CC BY
534
ИММУНОЛОГИЯ № 2, 2013
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 612.112.94.063:615.275.4].08
А.М. Савилова1, М.М. Чулкина2, Л.П. Алексеев1
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ мРНК ИНТЕРЛЕйКИНА-2 И РЕЦЕПТОРА ИнтЕРЛЕйКИнА-2а В ЛИМфОцИтАх, АКтИВИРОВАннЫх фгА И КонА
1ФГБУ ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России, г. Москва (115478, Каширское ш., д. 24, корп. 2); 2ЗАО НПФ ДНК-Технология, г Москва
Классическим методом оценки функционального состояния лимфоцитов является реакция бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ), в которой in vitro оценивают степень пролиферации мононуклеарных клеток периферической крови в ответ на стимулы. В качестве контроля в РБТл применяют неспецифические митогены: фи-тогемагглютинин ФгА и конканавалин А (КонА), которые вызывают в основном Т-клеточный ответ. В настоящее время имеются лишь отдельные разрозненные данные о том, как меняется профиль экспрессии ключевых генов, участвующих в реализации ответа лимфоцитов на неспецифические митогены. В нашей работе была поставлена цель получить целостную картину изменения количества мРНК генов интерлейкина (IL)-2 (IL-2) и рецептора IL-2а (IL-2ra) после стимуляции лимфоцитов ФГА и КонА при культивировании клеток в течение длительного времени, поскольку гены IL-2 и IL-2r являются одними из ключевых в ответе мононуклеарных клеток крови на стимуляцию неспецифическими митогенами. Экспрессию мРНК выбранных генов оценивали с помощью метода полимеразной цепной реакции в реальном времени, который отличается высокой чувствительностью и специфичностью и позволяет работать в широком диапазоне концентраций мРНК.
В ходе работы определены основные закономерности изменения содержания мРНК генов IL-2 и IL-2r при стимуляции митогенами. Полученные результаты позволяют сделать вывод о разном механизме действия ФГА и КонА на лимфоциты, а также о том, что возможны существенные индивидуальные отличия в ответе лимфоцитов на стимуляцию. Уровень мРНК гена IL-2 можно использовать в качестве маркера активации лимфоцитов под действием КонА в первые же часы после стимуляции, а под воздействием ФГА максимум содержания мРНКэтого цитокина достигается лишь на 3-4-е сутки культивирования.
К л ю ч е в ы е с л о в а : фитогемагглютинин, конканавалин А, экспрессия мРНК, интерлейкин-2, интерлейкин-2-рецептор, ПЦР в реальном времени
Savilova A.M.1, Chulkina M.M.2, Alexeev L.P.1
COMPARATIVE INVESTIGATION OF INTERLEUKIN-2 AND INTERLEUKIN-2 RECEPTOR ALPHA MRNA EXPRESSION IN LYMPHOCYTES ACTIVATED BY PHA OR CONA
One of the classic methods of lymphocytes functional activity research is blast-transformation reaction (RBTL) were proliferation rate in response to different stimuli in vitro is estimated by introduction of radioactive 3H-thymidine in cell DNA. Nonspecific mytogens phytohemagglutinin (PHA) or concanavalin A (ConA) inducing generally T-cell response are usually used as a control in RBTL. At present there are only descrete and segmentary data about expression patterns of key genes involved in lymphocytes reaction to nonspecific mitogens. The aim of our work was to obtain the integral picture of interleukin-2 (IL-2) and interleukin-2 receptor alpha (IL-2ra) mRNA expression pattern in lymphocytes during long period of cultivation after their stimulation with PHA or ConA as far as IL-2 and IL-2ra are one of the key genes involved in mononuclear cells response to nonspecific mitogen stimulation. mRNA expression of these genes was calculated by realtime PCR method that is highly sensitive and specific and allows to work in wide range of mRNA concentration.
Common patterns of IL-2 and IL-2ra mRNA expression in cells of healthy donors stimulated with T-cells mitogens were identified. The obtained results allow to conclude that mechanisms of action of PHA and ConA on cells are different and that significant individual differences of mRNA kinetics in lymphocytes of distinct donors are possible. IL-2 mRNA level can be used as a marker of lymphocytes activation by ConA in the very first hours of stimulation, but with PHA stimulation the cytokine's mRNA content achieves its maximum only on 3-4 days of cultivation.
