Моноклональные антитела к белкам вируса гепатита с — инструмент для картирования антигенных детерминант, диагностики гепатита с и изучения вирусного патогенеза Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 616.36-002-07:616-097

MONOCLONAL ANTIBODIES ТО HEPATITIS С VIRUS PROTEINS AS A TOOL FOR ANTIGENIC DETERMINANT MAPPING, HEPATITIS С DIAGNOSTICS AND INVESTIGATION

OF VIRAL PATHOGENESIS

О. V. Masalova, A.A. Kushch The Ivanovsky Institute of Virology RA MS

ABSTRACT

A panel of 25 hybridomas producing monoclonal antibodies (MAB) to hepatitis С virus (HCV) recombinant proteins: core (7 clones). NS3 (7 clones). NS4 (6 clones) and NS5A (5 clones) has been obtained. More than 60 short peptides of varied length and surrogate proteins were used for antigenic determinant mapping. Seven new determinants of core protein have been identified. The antigenic structure schemes were constructed for a segments of NS3 and NS5A proteins. It was demonstrated that the 5-1-1 immunogenic region of NS4 contains 5 epitopes which were identified for the first time.

A quantitative method for the determination of core protein in blood serum with the use of MAB has been developed. The method allows one to detect up to 5 pg antigen per ml plasma, being cheaper and simpler for HCV revealing than PCR. The method enables differentiation of free nucleocapsides. HCV virions and immune complexes. It can be employed in diagnostics, monitoring of interferon therapy and disease prognosis.

The occurrence of HCV protein in cells was studied on liver cryostat sections using the MAB. In patients, the occurrence of the proteins (74%) was higher than the occurrence of viral RNA in blood serum (64%). which indicates higher sensitivity of this test for the detection of direct markers of HCV infection. In 23% patients viral proteins were detected in peripheral blood lymphocytes.

New data on the role of HCV proteins in the mechanism of liver damage in hepatitis С were obtained. The most significant viral and immune factors determining the course and outcome of hepatitis С and playing an important role in the pathogenesis of the diseases caused by HCV were analyzed.

МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА К БЕЛКАМ ВИРУСА ГЕПАТИТА С — ИНСТРУМЕНТ ДЛЯ КАРТИРОВАНИЯ

АНТИГЕННЫХ ДЕТЕРМИНАНТ, ДИАГНОСТИКИ ГЕПАТИТА С И ИЗУЧЕНИЯ ВИРУСНОГО ПАТОГЕНЕЗА

О. В. Мае олова, А. А. Кущ Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН

РЕЗЮМЕ

Получена панель из 25 гибридом, продуцирующих моноклональпые антитела (МКА) к рекомбинантным белкам вируса гепатита С (ВГС): core (7 клонов), NS3 (7 клонов), NS4 (6 клонов) и NS5A (5 клонов) Для картирования антигенных детерминант (АГД) было использовано более 60 синтетических пептидов различной протяженности и коротких суррогатных белков. Выявлено 7 новых АГД белка core. Построены схемы антигенной структуры участка хеликазного домена белка NS3 и изученного района молекулы белка NS5A. В нммуно-генном районе 5-1-1 белка NS4 ВГС идентифицированы 5 АГД. не описанных ранее.

Разработан количественный метод выявления соге-белка в сыворотках крови с помошыо МКА. Метод позволяет выявлять до 5 пг антигена на 1 мл плазмы и является более простым и дешевым методом обнаружения ВГС по сравнению с полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Метод позволяет дифференцировать безоболо-чечные нуклеокапсиды. вирионы ВГС и иммунные комплексы. Может использоваться при диагностике, мониторинге интерферонотерапни и прогнозе заболевания.

С помощью МКА изучена частота выявления белков ВГС в клетках на криостатных срезах печени больных. Белки ВГС были обнаружены у 74% пациентов, чаше, чем РНК ВГС в сыворотке крови (61%). Это указывает на большую чувствительность данного теста при выявлении прямых маркеров ВГС-инфекции. В лимфоцитах периферической крови белки ВГС были обнаружены у 23% больных.

