CC BY
85
ИММУНОЛОГИЯ № 5, 2012
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012
УДК 616.36-002.2-022.6-092:612.017.1]-078.33
Н. Д. Ющук, Е. В. Шмелева, О. С. Капитонова, Н. В. Федосеева, И. П. Балмасова,
О. Ф. Еремина
ПРОЛИФЕРАТИВНЫЙ ОТВЕТ ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ
гепатитом c с различными генотипами возбудителя
ГБОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологический университет Минздравсоцразвития России, лаборатория патогенеза и методов лечения инфекционных заболеваний отдела клинической медицины и кафедра инфекционных болезней и эпидемиологии НИМСИ (Москва, 127473, ул. Делегатская, д. 20, стр. 1)
Изучали иммунный ответ лимфоцитов периферической крови у больных хроническим гепатитом C (ХГС) на инкубацию с фитогемагглютинином (ФГА) и рекомбинантными белками вируса гепатита C (ВГС) - NS4 ВГС генотипов 2а+3а и NS4+core ВГС генотипа 1b. Оценивали популяционный/субпопуляционный состав лимфоцитов крови и их пролиферативную активность с использованием метода проточной цитофлюориметрии. Пациенты с ХГС по сравнению со здоровыми лицами изначально имели сниженное содержание основных популяций T-клеток на фоне увеличения процента естественных киллиров (ЕК) и пролиферирующих T-хелперов. Неспецифическая стимуляция ФГА приводила к резкому снижению содержания пролиферирующих ЕК и цитотоксических T-клеток у пациентов с ХГС. В ответ на антигены NS4 ВГС генотипов 2а+3а у больных ХГС с генотипами 2а и 3а ВГС регистрировали увеличение количества пролиферирующих T-хелперов, а также клеток, экспрессирующих маркер CD25; при этом количество пролиферирующих ЕК снижалось. У больных ХГС с генотипом 1b после воздействия NS4+core ВГС генотипа 1b наблюдали большой разброс данных, что может свидетельствовать о гетерогенности иммунного ответа на эти рекомбинантные белки.
Ключевые слова: хронический гепатит C, пролиферативный ответ, специфический иммунный ответ, антигены вируса гепатита C
N.D. Yuschuk, E.V Shmeleva, O.S. Kapitonova, N.V Fedoseeva, I.P. Balmasova, O.F. Eremina
PROLIFERATIVE RESPONSE OF BLOOD LYMPHOCYTES OF PATIENTS WITH CHRONIC HEPATITIS С WITH DIFFERENT GENOTYPES OF THE CAUSATIVE AGENT
Studying the immune response of peripheral blood lymphocytes in patients with chronic hepatitis С (СНС) incubation with phytohemagglutinin (APF) and recombinant proteins of hepatitis С virus (НСУ) - NS4 НСУ genotype 2A+3A and NS4+core НСУ genotype 1b. Estimated population/subpopulation composition of blood lymphocytes and their proliferative activity with use of a method of running cytofluorimetry. Patients with СНС compared with healthy persons initially had reduced the content of the main populations of T cells in the background percent increase in natural killer (БС) and the proliferative of T-helpers. Non-specific stimulation of the PHA has led to a sharp decrease of the contents of proliferative БС and cytotoxic T-cells in patients with ^С. In response to antigens NS4 H^ genotype 2A+3b in ^С patients with genotype 2A and 3A H^ registered the increase in the number of proliferating T-helpers, as well as cells expressing marker CD25; the number of proliferating the БС declined. In ^С patients with genotype 1b after exposure NS4+core H^ genotype observed a large scatter of data that can testify the heterogeneity of the immune answer to these recombinant proteins.
