CC BY
202
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ И ИММУНОГЕНЕТИКА
- 2009. - Т. 13, № 4. - С. 21-25.
3. Фрейдин М. Б., Рудко А. А., Колоколова О. В. и др. Сравнительный анализ структуры наследственной компоненты подверженности туберкулезу у тувинцев и русских // Молекул. биол. - 2006. - Т. 40, № 2. - С. 252-262.
4. Agranoff D., Monahan I. M., Mangan J. A. et al. Mycobacterium tuberculosis expresses a novel pH-dependent divalent cation transporter belonging to the Nramp family // J. Exp. Med. - 1999.
- Vol. 190, P. 717-724
5. Barton C. H., Biggs T. E., BakerS. T. et al. Nramp1: a link between intracellular iron transport and innate resistance to intracellular pathogens // J. Leuk. Biol. - 1999. - Vol. 66. - P. 757-762.
6. Bellamy R. Genetic susceptibility to tuberculosis // Clin. Chest Med. - 2005. - Vol. 26, N 2. - P 233-246.
7. Brookes A. J. The essence of SNPs/Gene. - 1999. - Vol. 234. - P 177-186.
8. Cellier M., Govoni G., Vidal S. et al. Human natural resistance-associated macrophage protein: cDNA cloning, chromosomal mapping, genomic organization and tissue-specific expression // J. Exp. Med. - 1994. - Vol. 180. - P. 1741-1752.
9. Deluca H. F., Cantorna M. T. Vitamin D: its role and uses in immunology // FASEB J. - 2001. - Vol. 15, N 14. - P 2579-2585.
10. Dye C. et al. Measuring tuberculosis burden, trends and the impact of control programmes Supporting online material // Jnt. Tubercle Lung Dis. - 2005. - Vol. 9, - P. 1-8.
11. Gao L. et al. Vitamin D receptor genetic polymorphisms and tuberculosis: updated systematic review and meta-analysis // Int. J. Tuberc. Lung. Dis. - 2010. - Vol. 14, N 1. - P. 15-23.
12. Leandro A. C. C. S. et al. Genetic polymorphisms in vitamin D receptor, vitamin D-binding protein, Toll-like receptor 2, nitric oxide synthase 2, and interferon-gamma genes and its association with susceptibility to tuberculosis // Brazil. J. Med. Biol. Res. -2009. - Vol. 42, N 4. - P. 312-322.
13. LiH. T. et al. SLC11A1 (formerly NRAMP1) gene polymorphisms and tuberculosis susceptibility: a meta-analysis // Int. J. Tuberc. Lung Dis. - 2006. - Vol. 10, N 1. - P. 3-12.
14. Li X. et al. SLC11A1 (NRAMP1) polymorphisms and tuberculosis susceptibility: updated systematic review and meta-analysis // PloS One. - 2011. - Vol. 6, N 1. - P. e15831.
15. Morris G. a J. et al. Interleukin 12B (IL-12B) genetic variation and polmonary tuberculosis: a study of cohorts from The Gambia, Gvinea-Bissau, United States and Argentina // PloS One. - 2011. - Vol. 6, N 2. - P. e16656.
16. Ottenhoff T. H. M. et al. Control of human host immunity to mycobacteria // Tuberculosis (Edinburgh). - 2005. - Vol. 85, N 1-2. - P. 53-64.
17. Stein C. Genetic epidemiology of tuberculosis susceptibility: Impact of study design // PloS Pathogen. - 2011. - Vol. 7, N 1. -P.
18. United T. et al. Heredity versus environment in tuberculosis in Twins // Crit. Care Med. - 1978. - Vol. 16, N . - P. e1001189
19. Velez D. R. et al. Association of SLC11A1 with tuberculosis interactions with NOS2A and TLR2 in African-Americans and Caucasians // Int. J. - 2010. - Vol. 13, N 9. - P. 1068-1076.
Поступила 29.03.12
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 612.017.1:796].083.3
М. Н. Болдырева1, С. В. Царев1, М. М. Чулкина2, А. М. Савилова2, О. В. Бурменская2,
Д. Ю. Трофимов2, Н. И. Ильина1, Н. В. Шартанова, л. П. Алексеев1
ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ У СПОРТСМЕНОВ
высших достижений методом пцр в реальном ВРЕМЕНИ
1ФГБУ ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России (115478, г. Москва, Каширское ш., д. 24, корп. 2), 2ЗАО НПФ "ДНК-Технология" (г Москва, Варшавское ш., д. 125ж, корп. 6)
У спортсменов из молодежной сборной России по тяжелой атлетике, в которую были включены практически здоровые, часто болеющие респираторными заболеваниями, а также с аллергией вне обострения, методом полимеразной цепной реакции в реальном времени в слизистой носоглотки и мононуклеарах периферической крови провели исследование экспрессии (мРНК) широкого спектра генов, кодирующих факторы, которые участвуют в развитии иммунных реакций - интерлейкин (IL)-1p, фактор некроза опухоли a, IL-8, IL-18; Toll-line receptor 2 (TLR2), TLR4, TLR9, интерферон (IFN)-a, IFN-y, IL-28, IL-29, CD45, CD68, CD56, GATA3, TBX21, RORC2, FoxP3, трансформирующий фактор роста Pr Изменения в виде повышения экспрессии генов цитокинов, участвующих в реализации воспаления (IL-1, IL-8), рецепторов врожденного иммунитета (TLR2, TLR4) и снижения экспрессии транскрипционного фактора RORC2, обеспечивающего обратную регуляцию воспаления, выявили только у спортсменов с аллергией (вне обострения) и только в тканях носоглотки.