С помощью МКА были получены новые данные о роли белков ВГС ь мехаии \ ере * :ения печени при гепатите С. Проведен анализ наиболее значимых вирусных и иммунных £акт г в - • - ::;'.х на течение и исход гепатита С и играющих важную роль в патогенезе заболевания, вы (ызасм В1 (

Введение

Вирус гепатита С (ВГС) отнесен к отдельному роду Hepacivirus в семействе Flaviviridae [36]. Нуклеокапсид вириона сформирован белком core; в состав белково-липиднон оболочки, покрывающей снаружи частицу, входят липиды клетки-хозяина и комплекс двух вирусных гликопротеннов — Е1 и Е2. нековалентно связанных между собой. Белок core связан с геномной одноце-почечной молекулой РНК положительной полярности размером 9600 нуклеотндных остатков. Геном ВГС кодирует полипротеин-предшествешшк протяженностью около 3000 аминокислотных остатков (а.о.), в результате проиессинга которого образуется по крайней мере 10 структурных и неструктурных белков (рис. 1). Протео-литический процессинг происходит на мембранах эцдоп-лазматического ретикулума и регулируется клеточными и вирусными протеазамн [15].

ВГС — один из наиболее частых этиологических факторов, вызывающих гепатит парентеральным путем заражения. Актуальность изучения этого заболевания обусловлена рядом причин. Гепатит С (ГС) широко и повсеместно распространен—до 3% населения земли инфицированы ВГС. ГС ассоциируется с высоким риском хроннзацни инфекции — от 50% до 85% случаев острого ГС принимают хроническую форму, при этом у 20-30% больных хронический гепатит С (ХГС) заканчивается циррозом печени или гепатоцел-люлярной карциномой [17]. Распространению ГС в значительной степени способствует отсутствие специфических средств профилактики и лечения, а также недостатки имеющихся диагностических тест-систем. Возможности изучения структуры ВГС и патогенеза заболевания ограничены сложностями культивирования вируса в клеточных системах и экспериментального заражения животных. Натуральные вирусные белки изучены недостаточно, так как ВГС циркулирует и накапливается в организме больных в низких концентрациях [ 15; 17; 39: 50]. В то же время детальное изучение свойств и антигенной структуры вирусных белков необходимо для понимания воздействия ВГС на иммунную систему хозяина, совершенствования диагностики гепатита С и создания эффективных противовирусных препаратов и вакцин.

В лаборатории клеточной инженерии НИН вирусологии им. Д.И Ивлмэск РА МН проводятся исследования. направ теиные на »работку новых методов диагностики ГС . а ик*е анализируется роль вирусных и хозяйских факторов в развитии патологических процессов Основными экспериментальными инструментами хтя решения поставленных задач являются полученные нами чоноклональные антитела (МКА) к белкам ВГС Получение МКА представляет интерес по нескольким причинам. Во-первых, использование МКА позволяет изучить антигенную структуру вирусных белков, при этом можно идентифицировать как линейные, так и конформационно зависимые эпитопы. При помощи традиционного подхода — метода пептидного картирования (определение реактивности химически синтезированных пептидов с сыворотками от больных гепатитом С) короткие олигопептиды (до 20 а.о.) могут имитировать только линейные антигенные детерминанты [27; 37; 44], в то время как индукция иммунного ответа при гепатите С в значительной части определяется конформационнымн эпитопами [18; 26; 27; 40]. Включение в состав суррогатных антигенов — рекомбн-нантных белков и пептидов, используемых для выявления антител к ВГС. наиболее полного набора им-мунодоминантных участков вирусных белков — позволяет значительно повысить чувствительность тест-систем [19; 40]. Во-вторых, на основе МКА можно создавать диагностические тест-системы для детекции белков ВГС. В настоящее время подобные тест-системы практически отсутствуют, так как в связи с низким содержанием вируса в организме инфицированных лиц предъявляются очень высокие требования к аффинности и специфичности иммунных реагентов В-третьих, с помощью МКА можно выявить функционально значимые эпитопы. нейтрализующие вирус и вызывающие протективный эффект, что необходимо для создания вакцин. Подобные исследования с использованием МКА к поверхностным белкам ВГС уже проводятся [56]. Наконец, МКА могут служить пенным инструментом в исследованиях, направленных на изучение участия белков ВГС в патогенезе ГС.

-9600 и.о. (3008-3037 а. о.)

