CC BY
82
Медицинская Иммунология 2004, Т. 6, № 6, стр 507-514 © 2004, СПб РО РААКИ
Оригинальные статьи
ВЛИЯНИЕ ИММУНОМОДУЛИНА (ПЕПТИДОВ ИЗ ФЕТАЛЬНОГО ТИМУСА)
НА ПРОЛИФЕРАТИВНЫЙ ОТВЕТ Т- ЛИМФОЦИТОВ И ЦИТОТОКСИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ НАТУРАЛЬНЫХ КИЛЛЕРОВ
в системе т тю
Ризопулу А.П., Гариб Ф.Ю., Кахаров Б.А.
Научно-методический Центр М3 РФ по молекулярной медицине СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова, Россия
Резюме. Работа посвящена изучению влияния иммуномодулина - препарата, полученного из фетального тимуса овец, на спонтанную, ФГА- и Кон А-индуцированную бластную трансформацию Т-лимфоци-тов (РБТЛ) у 25 больных хламидиозом, а также на цитотоксическую активность натуральных киллеров у 10 больных туберкулезом, раком толстой кишки и 10 здоровых доноров в системе in vitro.
Результаты показали, что иммуномодулин оказывает умеренное регулирующее влияние на спонтанную бластную трансформацию лимфоцитов в системе in vitro', при исходно низких значениях спонтанной РБТЛ пролиферативный ответ усиливается, а при повышенных - снижается.
Выявлен костимулирующий эффект иммуномодулина в реакции ФГА-индуцированной бластной трансформации Т-лимфоцитов, зависимый от контрольных значений пролиферативного ответа. Отмечена также нормализация изученных показателей: под влиянием препарата: при исходно низких значениях пролиферация возрастает, а при повышенных - снижается.
Не отмечено достоверного влияния иммуномодулина на Кон А -индуцированную бластную трансформацию Т-лимфоцитов.
Обнаружено достоверное усиление мембранотоксической функции естественных клеток-киллеров по отношению к клеткам-мишеням К-562 под влиянием иммуномодулина после предварительной инкубации препарата только с эффекторными клетками. При совместной инкубации иммуномодулина одновременно с эффекторами и клетками-мишенями К-562 мембранотоксическая активность естественных клеток-киллеров не проявляется, что, возможно, связано с ускорением размножения мишеневых клеток.
Ключевые слова: иммуномодулин, цитотоксические лимфоциты, пролиферация Т-лимфоцитов, иммунокоррекция.
Rizopulu A., Garib F., Kakharov В.
INFLUENCING THE IMMUNOMODULINE (THE PEPTIDES FROM FETAL THYMUS)
ON THE PROLIFERATIVE ANSWER OF THE T- LYMPHOCYTES
AND CYTOTOXIC ACTIVITY OF THE NATURAL KILLERS IN THE SYSTEM IN VITRO
Abstract. The article is dedicated to analysis of influencing the immunomoduline, obtained from sheep’s fetal thymus, on cytotoxic activity natural killers for 20 patients with tuberculosis and colon’s cancer, and 10 healthy
------------------------------------------------ donors and on spontaneous, FHA and ConA-induced
Адрес для переписки: blasttransformation (BTL) of T-lymphocytes for 25
Ризопулу Анна Панаётовна - ученый секретарь patjents with chiamidiosis in the system in vitro.
НМЦ no молекулярной медицине М3 РФ СПбГМУ The results have shown> that immunomoduline
им. акад. И.П. Павлова renders moderate adjusting influencing on spontaneous
rji . 09// ПЛ ^ \
iел.. (pao.j. blasttransformation of the lymphocytes in the system
Факс (812)238-71-94. jn vjtro: uncJer the original low values spontaneous BTL
E-mail: annanzopulu@inbox.ru или proliferative answer is boosted, and under heightened, -
ganbfimz@inbox.ru is decreased.
It is detected costimulated effect of the immunomoduline in reacting PHA-induced blasttransformation of T-lymphocytes dependent on original values of the proliferative answer, that promotes of the normalization of the studied indexs. Under original low values the proliferation increases, and under heightened ones - is slashed.
It is not noted of authentic influencing the immunomoduline on Con- A induced blasttransformation of T-lymphocytes.