Ключевые слова: экспрессия генов, ПЦР, мРНК, иммунная система, спорт высоких достижений
M.N. Boldyreva, S.V Tsarev, M.M. Chulkina, A.M. Savilova, O.V. Burmenskaya, D.Yu. Trofimov, N.I. Ilyina, N.I. Shartanova, L.P. Alekseev
A STUDY OF THE EXPRESSION OF GENES OF THE IMMUNE SYSTEM OF THE ATHLETES OF THE HIGHEST ACHIEVEMENTS OF THE PCR METHOD IN THE REAL TIME
Group of sportsmen of the youth national team of Russia in heavy athletics, which included practically healthy, with frequent respiratory diseases and athletes with allergies without exacerbation, the method of PCR in real time in the mucous membrane of the nose, throat and peripheral blood mononuclear a study was conducted of expression (mRNA) of a wide spectrum of genes involved in the development of immune reactions: IL-1P, TNF-a, IL-8, IL-18; TLR2 and TLR4, TLR9, IFN-a, IFNy, IL-28, IL-29, CD45, CD68, CD56, GATA3, TBX21, RORC2, Foxp3, TGF-31. Changes in the form of increased expression of genes involved in the implementation of inflammation (IL-1, IL-8), receptors in innate immunity (TLR2 and TLR4) and the lower of the expression of transcription factor RORC2, providing retroactive regulation of inflammation are revealed only in athletes with Allergy (non-acute) and only in the tissues of the nose, throat.
Key words: gene expression, PCR, mRNA, the immune system, the sport of high achievements
- 231 -
ИММУНОЛОГИЯ № 5, 2012
Введение. Одной из серьезных проблем мирового спорта высоких достижений является сохранение высокой спортивной формы, достигнутой во время подготовки к соревнованиям, в период проведения самих соревнований. Известно, что у части спортсменов в этот период ухудшаются спортивные результаты из-за возникновения ОРЗ. Ранее считалось, что все ОРЗ - это инфекции, которые развиваются на фоне временной «иммунологической недостаточности» вследствие интенсивного тренировочного процесса в период подготовки к соревнованиям.
Факты, которые были накоплены исследователями в области спортивной медицины за последние 20 лет, свидетельствуют о том, что только 1/3 ОРЗ у спортсменов высших достижений вызваны инфекциями, преимущественно вирусными. Еще 1/3 заболеваний обусловлены неинфекционным воспалением, например аллергическим или аутоиммунным. Причины оставшейся части ОРЗ у спортсменов остаются пока не установленными. Но поскольку независимо от этиологии воспалительного процесса все варианты острых заболеваний верхних дыхательных путей клинически проявляются сходным образом, всю группу предложено называть острыми респираторными симптомами (ОРС) [17].
Непосредственной причиной появления большинства респираторных симптомов независимо от этиологии (инфекция, аллергия, аутоиммунитет, травма) является воспаление в тканях верхних дыхательных путей. Механизм реализации воспаления также универсален - это каскадная активация широкого спектра клеток, обеспечивающих функцию врожденного и адаптивного иммунитета. Активация клеток сопровождается увеличением синтеза активационных и регуляторных молекул, цитокинов и хемокинов, а также рецепторов к ним.
Пока окончательно неизвестно, можно ли воспаление, вызванное разными этиологическими причинами, связать с определенным спектром активированных молекул, но работы в этом направлении ведутся в различных лабораториях мира. Очень важным и перспективным представляется установление спектра или профиля самих молекул (или профиля экспрессии генов этих молекул), которые характеризуют конкретный тип воспаления. Установление типа и силы воспалительной реакции непосредственно в тканях позволит как диагностировать, так и прогнозировать развитие воспалительных заболеваний респираторного тракта у спортсменов высших достижений в разные периоды тренировочного процесса и соревнований.