K e y w o r d s .• phytogemagglutinin, concanavalin A, mRNA expression, interleukin-2, interleukin-2 receptor, real-time PCR
Введение. Митогены - вещества (как правило, это белки), способные индуцировать митотическое деление лимфоцитов без участия антигенраспознающих рецепторов, т. е. неспецифически. Они запускают пути передачи сигнала с вовлечением в процесс митогенактивируемой киназы и в итоге вызывают переход клеток из фазы G0 в митоз. Мито-гены часто используют в иммунологии для стимуляции лимфоцитов, наиболее широко применяют такие белки, как ФГА и конканавалин А (КонА). ФГА-П получают из семян фасоли (Phaseolus vulgaris), а КонА - из бобов (Canavalia ensiformis). Эти лектины являются поликлональными стимуляторами Т-системы лимфоцитов, стимулируют образование интерлейкина (IL)-2, повышают цитотоксичность клеток.
Алексеев Леонид Петрович (Alekseev Leonid Petrovich), д-р мед. наук, проф., тел. 8(499) 617-78-22
IL-2 является важным провоспалительным цитокином, который стимулирует пролиферацию и дифферен-цировку активированных Т-лимфоцитов в эффекторные Th-лимфоциты или цитотоксические Т-клетки. IL-2 может стимулировать крупные гранулярные лимфоциты, макрофаги и В-клетки. IL-2 секретируется CD4+ Т-лимфоцитами, а также Т-клетками некоторых других субпопуляций лимфоцитов. Мишенями регуляторного действия IL-2 являются различные субпопуляции Т-клеток, В-клетки, натуральные киллерные (NK) клетки, макрофаги. Все эти клетки имеют соответствующий рецептор для восприятия сигнала от IL-2. Рецепторы IL-2 найдены на T-клетках, B-клетках, NK клетках. IL-2 усиливает В-клеточный рост и синтез иммуноглобулинов, интерферона (IFN), модулирует экспрессию рецептора IL-2 [9]. Терапевтическое применение IL-2 связывают с использованием активированных цитокином клеток против
- 76 -
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ И ИММУНОГЕНЕТИКА
опухолевого роста (W. D. Otter и соавт. 2008). Основным результатом действия IL-2 на покоящиеся или стимулированные антигеном или митогеном клетки является обеспечение их пролиферации; именно эта биологическая активность IL-2 определяет его в качестве типичного ростового фактора клеток лимфомиелоидного комплекса.
Иммунодефицитные состояния - понижение количества и функциональной активности основных компонентов иммунной системы, ведущее к нарушению защиты организма от бактерий, вирусов, простейших и проявляющееся в повышенной частоте заболеваний. Исследования в иммунологии, характеризующие разные звенья иммунитета, включают обширный спектр лабораторной диагностики. Сюда входят и определения регулирующих иммунную защиту биологических веществ (IFN, IL, цитокинов), определение содержания общего IgE, а также ^А, IgG и Ig^ уровня субпопуляций лимфоцитов и их активности, уровня фагоцитарной активности и циркулирующих иммунных комплексов. Также проводят различные лабораторные и аппаратные исследования состояния и функционирования отдельных конкретных органов и систем. Т-клетки (CD3+) составляют большую часть лимфоцитов периферической крови (70-80%). Для количественной оценки Т-системы иммунитета используют проточную цитометрию с целью определения процентного и абсолютного количества зрелых Т-лимфоцитов (CD3+) и двух основных их субпопуляций: хелперов/индукторов (CD4+) и киллеров/ супрессоров (CD8+). Методы оценки функциональной активности Т-лимфоцитов достаточно сложны, золотым стандартом является реакция бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ) с использованием основных Т-клеточных митогенов (ФГА и КонА). Процедура РБТЛ подразумевает использование радиоактивного 3Н-тимидина, по инкорпорации которого в ДНК оценивают степень пролиферации лимфоцитов; в нашей лаборатории предложен способ оценки степени пролиферации с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени без использования радиоактивной метки [2]. Пролиферативный ответ T-лимфоцитов на митогены понижен практически при всех хронических инфекционновоспалительных процессах, злокачественных заболеваниях, особенно кроветворной системы; при всех видах иммунодепрессивной терапии, СПИДе и всех первичных T-клеточных иммунодефицитах. Изучение факторов, влияющих на способность Т-лимфоцитов к пролиферации, может дать новую значимую информацию о работе иммунокомпетентных клеток.
