CC BY
123
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 612.112.94.083
Чулкина М.М.13, Трофимов Д.Ю.12, Кофиади И.А.3, Алексеев Л.П.3, Савилова А.М.1
КОМПЛЕКСНЫЙ АНАЛИЗ КИНЕТИКИ ЭКСПРЕССИИ МРНК ЦИТОКИНОВ В РЕАКЦИИ БЛАСТНОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ С МИТОГЕНОМ КОНА
1ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова», г. Москва; 2ЗАО «НПФ ДНК-Технология», г. Москва; 3ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, 115478, г Москва
Для характеристики функций клеточного звена иммунного ответа актуальной задачей является изучение роли отдельных цитокинов и взаимодействия различных групп цитокинов как в модельных экспериментах, так и в клинических исследованиях. Координация продукции цитокинов в течение активации лимфоцитов контролирует пролиферацию, дифференцировку и функции клеток и является критичной для регуляции иммунного ответа. Метод полимеразной цепной реакции в реальном времени представляет возможность для определения самых ранних этапов активации клеток на уровне транскрипции ключевых генов цитокинов. А также позволяет оценивать в одной пробе большое количество транскриптов генов и проводить одновременное исследование широкого спектра цитокинов в одной временной точке эксперимента. В реакции бластной трансформации мононуклеарных клеток человека с митогеном КонА проведено исследование динамики экспрессии мРНК генов цитокинов (интерлейкина (IL)-ip, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12a, IL-17, фактора некроза опухоли интерферона а, интерлейкина-Y), генов факторов транскрипции (GATA-3, t-bet и rorc) и гена cd69 в течение 5 сут. Полученные данные указывают на активацию генов провоспалительных цитокинов в реакции бластной трансформации. Показана корреляция экспрессии мРНК транскрипционных факторов GATA-3, t-bet и rorc и связанных с ними цитокинов. Изучение динамики экспрессии мРНК может в значительной мере расширить возможности исследований функциональных характеристик клеточного звена иммунного ответа.
Ключевые слова: реакция бластной трансформации лимфоцитов; цитокины; конканавалин А; интерферон-у; GATA-3; t-bet; RORC; ПЦР в реальном времени.
Для цитирования: Иммунология. 2014; 36 (6): 306-312. Chulkina M.M.13, Trofimov D.Yu.1-2, Kofiadi I.A.3, Alekseev L.P.3, Savilova A.M.1
COMPARATIVE ANALYSIS OF DIFFERENT CYTOKINES AND TRANSCRIPTION FACTORS MRNA EXPRESSION IN LYMPHOCYTES ACTIVATED BY CONA
TSBI «Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology», Moscow, Russia; 2«DNA-Technology Ltd», Moscow, Russia; 3FSBI «NRC Institute of immunology» FMBA of Russia, Moscow, Russia
Cytokines are signaling molecules in the regulation of immune response critical for cell survival, stimulation or inhibition of cell growth, differentiation, and activation of apoptosis. Detailed kinetics of cytokine gene's mRNA expression (IL-1beta, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12-alpha, IL-15, IL-17, TNF-alpha , IFN-gamma), and mRNA expression of transcription factor genes (GATA-3, t-bet and RORC) in response to ConA in mononuclear cells of six healthy donors were investigated at 23 timepoints. The mRNA expression of proinflammatory cytokine genes was shown to be reliable marker of cell proliferation after stimulation with ConA. There was also shown correlation of expression levels of Th1-, Th2-, and Th17-differentiation pathways and related cytokines. We propose to use real-time PCR for a comprehensive assessment of functional activity of cell-mediated immune response in blast transformation reaction.
Keywords: reaction of blast transformation (RBTL); cytokines; concanavalin A; IFN-gamma; GATA-3; t-bet; RORC; real-time PCR.
citation: Immunologiya. 2014; 35 (6): 306-312. (in Russian)
введение. Реакция бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ) с митогенами является одним из методов оценки функционального состояния лимфоцитов человека. В РБТЛ выявляют важное свойство лимфоцитов трансформироваться в активные лимфоциты. Индекс стимуляции (ИС) отражает уровень функциональной активности лимфоцитов в преакти-вированном состоянии и способность увеличивать активность лимфоцитов в ответ на стимуляцию. Определение способности продуцировать цитокины мононуклеарными клетками, активированными в РБТЛ, является важным подходом, направленным на выяснение механизмов нарушений в иммунной системе, ведущих к развитию заболеваний [1-5]. Изначально большинство исследований кинетики цитокинов в РБТЛ было сосредоточено на изучении соотношения между содержанием интерлейкина-2 (ТЬ-2) и уровнем его рецептора, а также на изучении уровня экспрессии интерферона (!КЫ-у) [3]. В настоящее время исследо-
Для корреспонденции: Чулкина Марина Михайловна, chulkina@gmail.com;
For correspondence: chulkina Marina Mikhaylovna, chulkina@ gmail.com
вание цитокинового профиля при действии различных агентов на мононуклеарные клетки рассматривают с позиции изучения преобладающего направления ответа (ТЫ- или ТЬ2-путь), оно и прочно вошло в лабораторную клиническую практику. Направленный ответ на действие конкретных препаратов можно изучать по изменению профиля провоспалительных и противовоспалительных цитокинов при их действии на активированные митогеном лимфоциты. Такое направленное изменение профиля цитокинов свидетельствует об изменении активности ТЫ - и ТЬ2-клеток [5]. Экспрессия цитокинов, а также их рецепторов может регулироваться как общими механизмами, так и независимыми процессами. Так как цитокины являются быстрыми сигнальными молекулами, мРНК многих из них нестабильна, подвергается быстрой деградации и обычно служит субстратом для других сигнальных механизмов в клетке. Однако мРНК ряда генов цитокинов стабильна, поэтому ее уровень может быть использован в качестве надежного маркера для оценки степени активации и пролиферации, например, для генов ГЬ-2 и его рецептора. Активацию и пролиферацию лимфоцитов можно оценивать по уровню экспрессии мРНК ключевых маркеров этих процессов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)
в реальном времени (ПЦР-РВ). Данный метод обладает рядом достоинств, в том числе возможностью оперативно моделировать системы для оценки уровня экспрессии мРНК различных мишеней, возможностью в одной пробе оценивать большое количество целевых продуктов. При стандартизации метода постановки реакции и анализа результатов можно сравнивать данные из разных серий экспериментов. Безусловный интерес представляет одновременное исследование содержания цитоки-нов и транскрипционных факторов, связанных с тремя путями активации клеточного звена иммунного ответа Th1, Th2 и Th17. Количественная оценка этих показателей, полученная методом ПЦР-РВ, является перспективной для целого ряда клинических и научных исследований.
