Пащенков, Б. В. Пинегин // Иммунология. -2009. - № 1. - С. 66-76.
Lemaire B. The dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults / B. Lemaire, E. Nicolas, L. Michaut, et al. - Cell. - 1996. - Vol. 86. - Р. 973-983. Medzhitov R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response / R. Medzhitov. -Nature. - 2007. - Vol. 449. - Р. 819-826.