Материалы и методы. Реагенты, среды, приборы. Ва-кутейнеры с гепарином BD Vacutainer Heparin Tubes #367675; центрифуга для выделения лимфоцитов Eppendorf 5810R, ротор А-4-81; ФГА "ПанЭко", Россия, #М022, стоковый раствор в плотной питательной среде (ППС) 25 мкг/мл; КонА, "ПанЭко", Россия, #М011, стоковый раствор в ППС 25 мкг/ мл; 96-луночные индивидуально упакованные планшеты -Nunc; среда 199 c солями Хэнкса и глутамином - "ПанЭко", Россия, #С230; среда RPMI-1640 - Sigma, США, #R0883; раствор фиколла - "ПанЭко", Россия, #P050 (плотность 1077 г/ мл); глутамин "ПанЭко", Россия, #Ф032; HEPES "ПанЭко", Россия, #Ф134; ППС RPMI-1640 с добавлением 2 мМ глутамина, 20 мМ HEPES-буфера и 10% инактивированной FBS; сыворотка Standart Fetal Bovine Serum, HyClone #SH30088.03, лот APC20780, инактивирована нагреванием на водяной бане в течение 1 ч при 56°С; синтез праймеров и зондов, НПФ ДНК-Технология, Россия; инвертированный микроскоп Nikon TMS; набор для выделения нуклеиновых кислот "Проба-НК", НПФ ДНК-Технология, Россия, #P-002/1; ам-плификатор для ПЦР в реальном времени "ДТ-322", НПФ ДНК-Технология, Россия, #O-DT322-02/2, и "ДТ-96", НПФ ДНК-Технология, Россия, #O-DT96-05/1; твердотельный термостат с прижимной крышкой "Гном", Россия, НПФ ДНК-Технология #O-TT1.
РБТЛ. Сначала брали кровь 12 здоровых доноров (равное количество мужчин и женщин, средний возраст 32±6 лет),
мононуклеарные клетки которых исследовали без стимуляции и при стимуляции митогенами. Без стимуляции брали следующие четыре точки: сразу после выделения на фиколле и через 6, 18, 36 ч культивирования в ППС. При стимуляции ФГА и КонА исследовали следующие шесть точек: в момент добавления стимула (через 8-12 ч после выделения на фикол-ле) и далее через 6, 18, 28, 52, 76 ч (эта часть в данной работе не показана). Подобный эксперимент с этими донорами повторили дважды.
Из исследованной выборки были отобраны наиболее различающиеся по результатам предварительных анализов двое здоровых доноров (женщина 34 лет и мужчина 33 лет), на клетках крови которых была построена более развернутая кинетика ответа, представленная в настоящей работе. Кровь брали натощак в вакутейнеры с гепарином, выделение лимфоцитов проводили не позднее чем через 2 ч после взятия крови. Выделение фракции мононуклеарных клеток осуществляли так, как описано ранее [4], с небольшими изменениями. Коротко: 7 мл свежей крови, взятые в вакутейнер с гепарином, разбавляли 1:2 по объему средой 199 c солями Хэнкса и глутамином, наслаивали на 3-4 мл раствора фикол-ла, центрифугировали при 1600 об/мин, 15°С, 15 мин. Интерфазу аккуратно переносили в чистые пробирки и трижды отмывали 5-8 мл среды 199 в той же центрифуге при 1200 об/ мин, 15°С, 10 мин. После отмывок сливали супернатант, полученные клетки ресуспендировали на вортексе в 1 мл ППС RPMI-1640, определяли количество выделенных мононуклеарных клеток в гемоцитометре под микроскопом. Добавляли необходимое количество ППС RPMI-1640 до концентрации 106 клеток на 1 мл среды.
В стерильный планшет раскапывали по 2-105 выделенных клеток на лунку в объеме 200 мкл, добавляли по 20 мкл стокового раствора ФГА или КонА (итоговая концентрация 2,5 мкг/мл). В лунки с клетками для контроля спонтанной пролиферации митоген не добавляли. Планшет помещали в СО2-инкубатор, насыщенный водяным паром, на 7-8 суток при 37°С, 5% СО2. Через определенное количество часов брали пробы клеток.
Праймеры и зонды для ПЦР в реальном времени. Для определения содержания мРНК исследуемых генов в наших экспериментах использовали праймеры и зонды, опубликованные ранее [2].