Общая характеристика цитокинов различных групп хорошо описана, однако изучение роли отдельных цитокинов и взаимодействия различных групп цитокинов как в модельных экспериментах, так и в клинических исследованиях по-прежнему актуальной. В предыдущих исследованиях мы показали, что изменение экспрессии мРНК генов циклинза-висимой киназы-1 и топоизомеразы 2а надежно коррелирует с ИС мононуклеарных клеток периферической крови в РБТЛ с неспецифическими митогенами. Также показали зависимую кинетику экспрессии мРНК генов IL-2 и его рецептора. Тем не менее, обнаружили индивидуальные различия в кинетике и уровне экспрессии мРНК этих генов, что связано с различной степенью пролиферации клеток [6].
Целью данной работы стало исследование зависимости уровня экспрессии мРНК генов цитокинов и транскрипционных факторов и степени пролиферации лимфоцитов в реакции бластной трансформации с митогеном конканавалином А (КонА).
Материал и методы. Объект исследования. Обследовали 6 здоровых доноров (4 женщин и 2 мужчин) в возрасте от 25 до 32 лет.
РБТЛ. Выделение фракции мононуклеарных клеток проводили согласно Current protocols in immunology (2003). Периферическую кровь с гепарином наслаивали на фиколл, центрифугировали при 1600 об/мин 15 мин, затем двукратно отмывали в среде 199, осадок ресуспендировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% FBS. В 96-луночный планшет раскапывали по 2-105 выделенных клеток на лунку в объеме 200 мкл, через 18 ч добавляли по 20 мкл раствора КонА (итоговая концентрация 2,5 мкг/мл). В лунки с клетками для контроля спонтанной пролиферации КонА не добавляли. Планшет помещали в СО2-инкубатор на 7 сут при 370С, 5% СО2.
Отбор проб осуществляли через определенные промежутки времени после добавления митогена. Первые 8 ч пробы отбирали каждый час, затем через каждые 8 ч (12 проб) и две точки забора через 169 и 177 ч. Всего отобрали 22 пробы. Каждую временную точку анализировали в трех повторах, от каждого донора в расчетах использовали среднее значение. В качестве отрицательного контроля использовали точки спонтанной пролиферации без добавления КонА.
Оценка РБТЛ по включению меченого 3Н-тимидина. Оценку РБТЛ по включению меченого ЗН-тимидина проводили в соответствии с описанием, приведенным в current protocols in immunology (2003). Через 72 ч инкубации с 5% СО2 и при 37°С клеток с КонА (либо без КонА - контроль спонтанной пролиферации) вносили в лунку раствор ЗН-тимидина 1 мкг/мл (удельная радиоактивность 2 Ки/моль), инкубировали 18 ч, собирали клетки на харвестере (Titertek cell harvester, Flow Laboratories) на стеклянные фильтры, промывали водой, фиксировали метанолом, фильтры помещали во флаконы со сцинтиллятором и уровень радиоактивной метки определяли на р-счетчике (Wallac 1409 DSA).
По полученным значениям CPM определяли ИС лимфоцитов по формуле:
ИС = CPM(среднее значение опыта)/CPК(среднее значение контроля),
где среднее значение контроля представляет собой среднее значение cPM образцов, культивированных без добавления КонА.
Выделение РНК и ДНК. Для выделения нуклеиновых кислот использовали наборы «Проба-НК», «НПФ ДНК-Технология». Метод выделения основан на лизисе образцов гуанидинизотиоцианатом.
Получение кДНК. В качестве праймеров для обратной транскрипции использовали специфические олигонуклеоти-ды. Реакцию проводили при температуре 40°С в течение 1 ч с последующей инактивацией обратной транскриптазы при 95°С в течение 15 мин.
Проведение ПЦР-РВ. Для определения содержания мРНК исследуемых генов в наших экспериментах были использованы праймеры и зонды, разработанные ранее [7]. Так же проводили ПЦР для гена ghr с геномной матрицы, без проведения реакции обратной транскрипции. Все зонды содержали метку Fam. Реакции амплификации со специфичными праймерами проводили в отдельных пробирках. Для повышения чувствительности и специфичности ПЦР использовали «горячий старт», который обеспечивался путем разделения компонентов реакции парафином. Амплификацию осуществляли в режиме реального времени в объеме 35 мкл по следующей программе:
80°С 30 с, 94°С 2 мин 1 цикл;
94°С 10 сек, 64°С 20 с 50 циклов.
Для ПЦР в режиме реального времени использовали приборы ДТ-322 и ДТ-96 («НПФ ДНК-Технология»). Уровень флюоресценции измеряли на каждом цикле при температуре 64°С. Дополнительный контроль прохождения реакции осуществляли методом электрофореза продуктов ПЦР в 2% агарозном геле.