Key words: chronic hepatitis C, proliferative response, the specific immune response, antigens of hepatitis C virus
Более 20 лет прошло после открытия вируса гепатита C (ВГС), но до сих пор предотвращение, контроль и лечение гепатита C остаются глобальной проблемой здравоохранения во всех странах [5]. Около 170 млн человек инфицированы ВГС, и более 350 тыс. ежегодно умирают от патологий, связанных с данным вирусом [1, 2]. Ученые разных стран ищут новые пути подхода к лечению и предотвращению прогрессирования хронического гепатита C (ХГС) [4]. Основная масса научных исследований по данной патологии посвящена изучению особенностей реагирования иммунной системы на вирус и ее участия в развитии исходов ХГС [6, 7]. Накоплено достаточно данных о том, что клеточно-опосредованный иммунный ответ играет решающую роль в элиминации ВГС из организма, однако именно цитотоксические клетки иммунной системы способствуют прогрессированию фиброза печени и развитию цирроза [3]. Дальнейшее изучение и понимание иммунопатогенеза ВГС-инфекции, в частности соотношения реакций адаптивного и врожденного иммунитета, дадут ключ к управлению данным патологическим процессом.
Ющук Николай Дмитриевич - д-р мед. наук, проф., акад. РАМН, зав. каф., президент МГМСУ, тел. 8(495)631-25-44, е-mail:prof.uyshuk@gmail.com
Материалы и методы. Обследованы 20 больных ХГС и 10 клинически здоровых лиц. Для экспериментальных исследований использовали цельную венозную кровь (VACUTEST KIMA, Италия) с последующим выделением мононуклеар-ных клеток (PBMC) с помощью фиколла (плотность 1,077; ООО «ПанЭко», Россия). Часть выделенных клеток использовали для определения параметров клеток до инкубации. Другую часть клеточной суспензии помещали в плоскодонные 96-луночные культуральные планшеты («Costar», США) по следующей схеме:
1) PBMC + среда (негативный контроль - NC);
2) PBMC + среда + фитогемагглютинин (ФГА) (позитивный контроль);
3) PBMC + среда + NS4 2а, 3а ВГС (рекомбинантные белки ВГС генотипов 2а и 3а);
4) PBMC + среда + NS4 + HCVcore 1b ВГС (рекомбинантные белки ВГС фенотипа 1b).
В качестве среды для инкубации использовали RPMI-1640 без индикатора (ООО «ПанЭко», Россия) с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, проверенной на наличие эндотоксинов и инактивированной при 56°C (ООО «ПанЭко», Россия), 2 ммоль/л L-глутамина (ООО «ПанЭко», Россия), 0,5 мг/мл гентамицина (ООО «ПанЭко», Россия). После 72 ч инкубации при 37°C, 5% CO2 и 95% влажности
- 264 -
ИММУНОПАТОЛОГИЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ ИММУНОЛОГИЯ
производили отмывку культуры клеток от среды, их последующую обработку моноклональными антителами («BD Biosciences», США) и анализ на проточном цитофлюометре BD FACS Canto II («Becton Dikinson», США). Для получения статистически достоверных результатов осуществляли набор не менее 10 000 событий в лимфоцитарный гейт.
Определяли следующие фенотипы клеток: CD45+/CD3+, CD45+/CD3+/ki67+; CD45+/CD3+/CD4+; CD45+/CD3+/CD4+/ ki67+; CD45+/CD3+/CD8+; CD45+/CD3+/CD8+/ki67+; CD45+/ CD3-/CD56+/; CD45+/CD3-/CD56+/ki67+; CD45+/CD3+/CD25+; CD45+/CD3+/CD25high; CD45+/CD3+/CD25+/FoxP3+; CD45+/ CD3+/CD25high/FoxP3+.
Использовали следующие коэффициенты:
• коэффициент отклонения (КО) от контроля для построения диаграмм, вычисляемый по формуле 1:
Показатель в основной группе - Показатель в контрольной группе КО =---------------------------------------------100% + 100%;
Показатель в контрольной группе
• индекс стимуляции (ИС) для показателей индуцированной пролиферативной активности, вычисляемый по формуле 2:
Показатель после Показатель после
инкубирования в тест-системе - инкубирования
с индуктором в интактной тест-системе
ИС =---------—-----------------------------------• 100% +100%.