Выделение РНК и ДНК. Для выделения нуклеиновых кислот использовали наборы "Проба-НК". Метод основан на лизисе образцов в 4 М растворе гуанидинтиоционата, осаждении нуклеиновых кислот изопропанолом с последующими отмывками этанолом и ацетоном. Использование 4 М раствора гуанидинтиоцианата позволило зафиксировать материал, предотвратить его деградацию, а также провести все работы и измерения в пределах одного эксперимента. Выделение образцов проводили в соответствии с методикой набора "Проба-НК".
Реакцию обратной транскрипции проводили в объеме 20 мкл (в реакцию брали 16,5 мкл полученного препарата нуклеиновых кислот). В качестве праймеров для обратной транскрипции использовали специфические олигонуклеотиды. Реакцию проводили при температуре 40°С в течение 1 ч, с последующей инактивацией обратной транскриптазы при 95°С в течение 15 мин.
ПЦР в реальном времени. Для каждого образца проводили ПЦР со специфическими праймерами на гены IL-2 и IL-2ra. Праймеры и зонды для ПЦР подобрали с учетом структур экзонов и интронов таким образом, чтобы исключить отжиг на матрице геномной ДНК. Это позволило не использовать дополнительный этап обработки нуклеиновых кислот ДНКазой. Отсутствие амплификации на матрице геномной ДНК со специфичных праймеров на гены il и IL-2ra проверяли экспериментально на образцах, не прошедших реакцию обратной транскрипции. Все зонды содержали метку Fam. Реакции амплификации со специфичных праймеров на IL-2, IL-2ra и ghr
- 77 -
ИММУНОЛОГИЯ № 2, 2013
ставили в разных пробирках. Для повышения чувствительности и специфичности ПЦР использовали "горячий старт", который обеспечивался путем разделения компонентов реакции парафином. Амплификацию осуществляли в режиме реального времени в объеме 35 мкл по следующей программе:
80°С 30 с; 94°С 1 мин 1 цикл;
94°С 10 с; 64°С 20 с 50 циклов.
Для ПЦР в реальном времени использовали приборы "ДТ-322" и "ДТ-96" (НПФ ДНК-Технология, Россия). Уровень флуоресценции измеряли на каждом цикле при температуре 64°С. Дополнительный контроль прохождения реакции осуществляли методом электрофореза продуктов ПЦР в 2% агарозном геле.
Параметры, используемые для описания ПЦР в реальном времени:
1) Ср - значение порогового цикла, автоматически определяемое прибором;
2) Slope - разница в значениях Ср (Д Ср) при разведении образца в 10 раз;
3) эффективность амплификации оценивали по формуле:
Е = lQ-(1/sloPe>; Е(%) = (Е- 1)100% (1);
4) в качестве главной характеристики эксперимента использовали отношение (R) уровня экспрессии маркеров реакции к фоновому значению экспрессии этих маркеров, полученному в первые часы культивирования лимфоцитов; фактически величина R показывает, во сколько раз увеличивается количество мРНК исследуемого гена в процессе культивирования лимфоцитов под действием стимуляторов по сравнению с количеством мРНК этого гена в лимфоцитах, выделенных из крови здорового донора и культивированных без стимуляции в течение 12 ч.
Для определения R использовали два способа [1]:
- метод нормировки по ДНК; г считали как соотношение нормированного по ДНК гена ghr уровня экспрессии мРНК IL-2 или IL-2ra (X) в определенный момент времени (X)/ (ghr) к фоновому значению (X)/(ghr).
- метод без применения нормировочных генов:
R = l0(Cpf-Cpi)/slope (2)
где Cpf - фоновое значение порогового цикла в первые часы РБТЛ, Cpi - значение порогового цикла в определенный момент времени РБТЛ.
Мониторинг экспрессии мРНК генов IL-2, IL-2ra. Кинетику нарастания мРНК генов осуществляли путем отбора проб в определенные промежутки времени РБТЛ, причем каждую временную точку ставили в двух повторах и в расчетах использовали среднее значение. В качестве отрицательного контроля использовали точки спонтанной пролиферации без добавления ФГА/КонА. Таким образом, в каждый момент времени отбирали материал из четырех лунок планшета для каждого образца. Провели три независимых эксперимента с клетками PBMC отобраных доноров, в результатах показаны средние значения по трем экспериментам.