It was detected reliable intension of membranotoxic function of natural killer to cells-targets to K-562 under influencing the immunomoduline after preliminary incubation of a drug only with effectors cells. In combined incubation of immunomoduline is simultaneous with effector cells and cells-targets to K- 562 membranotoxic activity of natural killers doesn’t vary. (Med.Immunol., 2004, vol.6, № 6, pp 507-514)
Введение
Иммунокоррекция имеет важное значение в проведении патогенетической терапии, поскольку накоплено много фактов, свидетельствующих о роли иммунных механизмов в развитии патологии. Препараты тимуса нашли широкое применение в клинической практике. Так, экстракты тимуса используют при лечении раковых, аутоиммунных заболеваний, многих хронических инфекционных процессов, в гериатрии и др. [1, 2, 3, 9, 15, 19, 20]. Важнейшим механизмом действия тимических пептидов является усиление функциональной активности Т-лимфоцитов, однако многоэтапный процесс развития иммунной реакции включает активацию не только клеточных, но и гуморальных факторов иммунитета, способствуя усилению продукции специфических антител, цито-кинов, факторов воспаления и др. [7,16, 22].
В кооперативные межклеточные взаимодействия вовлекаются и факторы неспецифической защиты [8, 25]. Естественный иммунитет человека в значительной мере определяется естественными (натуральными) клетками-киллерами (ЕК). Решающая защитная роль на ранних этапах вирусной инфекционной агрессии, когда еще не сформировались механизмы адоптивного иммунитета, принадлежит ЕК [26]. В их отсутствие начальные этапы инфекционного процесса протекают очень тяжело. В то же время, различные патологические состояния (ВИЧ- инфекция, онкологические заболевания, аутоиммунные расстройства и др.) могут значительно влиять на функциональную активность лимфоцитов [15, 22]. Ослабление иммунореактивности Т-лимфоцитов и естественных клеток-киллеров in vivo приводит к снижению ответа на антигенные воздействия и негативно отражается на их способности активироваться в системе in vitro.
Среди известных тимусных пептидов определенный интерес представляет препарат, полученный из фетальных овечьих тимусов. Было установлено, что он состоит из 15 пептидов с м.м. до 6 кДа. Показано его иммунокорригирующее действие в экспериментах и клинических наблюдениях, в связи с чем он получил название «Иммуномодулин». Он серийно выпускается в Ташкентском НИИ вакцин и сывороток и ЧНПП «Иммуномед» (Ташкент) и разрешен к медицинскому применению в Узбекистане и Казахстане [2].
Цель работы - изучить влияние иммуномодули-на фетального происхождения на функциональную активность Т- лимфоцитов и естественных клеток-киллеров человека в системе in vitro.
Материалы и методы
Определение влияния иммуномодулина на пролиферативный ответ Т-лимфоцитов
Материалом для исследования бластогенеза лимфоцитов служили мононуклеары периферической крови 25 больных хламидиозом в возрасте 18-45 лет.
В качестве активатора РБТЛ использовали фи-тогемагглютинин (ФГА) («Sigma») и конканавалин A (Con A) (Pharmacia) в субоптимальных концентрациях (по 10 мкг/мл).
В опытные образцы к лимфоцитам (1 млн/мл) добавляли иммуномодулин в конечной концентрации 0,05 мкг/мл. Планшет инкубировали при 37°С -1 ч, после чего вносили в лунки соответствующий митоген. В контрольные образцы лимфоцитов добавляли только митоген. При изучении спонтанной бла-сттрансформации лимфоцитов митоген не использовали.
Через 48 часов в образцы вносили 3Н -тимидин в концентрации 1 мкКюри/мл. Результаты реакции учитывали через 72 часа после начала культивирования.
Для количественной оценки влияния иммуномодулина на пролиферативный ответ Т - лимфоцитов использовали индекс воздействия (ИВ), который рассчитывали по формуле:
нв = ~-Ик*100%, те
Ик
Ио - число импульсов в минуту (имп./мин) в опыте;
Ик - число имп./мин в контроле.
Определение влияния иммуномодулина на цитотоксическую активность естественных клеток-киллеров
Материалом для исследования цитотоксической активности служили мононуклеары периферической крови 30 человек, в том числе 10 - здоровых до-
норов, 10 - больных туберкулезом, 10- больных раком толстой кишки IV ст.
Концентрацию выделенных из периферической крови лимфоцитов доводили до 1 млн/мл. Мембранотоксическую активность естественных клеток-киллеров определяли по способности эффек-торных клеток повреждать клетки-мишени, меченые 3Н -уридином (Б.Б.Фукс, 1982).