Показатель после инкубирования в интактной тест-системе
Для статистической обработки данных применяли методы дескриптивной статистики, сравнение величин осуществляли приемами непараметрической статистики (данные не имели нормального распределения) с использованием критерия Манна-Уитни. Математико-статистическую обработку данных проводили с помощью пакета статистических программ SPSS, версия 17.0 (допустимая ошибка E = 5%).
Результаты и обсуждение. У больных ХГС исходные показатели иммунного ответа значительно отличались от таковых у здоровых лиц и между собой в группах с различными генотипами вируса (рис. 1, см. таблицу). Так, у больных ХГС по сравнению с лицами группы контроля достоверно повышался уровень пролиферирующих T-лимфоцитов (CD3+/ki67+). Данное повышение регистрировали в основном за счет субпопуляции CD3+/CD4+/ki67+ (пролиферирующие T-хелперы), процентное содержание которой возрастает более чем в 6 раз у больных ХГС с генотипами 2а, 3а (р = 0,009) и более чем в 4 раза у пациентов с ХГС с генотипом 1b
CD3+
Здоровые доноры --------ХГС 2а, За --------ХГС 1Ь
Рис. 1. Коэффициенты отклонения процентного содержания клеток у здоровых лиц (контроль) в сравнении с аналогичным показателем у больных ХГС с генотипами 2a, 3a и 1b (до инкубации).
(р = 0,008). При этом в крови у больных ХГС отметили значимое уменьшение количества клеток, не имеющих маркер ki67, т. е. находящихся в стадии покоя G0: CD3+/CD4+/CD8+, на фоне достоверного 2-кратного повышения уровня CD3-/ CD56+-клеток.
Экспрессия маркера активации CD25 на T-лимфоцитах была снижена у больных ХГС с генотипом 1b (р = 0,042).
По всей вероятности, данные изменения у пациентов ХГС можно объяснить наличием воспалительных процессов в печени, поддерживаемых вирусной персистенцией, что приводит к перераспределению лимфоцитов крови и их миграции в печень и, как следствие, снижению их количества в периферической крови. Повышение же содержания клеток, находящихся в активных фазах клеточного цикла G1, S, G2, M (кд67+-лимфоциты), свидетельствует о постоянной антигенной стимуляции T-лимфоцитов. Повышенный фон естественных киллеров (ЕК), клеток, играющих большую роль в противовирусной защите организма, возможно, отражает рост их активности не только в крови, но и в печени.
Средние значения показателей у больных ХГС с генотипами 2а, 3а и 1b, а также у здоровых лиц (M ± т)
Показатель, % ХГС Здоровые лица Р1 Рг Р3
генотипы 2а и 3а генотип 1b
СЭ45+/С03+ (от лимфоцитов) 37,78 ± 27,01 40,28 ± 17,49 72,49 ± 9,33 0,090 < 0,001* 0,637
СЭ45+/С03+/И67+ (от СЭ45+/С03+) 2,15 ± 1,07 1,38 ± 0,94 0,61 ± 0,35 0,005* 0,015* 0,130
СЭ45+/С03+/С04+ (от лимфоцитов) 22,85 ± 19,23 20,19 ± 11,73 44,20 ± 7,26 0,123 < 0,001* 0,777