Решение этой задачи стало возможным только в самое последнее время в связи с разработкой новой технологии -полимеразной цепной реакции с регистрацией результатов в реальном времени (ПЦР РВ), которая обеспечивает возможность количественной оценки экспрессии любых генов, в том числе генов, участвующих в иммунном ответе. Настоящее исследование - пилотное в данном направлении.
Цель работы - исследовать уровень экспрессии широкого спектра генов иммунной системы в тканях верхних дыхательных путей и мононуклеарах периферической крови у спортсменов высших достижений.
Материалы и методы. В исследовании принимала участие группа спортсменов - молодежная сборная России по тяжелой атлетике (п = 22). Ото всех спортсменов было получено письменное информированное согласие на проведение исследования. Клиническое обследование включало сбор анамнеза, клинический осмотр и кожные тесты с аллергенами.
У всех спортсменов провели исследование уровня экспрессии мРНК генов иммунной системы, кодирующих следующие белки: интерлейкин (IL)-1p, IL-8, IL-18, IL-28, IL-29, фактор некроза опухоли a (TNFa), Toll-like receptor 2 (TLR2), TLR4, TLR9, интерферон (IFN)-a, IFN-y, CD45, CD68, CD56,
Алексеев Леонид Петрович - д-р мед. наук, проф., тел. 8(499) 617-78-22
GATA3, TBX21, RORC2, Foxp3, трансформирующий фактор роста Р1 (TGF-P1).
Уровень экспрессии генов определяли методом ПЦР РВ с предварительным проведением реакции обратной транскрипции мРНК соответствующих генов (оборудование и реагенты производства НПФ «ДНК-Технология», Москва).
Уровень экспрессии генов выражали в условных единицах относительно нормировочных генов (GUSB, HPRT1, B2M), имеющих относительно устойчивый уровень экспрессии, что является необходимым условием для вычисления нормировочного фактора (NF).
Экспрессию генов вычисляли по стандартной формуле:
N = EA(Cpmin - Cp)/NF,
где E - эффективность ПЦР (вычисляли в автоматическом режиме с помощью программного обеспечения амплификатора ДТ-96, «ДНК-Технология»); Cpmin - минимальное значение порогового цикла исследуемого цитокина в данном эксперименте; Cp - значение порогового цикла цитокина.
Материалом для исследования экспрессии генов служили соскоб эпителиальных клеток из носоглотки и мононуклеары периферической крови.
В момент взятия биоматериала все спортсмены были практически здоровы или вне стадии обострения заболеваний.
Результаты статистически обрабатывали непараметрическим методом (64est Mann-Whitney) с помощью пакета статистических программ Statistica.
На основании клинико-анамнестических данных всех спортсменов разделили на 3 группы. В 1-ю группу вошли спортсмены (n = 10), не имеющие клинического диагноза (практически здоровые), во 2-ю (n = 7) - имевшие в анамнезе хронические инфекции (герпес-вирусная, хронический тонзиллит, частые ОРВИ), в 3-ю (n = 5) - с анамнестическими данными о любых проявлениях аллергических реакций и/или имеющие положительные кожные пробы и/или имеющие лабораторные признаки аллергических реакций (повышенный уровень IgE).
Результаты и обсуждение. При исследовании уровня экспрессии генов, обеспечивающих функционирование врожденного и адаптивного иммунитета в трех группах спортсменов высших достижений, выявили между ними ряд различий. Все полученные результаты представлены в таблице.
Все исследованные гены можно условно разделить на 5 групп в зависимости от их роли в функционировании иммунной системы.
К 1-й группе можно отнести гены, участвующие в реализации как острого, так и хронического воспаления: IL1B, IL8 [18], TNFa [16] и IL18 [2]. В нашем исследовании у спортсменов из 1-й (норма) и 2-й (хронические инфекции) группы уровень экспрессии генов IL1B и IL8 в слизистой носа были такими же, что и в крови. У спортсменов из 3-й группы (аллергия) уровень экспрессии генов IL1B и IL8 был повышен по сравнению с таковым в группе контроля (1-я группа) только в слизистой носа, но не отличался от аналогичного показателя в группе контроля в крови. Повышенный уровень экспрессии генов IL1B и IL8 только в тканях слизистой носа свидетельствует о наличии локальной воспалительной реакции в области контакта с аллергеном даже при отсутствии клинических симптомов аллергии.
Уровень экспрессии гена IL18 в тканях носоглотки во всех группах в несколько раз превышал уровень экспрессии этого гена в крови, различий между группами не обнаружили. Уровень экспрессии гена TNFa, наоборот, оказался в несколько раз выше в крови, чем в слизистой носоглотки, и он также не различался в группах. Вероятно, продукты указанных генов не участвуют в реализации той степени воспаления, которое имелось у спортсменов с аллергией (3-я группа) вне стадии обострения.