Нуклсотидные позиции 1 ' 34! 914 1490 2579 2768 3419

5312 5474

6257 7598

9371

9600

5' UTR core El Е2 NS2 NS3 NS4A NS4B NS5A NS5B 3' UTR

I 191 383 746 809 1026 Аминокислотные позиции

1653 1711

1932 2619

ЗОЮ

Рис. 1. Схема гснстической организации геномном РНК ВГС. Нуклсотидные и аминокислотные пошипи указаны относительно субтипа lb

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

V>Vtom2/2003

1. Получение МКА к белкам ВГС

Для получения МКА были использованы реком-бинантные белки, имитирующие последовательности вирусных антигенов: N -концевую часть белка нук-леокапсида (гСоге-1-90 а.о.) и более протяженный соге-белок (гСоге-1-150). часть хеликазного домена белка NS3 (rNS3-1356-1459 а.о.), N-концевую часть белка NS4 (rNS4-1677-1756 а.о.), часть белка NS5A (rNS5 — 2193-2300 а.о.). Перечисленные последовательности были выбраны на основе сведений об их активном взаимодействии с антителами в сыворотках больных гепатитом С [18; 27; 37; 44]. Белки эксп-рессировали в клетках E.coli в комплексе с белком слияния глютатион-5-трансферазой (GST), для получения гСоге-1-150 использовали белок слияния Ь-га-лактозидазу (Gal). Соге-1-150 представляет собой «мозаичную» конструкцию, включающую наиболее активные антигенные детерминанты белка [6]. тогда как все остальные белки экспрессированы с плазмнд. кодирующих соответствующие участки вирусного генома из сыворотки больного гепатитом С генотипа IЬ Рекомбннантные белки были любезно предоставлены Т.Н. Улановой и А.Н. Бурковым (НПО «Диагностические системы». Н. Новгород).

Одним из определяющих факторов в эффективности гибридомной технологии является высокий уровень иммунного ответа на вводимый антиген. В связи с этим был проведен экспериментальный анализ им-муногепности рекомбннантных белков ВГС: на модели белка rNS4 изучена зависимость активности и эпи-топной специфичности антител от типа адъювал та. использованного при введении антигена мышам [8]. Сравнивали иммуностимулирующую активность 2 традиционных адъюваитов — полного адъюванта Фрейнда (Г1АФ) и гидроокиси алюминия (AI) — с тремя новыми веществами — глюкозиламннилмурамил-динептидом (ГМДП. синтетический фрагмент пепти-

до-гликана из стенки микобактерий) и 2 водорастворимыми производными фуллерена С(Л\ СЫ-ГМДП и натриевой соли аминокапроновой кислоты (СЫ1-АКК). Ранее было показано, что аминокислотные и дипеп-тидные производные фуллерена оказывают иммуностимулирующее действие при иммунизации животных модельным белком — яичным альбумином [2; 3], не обладают цитотоксичиостью и собственной иммуно-генностыо [2; 3:25]. Соединения ГМДП, С^-ГМДП и СМ-АКК были любезно предоставлены Т.М. Андроновой. О.М. Вольпиной (ИБХ РАН) и В С. Романовой (ИНЭОС РАН).

Проведенные исследования показали, что репертуар и активность антител значительно различались в зависимости от использованного адъюванта [8]. Так. ПАФ и А1 вызывали более сильный гуморальный ответ на гЫБ4 в течение первых 6 недель (3 иммунизации) по сравнению с ГМДП. С^-ГМДП и СМ-АКК. Однако после 4 — 5 иммунизаций и бустерной инъек-шш титры антител, стимулированных 3 последними соединениями, оказались на I -2 порядка выше по сравне-шпо с ПАФ и А1 (табл. 1). Анализ иммунного ответа животных с помощью синтетических пептидов, имитирующих линейные антигенные детерминанты белка гК54. позволит впервые показать, что ГМДП и С№-АКК вызывают образование антител к большему числу эпито-пов. чем остальные испытанные адьюванты. Так. например. только ГМДП и С^-АКК стимулировали активный В-клеточный ответ к антигенным детерминантам белка а также к эпитопам белка N54А генотипов 2 и 3 (табл. 2). На основании полученных данных эти соединения выглядели очень перспективными адыован-тами. Однако при сравнительном изучении адъювант-ной способности ГМДП и СМ-АКК в опытах с друга-ми белками ВГС оказалось, что более эффективен в качестве адъюванта был ГМДП (табл. 1). Проведение серии слияний показало, что количество первично