С045+/СЭ3+/С04+/к167+ (от СЭ45+/С03+/С04+) 3,98 ± 3,18 2,66 ± 2,28 0,64 ± 0,47 0,009* 0,008* 0,395
СЭ45+/С03+/С08+ (от лимфоцитов) 13,23 ± 6,97 17,90 ± 10,24 25,56 ± 6,28 0,020* 0,036* 0,508
С045+/СЭ3+/С08+/к167+ (от СЭ45+/С03+/С08+) 0,93 ± 1,33 1,02 ± 1,12 0,38 ± 0,32 0,694 0,093 0,601
СЭ45+/С056+/С03- (от лимфоцитов) 32,48 ± 11,76 28,34 ± 10,29 15,34 ± 8,60 0,031* 0,006* 0,345
С045+/СЭ56+/С03-/к167+ (от СЭ45+/С056+/С03-) 0,78 ± 0,56 1,48 ± 1,58 0,66 ± 0,68 0,589 0,234 0,705
СЭ45+/С03+/С025+ (от СЭ45+/С03+) 28,28 ± 16,39 20,37 ± 15,30 32,33 ± 13,67 0,643 0,042* 0,395
CD45+/CD3+/CD25+/FoxP3+ (от СЭ45+/С03+) 0,78 ± 0,76 0,51 ± 0,74 0,51 ± 0,60 0,641 0,775 0,364
СЭ45+/С03+/С025ЫвЬ (от СЭ45+/С03+) 0,20 ± 0,14 0,13 ± 0,13 0,17 ± 0,15 0,637 0,480 0,241
CD45+/CD3+/CD25high/Foxp3+ (от СЭ45+/С03+/С025ЫвЬ) 41,68 ± 50,01 15,31 ± 31,38 14,16 ± 19,56 0,634 0,190 0,268
Примечание. р1 - между показателями у больных ХГС с генотипами 2а, 3а и здоровыхлиц; р2 - между показателями у больных ХГС с генотипом 1b и здоровых лиц; р3 - между показателями у больных ХГС с генотипами 2а, 3а и больных ХГС с генотипом 1b; по критерию Манна-Уитни при р < 0,05.
- 265 -
ИММУНОЛОГИЯ № 5, 2012
NC
Больные ХГС 2а, За
----Здоровые доноры
.... Больные ХГС 1 b
----Больные ХГС 2а, За
----ХГС 1Ь
....Здоровые доноры
Рис. 2. Коэффициенты отклонения после 72-часовой инкубации в присутствии ФГА.
а - коэффициенты отклонения процентного содержания клеток NC у здоровых лиц и больных ХГС с генотипами 2a, 3a и 1b; б - коэффициенты отклонения ИС у больных ХГС с генотипами 2a, 3a и 1b от таковых у здоровых лиц.
В то же время у больных ХГС с генотипом 1b изначальная стимуляция T-хелперов проявляется в меньшей степени, чем у больных ХГС с генотипами 2а, 3а. Возникает вопрос, связано ли это с более выраженным феноменом иммунного ускользания ВГС с генотипом 1b по сравнени с ВГС с генотипами 2а и 3а. Для решения этого вопроса изучали влияние неспецифической стимуляции лимфоцитов ФГА у больных с различными генотипами вируса.
Влияние неспецифической стимуляции (ответ лимфоцитов на ФГА). При проведении исследований выявили, что инкубация в течение 72 ч в культуральной среде даже без митогенов (негативный контроль - NC) оказывает влияние на популяционный/субпопуляционный состав и функциональные характеристики лимфоцитов. В связи с этим для корректного сравнения показателей лимфоцитов, подвергнутых инкубации в присутствии ФГА и рекомби-
532
642
Рис. 3. Коэффициенты отклонения ИС у больных ХГС с генотипами 2a, 3a и 1b от таковых у здоровых лиц (после инкубации с антигенами NS4 2a,3a ВГС).
ИС у здоровых лиц приняты за 0.
нантных вирусных белков ВГС, проводили их сопоставление с NC, а не с параметрами лимфоцитов крови до инкубации.