Группа генов, кодирующих TLR, связана с функцией врожденного иммунитета. Эти рецепторные молекулы экспрессируются фагоцитирующими клетками, а также эпителиальными
- 232 -
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ И ИММУНОГЕНЕТИКА
Уровень экспрессии генов иммунной системы у спортсменов
Материал Норма (1-я группа) Хронические инфекции (2-я группа) Аллергия (3-я группа)
слизистая носоглотки 10 7 5
Ген (норма)
кровь (норма) 9 7 4
медиа- квартальный медиана квартальный размах* медиана квартальный 1-3 2-3
на размах* размах*
Воспаление
IL1 Слизистая носоглотки 7,5 20,5 3,7 7,5 90,5 284,6 < 0,05 < 0,05
Кровь 3,4 3,1 3,4 2,2 5,0 3,5 Нд Нд
Р Нд Нд Нд Нд Нд
IL8 Слизистая носоглотки 8,4 16,9 3,4 6,6 116,7 244,0 Нд < 0,05
Кровь 8,0 2,1 13,0 7,5 7,9 4,1 Нд Нд
Р Нд Нд Нд Нд Нд
IL18 Слизистая носоглотки 8,0 2,4 8,0 4,7 3,9 1,8 Нд Нд
Кровь 2,0 1,6 1,5 0,4 1,6 0,5 Нд Нд
Р < 0,001 < 0,001 < 0,05 Нд Нд
TNFA Слизистая носоглотки 2,7 1,3 2,2 2,0 6,4 2,8 Нд Нд
Кровь 12,7 3,4 13,0 3,4 8,4 8,0 Нд Нд
Р < 0,001 < 0,001 Нд Нд Нд
Рецепторы врожденного иммунитета
TLR2 Слизистая носоглотки 2,9 3,8 2,6 2,0 24,3 19,4 Нд < 0,05
Кровь 18,0 6,9 18,0 10,3 13,7 5,0 Нд Нд
Р < 0,001 < 0,001 Нд Нд Нд
TLR4 Слизистая носоглотки 4,4 8,5 3,0 0,7 52,0 56,1 < 0,05 < 0,01
Кровь 42,2 25,3 41,3 27,1 33,2 ОО об Нд Нд
Р < 0,001 < 0,001 Нд Нд Нд
TLR9 Слизистая носоглотки 3,2 2,5 2,6 2,1 18,4 13,8 Нд Нд
Кровь 18,8 8,3 16,8 13,9 13,6 5,9 Нд Нд
Р < 0,001 < 0,01 Нд Нд Нд
IFN
FNA Слизистая носоглотки 47,5 56,2 62,5 45,2 92,6 135,7 Нд Нд
Кровь 7,8 8,6 4,3 9,0 4,8 5,4 Нд Нд
Р < 0,001 < 0,001 < 0,05 Нд Нд
FNG Слизистая носоглотки 6,3 4,8 3,0 30,8 6,4 3,0 Нд Нд
Кровь 4,3 1,8 4,0 5,0 8,1 5,8 Нд Нд
Р Нд Нд Нд Нд Нд
IL28 Слизистая носоглотки 0 0 0 0 0 0 Нд Нд
Кровь 1,0 2,1 0 3,3 0 0 Нд Нд
Р Нд Нд Нд Нд Нд
IL29 Слизистая носоглотки 0 1,7 0 0 0 0 Нд Нд
Кровь 0 0 0 0 0 0 Нд Нд
Р Нд Нд Нд Нд Нд
Маркеры дифференцировки клеток
CD45 Слизистая носоглотки 4,1 2,0 1,9 1,1 40,3 42,6 Нд Нд
Кровь 62,5 15,0 68,6 23,1 58,9 36,7 Нд Нд
Р < 0,001 < 0,01 Нд Нд Нд
CD68 Слизистая носоглотки 4,1 3,0 3,0 2,5 5,0 4,8 Нд Нд
Кровь 6,2 1,9 4,2 1,3 5,2 4,0 Нд Нд
Р Нд Нд Нд Нд Нд
CD56 Слизистая носоглотки 0 0 0 1,4 0 1,0 Нд Нд
Кровь 28,5 37,1 39,4 11,2 24,0 20,8 Нд Нд
Р < 0,001 < 0,001 < 0,05 Нд Нд
- 233 -
ИММУНОЛОГИЯ № 5, 2012
Регуляторные факторы
TGFfi Слизистая носоглотки 2,8 2,9 2,4 1,7 10,6 10,9 Нд Нд
Кровь 49,6 15,8 50,8 18,5 37,0 31,2 Нд Нд
Р < 0,001 < 0,001 < 0,05 Нд Нд
FOXP3 Слизистая носоглотки 2,6 1,8 3,0 2,7 2,4 2,3 Нд Нд
Кровь 12,7 4,7 11,6 12,2 11,7 4,5 Нд Нд
Р < 0,001 < 0,001 < 0,05 Нд Нд
TBX21 Слизистая носоглотки 8,6 6,1 6,7 4,1 5,0 6,4 Нд Нд
Кровь 154,0 43,8 157,6 56,8 110,3 161,2 Нд Нд
Р < 0,001 < 0,01 < 0,05 Нд Нд
GATA3 Слизистая носоглотки 2,0 0,4 3,0 1,8 2,4 2,8 Нд Нд
Кровь 14,9 4,4 13,9 5,1 8,7 97,4 Нд Нд
Р < 0,001 < 0,05 < 0,05 Нд Нд
RORC2 Слизистая носоглотки 215,6 188,6 90,6 158,3 48,5 41,4 < 0,01 Нд
Кровь 9,4 6,5 18,8 17,2 9,8 6,5 Нд Нд
Р < 0,001 < 0,01 Нд Нд Нд
Примечание. *- квартальный размах - разность значений 75-й и 25-й процентили; диапазон вокруг медианы, который содержит 50% наблюдений; Нд - недостоверно.