Анализ данных ПЦР-РВ и статистическая обработка данных. Для количественного анализа экспрессии генов использовали относительный метод ДДСр.
1. Ср - значение порогового цикла, автоматически определяемое прибором.
2. Slope - разница в значениях Ср (ДСр) при разведении образца в 10 раз.
3. Эффективность амплификации Е оценивали по формулам:
Е = io~(i/siope). е (в %) = (Е - 1) ■ 100%.
4. В качестве главной характеристики эксперимента использовали отношение (R) уровня экспрессии маркеров реакции к значению экспрессии этих маркеров в культуре лимфоцитов без добавления митогена. Для определения R использовали метод нормировки по ДНК. R считали как соотношение нормированного по ДНК гена ghr уровня экспрессии мРНК исследуемых генов (X) в определенный момент времени стимуляции (X/ghr) к значению уровня экспрессии данного гена в контрольном образце (XJ ghrJ) [7].
Результаты. Для оценки степени пролиферации лимфоцитов в реакции бластной трансформации использовали радиоизотопный метод. В табл.1 приведены средние значения ИС и стандартное отклонение для каждого донора.
Включение меченого тимидина 3Н
Экспрессия цитокинов в нестимулированных клетках.
Экспрессия цитокинов в лимфоцитах сразу после выделения на фиколле была существенно выше, чем через несколько часов инкубации в среде (табл. 2).
Таблица 1
Включение 3Н-тимидина в ходе РБТЛ при стимуляции лимфоцитов КонА и при спонтанной пролиферации
Донор
Спонтанная пролиферация (CPM М ± m)*
Стимуляция КонА (CPM М ± m)*
Средний ИС
1-й 2-й
3-й
4-й
5-й
6-й
835 ± 107
836 ± 67 764 ± 95 857 ± 88 849 ± 120 947 ± 79
77 613 ± 3193 73 706 ± 1327
65 453 ± 2047 69 425 ± 3486
66 433 ± 1721 64 404 ± 4000
93 ± 5 88 ± 5 85 ± 4 81 ± 3 78 ± 4 68 ± 6
Примечание. * - среднее по трем экспериментам.
Таблица 2
средние значения относительной экспрессии мрнК исследованных генов в клетках сразу после выделения на фиколле и контрольных образцах без добавления митогена после 12 ч инкубации
мРНК генов ilpl il4 il6 il8 il10 il12a il17 ifn-y tnF-a gata tbx rorc cd69
Сразу 293,6 ± 128,7 1,0 ± 0,7 0,4 ± 0,2 397,9 ± 189 0,7 ± 0,2 0,15 ± 0,04 0,004 ± 0,003 0,7 ± 0,4 7,3 ± 0,8 9,4 ± 1,8 3,9 ± 1,2 0,4 ± 0,3 22,9 ± 4,3
после вы-
деления
12 ч ин- 1,1 ± 1 0,02 ± 0,01 0,01 ± 0,01 16,9 ± 7 0,2 ± 0,08 0,01 ± 0,003 0 0,03 ± 0,02 1,18 ± 0,9 1,34 ± 0,6 0,5 ± 0,3 0,09 ± 0,07 0,39 ± 0,1
кубации
Примечание. Приведены средние значения относительной экспрессии ± стандартное отклонение. - фактор некроза опухоли а.
Спонтанная экспрессия мРНК исследуемых генов между донорами различалась незначительно. Однако для донора с самым высоким ИС (93) уровень экспрессии мРНК гена П6 в нестимулированных клетках был на порядок меньше, чем у других доноров (0,002 ± 0,001), а у донора с минимальным ИС (68) зафиксирована высокая экспрессия мРНК гена Шр в контроле (2,34 ± 0,64).
Относительная экспрессия цитокинов в РБТЛ
Провоспалительные цитокины. Развернутая кинетика экспрессии мРНК генов провоспалительных цитокинов !Ь-1р, !Ь-6, !Ь-12а, !Ь-15,1Ь-17, Т№-а, ШШ-у при действии КонА на культуру лимфоцитов показала, что увеличение экспрессии мРНК этих генов изменяется в достаточно широком диапазоне, особенно высокие значения экспрессии наблюдали для мРНК генов Шр и ifn-y.
Для мРНК гена ifn-y относительная экспрессия значительно превышала спонтанную и имела два выраженных пика: в первые часы после добавления митогена и на 3-и сутки стимуляции. Увеличение в первые часы составило в среднем 900 раз по сравнению со спонтанным уровнем экспрессии, среди исследованных нами цитокинов для мРНК ШШ-у наблюдали максимальное увеличение уровня экспрессии, где превышение над спонтанной активацией было в тысячи раз. У донора с максимальным значением ИС (ИС = 93) к 3-м суткам активации увеличение относительной экспрессии мРНК гена ШШ-у превышало спонтанную стимуляцию в десятки тысяч раз (рис. 1).
Результаты исследования кинетики мРНК 1пГ-а показали значительное - до 100 раз - увеличение экспрессии у 1 доно-
10 000
1000
80 100 120 140 160 180 200
Рис. 1. Кинетика относительной экспрессии мРНК гена 1Й1-у в лимфоцитах, стимулированных КонА. Пунктирная линия - кинетика изменения уровня мРНК гена №N7 для донора с ИС (93), черная линия - кинетика изменения уровня мРНК гена 1&-у, среднее значение по 5 донорам.
Здесь и на рис. 2-5 по оси абсцисс - время (в ч); по оси ординат - относительная экспрессия мРНК.