а) подготовка клеток-мишеней К-562
В качестве мишеней использовали клетки ми-елолейкозной линии человека К-562 (5 млн/мл), меченые 3Н-уридином: I мкКюри/ мл и инкубировали при 37°С в водяной бане 1,5 ч. После чего клетки трижды отмывали большим объемом среды 199 с 20% фетальной телячьей сывороткой. Для предотвращения клетками-эффекторами реутилизации продуктов гидролиза ДНК, включившими радиоактивную метку, клетки-мишени инкубировали 2 ч в питательной среде (состав: ИРМ1-1640 с 10% эмбриональной телячьей сывороткой, 2 мМ Ь-глютамина и 40 мкг/мл гентами-цина) при 37°С и вновь отмывали однократно в большом объеме среды 199 с 20% фетальной телячьей сывороткой.
б) план эксперимента
Влияние иммуномодулина на цитотоксическую активность ЕК изучали, используя два варианта инкубации.
В первом варианте после раскапывания эффек-торных клеток и клеток-мишеней в планшеты вносили иммуномодулин (0,05 мкг/мл, опыт), в контрольные пробы препарат не вносили.
Во втором варианте эксперимента с иммуномо-дулином инкубировали только эффекторные клетки (опыт). В качестве контрольных использовали образцы клеток, которые инкубировали только в питательной среде (контроль 1) или эффекторные клетки инкубировали с 1Ь-2 (контроль 2). Затем лимфоциты отмывали 10 мин при 1000 об/мин. Доводили их концентрацию до 500 тыс. в 100 мкл питательной среды. После чего в 96-луночные круглодонные планшеты (]Чипк) вносили эффекторные лимфоциты и клетки-мишени, меченные 3Н-уридином в соотношении 50:1. Планшеты инкубировали 4 ч в СО,-инкубаторе (5%), предварительно осадив клетки центрифугированием в течение 2 мин при 1000 об/мин.
По окончании инкубации исследуемые образцы переносили на стекловолоконные фильтры с помощью харвестера. Фильтры высушивали, помещали в сцинтиляционную жидкость и проводили учет реакции по включению радиоактивной метки с помощью Р-счетчика (“ЬКВ”).
Показатель активности ЕК выражали индексом цитотоксичности (ИЦ), который определяли по формуле:
(среднее значение в опыте (имп./мин) \
1-------------------------------1x100%
. среднее значение в контроле (имп./мин)/
Статистическую обработку результатов проводили с использованием стандартных методов вариационной статистики с вычислением средней арифметической (М), ее ошибки (ш) и критерия Стъюден-та (t).
Результаты
Было установлено, что среднее значение спонтанной РБТЛ у больных хламидиозом в контрольной группе (без инкубации с митогеном и иммуномоду-лином) составляло 280±14 имп./мин с размахом индивидуальных колебаний от 153 до 404 имп/мин (табл.1). В присутствии иммуномодулина (опыт) показатели спонтанного бластогенеза достоверно увеличились в среднем по группе до 351±26 имп./ мин с размахом индивидуальных колебаний от 207 до 673 имп./мин. Индекс воздействия препарата на спонтанную РБТЛ составил +25,3% (Р<0,05). Следовательно, иммуномодулин в среднем на всю группу оказывал умеренное стимулирующее влияние на спонтанную бластную трансформацию лимфоцитов больных хламидиозом в системе in vitro.
Детальный анализ влияния иммуномодулина на индивидуальные показатели обнаруживает его разнонаправленное действие в изучаемой системе. Так, из общего числа обследованных, повышение спонтанной РБТЛ наблюдалось у 60%, понижение - у 36%, у одного больного (4%) изменений не отмечено. Учитывая, что по данным наших клинических исследований, иммуномодулин проявляет себя как иммунокорригирующий препарат, представлялось интересным оценить его воздействие на изучаемую систему в зависимости от исходных ее показателей (т.е. без инкубации с препаратом). Для этого полученные значения спонтанной бластной трансформации в контроле были разделены в зависимости от исходных параметров на две подгруппы: А) с показателями спонтанной РБТЛ ниже средней арифметической (<280 имп./мин) и Б) с показателями спонтанной РБТЛ выше средней арифметической (>280 имп./мин). Анализ средних показателей по группе А составил 210±12 имп./мин с колебаниями индивидуальных значений от 153 до 298 имп./мин. Инкубация с иммуномодулином обнаружила достоверное усиление спонтанного бластогенеза до 363±30 имп./мин с колебаниями индивидуальных значений в этой группе от 312 до 673 имп./мин. Индекс воздействия составил +72,8% (Р<0,001). В то же время, в группе Б исходные значения в среднем по группе
составляли 387±27 имп./мин с размахом индивидуальных колебаний от 202 до 648 имп./мин. Индекс воздействия иммуномодулина на спонтанную блас-тную трансформацию был минус 12,4%. Различия недостоверны (Р>0,05).