Результаты. При проведении экспериментов в каждую лунку планшета вносили одинаковое количество материала, поэтому благодаря использованному в данной работе протоколу взятия проб и выделения нуклеиновых кислот (см. главу "Материалы и методы") исключалась деградация мРНК, и, таким образом, нормировка по мРНК генов жизнеобеспечения клетки (housekeeping genes) не являлась необходимой. Для корректировки полученных значений по количеству клеток использовали нормализацию по количеству ДНК, определяемому с помощью ПЦР в реальном времени по значениям, полученным для гена рецептора к гормону роста человека ghr. Этот ген присутствует в гаплоидном геноме в единственной копии. Кроме того, поскольку в данной работе количество клеток и условия культивирования были стандартизованы, оказалось возможным определять соотношение уровня экспрессии мРНК генов IL-2 и IL-2ra напрямую, без применения нормировочных генов (формула 2). Ранее нами [2] было показано, что при стимуляции PBMC ФГА
экспрессия мРНК часто используемого нормировочного гена "домашнего хозяйства" hprtl увеличивается; в случае с КонА экспрессия мРНК этого гена также увеличивается (в работе не показано), поэтому данный ген оказался непригоден для нормировки в нашей работе, но он может быть использован для контроля стадий выделения нуклеиновых кислот и обратной транскрипции. Соотношения нормированных значений по ДНК в большинстве случаев соответствовали соотношению уровня экспрессии без применения нормировочных генов.
В работе были установлены следующие закономерности:
- при стимуляции ФГА в рРБТЛ экспоненциальное увеличение уровня экспрессии мРНК генов IL-2 и IL-2ra начинается со 2-3-х суток культивирования (через 24-48 ч) (рис. 1);
- максимум экспрессии мРНК генов IL-2 и IL-2ra при стимуляции ФГА приходится на 3-4-е сутки реакции (72-96 ч) (см. рис. 1);
- количество мРНК гена IL-2 начинает нарастать буквально в первые минуты и часы после стимуляции КонА, а количество мРНК гена IL-2ra начинает плавно увеличиватья примерно с конца 1-х суток стимуляции (около 20 ч; рис. 2);
- максимум содержания мРНК гена IL-2 наблюдается в первые часы культивирования с КонА (4-6 ч), а максимум содержания мРНК гена IL-2ra - существенно позже, на 3-и сутки (60-72 ч (см. рис. 2).
- уровень экспрессии мРНК генов IL-2 и IL-2ra возрастает в сотни и тысячи раз по сравнению с исходным в крови здоровых доноров; следовательно, оценка этого уровня с помощью ПЦР является еще одним доступным методом наряду с использованием гибридизационных методов (см. рис. 1, 2).
Обс уждение. В момент после выделения PBMC у здоровых доноров в них содержится заметное количество мРНК генов IL-2 и IL-2ra (в данной работе не показано). Далее при культивировании мононуклеарных клеток без стимуляции мРНК этих генов детектируется на низком уровне (см. главу "Материалы и методы"). Это согласуется с результатами более ранних работ, где был обнаружен определенный уровень экспрессии мРНК генов IL-2 и IL-2ra в свежевыделенных PBMC [3], несмотря на то, что в более ранних работах использовали менее чувствительный и специфичный способ оценки количества мРНК (метод полуколичественной ПЦР) по сравнению с ПЦР в реальном времени. В нашей работе оценку количества мРНК генов IL-2 и IL-2ra проводили не только в свежевыделенных лимфоцитах, но и в
11_-2_1, ФГА -Ф- IL-2_2, ФГА
IL-2RA_1, ФГА IL-2RA_2, ФГА
Рис. 1. Кинетика изменения уровней экспрессии мРНК генов il2 и il2ra в популяции мононуклеарных клеток периферической крови, взятых у 2 здоровых доноров и стимулированных ФГА.
IL2_1, ФГА - уровень экспрессии мРНК гена il2 в популяции клеток до-
нора 1, IL2_2, ФГА - уровень экспрессии мРНК гена il2 в популяции клеток донора 2, IL2RA_1, ФГА - уровень экспрессии мРНК гена il2ra в популяции клеток донора 2, IL2RA_2, ФГА - уровень экспрессии мРНК гена il2ra в популяции клеток донора 2.
- 78 -
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ И ИММУНОГЕНЕТИКА
Рис. 2. Кинетика изменения уровней экспрессии мРНК генов il2 и il2ra в мононуклеарных клетках периферической крови, стимулированных КонА.
Показано среднее значение по 2 здоровым донорам.
IL2 - уровень экспрессии мРНК гена il2 в РВМС, IL2R - уровень экспрессии мРНК гена il2ra в РВМС.