ра (ИС = 93) уже в первые часы после добавления митогена, однако кинетика экспрессии мРНК данного гена различалась у отдельных доноров. Для донора с высоким значением ИС можно говорить о выраженном пике экспрессии мРНК гена Ш^а в течение 2-х суток стимуляции, для остальных доноров уровень экспрессии, наблюдаемый в 1-е сутки, оставался тем же в течение 3 сут. Для всех доноров наблюдалось снижение экспрессии мРНК данного цитокина после 3 сут эксперимента до уровня, не превышающего спонтанную стимуляцию.
Для мРНК Ш7 показано, что в мононуклеарных клетках сразу после выделения и культуре лимфоцитов без стимуляции экспрессия данного гена отсутствует или находится на минимальном уровне. Под действием КонА изменение экспрессии мРНК данного гена наблюдали начиная с 1-го часа стимуляции. Диапазон изменения экспрессии оказался схожим для всех доноров: начиная с 25-х часов стимуляции отметили существенное увеличение экспрессии мРНК, максимум достигался во временном интервале от 44 до 72 ч, после чего происходило резкое снижение экспрессии до уровня спонтанной стимуляции (рис. 2).
Противовоспалительные цитокины. В работе исследовали развернутую кинетику относительной экспрессии мРНК гена противовоспалительного цитокина !Ь-10. Показали, что в культуре клеток без добавления митогена наблюдается спонтанная экспрессия мРНК гена Ш0. При действии КонА экспрессия мРНК этого гена не превышает 10 раз по сравнению с нестимулированными клетками, максимальное значение экспрессии достигается на 2-е сутки стимуляции, а через 3 сут для всех доноров наблюдали снижение уровня экспрессии мРНК по сравнению с контролем в 10-20 раз. Таким образом, происходят значительные изменения в кинетике экспрессии мРНК гена данного цитокина относительно
60 80 100 120 140 160 180 200
Рис. 2. Кинетика относительной экспрессии мРНК гена il17 при стимуляции клеток КонА. Среднее значение по донорам (n = 6).
Рис. 3. Кинетика относительной экспрессии мРНК гена ^-10 в лимфоцитах, стимулированных КонА.
Прерывистая линия - кинетика изменения уровня мРНК гена П10 для донора с ИС (68), черная линия - кинетика изменения уровня мРНК гена П10, среднее значение по 5 донорам.
спонтанного уровня. Для донора с минимальным значением ИС (68) показана максимальная экспрессия мРНК гена Ш0 (рис. 3).
Для мРНК гена П4 увеличение относительной экспрессии до 40 раз наблюдали на 2-е сутки стимуляции, а после 3-х суток стимуляции уровень снижался до уровня спонтанной экспрессии.
Транскрипционные факторы. В нашем исследовании не наблюдали существенного увеличения относительной экспрессии мРНК гена транскрипционного фактора gata-3 в стимулированных КонА лимфоцитах по сравнению со спонтанной экспрессией в первые 3 сут. Для генов шгс и t-bet выявили пик экспрессии мРНК на 3-и сутки после стимуляции, причем для гена t-bet увеличение экспрессии наблюдали уже в 1-е сутки (рис. 4). Мы не обнаружили значимых различий между донорами по максимальным значениям уровня относительной экспрессии транскрипционных факторов и различий в динамике экспрессии.
Маркер ранней активации а369. При стимуляции культуры мононуклеарных клеток КонА пик экспрессии наблюдали в 1-й час активации клеток. Различий по донорам в уровне максимального значения уровня относительной экспрессии мРНК не выяили. Начиная с временной точки 2 ч для всех доноров отметили снижение относительной экспрессии. В течение всего экесперимента экспрессия данного гена в стимулированной культуре была выше, чем в спонтанной (рис. 5).
Обсуждение. Определение уровня спонтанной продукции провоспалительных цитокинов в культуре клеток периферической крови очень важно для характеристики предварительной активированности клеточного звена иммунного ответа [5]. Согласно представленным данным, различия уровня экспрессии мРНК гена Шр у отдельных доноров в культуре клеток без добавления митогена могут достигать 10 раз. Этот факт следует учитывать при анализе результатов, так как уровень экспрессии этого цитокина, измеренного в цельной крови и культуре клеток после выделения на фиколле, различался между донорами не более чем в 2 раза [5]. Более того, при культивировании клеток без митогена наблюдали снижение экспрессии данного гена, что связано с функциональным значением данного цитокина в очень быстрых ответах клеток на внешние воздействия. Таким образом, мы считаем необходимым использовать в качестве контроля культуру нестиму-лированных клеток в конкретные временные точки, а также
и-1-1-1-г~
0 20 40 60 80
—■— gata 3 -♦- t-be t —4— го гс
Рис. 4. Кинетика экспрессии мРНК генов транскрипционных факторов GATA, t-bet, rorc.
Здесь и на рис. 5: показаны средние значения для всех доноров (n = 6).
проводить добавление стимулирующего агента для исследования уровня цитокинов в культуру мононуклеарных клеток не ранее чем через 12 ч после выделения. Низкая экспрессия мРНК гена il16 для донора с самым высоким ИС может отражать потенциал активации клеточного звена иммунного ответа, однако для других цитокинов и транскрипционных факторов не было показано отличий от других доноров.
Согласно нашим данным, в РБТЛ происходит активация генов провоспалительных цитокинов и отмечается существенное увеличение экспрессии мРНК, в особенности IFNy. Это согласуется с результатами более ранних исследований [3, 4], где изучали экспрессию ifn-y при стимуляции митогенами и показали высокую продукцию этого ци-токина Thl-клетками. Преобладание синтеза ifn-y в РБТЛ связано с нарушением баланса цитокинов, характерного для нормальных физиологических условий, что достигается путем переключения сигнальных путей с Jak/STAT-опосредованного пути передачи сигнала от цитокинов на сигнальные пути с участием ингибирующих факторов группы SOCS [8].