Таким образом, использованный подход позволил установить, что иммуномодулин влияет на спонтанную бласттрансформацию лимфоцитов избирательно, в зависимости от индивидуальных исходных значений спонтанного бластогенеза: под влиянием иммуномодулина низкие значения повышаются, а высокие остаются без изменения. Причем, практически во всех образцах отмечена нормализация показателей спонтанной РБТЛ, что свидетельствует об иммунокорригирущем воздействии иммуномодулина на спонтанную бластную трансформацию лимфоцитов больных хламидиозом. Как известно, спонтанная РБТЛ обусловлена эндогенной стимуляцией Т-лимфоцитов бактериальными антигенами. Относительно слабый лимфобластный ответ иммуномодулин усиливает до оптимального.
Оценка результатов пролиферативного ответа на Т-митогены отражает поликлональную активацию иммунных функций и свидетельствует о том, что регулирующие клетки в организме могут давать адекватный ответ на соответствующий стимул [12].
Функциональную активность Т-лимфоцитов мы изучали также по их способности к вступлению в митотический цикл под влиянием ФГА. Установле-
но, что под влиянием лектина бластная трансформация лимфоцитов в целом на группу составляет (51,4±3,3) х 103 имп./мин с индивидуальными колебаниями показателей от 41 до 74 тыс. имп./мин (табл.2).
В опытной группе среднее значение этого показателя достоверно не отличалось от контроля и составило (57,0±2,4) х 103 имп./мин с индивидуальными значениями от 42 до 77 тыс. имп./мин. Индекс воздействия иммуномодулина в среднем на группу составил +11%.
Как и в предыдущем случае, мы провели анализ влияния иммуномодулина на РБТЛ-ФГА с учетом исходных индивидуальных показателей. Для этого полученные значения РБТЛ в контроле были разбиты на 2 группы по способности Т-лимфоцитов трансформироваться в бластные формы под воздействием ФГА: ниже 50 х 103 имп./мин-группа А и выше 50 х 103 имп./мин -группа Б. Анализ средних значений в группе А показал, что РБТЛ с ФГА составила (39,7±2,0) х 103 имп./мин. Этот показатель достоверно увеличился при сокультивировании с иммуномодулином в среднем до (50,7+3,3) х 103 тыс.имп./мин. Индекс воздействия составлял +27,7% (Р<0,05). В то же время в группе Б исходные показатели ФГА-индуцированной бласттранс-формации в среднем составляли (65,0±3,0) х 103 имп/ мин и практически не изменялись при добавлении в культуру иммуномодулина. Важно подчеркнуть, что
Табл.1. ВЛИЯНИЕ ИММУНОМОДУЛИНА НА СПОНТАННУЮ БЛАСТНУЮ ТРАНСФОРМАЦИЮ Т-ЛИМФОЦИТОВ БОЛЬНЫХ В СИСТЕМЕ IN VITRO (имп./мин)
Группа Число наблюдений Контроль Опыт (+иммуно-модулин) Индекс воздействия
1. В целом на группу 25 280±14 351±26 * +25,3%*
2. С исходно низкими значениями (<280) (Г руппа А) 13 210±12 363130 * +72,8% *
З.С исходно повышенными значениями (> 280) (Группа Б) 12 387±27 379122 -12,4%
Примечание: * - достоверные различия с группой контроля.
Табл.2. ВЛИЯНИЕ ИММУНОМОДУЛИНА В СИСТЕМЕ IN VITRO НА БЛАСТНУЮ ТРАНСФОРМАЦИЮ Т-ЛИМФОЦИТОВ, ИНДУЦИРОВАННУЮ ФГА (X 103 имп./мин)
Группа Число наблюдений Контроль Опыт (+иммуно-модулин) Индекс воздействия
1. В целом на группу 13 51,413,3 57,012,4 +11%
2. С исходно относительно низкими значениями (<51) Группа А 7 39,712,0 50,713,3* +27,7%*
З.С исходно относительно повышенными значениями (> 51) Группа Б 6 65,013,0 64,512,0 0%
Примечание: * - достоверные различия с группой контроля (Р<0,05).
иммуномодулин нормализовал пролиферативный ответ лимфоцитов, причем индивидуальные значения РБТЛ с ФГА при сокультивировании с препаратом не превышали нормативных показателей.