клетками респираторного тракта, участвующими во врожденном иммунитете [3]. Молекулы TLR обеспечивают распознавание химических структур, общих для различных инфекционных агентов, что позволяет организму быстро реагировать относительно неспецифическим ответом на различные возбудители инфекций. Так, TLR2 связывается с липопротеинами/ липопептидами, пептидогликанами грамположительных бактерий, некоторыми структурными вирусными белками, гемаг-глютинином вируса кори, зимозаном сахаромицетов и т. д. [2]; TLR4 - с липополисахаридами грамположительных бактерий, оболочечными белками некоторых вирусов, TLR9 - с эндоли-зосомным немитилированным CpG-мотивом бактерий и вирусов и также с эндогенной ДНК.
В нашем исследовании уровень экспрессии генов TLR2, TLR4 и TLR9 в 1-й (норма) и 2-й (хроническое воспаление) группах не отличался и в ткани слизистой носоглотки, и в крови. В крови уровень экспрессии генов TLR2, TLR4 и TLR9 был выше, чем в ткани носоглотки. У спортсменов из 3-й группы (аллергия) уровень экспрессии всех исследованных генов TLR был повышен в тканях и одновременно снижен в крови, следствием чего стало то, что различия в экспрессии этих генов между кровью и тканями слизистой носоглотки в 3-й группе в отличие от 1-й и 2-й групп оказались недостоверными. Количество человек в исследованных группах было небольшим, тем не менее повышение экспрессии генов TLR в ткани носоглотки у спортсменов с аллергией, особенно генов TLR2 и TLR4, было достоверным. Необходимо продолжение исследований для выяснения причин активации рецепторов врожденного иммунитета у спортсменов с аллергией вне стадии обострения. Отсутствие повышения экспрессии генов TLR у спортсменов из 2-й группы закономерно при отсутствии активного инфекционного процесса в тканях носоглотки.
IFN I (а/p) и II (у) типов - это белки с противовирусной активностью, они секретируются клетками с функцией врожденного иммунитета в ответ на различные стимулы. Кроме противовирусного действия, IFN оказывают антибактериальное и антипаразитарное. В самое последнее время IFN стали рассматривать и как важные регуляторы клеточной пролиферации, дифференцировки, жизнеспособности и смерти клеток, а также как активаторы специализированных функций клеток особенно в иммунной системе. Доказано, что эти белки играют важную роль в развитии инфекционных, аутоиммунных и онкологических заболеваний [11]. В нашем
исследовании наиболее высокий уровень экспрессии установили для IFN-а в тканях слизистой носоглотки. Уровень экспрессии этого гена в исследованных группах не различался. Уровень экспрессии гена IFN-а у спортсменов с аллергией был выше, чем в других группах, но большой разброс показателей и маленькая выборка (n = 4) не позволили доказать различия между 3-й группой (аллергия) и остальными. В крови уровень экспрессии гена IFN-а во всех группах был существенно ниже, чем в слизистой носоглотки. Вероятно, IFN-а может принимать участие в местных воспалительных реакциях при аллергии вне обострения, однако это предположение требует дополнительной проверки на большей выборке. Уровень экспрессии IFN-y не различался как во всех группах, так и между аналогичным показателем в ткани слизистой носоглотки и крови, что, вероятно, соответствует отсутствию клинических симптомов воспаления в респираторном тракте во всех группах спортсменов.
В последнее время большое внимание исследователи уделяют изучению недавно открытых IFN III типа (IFN-Х - IL-28/29). Считается, что они участвуют в раннем иммунном ответе против вирусных инфекций. Однако до сих пор остается неизвестным, каким образом они участвуют в противовирусной резистентности [10]. В нашем исследовании экспрессия генов IFN-Х (IL-28, IL-29)) во всех группах спортсменов как в крови, так и в тканях слизистой носоглотки была или очень низкой, или полностью отсутствовала. Полученные результаты могут быть связаны с тем, что этот тип IFN синтезируется при острых вирусных инфекциях, а в нашем исследовании спортсмены на момент исследования не имели клинических признаков вирусной инфекции.