Для 1 донора (с минимальным значением ИС = 68) зна-
--1-1-1-1-1-1-7А-1-1-1-1
0 1 2 3 4 5 6 20 40 60 80 100
Рис. 5. Кинетика экспрессии мРНК гена cd69.
чения относительной экспрессии провоспалительных цитокинов были существенно ниже, чем для остальных 5. Для его же клеток показана наибольшая спонтанная активация. Высокий уровень спонтанной продукции мРНК гена провос-палительного цитокина il1p в культуре согласуется с более низкими значением относительной экспрессии при действии КонА.
Отсутствие выраженного пика экспрессии мРНК гена tnf-a связано с низкой стабильностью мРНК и временем ее полужизни. В ранних работах [9] показано, что в первые часы после стимуляции происходит значительное увеличение экспрессии данного гена, а затем снижение до базового уровня. Однако был использован метод полуколичественной ПЦР, который являлся менее чувствительным и точным, чем ПЦР-РВ. Также это может быть обусловлено экспрессией этого цитокина в первые часы активации преимущественно моноцитами, которые присутствуют в культуре. На основании полученных данных можно предположить, что экспрессия этого цитокина связана с индивидуальной реактивностью лимфоцитов доноров.
Представленные в работе данные хорошо согласуются с исследованием уровня белковых продуктов исследованных генов методом Bio-plex. При культивировании мононуклеарных клеток здоровых доноров под действием митогена через 96 ч стимуляции обнаруживали высокую концентрацию провоспа-лительных цитокинов: IL-1, IL-6, IFN-y, IL-17 и IL-8, также отмечалась спонтанная продукция IL-8 и IL-17, из провоспалительных цитокинов выявили экспрессию IL-10. Более того, показана индивидуальная изменчивость уровня экспрессии цитокинов среди здоровых доноров [10]. Тогда как, согласно нашим данным, максимальное значение экспрессии провоспа-лительных цитокинов наблюдалось в существенно более ранние часы. Однако существуют сообщения о совпадении профилей экспрессии мРНК и белка для цитокинов IL-2 и IFN-y для КонА-индуцированных клеток [11]. Согласно нашим данным, уровень экспрессии мРНК гена ifn-y на 3-и сутки наиболее точно отражает уровень пролиферации лимфоцитов в РБТЛ с КонА. Таким образом, соотношение уровня пролиферации лимфоцитов и продукции цитокинов взаимосвязано, что также показано в ряде работ. Например, уровень пролиферации клеток можно достоверно оценивать по уровню IL-2 на 2-е сутки и IFN-y на 5-е сутки, когда наблюдали максимальное количество белкового продукта (использовали метод оценки продукта ПЦР по конечной точке и ELISPOT). Среди провос-палительных цитокинов наибольшие изменения отмечены для гена il 10, что согласуется с данными ряда исследований, в том числе и с анализом белковых продуктов генов цитокинов Th2-группы [5].
Хорошо известно, что в лимфоцитах человека в Th1-клетках при активации наблюдается увеличение экспрессии транскрипционного фактора T-bet [12]. Представленные в работе данные согласуются с результатами активации клеток по Th1- и по №2-пути, при которой наблюдали повышение уровня T-bet через 24 ч с наибольшим его содержанием в Th1-клетках, через 48 ч экспрессия T-bet в TM-клетках стабилизировалась и не определялась в №2-клетках [13]. Однако в нашей работе пик содержания мРНК гена этого транскрипционного фактора наблюдали через 3 сут культивирования, что связано с разной моделью эксперимента: мы использовали культуру мононуклеарных клеток при стимуляции неспецифическим митогеном, в то время как в работе E. Ylikoski и соавт. [13] использовали гомогенные клоны лимфоцитов и действовали специфически на Т-клеточный рецептор. RORC является членом семейства транскрипционных факторов ROR, данный белок является ДНК-связывающим транскрипционным фактором и относится к ядерным рецепторам гормонов NR1 [14]. Функции этого белка активно изучают, однако достоверно его важная роль определена для лимфоидного органогенеза и тимопоэза [15]. Результаы исследований на мышиной модели показали, что данный белок мог ингибиро-вать экспрессию Fas-лиганда и IL-2. В недавнем исследовании показано, что он являлся ключевым транскрипционным
фактором в развитии ТЫ7-пути и ингибировал экспрессию FOXP3 в лимфоцитах человека. Нокдаун по гену RORC2 приводил к повышению уровня FOXP3 и снижению экспрессии провоспалительных цитокинов ]Ь-1, ]Ь-6, ГЬ-17, ЮТу и ТЫР-а при дифференцировке наивных Т-клеток. Таким образом, роль данного транскрипционного фактора не сводилась только к индукции ТЫ7-пути, он также оказывал супрессор-ное воздействие на регуляторные механизмы [16]. В нашей работе показано повышение экспрессии мРНК данного гена при максимальной пролиферации культуры лимфоцитов, и в кинетике накопления мРНК генов Ш7 и гогс максимальные пики транскрипции совпадают.
В данном исследовании наблюдали увеличение экспрессии всех транскрипционных факторов после 5 сут стимуляции КонА. Можно предположить, что в ходе РБТЛ различные популяции клеток продуцировали большое количество провоспалительных факторов, которые в свою очередь могли быть индукторами других генов.