Следовательно, иммуномодулин оказал достоверное стимулирующее влияние на ФГА - индуцированную бластную трансформацию Т-лимфоцитов в зависимости от исходной чувствительности к ФГА: у лиц с исходно сниженными показателями выявлено стимулирующее влияние, а у лиц с исходно нормальным ответом на ФГА - воздействия не отмечено. Таким образом, отмечен костимулирую-щий эффект иммуномодулина на ФГА-индуциро-ванный исходно сниженный пролиферативный ответ лимфоцитов.
Анализ влияния иммуномодулина на бластную трансформацию лимфоцитов, индуцированную Соп А (5 мкг/мл) показал, что в среднем на группу изменения пролиферативного ответа в опытной группе, в сравнении с контрольной, не отмечено. Так, бласт-ная трансформация лимфоцитов под влиянием иммуномодулина, составила (15,5±1,3) х 103 имп./мин с индивидуальными значениями от 6 до 28 тыс. имп./ мин. Аналогичный показатель (15,8± 1,3) х 103 имп./ мин был в группе контроля с размахом индивидуальных колебаний от 6 до 42 тыс.имп./мин.
Полученные результаты, с учетом исходных значений по группе контроля, показали заметную разницу показателей РБТЛ с Соп А. Так, усредненные показатели исходно низких значений (группы А) составили (9,4±1,1) х 103 имп./мин, в результате со-культивирования с иммуномодулином среднее зна-
чение РБТЛ недостоверно возросло до 11,2±1,8тыс. имп./мин; индекс воздействия препарата на бластогенез, индуцированный Соп А был +19%. В группе с исходно относительно повышенными показателями иммуномодулин практически не повлиял на выраженность реакции.
Следовательно, анализ с учетом результатов индивидуальных значений показал, что при исходно низких показателях (подгруппа А) пролиферативный ответ несколько усиливается под влиянием иммуномодулина, при повышенных - снижается (подгруппа Б). Мы полагаем, что отсутствие выраженного достоверного влияния иммуномодулина на СопА-индуцированный лимфобластный ответ связано со стимуляцией иммуномодулином, в комплексе с митогеном, Т-лимфоцитов с супрессорными функциями, либо продукцией 1Ь-4, которые тормозят пролиферацию «отвечающих» Т-лимфоцитов.
Другой задачей нашей работы было исследование влияния иммуномодулина на цитотоксическую активность ЕК.
В первом варианте эксперимента препарат добавляли непосредственно в систему эффектор-мишень, а во втором - только к эффекторам.
Результаты показали, что предварительное культивирование иммуномодулина с комплексом эффек-торных клеток и клеток-мишеней К-562 достоверной разницы в цитотоксической активности ЕК между группой опыта (культивирование с иммуномодулином) и контроля (без препарата) не обнаруживает. Причем, эти результаты с высокой долей вероятности воспроизводятся в опыте независимо от
Рак
Туберкулез
Здоровые
О 10 20 30 40 50 60 70
□ Контроль ИИммуномодулин РіІ_-2
Рис. Стимуляция цитотоксической активности натуральных киллеров под влиянием иммуномодулина (%)
того, лимфоциты больных или здоровых были использованы в эксперименте.
Так, у здоровых людей мембранотоксическая активность ЕК составляла 52,0±2,1% в контроле и 51,8±1,9% в опыте (Р>0,05).
У больных туберкулезом отмечена сниженная естественная клеточная цитотоксичность, которая составляет 41,7±0,7% в контроле против 41,5±0,8% в опыте при инкубации с иммуномодулином (Р>0,05).
В 2 раза ниже значений здоровых доноров мембранотоксическая активность ЕК обнаружена у больных раком толстой кишки IV ст. Инкубация с иммуномодулином не повлияла на эффекторную активность ЕК и составила в опыте 23,4±0,8% против 24,2±0,9% в контроле (Р>0,05).
Во втором варианте опыта с предварительной обработкой препаратом только мононуклеаров, были получены противоположные результаты. Так, инкубация эффекторных клеток с иммуномодулином (без клеток-мишеней) показала достоверную стимуляцию мембранотоксической активности натуральных киллеров во всех изученных группах (рис.). В этой группе экспериментов было использовано два контроля: предварительная параллельная инкубация эффекторных клеток только в питательной среде и инкубация эффекторных клеток с IL-2 .
Так, у здоровых доноров индекс цитотоксичности ЕК составлял 51,2±1,9%; инкубация с IL-2 повышает эти значения до 65,7±1,6%; преинкубация с иммуномодулином активирует их до 58,3± 1,7%. Разница значений опыта с контролями была достоверной (Р< 0,05).