Ранее полученными доказательствами влияния интенсивных физических нагрузок на функции иммунной системы у спортсменов высших достижений стали количественные и качественные изменения субпопуляционного состава клеток в периферической крови [17]. Мы также провели исследование уровня экспрессии генов ряда дифференцировочных маркеров клеток, ранее изучавшихся только методом проточной цитометрии.
Установили, что молекула CD45 (подобная рецептору тирозинфосфатазы) экспрессирована почти на всех гематопоэтических клетках, но ее наибольшее количество экспрессируется на лимфоцитах. Наивысшую экспрессию наблюдали на T-натуральных киллерах (NKT-клетках). Она экспресси-
- 234 -
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ И ИММУНОГЕНЕТИКА
руется также на цитотоксических/супрессорных T-, NK-, хел-перных T- и B-клетках [9]. В нашем исследовании уровень экспрессии гена CD45 в крови у спортсменов из 1-й (норма) и 2-й (хронические инфекции) групп был существенно выше, чем в ткани слизистой носоглотки. У спортсменов из 3-й группы (аллергия) уровень экспрессии CD45 в крови и слизистой носоглотки не различался из-за увеличения значений экспрессии этого гена в ткани носоглотки в сочетании с отсутствием различий по этому показателю в группе контроля в крови. Предположение о том, что полученные данные могут свидетельствовать о местной лимфоцитарной реакции у спортсменов с аллергией вне обострения требует последующего подтверждения.
Другой дифференцировочный маркер клеток иммунной системы - CD68, гликопротеин, считается маркером моно-цитов/макрофагов, но он относительно неспецифичен, экспрессируется также на миелоидных, дендритных клетках, фибробластах, клетках Лангерганса и других [7]. В нашем исследовании различий в уровне экспрессии этого гена между группами спортсменов, а также в разных тканях (кровь и слизистая носоглотки) не выявили, что свидетельствует о том, что клетки, на которых экспрессируется CD68, не участвуют в аллергическом воспалении вне обострения.
Маркером зрелых NK-клеток считают молекулу CD56
[5] . NK-клетки представляют первую линию защиты против инфекций и опухолевых метастазов. Эти клетки проявляют иммунорегуляторную активность путем секреции множества цитокинов и хемокинов, а также путем взаимодействия с дендритными клетками для реализации врожденного и адаптивного иммунного ответов [13]. В нашем исследовании экспрессия этого гена в тканях слизистой носа практически отсутствовала, в крови уровень экспрессии в разных группах спортсменов не различался, что свидетельствует о том, что эти клетки у них не были активированы.
Следующая группа исследованных генов имеет отношение к регуляции иммунных функций. К этой группе можно отнести TGF-р, который играет ключевую роль в реализации разнообразных клеточных функций, включая пролиферацию клеток, апоптоз, дифференцировку, миграцию, адгезию, ангиогенез, стимуляцию синтеза внеклеточного матрикса и обратную регуляцию его деградации. TGF-Р и его рецепторы повсеместно экспрессируются большинством типов клеток и тканей [8]. Что касается его роли в иммунном ответе, то установлено, что TGF-Р - это плейотропный цитокин, который может влиять на регуляторный или воспалительный ответ в зависимости от уровня других цитокинов, присутствующих в микроокружении
[6] . В нашем исследовании экспрессия гена TGF-Р была выше в крови, чем в ткани слизистой носоглотки, во всех группах спортсменов и различий между группами не было. В слизистой носоглотки наибольшие значения, как и разброс показателей экспрессии, наблюдали у спортсменов с аллергией. Вероятно, этот ген может быть задействован в местной иммунной реакции ткани у спортсменов с аллергией. Это предположение требует проведения дальнейших исследований.
Ген TBX21 - человеческий ген, аналог мышиного гена T-bet (T-box - транскрипционный фактор), был впервые описан как фактор транскрипции, который ответствен за развитие THl-ответа [14]. Транскрипционный фактор GATA3 играет ключевую роль в дифференцировке T-клеток, участвующих в ХШ-ответе [15]. Ген FoxP3 имеет непосредственное отношение к T-регуляторным клеткам (T-reg) [15]. А транскрипционный фактор, ген RORC2 (у мышей - ROR-y), влияет на дифференцировку TH17-клеток [15]. В нашем исследовании экспрессия генов TBX21, GATA3 и FoxP3, участвующих в регуляции иммунного ответа, в крови была выше, чем в слизистой носоглотки, во всех группах спортсменов, а гена RORC2, наоборот, ниже. Экспрессия этого гена в слизистой носоглотки в 1-й группе (норма) была выше, чем у спортсменов с аллергией. По другим регуляторным генам различий между группами в уровне экспрессии в ткани носоглотки не выявили.