Существующие к настоящему времени исследования указывают на различные временные интервалы пика экспрессии мРНК гена cd69. Так, в одной работе показано, что при активации пик экспрессии мРНК гена cd69 достигается через 3 ч, а через 8 ч уже возвращается к минимальному уровню [17]. Однако в другом исследовании [18] обнаружили, что максимальное содержание мРНК приходится на 6 ч, а к 24 ч мРНК в культуре не детектируется. Согласно нашим данным, экспрессия мРНК данного гена максимальна в 1-й час действия митогена в среднем в 50 раз выше спонтанной активации. Далее при действии митогена накопления мРНК не наблюдали, в течение всего времени эксперимента уровень экспрессии данного гена в среднем в 15 раз выше, чем в контрольном образце. Это может быть связано с тем, что в более ранних исследованиях использовали менее чувствительные методы оценки мРНК, чем ПЦР-РВ. В ранних работах показано, что кинетика экспрессии мРНК генов cd69 и П2 в активированных Т-лимфоцитах совпадает, однако время полужизни мРНК cd69 составляет от 30 до 45 мин, в результате чего мРНК этого маркера исчезает быстрее, чем мРНК гена П2. Это обусловлено молекулярной структурой мРНК: наличием нескольких Аи-богатых мотивов в нетранслируемой области 3' (3'-Ш^), которые вовлечены в селективную дестабилизацию короткоживущих мРНК многих цитокинов и прото-онкогенов млекопитающих. Предполагается, что быстрая "деградация" мРНК СЭ69 в активированных Т-лимфоцитах участвует в регуляции экспрессии цитокинов и протоокоге-нов через селективную "деградацию" их мРНК [17]. Таким образом, "деградация" мРНК СD69 участвует в запуске многих сигнальных путей при активации лимфоцитов и контролирует экспрессию других сигнальных молекул, молекул адгезии (в частности, Е-селектина). Экспрессия белка, кодируемого данным геном, является маркером ранней активации лимфоцитов и широко используется в различных иммунологических тестах. Увеличение уровня мРНК гена cd69 происходит в более ранние временные интервалы. Согласно нашим данным, в 1-й час действия митогена на культуру мононукле-арных клеток достигается максимум экспрессии. Мы не обнаружили существенных различий между донорами, также в культуре клеток без действия стимула уровень экспрессии данного гена был стабильным на протяжении всего времени наблюдения. Таким образом, данный маркер является надежным показателем ранней активации клеток в первые часы и, возможно, минуты действия активационного агента, что может быть использовано для различных моделей исследования функциональных характеристик лимфоцитов; данные, полученные методом ПЦР-РВ, могут дать более раннюю и очень надежную оценку степени активации лимфоцитов.
Мы продемонстрировали индивидуальные различия в профиле экспрессии ряда цитокинов. Индивидуальные особенности клеточного звена иммунитета являются одной из причин таких различий. В качестве характеристики соотношения ТЫ- и №2-ответов можно рассматривать спектр цитокинов, секретируемых клетками в ответ на стимулы.
Исследование спектра продуцируемых клетками цитокинов может иметь прогностическое значение для описания функционального состояния лимфоцитов. Современные методы анализа позволяют провести комплексное исследование культуры клеток различными методами одновременно. Например, можно исследовать уровень белковых продуктов методом ELISA и проводить ПЦР в одной временн0й точке. С помощью анализа экспрессии мРНК различных генов (в том числе цитокинов) можно создавать комплексные профили селективной индукции и ингибирования большого количества генов, как высокоспецифичных для конкретной популяции клеток крови, так и для общих с другими типами. Это дает широкие перспективы для изучения экспрессии мРНК и белков, открывая новый взгляд на регуляцию и дифференциров-ку клеток иммунной системы.
ЛИТЕРАТУРА
1. Arai K.-I., Lee F., Miyajima A., Miyatake S., Arai N., Yokota T. Cytokines: coordinators of immune and inflammatory responses. Annu. Rev. Biochem. 1990; 59: 783-836.
2. Ullman K.S., Northrop J.P., Verweij C.L., Crabtree G.R. Transmission of signals from the T lymphocyte antigen receptor to the genes responsible for cell proliferation and immune function: the missing link. Annu. Rev. Immunol. 1990; 8: 421-52.
3. Fan J., Nishanian P., Breen E.C., McDonald M., Fahey J.L. Cytokine gene expression in normal human lymphocytes in response to stimulation. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1998; 5 (3): 335-40.
4. Sullivan K.E., Cutilli J., Piliero L.M., Ghavimi-Alagha D., Starr S.E., Campbell D.E et al. Measurement of cytokine secretion, intracellular protein expression, and mRNA in resting and stimulated peripheral blood mononuclear cells. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2000; 7 (6): 920-4.
5. Radke L., López Hemmerling D.A., Lubitz A., Giese C., Frohme M. Induced cytokine response of human PMBC-cultures: correlation of gene expression and secretion profiling and the effect of cryopreservation. Cell. Immunol. 2012; 272 (4): 144-53.
6. Савилова А.М., Чулкина М. М., Трофимов Д.Ю. Исследование степени пролиферации лимфоцитов и экспрессии мРНК генов ИЛ2 и ИЛ2РА в активированных конканавалином А лимфоцитах с помощью ПЦР «в реальном времени». Уральский медицинский журнал. 2011; 3 (81): 78-86.
7. Трофимов Д.Ю., Бурменская О.В., Батенева Е.И., Алексеев Л.П., Насонов Е.Л., Александрова Е.Н и др. Разработка комплекса тест-систем на основе ОТ-ПЦР в режиме «реального времени» для определения цитокинового профиля в мононуклеарных клетках крови и синовиальной жидкости при ревматоидном артрите. Медицинская иммунология. 2008; 10 (6): 563-70.
8. Hanada T., Yoshida T., Kinjyo I., Minoguchi S., Yasukawa H., Kato S. et al. A mutant form of JAB/SOCS1 augments the cy-tokine-induced JAK/STAT pathway by accelerating degradation of wild-type JAB/CIS family proteins through the SOCS-box. J. Biol. Chem. 2001; 276 (44): 40746-54.
9. English B., Weaver W., Wilson C.B. Differential regulation of lymphotoxin and tumor necrosis factor genes in human T lymphocytes. J. Biol. Chem. 1991; 266 (11): 7108-13.