У больных туберкулезом в контроле мембранотоксическая активность ЕК составляла 41,5±0,8%, под влиянием преинкубации in vitro с IL-2 она повышается до 53,3± 1,1 %, преинкубация с иммуномодулином способствует возрастанию индекса цитотоксичности ЕК до 48,1±0,9% (Р<0,05 по отношению к контролю).
В эксперименте, проведенном на лимфоцитах больных раком толстого кишечника IV ст., обнаружено глубокое снижение мембранотоксической активности ЕК, которое составляло 23,8±1,5%. Предварительная инкубация эффекторных клеток с IL-2 способствует повышению активности ЕК до 34,3±1,3%, при культивировании с иммуномодулином эти значения составляют 29,3±1,5% (Р<0,05, Р<0,05 по отношению к контролям).
Обсужение
Лимфобластогенез уже десятки лет привлекает внимание исследователей в связи с его ключевой ролью в процессе иммуногенеза и отражает основные этапы взаимодействия антигена (митогена) с клеточными рецепторами: трансдукцию сигнала, дерепрессию соответствующих генов, пролифератив-
ный ответ, клеточную дифференцировку, продукцию цитокинов. Другими словами, лимфобластный ответ под влиянием митогена позволяет моделировать реакцию лимфоцитов на антиген с ее количественной оценкой высокоточным способом - по включению меченого тимидина во вновь синтезированную ДНК [15]. В зависимости от задачи исследования, в экспериментах используют разные митогены в определенных дозах [14]. В нашей работе было изучено влияние ФГА в субоптимальныной дозе с целью регистрации костимулирующего действия препарата. В отличие от других исследователей, изучавших влияние тимических пептидов, полученных от телят [1,
9, 20, 23], мы впервые имели возможность оценить действие фетальных пептидов из тимуса овечьих плодов.
Способность препаратов, полученных из эмбриональных тканей, оказывать положительные эффекты на функционирование, пролиферацию и дифференцировку культивируемых клеток интенсивно изучается в настоящее время, что связано с возможностью практического использования препаратов из эмбриональных тканей, обладающих положительным влиянием. Известно, что в фетальных тканях содержится большое количество биологических активных веществ белковой и пептидной природы - в частности трофические факторы, повышающие выживаемость клеток, сопротивляемость неблагоприятным факторам внешней и внутренней среды и стимулирующие регенерацию поврежденных тканей [6, 16]. В частности, serum anti-apoptosis factor встречается только в эмбриональных тканях, что, возможно и определяет оптимальное соотношение интенсивности генетически программируемой клеточной гибели и уровня пролиферации клеток [3, 6]. Принципиальной особенностью действия фетальных тимусных пептидов является зависимость выраженности и направленности их эффектов от исходного состояния регулируемых клеток, что способствует нормализации выведенных из равновесия процессов [2,17]. В частности, как показало наше исследование, им-муномодулин не обладает митогенной активностью, но проявляет ее только при одновременной стимуляции ФГА или эндогенными митогенами (при спонтанной бласттрансформации). Это свидетельствует в пользу костимулирующего действия имму-номодулина на лимфобластный ответ. Костимули-рующее влияние тимического пептида на бластогенез, очевидно, реализуется через специфический рецептор к пептидам тимуса, обнаруженный на лимфоцитах [24]. По-видимому, одновременная активизация рецепторов к ФГА и к тимусному пептиду является усиленным стимулом для процесса пролиферации лимфоцитов.
По данным литературы, каждый из пептидов, входящих в состав тимозина активен на определенном этапе дифференцировки, начиная от стволовых эле-
ментов костного мозга и заканчивая эффекторами клеточного иммунитета. Тимозины-(33 и -(34 индуцируют генерацию предшественников Т-лимфоци-тов; тимозин-а1 вызывает превращение пре-Т-кле-ток в тимоциты, а тимозины-а5 и а 7 оказывают влияние на дифференцировку и функциональную активность клеток-предшественников [20, 23]. Понятно, что, работая со смесью фетальных пептидов, не представляется возможным выявить конкретный пептид или его фрагменты, ответственные за определенные функции. В другом нашем исследовании, когда удалось прочитать структуру одного из активных фетальных тимусных пептидов (6 фракция) и синтезировать фрагмент из 3-х аминокислот, было продемонстрировано его костимулирующее действие в модели индукции интерфероногенеза [4]. Так, сочетанное введение классического индуктора Циклоферона [5] с синтетическим фрагментом фетального тимусного пептида (Саногена) способствовало усилению продукцию интерферона и пролонгации его циркуляции в кровотоке. В то же время синтетический фрагмент иммуномодулина, введенный отдельно, обладал слабой интерферониндуци-рующей активностью.