цельной крови, только что взятой у здоровых доноров, и разницы между нормированными значениями количества мРНК этих генов не обнаружили. Это может говорить о том, что процедура выделения на фиколле практически не влияет на увеличение экспрессии мРНК данных генов, а то количество мРНК генов IL-2 и IL-2ra, которое присутствует в клетках крови здоровых доноров, отражает нормальный физиологический уровень экспрессии мРНК этих цитокинов. Далее при культивировании PBMC в отсутствие стимула уровень мРНК генов IL-2 и IL-2ra падает в первые часы в несколько раз, что, по-видимому, указывает на отсутствие физиологического поддержания экспрессии этих цитокинов на том уровне, который имеется в крови в целостном организме.
В ходе экспериментов обнаружили, что при стимуляции PBMC КонА уровень мРНК генов IL-2ra и IL-2 повышается по-разному в отличие от довольно сходной кинетики накопления мРНК этих генов при стимуляции клеток ФГА. Уровень мРНК гена IL-2 под действием КонА начинает нарастать уже в первые же минуты и часы после стимуляции, и его максимум наблюдается через 4-6 ч культивирования с КонА, а повышение содержания мРНК гена IL-2ra происходит существенно позже, примерно через 20 ч после стимуляции, достигая максимума через 60-80 ч (примерно к 3-м суткам стимуляции) (см. рис. 2).
Ранее показано [6], что при стимуляции КонА PBMC здоровых доноров уровень мРНК IL-2 в них начинает нарастать через 6 ч после добавления стимула и достигает максимума через 12-24 ч. Расхождение между нашими результатами и результатами, полученными в упомянутой работе, может объясняться разными методами исследований: в работе [6] уровень мРНК IL-2 определяли с помощью Нозерн-блоттинга, а гибридизационные методы отличаются существенно меньшей чувствительностью, чем ПЦР в реальном времени. В работе [7] показано, что через 3 сут после стимуляции PBMC митогеном КонА продукции растворимого IL-2 в среде культивирования практически не обнаруживается; это согласуется с результатами, полученными в нашей работе, поскольку примерно через 72 ч после стимуляции КонА экспрессия мРНК гена IL-2 падает до уровня, характерного для клеток без стимуляции. Кроме экспериментов с клетками человека действие КонА исследовали также на лимфоциты других видов животных. В частности, при стимуляции PBMC свиней КонА [11] оказалось, что максимальный уровень мРНК гена IL-2 в них содержится между 8 и 16 часами после добавления митогена, причем нарастание содержания мРНК в ответ на стимуляцию хорошо согласуется с изменением уровня растворимого белка IL-2 в культуральной жидкости выделенных
лимфоцитов в 1-2-е сутки культивирования. В данной работе анализ уровня мРНК проводили с помощью денситометрии количества полученного ампликона по конечной точке, что является менее чувствительным полуколичественным методом по сравнению с ПЦР в реальном времени. В работе [5] с помощью ПЦР в реальном времени показано, что количество мРНК гена IL-2 в PBMC благородного оленя, стимулированных КонА, максимально в период 8-16 ч после начала стимуляции, а затем оно падает к 72 ч культивирования до уровня спонтанной стимуляции. Отличия в кинетике накопления содержания мРНК этого цитокина в PBMC оленя и человека в ответ на стимул могут объясняться разным способом действия митогена КонА на лимфоциты из разных видов, а также определенными различиями в методике культивирования лимфоцитов. Кроме того, в работе [5] использовали достаточно высокую концентрацию КонА (10 мкг на 1/мл среды) для стимуляции PBMC оленя; такая концентрация для лимфоцитов человека представляет собой верхнюю границу и является уже токсичной.
Известно, что IL-2 (продукт гена IL-2) непосредственно участвует в регуляции экспрессии собственного рецептора IL-2RA (CD25; продукт гена IL-2ra) [9], и кинетика экспрессии мРНК гена IL-2ra, нарастающая в нашей работе вслед за экспрессией мРНК гена IL-2, это подтверждает. Интересно, что при стимуляции КонА пик максимального содержания мРНК гена IL-2ra оказался достаточно узким (62-76 ч после добавления стимула) (см. рис 2) в отличие от широкого пика для мРНК этого гена при стимуляции ФГА (60-96 ч и даже более) (см. рис. 1). Кроме того, обращает внимание разница в количестве мРНК гена IL-2ra в максимальной точке: при стимуляции КонА уровень мРНК гена IL-2ra оказался выше уровня спонтанной стимуляции более чем в 1000 раз, а при стимуляции ФГА максимальное количество мРНК этого гена превышало уровень спонтанной стимуляции в 200-300 раз. Стимулирующая концентрация митогенов была одинаковой. Содержание мРНК гена IL-2 при стимуляции ФГА и КонА оказалось несколько более сходным, хотя и с некоторым превышением в случае стимуляции КонА: в 250 и 450 раз выше уровня спонтанной стимуляции соответственно. При стимуляции ФГА и КонА кинетика нарастания уровня мРНК гена IL-2ra оказалась в целом более сходной, чем кинетика нарастания мРНК гена IL-2, для которого увеличение количества мРНК было более резким и быстрым при стимуляции КонА.