Таблица 1

Сравнительное действие различных алъювантов па иммунный ответ и эффективность гибридизации спленоцнтов мышей, иммунизированных рскомбинашными белками ВГС

Белки ВГС Адъювант Титр антител в гипериммунных сыворотках с антигеном Количество первично-положительных клонов* Количество отобранных клонов**

Рекомбинант-ный белок GST или Gal Лизат E.coli

Core 1 -90 ПАФ 5x105 104 104 300 15

С60- АКК 104 103 103 Слияния не проводилось

Core 1-150 ПАФ 106 104 104 200 8

NS3 ГМДП 10s 103 103 600 31

NS4 ПАФ 5x10" 104 103 200 8

ГМДП 10" 103 104 400 10

С6о-АКК 10s 104 103 Слияния не проводилось

Сбо-ГМДП 10" 104 103

Al 10" 104 104

NS5A ПАФ 105 104 104 100 4

ГМДП 10* 103 10J 250 8

Сбо-АКК 103 103 103 Слияния не проводилось

" Клоны, активно реагирующие с рекомбинантным белком и не взаимодействующие с белками слияния и Е.соИ; Клоны. сохранившие стабильную и высокую продукцию МКА, а также лучшие ростовые характеристики.

3

\:?/том2/2003

российский биотерапевтический журнал

Таблица 2

Анализ взаимодействия антител из сывороток мышей, нчч>нн шроииных rNs-lc раыичными алъюваитамн. с сии готическими пептиламм

Область белка NS4 Пептиды, а. о. Генотип Относительна апианосп» сывороток в ИФА ири имм'.'Н/смщии с адью вантам и

ПАФ А. ГМДП С«-АКК Ос-ГМДП Без адъюванта

rNS4 1677-1756 lb + + + + + + + + + ♦ + + + + + + + +

5-1-1 1689- 1738 lb + + + + + + + + + ♦ ♦ + + + + + + +

NS4 А 1683 - 1705 lb -

1688- 1705 lb +/- - + + +

1689- 1707 la + + + + + + + + + + + + + + + + +

1689- 1708 la + + + + + + + + + + +/-

lb + + + + + + + + + + + +/-

2a + +/- + + + + +

2c +/- + + + + +/-

За +/- + + + + +/-

1693 - 1707 lb + + + + + + + + + + + + + +

1700-1711 la + + + + + + + + + + + + + + +/-

NS4 В 1710- 1728 la +/- + + + + +

2b,2c, 4, 5, 6 + + +

1711 - 1732 la + + + + + + +

lb + + + + + + + + +/- + +

2a, 2b —

3a — + + + +

1713-1731 lb +/- + + + +

Примечание: отношение сигнала к фону (P/N) при разведении сывороток 1:100: - < 3; +/- = 3-5; + = 6-10; ++=11-30; +++ > 30.

положительных гибридомных клонов и их эпитолное разнообразие было больше при использовании этого вещества. В настоящее время проводится дальнейшее исследование способности ГМДП усиливать иммунный ответ на модели 3 различных рекомбинант-ных белков ВГС.

Гибридизацию спленоцитов мышей Balb/c. иммунизированных рекомбинантными белками, с клетками мнеломы Sp2/0 проводили по стандартной методике [28]. Скрининг клонов выполняли методом непрямого ИФА, при этом для сенсибилизации твердой фазы использовали 3 вида антигенов: соответствующий ре-комбннаптный белок, лизат бактериальных клеток и белки слияния. Позитивными считали клоны, активно (ОП> 1,0) реагирующие с рекомбинантным белком и не взаимодействующие с белками GST и E.coli (см. табл. I). Большинство гибридных клеток оказались нестабильными по продукции МКА: в результате клонирования методом предельных разведении было отобрано 25 гибридом, стабильно секретируюшнх МКА к белкам согс (7 клонов), NS3 (7 клонов). NS4 (6 клонов) и NS5A (5 клонов) [1:6; 11; 35] (табл. 3). МКА накапливали в асцитных жидкостях мышей, очищали с помощью аффинной хроматографии на протеин А сефарозе или с использованием капрнловой кислоты.