На рис. 2 представлены коэффициенты отклонения показателей и их ИС после инкубации с ФГА. Самый высокий ИС в ответ на ФГА наблюдали у CD3+/CD4+/ki67+-клеток у всех лиц, включая тех, кто вошел в группу контроля. Однако при сравнении у больных ХГС с генотипом 1b отметили тенденцию к снижению ИС пролиферирующих T-хелперов в 1,4 раза по сравнению с аналогичным показателем в контроле; в то же время у больных ХГС с генотипами 2а, 3а ФГА-индуцированная пролиферативная активность была сохранена. Процент пролиферирующих цитотоксических T-клеток (CD3+/CD8+/ki67+) после инкубации с ФГА снижался по сравнению с таковым у здоровых лиц у двух групп больных ХГС, особенно у пациентов с генотипами 2а, 3а (в
4 раза; р = 0,045). Как показали результаты наших исследований, в наибольшей степени страдала пролиферативная активность ЕК: у больных ХГС с генотипами 2а, 3а количество CD3-/ CD45+/ki67+-клеток снижалось в 21 раз, а их ИС - в 26 раз (р = 0,031); у пациентов с ХГС с генотипом 1b количество данных клеток было уменьшено в 5 раз, а ИС - в 11 раз по сравнению с аналогичными показателями в контроле (p = 0,003 и p = 0,001 соответственно). По ИС пролиферирующих ЕК установили достоверную разницу между группами больных с разными генотипами (p = 0,033).
Что касается вышеперечисленных популяций, находящихся в стадии покоя G0 (Ы67-клетки), их ИС
- 266 -
ИММУНОПАТОЛОГИЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ ИММУНОЛОГИЯ
были совершенно незначительны, а зачастую меньше 100, что говорит об уменьшении их количества по сравнению с таковым в NC. Так, ИС < 100 характерен для покоящихся Th-хелперов, особенно заметное снижение отметили у больных ХГС с генотипами 2а, 3а, где ИС составил всего 57 (против 93 в группе контроля; р = 0,014). Значимое снижение по сравнению с аналогичным показателем у здоровых лиц ИС цитотоксических клеток (Tctl) регистрировали у обеих групп больных ХГС, но особенно это было выражено у пациентов с ХГС с генотипами 2а, 3а (р = 0,009 для генотипов 2а, 3а; p = 0,006 для генотипа 1b). Тенденция к снижению процента ЕК характерна для больных ХГС с генотипом 1b, хотя достоверной разницы по ИС между больными и здоровыми лицами не обнаружили.
У всех лиц в ответ на ФГА выявили повышение содержания T-лимфоцитов, экспрессирующих CD25, а также клеток с высокой плотностью данного маркера на своей поверхности (CD25high). Особенно данная тенденция характерна для больных ХГС с генотипом 1b, ИС которых для CD3+/CD25+-клеток в 2 раза выше, чем в остальных группах. Также можно отметить тенденцию к резкому возрастанию ИС для регуляторных CD3+/CD25high/FoxP3+-клеток - в 11 раз у больных ХГС с генотипами 2а, 3а и в 5 раз у пациентов с ХГС с генотипом 1b - по сравнению с аналогичным показателем в контроле, где количество данных клеток, напротив, снижалось при инкубации с ФГА.
Возможно, воздействие сильным стимулятором, каким является ФГА, приводит к истощению и дальнейшему апоптозу PBMC у больных ХГС, иммунитет которых изначально напряжен вследствие хронической инфекции. Регуляторные T-клетки (Treg), безусловно, вносят свой вклад: вероятнее всего, сильное подавление ЕК связано с ингибиторным влиянием Treg, основная функция которых состоит в предотвращении аутоагрессии и сдерживании чрезмерной реакции иммунной системы.
Таким образом, субпопуляция T-хелперов у больных ХГС с различными генотипами после неспецифической стимуляции давала примерно одинаковый пролиферативный ответ. Достоверные различия отметили только в экспрессии маркера ki67 у ЕК, которая снижалась в значительно большей степени у пациентов с генотипами ВГС 2а и 3 а.