Интересными представляются также индивидуальные различия в кинетике ответа мононуклеарных клеток на стимуляцию двумя митогенами. В ответ на стимуляцию ФГА два донора дали существенный сдвиг в кинетике накопления мРНК генов IL-2 и IL-2ra относительно друг друга, в то время как при стимуляции КонА такой разницы не отметили. При стимуляции КонА разница между количеством мРНК генов IL-2 и IL-2ra в каждой точке для генов IL-2 и IL-2ra не превышала 10% среднего значения. Для двух наиболее отличающихся здоровых доноров максимум содержания мРНК гена IL-2 приходился на 72 и 84 часа; а максимум содержания мРНК гена IL-2ra - на 72 и 96 ч после стимуляции ФГА (см. рис. 1). При стимуляции КонА все клетки у исследованных здоровых доноров показали максимальное содержание мРНК гена IL-2ra почти одновременно, через 62-65 ч, и через 4-6 ч - для мРНК гена IL-2 (см. рис. 2). Различия в кинетике экспрессии мРНК генов IL-2 и IL-2ra у разных доноров под воздействием двух митогенов связаны, по-видимому, с индивидуальной реактивностью лимфоцитов у конкретного человека и различным действием митогенов на мононуклеарные клетки крови.
В наших экспериментах обнаружили, что уровень экспрессии мРНК генов IL-2 и IL-2ra при стимуляции лимфоцитов ФГА и КонА повышается в сотни и даже тысячи раз; такие изменения легко показать с помощью ПЦР, поэтому данный метод кажется очень перспективным для оценки уровня экспрессии выбранных генов в РБТЛ в связи с про-
- 79 -
ИММУНОЛОГИЯ № 2, 2013
стотой, доступностью, хорошей воспроизводимостью, чувствительностью, специфичностью и возможностью использования в клинических исследованиях. В настоящее время метод ПЦР в реальном времени активно применяют в медицинских лабораториях, поскольку он обладает достаточной простотой и высокой пропускной способностью, особенно если учитывать возможности автоматизации по выделению нуклеиновых кислот и постановке реакций, а также наличие на медицинском рынке российских приборов таких отечественных производителей, как НПФ ДНК-Технология.
Заключение. В ходе экспериментов специфические тестсистемы, разработанные для оценки уровня экспрессии мРНК генов IL-2 и IL-2ra, были использованы с целью определения динамики накопления мРНК соответствующих генов в лимфоцитах, стимулированных митогенами ФГА и КонА; впервые была построена развернутая кинетика ответа мононуклеар-ных клеток крови на Т -клеточные митогены в течение 5-7 сут культивирования. мРНК этих генов были использованы как маркеры РБТЛ с помощью метода ПЦР в режиме "реального времени". Определены основные закономерности экспрессии мРНК генов IL-2 и IL-2ra в ходе стимуляции, выявлены значимые различия в экспрессии данных генов у разных доноров крови под действием двух митогенов. Показано, что мРНК гена IL-2 может служить ранним маркером активации моно-нуклеарных клеток крови в РБТЛ в первые же часы после стимуляции КонА. Применен подход оценки результатов реакции без использования нормировочных генов.
Полученные в работе результаты могут быть использованы в дальнейшем как в научных разработках, так и в клинической практике, поскольку РБТЛ является удобной и наглядной моделью исследования функциональной активности лимфоцитов in vitro.
ЛИТЕРАТУРА
1. ПЦР в реальном времени / Ребриков Д.В., Саматов ГА., Трофимов Д.Ю., Семенов П.А., Савилова А.М., Кофиади И.А., Абрамов Д.Д. М.: БИНОМ; 2009.