Другой эффект, отмеченный нами, как иммунокорригирующий, проявился в том, что лимфоциты доноров с нормальным ответом на ФГА, не реагировали на дополнительный стимул от тимусного пептида. В то же время, лимфоциты доноров со слабым ответом на ФГА, хорошо стимулировались пептидом и нормализовали лимфобластный ответ. В тех же условиях не отмечено влияния тимусных пептидов на бластогенез, индуцированный Кон-А, что, возможно, связано с достаточно выраженной активизацией супрессорных механизмов под влиянием ми-тогена.
Таким образом, фетальные пептиды тимуса регулируют и контролируют пролиферацию Т-лимфо-цитов и содействуют нормализации выведенных из равновесия процессов бластогенеза.
Нужно признать, что при изучении биологической целесообразности конкретного пептидного регулятора возникли проблемы из-за плейотропности его действия, т.е. его способности взаимодействовать с разными по структуре рецепторами, локализованными на многих клеточных популяциях и вызывать целый спектр разнообразных биологических эффектов. Полагают, что это зависит не столько от его первичной структуры, сколько от стереохимического строения и объемного рисунка распределения электрических зарядов, что позволяет пептиду вступать в реакции с рецепторами различных конфигурации [9,21].
Результаты наших исследований по исследованию активности натуральных киллеров показали, что в случае предварительной совместной инкубации иммуномодулина с эффекторными клетками и
клетками-мишенями К-562 препарат не обнаруживал достоверного воздействия на мембранотоксическую активность ЕК. Возможно, иммуномодулин одновременно стимулирует пролиферацию клеток-мишеней и активность естественных киллеров, проявление активности которых в результате совместного культивирования нивелируется. Это предположение косвенно подтверждают результаты второго эксперимента, когда иммуномодулин усиливал мембранотоксическую функцию ЕК после предварительной инкубации только с эффекторными клетками. Причем, достоверное повышение естественной киллерной цитотоксичности под влиянием инкубации in vitro эффекторных лимфоцитов с иммуномо-дулином отмечено во всех изученных группах и было сравнимо с воздействием IL-2, использованного в качестве положительного контроля.
Ранее нами было показано, что под влиянием иммуномодулина значительно усиливается интер-фероногенез в культуре лимфоцитов [11]. Возможно, влияние иммуномодулина на ЕК может быть обусловлено также активацией Т-лимфоцитов через специфические рецепторы, что, в свою очередь, приводит к повышению продукции IFN-y, IL-2, IL-12, IL-15 и др. цитокинов с одновременным появлением рецепторов к ним на других субпопуляциях лимфоцитов [7, 8, 18]. Следствием этих влияний явилось усиление мембранотоксической активности естественных клеток-киллеров, поскольку IL-2 непосредственно, без взаимодействия с рецептором CD25 запускает натуральные киллеры на цитолитическую реакцию [12, 13]. Несмотря на то, что ЕК не экспрессируют CD-25-а-цепи высокоаффинного рецептора для IL-2, клетки реагируют на него пролиферацией и повышением цитолитической активности [25, 26].
Ранее в эксперименте нами было показано рецеп-торопосредованное действие иммуномодулина на увеличение концентрации Са2+втимоцитах, которое сопровождалось переспределением ионов Са2+ между эндоплазматическим ретикулумом и митохондриями с усилением процесса биологического окисления и повышением энергетики клеток [10].
Следовательно, нами установлено, что фетальные тимусные пептиды обладают регулирующим влиянием на пролиферативную активность Т-лимфоцитов посредством взаимодействия их клеточных рецеторов с митогеном и тимусными пептидами, приводящее, в конечном итоге, к каскадному синтезу цитокинов, что, в свою очередь модулирует пролиферацию Т-клеток и цитотоксическую активность натуральных киллеров.
Список литературы
1. Арион В.Я. Иммунологически активные факторы тимуса // Итоги науки и техники. Серия Им-мунология,- М.- 1991.- №9.- С.10-50.
2. Гариб Ф.Ю., Гариб В.Ф. Иммуномодулин. Ташкент, Из-во мед.литературы им. Абу Али ибн Сино.
2000, 240 с.