10. De Jager W., Te Velthuis H., Prakken B.J., Kuis W., Rijkers G.T. Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells. Clin. Diagn Lab. Immunol. 2003; 10 (1): 133-9.
11. Vanrompay D., Bouchaut H., Buys N. Comparative analysis of porcine cytokine production by mRNA and protein detection. Vet. Immunol. Immunopathol. 2001; 81 (11): 97-112.
12. Kitamura N., Kaminuma O., Mori A., Hashimoto T., Kitamura F., Miyagishi M. et al. Correlation between mRNA expression of Th1/Th2 cytokines and their specific transcription factors in human helper T-cell clones. Immunol. Cell. Biol. 2005; 83: 536-41.
13. Ylikoski E., Lund R., Kylaniemi M., Filén S., Kilpelainen M., Savolainen J. et al. IL-12 up-regulates T-bet independently of IFN-y in human CD4+ T cells. Eur J. Immunol. 2005; 35: 1-10.
14. He Y.W., Deftos M.L., Ojala E.W., Bevan M.J. RORgamma-t, a novel isoform of an orphan receptor, negatively regulates Fas ligand expression and IL-2 production in T-cells. Immunity. 1998; 9: 797-806.
15. Sun Z., Unutmaz D., Zou Y.R., Sunshine M.J., Pierani A., Brenner-Morton S., Mebius R.E., Littman D.R. Requirement for RORgamma in thymocyte survival and lymphoid organ development. Science. 2000; 288: 2369-73.
16. Burgler S., Mantel P.Y., Bassin C., Ouaked N., Akdis C.A. Schmidt-Weber C.B. RORC2 is involved in T cell polarization through interaction with the FOXP3 promoter. J. Immunol. 2010; 11: 6161-9.
17. Santis A.G., López-Cabrera M., Sánchez-Madrid F., Proudfoot N. Expression of the early lymphocyte activation antigen CD69, a C-type lectin, is regulated by mRNA degradation associated with AU-rich sequence motifs. Eur. J. Immunol. 1995; 25 (8): 2142-6.
18. López-Cabrera M., Santis A.G., Fernández-Ruiz E., Blacher R., Esch F., Sánchez-Mateos P. et al. Molecular cloning, expression, and chromosomal localization of the human earliest lymphocyte activation antigen AIM/CD69, a new member of the C-type animal lectin superfamily of signal-transmitting receptors. J. Exp. Med. 1993; 178 (2): 537-47.
nocTynuna 29.04.14
REFERENCES
1. Arai K.-I., Lee F., Miyajima A., Miyatake S., Arai N., Yokota T. Cytokines: coordinators of immune and inflammatory responses. Annu. Rev. Biochem. 1990; 59: 783-836.
2. Ullman K.S., Northrop J.P., Verweij C.L., Crabtree G.R. Transmission of signals from the T lymphocyte antigen receptor to the genes responsible for cell proliferation and immune function: the missing link. Annu. Rev. Immunol. 1990; 8: 421-52.
3. Fan J., Nishanian P., Breen E.C., McDonald M., Fahey J.L. Cytokine gene expression in normal human lymphocytes in response to stimulation. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1998; 5 (3): 335-40.
4. Sullivan K.E., Cutilli J., Piliero L.M., Ghavimi-Alagha D., Starr S.E., Campbell D.E et al. Measurement of cytokine secretion, intracellular protein expression, and mRNA in resting and stimulated peripheral blood mononuclear cells. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2000; 7 (6): 920-4.
5. Radke L., López Hemmerling D.A., Lubitz A., Giese C., Frohme M. Induced cytokine response of human PMBC-cultures: correlation of gene expression and secretion profiling and the effect of cryopreservation. Cell. Immunol. 2012; 272 (4): 144-53.
6. Savilova A.M., Chulkina M. M., Trofimov D.Yu. Investigation of lymphocyte proliferation rate and il2 and il2ra mRNA expression in concanavalin a-activated lymphocytes by real time PCR. Ural skiy meditsinskiy zhurnal. 2011, t.3 (81), 78-86. (in Russian)
7. Trofimov D.Yu., Burmenskaya O.V., Bateneva E.I., Alekseev L.P., Nasonov E.L., Aleksandrova E.N. et al. Develop a set of test systems based on RT-PCR in "real time" to determine the cytokine profile in blood mononuclear cells and synovial fluid in rheumatoid arthritis. Meditsinskaya immunologiya. 2008; 10(6): 563-70. (in Russian)
8. Hanada T., Yoshida T., Kinjyo I., Minoguchi S., Yasukawa H., Kato S. et al. A mutant form of JAB/SOCS1 augments the cytokine-induced JAK/STAT pathway by accelerating degradation of wild-type JAB/CIS family proteins through the SOCS-box. J. Biol. Chem. 2001; 276 (44): 40746-54.
9. English B., Weaver W., Wilson C.B. Differential regulation of lymphotoxin and tumor necrosis factor genes in human T lymphocytes. J. Biol. Chem. 1991; 266 (11): 7108-13.
10. De Jager W., Te Velthuis H., Prakken B.J., Kuis W., Rijkers G.T. Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells. Clin. Diagn Lab. Immunol. 2003; 10 (1): 133-9.
11. Vanrompay D., Bouchaut H., Buys N. Comparative analysis of porcine cytokine production by mRNA and protein detection. Vet. Immunol. Immunopathol. 2001; 81 (11): 97-112.
12. Kitamura N., Kaminuma O., Mori A., Hashimoto T., Kitamura F., Miyagishi M. et al. Correlation between mRNA expression of
Th1/Th2 cytokines and their specific transcription factors in human helper T-cell clones. Immunol. Cell. Biol. 2005; 83: 536-41.