2. Савилова А.М., Бурменская О.В., Чулкина М.М., Трофимов
Д.Ю., Алексеев Л.П. Способ оценки степени пролиферации лимфоцитов и исследование экспрессии мРНК генов ИЛ2 и ИЛ2РА в активированных митогеном лимфоцитах с помощью ПЦР в реальном времени. Физиология и патология иммунной системы. 2009; 13 (11): 14-24.
3. Breen E.C., McDonaldM., Fan J., Boscardin J., Fahey J.L. Cytokine gene expression occurs more rapidly in stimulated peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus-infected persons. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2000; 7 (5): 769-73.
4. Coligan J.E. et al., eds. Current protocols in immunology. Chichester etc: John Wiley & Sons; 2003.
5. Harrington N.P., Surujballi O.P., Prescott J.F. Cervine (Cervus elaphus) cytokine mRNA quantification by real-time polymerase chain reaction. J. Wildlife Dis. 2006; 42 (2): 219-33.
6. Horgan A.F., Mendez M.V., O’Riordain D.S., Holzheimer R.G., Mannick J.A., RodrickM.L. Altered gene transcription after burn injury results in depressed T-lymphocyte activation. Ann. Surg. 1994; 220 (3): 342-52.
7. Katial R.K., Sachanandani D., Pinney C., Lieberman M.M. Cytokine production in cell culture by peripheral blood mononuclear cells from immunocompetent hosts. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1998; 5 (1): 78-81.
8. Nowell P.C. Phytohemagglutinin: An initiator of mitosis in cultures of normal human leucocytes. Cancer Res. 1960; 20: 462-6.
9. Reem G.H., Yeh N.H. Interleukin 2 regulates expression of its receptor and synthesis of gamma interferon by human T lymphocytes. Science. 1984; 225 (4660): 429-30.
10. Stavy L., Treves A.J., Feldman M. Effect of concanavalin A on lymphocyte-mediated cytotoxicity. Nature. 1971; 232 (5305): 56-8.
11. Verfaillie T, Cox E, To LT, Vanrompay D, Bouchaut H., Buys N., Goddeeris B. M. Comparative analysis of porcine cytokine production by mRNA and protein detection. Vet Immunol Immunopathol. 2001; 81 (1-2): 97-112.
12. Otter W.D., Jacobs J.J.L., Battermann J.J., Hordijk G.J., Krastev Z., Moiseeva E.V. et al. Local therapy of cancer with free IL-2. Cancer Immunol Immunother. 2008 July; 57(7): 931-50.
Поступила 24.10.12
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 612.6.05.014.482.08
К.В. Уткин1, И.А. Кофиади1, Е.И. Батенева4, А.В. Аклеев2, И.В. Орадовская1, А.А. Рагимов3, Г.Х. Викулов1, Т.Т. Радзивил5, Ю.г. Пащенкова1, л.П. Алексеев1
установление генетических маркеров устойчивости и чувствительности человека к радиационному воздействию
1ФГБУ ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России (115478, г Москва, Каширское ш., д. 24, корп. 2);2УНПЦ РМ ФМБА России; 3РНЦХ РАМН им. Б.В. Петровского; 4ЗАО НПФ ДНК-Технология; 5ФгУЗ КБ № 81 ФМБА России
Введение. Развитие атомной промышленности обеспечивает растущие потребности человечества в доступных источниках энергии, а также способствует реализации новых перспектив в достижении экономического и социального прогресса. Вместе с тем следует помнить о том, что этот путь отмечен многими человеческими жертвами, число которых, к сожалению, продолжает расти. Поэтому цель обеспечения радиационной безопасности - исключение или снижение до достижимого минимума вероятности негативного влияния радиации на организм человека [1].
Алексеев Леонид Петрович (Alekseev Leonid Petrovich), тел. 8(499) 617-78-22
Медицинские последствия радиационного поражения варьируют в зависимости от доз облучения. Результат воздействия доз, превышающих пороговое значение, проявляется в виде тяжелых клинических симптомов, вероятность развития которых чрезвычайно высока. В свою очередь эффекты малых доз облучения, которые находятся в зависимости от значения эффективной дозы, накопленной человеком за жизнь, носят стохастический характер и, согласно общепринятым в радиобиологии представлениям, не могут быть причиной непосредственных нарушений здоровья. Однако даже санитарные нормативы, регламентирующие допустимые дозы облучения, не гарантируют полной радиационной безопасности [2]. Считается, что длительное воздействие малых доз может вызывать в клетках организма изменения, приводящие к на-
- 80 -