3. Денеш Л., Хайош, Зпорни Л., Штауб М. Изучение действия фрагментов тимопоэтина на старых мышей// Иммунология,- 1989. - №3. - с.58-61.
4. Ершов Ф.И., Парфенов В.В. Методические указания по изучению специфической активности ин-терферонов и индукторов интерферона. В кн.:Руко-водство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М.: Ремедиум . - 2000, С. 281-286.
5. Ершов Ф.И., Тазулахова Э.Б. Индукторы интерферона - новое поколение иммуномодуляторов/ /Terra Medica.-1998.-2.-c. 2-7.
6. Зозуля А., Клошник Т., Корнеева Р. Клеточная терапия в косметологии: белково-пептидные комплексы фетальных тканей как действующее звено antiage therapy в косметических средствах // Косметика и медицина.- 2001,- №4(23).- С.32-39.
7. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., Воробьев А.А. Эндогенные иммуномодуляторы.- СПБ: Гиппократ, 1992.
8. А.П.Лыков, В.А.Козлов Натуральные киллеры и гемопоэз // Иммунология,- 2001.- №1,- С.10-14.
9. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., Малинин В.В. Пептидные тимомиметики.- СПб.- Наука,- 2000.- 158 с.
10. Ризопулу А.П. Научное обоснование опосредованной иммунокоррекции в постнатальном онтогенезе у млекопитающих.- Автореф. дис. доктора биол.наук,- Ташкент.- 2002,- 41 с.
11. Сайиткулов А.М., Гариб Ф.Ю. Иммуномодулин - индуктор интерфероногенеза.// Проблемы иммунопатологии детского возраста: Мат.Респ.науч-н.конф. - Ташкент,- 1998,- с.101-104.
12. Симбирцев А.С. Интерлейкин-1: от эксперимента в клинику // Медицинская иммунология,
2001,- Т.З, №3, С.431-438.
13. Чекнев С.Б. Фенотипическая и функциональная гетерогенность циркулирующего пула естественных киллеров// Иммунология,-1999,- №4,- С.24-33.
14. Хаитов P.M., Гущин И.С., Пинегин Б.В., Зеб-рев А.И. Методические указания по изучению им-
мунотропной активности фармакологических веществ в кн. «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологи-ческх веществ. Москва.-2000.-с.257-263.
15. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Основные представления об иммунотропных лекарственных средствах// Иммунология.- 1996. - №6. - с.4-9.
16. Ярилин А.А., Беляков И.М. Тимус как орган эндокринной системы// Иммунология 1996. - №1. -с.4-10.
17. Bernabei Р, Allione A, Rigamonti L. Regulation of interferon-gammareceptor (IFN-GammaR) chains: a peculiar way to rule the life and death of human lymphocytes. Eur. Cytokine Netw.- 2001,- 12:6-14.
18. Durantel D, Carrouee-Durantel S, Branza-Nich-ita N, Dwek RA, Zitzmann N. Expression of IFN-gam-ma and its receptor alpha in the peripheral blood of patients with chronic hepatitis C. Chin Med J (Engl). 2004 Jan; 117(1): 79-82.
19. Hadden J.W Immunostimulation// Immunology Today.- 1993,- Vol.l4.-P.275-280.
20. Goldstein A.L. Clinical potential and application of thymosin peptides. International Journal on Immu-norehabilitation 5 : 9, 1997.
21. Karelin A.A., Blishchenko E.Yu., Ivanov V.T. A novel system of peptidergic regulation// FEBS Lett. 1998.Vol/-428.N l-2.p. 7-12.
22. Kuby J. Immunology. Freeman a. Company, New York, 1997, 664 p.
23. Low T.L.K., Goldstein A.L. Thymosin fraction 5 and 5А// Methods in enzymology/ Ed.S.P.Golowick, N.O. Kaplan/Acad Press.- 1985. -V.116.- P.219-233.
24. Rinaldi G. C., RosariaT.M., Jezzi T. Receptors for thymosin alfa-1 on mouse thymocytes// Cell. Immunol. 1985.Vol. 91.P.289-293.
25. Powrie F., R. L. Coffman. Cytokine regulation of T - cell function : potentional for therapeutik intervention. Immunol. Today 1993, 14 :270.
26. Zhang P., Chen Z., Chen F., Li MW, Fan J, Zhou H.M., Liu J.H., Huang Z. Expression of IFN-gamma and its receptor alpha in the peripheral blood of patients with chronic hepatitis C. Chin Med J 2004; 117(1 ):79-82.
поступила в редакцию 20.11.2003 принята к печати 22.01.2004