Снижение экспрессии гена RORC2 в слизистой носоглотки у спортсменов с аллергией при повышении экспрессии генов, ассоциированных с воспалением, довольно неожиданно. Опубликованы работы, в которых, наоборот, при аллергическом рините уровень экспрессии гена RORC2 был выше, чем в контроле, и коррелировал с тяжестью заболевания [12]. Хроническое воспаление при хронической обструктивной болезни легких [4] не сопровождалось значимыми изменениями уровня экспрессии этого гена по сравнению с аналогичным показателем в контроле. А в работе S. Qu и соавт. на мышиной модели аллергического ринита продемонстрировали снижение экспрессии гена RORC в результате контакта с аллергеном [14]. Необходимо проведение дополнительных исследований для объяснения полученных нами результатов.
Заключение. На относительно небольшой группе спортсменов высших достижений, в которую были включены практически здоровые, часто болеющие респираторными заболеваниями, а также с аллергией вне обострения, было проведено пилотное исследование экспрессии широкого спектра генов, участвующих в развитии иммунных реакций.
Полученные результаты свидетельствуют об изменениях функции иммунитета только у спортсменов с аллергией (вне обострения) и только в тканях носоглотки, т. е. в месте первичного контакта периферической иммунной системы с вдыхаемым воздухом, который может содержать возбудителей респираторных инфекций и/или аллергены. Обнаруженные изменения профиля экспрессии генов иммунной системы выражались в повышении уровня экспрессии генов, участвующих в реализации воспаления (IL-1, IL-8), рецепторов врожденного иммунитета (TLR2, TLR4) и снижении уровня экспрессии транскрипционного фактора RORC2, обеспечивающего обратную регуляцию воспаления.
Для установления индивидуальных профилей активированных генов иммунной системы, характеризующих различные формы воспаления при респираторных заболеваниях разной этиологии у спортсменов высших достижений из разных видов спорта, необходимо проведение не только одномоментных, но и динамических исследований экспрессии генов иммунной системы в разные периоды тренировочного процесса и соревнований. В ходе таких исследований могут быть получены результаты, на основании которых будет возможен индивидуальный прогноз развития заболеваний респираторного тракта в наиболее ответственные периоды подготовки спортсменов высших достижений.
ЛИТЕРАТУРА
1. Трофимов Д. Ю., Бурменская О. В., Батенева Е. И. и др. Разработка комплекса тест-систем на основе ОТ-ПЦР в режиме реального времени для определения цитокинового профиля в мононуклеарных клетках крови и синовиальной жидкости при ревматоидном артрите. Мед. иммунол. 2008; 10(6): 563-570.
2. Balachandran Manavalan, Shaherin Basith, Sangdun Choi. Similar structures but different roles - an updated perspective on TLR structures. Front. Physiol. 2011; 2: 41.
3. Bals R., Hiemstra P. S. Innate immunity in the lung: how epithelial cells fight against respiratory pathogens. Eur. Respir. J. 2004; 23(2): 327-333.
4. Di Stefano A., Caramori G., Gnemmi I. et al. T helper type 17-related cytokine expression is increased in the bronchial mucosa of stable chronic obstructive pulmonary disease patients. Clun. Exp. Immunol. 2009; 157(2): 316-324.
5. Freud A. G., Yokohama A., Becknell B. et al. Evidence for discrete stages of human natural killer cell differentation in vivo. J. Exp. Med. 2006; 203(4): 1033-1043.
6. Ganesh B. B., Bhattacharya P., GopisettyA. et al. IL-1P promotes TGF-P1 and IL-2 dependent FoxP3 expression in regulatory T cells. PLoS One 2011; 6(7): e21949.
7. Harris J. A., Jain S., Ren Q. et al. CD163 versus CD68 in tumor associated macrophages of classical hodgkin lymphoma. Diagn. Pathol. 2012; 7: 12.
- 235
ИММУНОЛОГИЯ № 5, 2012
8. Hayashi H., Sakai T. Biological significance of local TGF-P activation in liver diseases. Front. Physiol. 2012; 3: 12.
9. Im M., Chae H., Kim T. et al. Comparative quantitative analysis of cluster of differentiation 45 antigen expression on lymphocyte subsets. Korean J. Lab. Med. 2011; 3(13): 148-153.
10. Kotenko S. V IFN-Xs. Curr. Opin. Immunol. 2011; 23(5): 583-590.
11. Li M. L., Tian W. W., Gao Y. D. et al. Genome-wide prediction of interferon family members of tree shrew and their molecular characteristics analysis. Dongwuxue Yanjiu 2012; 33(1): 67-74.