13. Ylikoski E., Lund R., Kylaniemi M., Filen S., Kilpelainen M., Savolainen J. et al. IL-12 up-regulates T-bet independently of IFN-Y in human CD4+ T cells. Eur J. Immunol. 2005; 35: 1-10.
14. He Y.W., Deftos M.L., Ojala E.W., Bevan M.J. ROR-gamma-t, a novel isoform of an orphan receptor, negatively regulates Fas ligand expression and IL-2 production in T-cells. Immunity. 1998; 9: 797-806.
15. Sun Z., Unutmaz D., Zou Y.R., Sunshine M.J., Pierani A., Brenner-Morton S., Mebius R.E., Littman D.R. Requirement for ROR-gamma in thymocyte survival and lymphoid organ development. Science. 2000; 288: 2369-73.
16. Burgler S., Mantel P.Y, Bassin C., Ouaked N., Akdis C.A. Schmidt-
Weber C.B. RORC2 is involved in T cell polarization through interaction with the Foxp3 promoter. J. Immunol. 2010; 11: 6161-9.
17. Santis A.G., López-Cabrera M., Sánchez-Madrid F., Proudfoot N. Expression of the early lymphocyte activation antigen CD69, a c-type lectin, is regulated by mRNA degradation associated with AU-rich sequence motifs. Eur. J. Immunol. 1995; 25 (8): 2142-6.
18. López-Cabrera M., Santis A.G., Fernández-Ruiz E., Blacher R., Esch F., Sánchez-Mateos P. et al. Molecular cloning, expression, and chromosomal localization of the human earliest lymphocyte activation antigen AIM/CD69, a new member of the C-type animal lectin superfamily of signal-transmitting receptors. J. Exp. Med. 1993; 178 (2): 537-47.
Received 29.04.14
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
УДК 616.9-022.-07:616.155.3-008.13-073.537
Ширшев С.В., Куклина Е.М., Заморина С.А., Некрасова И.В., Никитина Н.М.
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕЙКОЦИТОВ ПО СТЕПЕНИ ГАШЕНИЯ БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ
ФГБУН «Институт экологии и генетики микроорганизмов» УрО РАН, 614081, г Пермь, РФ
Разработан новый инструментальный метод оценки фагоцитоза живых бактериальных объектов, представленных рекомбинантным штаммом E. coli, который несет lux-регулон морской люминесцирующей бактерии V.fischeri («Эколюм-5»). В качестве тестируемых клеток используются цельная периферическая кровь, сепарированные нейтрофилы и мононуклеарные клетки. Принцип метода основан на уменьшении люминесценции E. coli lux+ в динамике поглощения их фагоцитами. В качестве показателя фагоцитарной активности наряду с абсолютными показателями биолюминесценции используется индекс фагоцитарной активности (ИФА), позволяющий сопоставлять абсолютные значения, которые получены в разных клеточных системах. Достоверность метода подтверждена микроскопическим методом оценки процента фагоцитоза латексных частиц, фагоцитарного числа и ИФА. Дополнительно проведена оценка жизнеспособности E. coli lux+ по количеству колониеобразующих единиц в динамике контакта лейкоцитов с объектами фагоцитоза.
Ключевые слова: биолюминесценция; фагоцитоз; E. coli lux+; периферическая кровь; нейтрофилы; мононуклеарные клетки.
Для цитирования: Иммунология. 2014; 35 (6): 312-317. Shirshev S.V., Kuklina E.M., Zamorina S.A., Nekrasova I.V., Nikitina N.M.
THE METHOD FOR DETERMINATION OF LEUKOCYTES PHAGOCYTIC ACTIVITY BY BIOLUMINESCENCE EXTINCTION DEGREE
Institute of ecology and genetics of microorganisms UB RAS, 614081, Perm, RF
The new objective instrumental method of the phagocytosis assessment of viable bacterial cells that are presented by a recombinant of E. coli strain («Ecolum-5») bearing lux-regulon of a sea luminescent bacterium V. fischeri is developed. Whole peripheral blood, separated neutrophils and mononuclear cells are used as testing cells. The principle of the method is based on reduction of E. coli lux+ luminescence during ingestion by phagocytes. In addition to absolute bioluminescence value the index of phagocytic activity (IPA) that enables to compare absolute values received in different cellular systems is used as indicator of phagocytic activity. Reliability of the method is confirmed with microscopic method of assessment of latex particles phagocytosis percent, phagocytic number and phagocytic index. Additionally the estimation of E coli lux+ viability is carried out by number of the colony forming units in dynamics of contact of leukocytes with phagocytosis objects.
Key words: bioluminescence; phagocytosis; E. coli lux+; peripheral blood; neutrophils; mononuclear cells.
Citation: Immenologiya. 2014; 30 (6): 312-317. (in Russian)
Известно, что многие заболевания или патологические состояния сопровождаются изменением фагоцитарной активности лейкоцитов. К настоящему времени разработано достаточное количество методов оценки фагоцитарной активности,
Для корреспонденции: Ширшев Сергей Викторович,
shirshev@iegm. ru
For correspondence: Shirshev Sergey Victorovich, shirshev@ iegm.ru
среди которых наибольшее распространение получили тесты, основанные на регистрации поглощения объектов фагоцитоза клетками. Результаты данных исследований можно учитывать микроскопически, в частности, по поглощению формалини-зированных эритроцитов барана [1] или латексных частиц [2] фагоцитами крови. Другой распространенный метод - проточная цитометрия с использованием витальных красителей. Таким образом оценивают фагоцитоз дрожжей [3], стафилококков [4-6] и других микроорганизмов. Известен и метод оценки поглощения бактерий, меченных радиоизотопами [7].