2. Характеристика и эпитопиое картирование МКА

Были изучены иммунохимические свойства полученных МКА. Для картирования антигенных детерминант было использовано более 60 сшггетическнх пептидов раз-

личной протяжешюстн и коротких рекомбштнтных белков (22—из области бе.лка нуклеокапсида; 7—из NS3:33 — из NS4:2 — из NS5). Пептиды были любезно предоставлены ВВ. Новиковым, В.К. Пнменовым (Нижегородский государственный университет) и Ю.А. Семилетовым (НИИ вирусологии РАМН (.Сравнивали также активность взаимодействия M КА с антигенами, входящими в состав 8 коммерческих тест-систем для определения антител к ВГС. 4 тест-системы были основаны на методе ИФА: «ИФА-антн-НСУ-спектр» (НПО «Диагностические системы». Н. Новгород, Россия). «Рекомби-Бест-анти-ВГС» (ЗАО «Вектор-Бест». Кольцово. Россия), «Murex anti-HCV ELISA» (версии 3 и 4) (Англия). Еще четыре тест-снстемы содержали реагенты для нммуноблота: «Chiron RIВА 3 HCVImmunoblotassay»! версии 1 и 2) (США). Murex GE 60 (Англия). Mikrogen (Германия) (см. табл. 3). Рекомбинан-тные белки, входящие в указанные тест-снстемы. различаются по аминокислотным последовательностям и экс-прессированы в различных клеточных системах (бакуло-вирусная. дрожжевая или бактериальная): часть антигенов представлены пептидами. Для сравнения эпнтопной специфичности МКА проводили рещшрокный конкурентный ИФА для чего конъюгнровалн M КА с пероксидазой. О природе детерминант (линейные или конформашюн-ные) судили по результатам анализа взаимодействия МКА с денатурированными антигенами Денатурацию белков проводили, обрабатывая их смесью растворов додецил-сульфата натрия и меркаптоэтанола в различных концентрациях, и оцешшали реактивность МКА с денатурированными белками по сравнению с исходными в ИФА. Кроме того, анализировали взаимодействие МКА. полученных к

российский биотераппвтический журнал

№3/том2/2003

Таблица 3

Взаимодействие моноклональных антител к белкам вируса гепатита С с пептидами и рекомбинан гными белками

1 £ 3 Класс/подкласс lg Эпитопная 1сцифичность i.o.), природа эпитопа 1 s 3 о Е s р- 2 S Коммерческие тест-системы на основе ИФА (ОП4М)2 Коммерческие тест-системы на основе иммуноблота

-e-J 5 * и о й ^ s g bf I О Н.Новгород :ктор-Бсст Murex Chiron RIBA3 к в Б Э

и U w а С- СО В. 3 В.4 В.1 В.2 S

1F9 Gl 76-90 (Л) 5x10"6 >3,0 Н.О. 1,7 - - - -

6D1 Gl 71-90 (К) 10° >3,0 н.о. 0,4 - - - -

и 1А12 Gl 1-80 (К) 10" 2,8 H.O. - - - - -

L» О и 27 Gl 1-80 (Л)? 5x10"" >3,0 0,5 - - - - -

37 Gl 1-80 (Л)? 10° >3,0 - - - - - -

D4 Gl 80-150 (Л)? 10* >3,0 0,3 - - - -

G7 G2b 80-150 (Л)? ю> 2,7 - - - - Н.О. н.о.

2G12 Gl I гр. (К) 10-" >3,0 1,6 >3,0 - + + +

2Н4 Gl I гр. (К) 10" >3,0 1,6 >3,0 - + + +

5В2 Gl II гр. (К) 10 s >3,0 0,6 >3,0 - + + +

УЗ у 5G2 Gl II гр. (К) 10* >3,0 0,4 >3,0 - + + +

1 6Е9 Gl III гр. (К) 10" >3,0 1.3 >3,0 - + + +

4Н8 Gl IV гр. (К) ю-5 >3,0 - >3,0 - + + +

4G7 M Vrp.(K) 10" >3,0 1,3 >3,0 - + + +

3F11 Gl 1700-1707 (Л) 5x10'7 >3.0 >3,0 >3,0 2,7 + + +

3F12 Gl 1700-1707 (Л) 9x10"' >3.0 >3,0 >3,0 2,8 + + +

s 1D11 G2b 1713-1717 (Л) 5x1 О* >3,0 2,9 0,3 0,3 - + +

z 1D3 Gl 1711-1732 (Л) Ю-1 2,7 0,7 - - + + +

6В11 Gl 1677-1756 (К) 10" 3,0 0,8 0,3 - - + +

Cl Gl 1689-1738 (К) Ю-5 2,6 - - НО. - но. н.о.