Влияние специфической стимуляции (ответ на антигены ВГС). При стимуляции PBMC рекомбинантными белками NS4 2а, 3а ВГС у больных ХГС с генотипами 2а, 3а наблюдали выраженное достоверное повышение процентного содержания CD3+/CD4+/ki67+-клеток (р = 0,031), что свидетельствует о специфическом иммунном ответе на свой антиген T-лимфоцитами, которые уже имели контакт с ВГС генотипов 2а или 3а (рис. 3). Количество пролиферирующих ЕК (CD3-/CD56+/ki67+), напротив, снижалось по сравнению с таковым в группе здоровых лиц (более чем в 6,5 раза; р = 0,023) и у больных ХГС с генотипом 1b (в 18 раз; р = 0,005). Кроме того, две группы больных достоверно различны и по количеству CD3+/CD25high-клеток (р = 0,016): ИС у пациентов с ХГС с генотипами 2а, 3а увеличен в 2 раза по сравнению с аналогичным показателем у больных ХГС с генотипом 1b. Однако более выраженное возрастание количества T-лимфоцитов, экспрессирующих маркер активации CD25 ^D3+^D25+) после стимуляции антигенами ВГС ге-
нотипов 2а, 3а, регистрировали у пациентов с ХГС с генотипом 1b (р > 0,05).
Следует отметить также тенденцию к 10-кратному увеличению ИС для CD3+/CD25high/FoxP3+-клеток убольных ХГС с генотипом 1b в ответ на NS4 2а, 3а по сравнению с таковым у больных ХГС с генотипами 2а, 3а и здоровых лиц. Интересно, что пациенты с генотипами 2а, 3а отвечали на не свой (NS4+core 1b) антиген подобным же образом: а именно выраженным увеличением количества регуляторных клеток, хотя данные изменения недостоверны.
Таким образом, антигены ВГС генотипов 2а, 3а вызывали выраженную специфическую стимуляцию T-лимфоцитов преимущественно CD4+-субпопуляции, что сопровождалось значительным падением экспрессии маркера ki67 у ЕК, как это наблюдали и при воздействии ФГА.
Что касается антигенов ВГС генотипа 1b, то они столь выраженное действие на иммунокомпетентные клетки не оказывали. В то же время большой разброс данных, полученных после воздействия NS4+core 1b антигенов ВГС на лимфоциты больных ХГС с генотипом 1b, позволяет предполагать гетерогенность иммунного ответа на данные рекомбинантные белки.
Дальнейшие исследования у больных ХГС с целью определения корреляций быстрого вирусологического ответа на терапию интерфероном и изменений, возникающих в иммунной системе до и после лечения, возможно, приведут к более глубокому пониманию патогенеза ХГС, роли отдельных клеток иммунной системы в этом процессе и позволят выявить клетки-мишени для иммунной терапии ХГС, что обеспечит возможность приблизиться к индивидуальному лечебному подходу.
Научно-исследовательская работа выполнена в рамках реализации ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг.
литература
1. Bacon B. R., Khalid O. New therapies for hepatitis С virus infection // Mo Med. - 2011. - Vol. 108, N 4. - P. 255-259.
2. Baldo V, Baldovin T., Trivello R., Floreani A. Epidemiology of H2V infection // Сшт. Pharm. Des. - 2008. - Vol. 14, N 17. - P. 1646-1654.
3. Bode J. G., Brenndorfer E. D., Haussinger D. Hepatitis С virus (HDV) employs multiple strategies to subvert the host innate antiviral response // J. Biol. Qiem. - 2008. - Vol. 389, N 10. - P. 1283-1298.
4. Kwon H., LokA. S. Does antiviral therapy prevent hepatocellular carcinoma? // Antivir. Ther. - 2011. - Vol. 16, N 6. - P. 787795.
5. Lavanchy D. Evolving epidemiology of hepatitis С virus // Qin. Microbiol. Infect. - 2011. - Vol. 17, N 2. - P. 107-115.
6. Roque-Cuellar M. C., Sanchez B., Garcia-Lozano J. R. et al. Cellular immune responses and occult infection in seronegative heterosexual partners of chronic hepatitis С patients // J. Viral Hepat. - 2011. - Vol. 18, N 10. - P. 541-549.
7. von Hahn T., Schulze A., Chicano Wust I. et al. The novel immunosuppressive protein kinase С inhibitor sotrastaurin has no pro-viral effects on the replication cycle of hepatitis B or С virus // PLoS One. - 2011. - Vol. 6, N 9. - P. e24142.
Поступила 06.04.12
- 267