12. LuH. G., PengH., Chen D. H. et al. Relationship between allergic symptoms and RORC2, and IL-17 in patients with allergic rhinitis. Zhonghua Er Bi Yan Hou Tou Jing Wai Ke Za Zhi 2011; 46(2): 144-148.
13. Pandya A. D., Al-Jaderi Z., HoglundR. A. et al. Identification of human NK17/NK1 cells. PLoS One 2011; 6(10): e26780.
14. Qu S. H., Li M., Liang J. P. et al. Change of Th17 and expression of RORyt in a murine model of allergic rhinitis after a stimulation
of allergen and corticosteroid. Zhonghua Yi Xue Za Zhi 2011; 91(6): 401-404.
15. Quaglino P., Bergallo M., Ponti R. et al. Th1, Th2, Th17 and regulatory T cell pattern in psoriatic patients: Modulation of cytokines and gene targets induced by etanercept treatment and correlation with clinical response. Dermatology 2011;
16. Solinhac R., Mompart F., Martin P. et al. Transcriptomic and nuclear architecture of immune cells after LPS activation. Front Physiol. 2011; 2: 41.
17. Walsh N. P., Gleeson M., ShephardR. J. et al. Position statement. Part one: Immune function and exercise. Exerc. Immunol. Rev. 2011; 17: 6-63.
18. Zimmermann H. W., Seidler S., Gassler N. et al. Interleukin-8 is activated in patients with chronic liver diseases and associated with hepatic macrophage accumulation in human liver fibrosis. PLoS One 2011; 6(6): e21381.
Поступила 02.04.12
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 618.3-008.6-092:612.017.1.014
В. А. Михайлова, О. М. Овчинникова, С. А. Сельков, Д. И. Соколов
особенности трансэндотелиальной миграции мононуклеаров периферической крови при физиологической беременности и гестозе
Лаборатория иммунологии ФГБУ Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта СЗО РАМН (199034, г Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3)
гестоз по сравнению с физиологической беременностью сопровождается повышенной функцией адгезии лимфоцитов и моноцитов периферической крови к эндотелию. Целью настоящей работы стала оценка функции трансэндотелиальной миграции лимфоцитов и моноцитов при физиологическом течении беременности и гестозе. Выявлено, что при гестозе количество T-лимфоцитов, CD4+-T-лимфоцитов, CD8+-T-лимфоцитов, NK-клеток и NKT-клеток, мигрировавших через монослой эндотелиальных клеток, снижено по сравнению с таковым при физиологической беременности, что отражает функциональные нарушения лимфоидных клеток иммунной системы при данной патологии. Работа выполнена при финансовой поддержке грантов НШ № 131.2012.7, ТК № 02.740.11.0711, МД-150.2011.7.
Ключевые слова: беременность, гестоз, трансэндотелиальная миграция, мононуклеары, лимфоциты, моноциты
V.A. Mikhaylova, O.M. Ovchinnikova, S.A. Selkov, D.I. Sokolov
CHARATERISTICS OF TRANSENDOTHELIAL MIGRATION OF PERIPHERAL BLOOD MONONULAER CELLS IN CASE OF HEALTHY PREGNANCY AND PREECLAMPSIA
Preeclampsia is associated with intensified adhesion function of peripheral blood lymphocytes and monocytes to endothelium. The aim of the present study was the assessment of transendothelial migration of lymphocytes and monocytes in case of healthy pregnancy and preeclampsia. We showed that in case of preeclampsia the amount of T-lymphocytes, CD4+ T-lymphocytes, CD8+ T-lymphocytes, NK-cells and NKT-cells which migrated through endothelial monolayer decreased when comparing with healthy pregnancy. This decrease is a possible result of malfunction of lymphoid cells in case of preeclampsia. This work was supported by grants НШ-131.2012.7, ГК №02.740.11.0711, МД-150.2011.7.
Keywords: pregnancy, preeclampsia, transendothelial migration, mononuclear cells, lymphocytes, monocytes
Введение. Частота возникновения гестоза при беременности достигает 6-8% в развитых странах и превышает 20% в развивающихся [1]. Несмотря на то что в литературе представлено большое количество исследований, посвященных
Михайлова Валентина Анатольевна - науч. сотр., асп., тел. 8(981)741-51-60, e-mail: mva_spb@mail.ru
гестозу, механизмы возникновения и развития этой патологии в настоящее время четко не установлены. Поэтому актуальным является определение механизмов, нарушающих физиологическое течение беременности и характерных для развития гестоза, на тканевом и особенно на клеточном уровне. При физиологическом течении беременности в ткани плаценты и децидуальной ткани присутствуют различные популяции лейкоцитов, основными из которых являются NK-клетки и макро-
- 236 -