2С9 Gl I гр. (К) 10° >3,0 н.о. - - Н.О. + +

3F4 Gl II гр. (Л) ? 10" 3,0 н.о. - - + + -

so 2 1С5 Gl Ш гр. (К) 10" 2,9 Н.О. - - - - -

6D12 Gl IV гр. (К) 5x10" 3,0 НО. - - но. - -

5А9 Gl IV гр. (К) 10" 2,9 н.о. - - Н.О. - -

Природа эпитопа - линейный (Л) или конформационно-зависимый (К);

ля МКА к белкам N83 и N55 римские цифры соответствуют группам сходных по специфичности МКА

(рис.2 и 3);

взаимодействуют с денатурированными белками, но не взаимодействуют с пептидами; ОГЬч; отрицательного контроля =0,1; - отсутствие взаимодействия;

Н.О. - не определяли._

К >ге 1-150и в иммуноблотепосле электрофореза > мбннантных белков в полиакриламидном геле в вос-. д вливающих условиях. Эпитопную специфичность 2 М К А I к белкам N'53 и N54) исследовали с помощью пеп-

• и.у юн <|)аговой библиотеки. Она содержит пептиды слу-инниг о состава определенной длины (в наших экспериментах 14 а.о.). экспонированные в составе оболочечных Ч ¡ков бактериофага [41]. Пугсм аффинной селекции от-" «роли варианты пе! ггидов. которые специфично связы-

:ся с исследуемыми МКА. Сравнение аминокнелот-ы \ последовательностей этих пептидов с амином !слот-ыми последовательностями белков дает возможность 'кхтиздщш как линейных, так и конформанионных де-.-руни.шт белка. Эти эксперименты были проведены Ог.

• I Оепьюга (Университет Тель-Авива. Израиль ).

~ гибридом продуцировали МКА. взаимодействуло-хие с рекомбинантным белком нуклеокапсида. 3 МКА

получены к белку, состоящему из 90 N-концевых а.о. 2 клона (1F9 и 6D1) опознавали частично перекрывающиеся, по различные детерминанты в районе 71-90 а.о. и при этом были иммунореактивны в двух ИФА-тест-системах (см. табл.3) и в тест-системе на основе иммуноблота «Mikrogen». МКА IА12 отличались по антигенной специфичности от 2 перечисленных выше клонов. Совокупность данных пептидного картирования, конкурентного анализа и взаимодействия с денатурированными белками [ 11 ] позволяет заключить, что М КА1F9 опознают линейный эпитоп 76-90 а.о.. МКА 6D1 —конформаиион-ный эпитоп. часть которого локализована на участке 71-90 а.о., МКА 1А12—также конформацнонный эпитоп в области 1-80 а.о. (см. табл. 3).

4 МКА (27,37. D4 и G7). полученные к более протяженному «мозаичному» рекомбинантному белку нук-леокапсида (1-150 а.о.). не взаимодействовали с пептида-

ми [6]. Различия в реактивности МКА с рекомбинантиым белком core 1-80 а.о. и конкурентный анализ позволили установить, что эти МКА опознают4 неперекрывающихся эпитопа. 2 из которых (МКА 27 и 37) локализованы на N-концевом, а 2 других ( D4 и G7)—на С-концевом участке молекулы (см. табл. 3). Прн денатурации рекомби-нантного антигена активность взаимодействия с МКА сохранялась как в ИФА. так и в иммуноблоте. Однако отсутствие активности этих МКА с пептидами не позволяет сделать однозначного заключения о линейной природе опознаваемых ими эгаггопов. Следует учитывать также возможность частичной ренатурации денатурированных рекомбинантны.х белков в водных растворах [20]. МКА. полученные к rCore 1-150. практически не взаимодействовали с белком rCore 1-90, и наоборот. Отсутствие перекрестного взаимодействия может объясняться как неполным совпадением последовательностей этих антигенов, так и различной их конформаиией. Действительно, сравниваемые белки были экспрессированы в составе плаз-мид. содержащих различные белки слияния: GST и Gal. Показано, что конформацня. антигенные свойства и стабильность рекомбинантпых белков ВГС находятся в сильной зависимости от протяженной последовательности белка слияния [38]. Таким образом, полученная нами панель МКА к белку нуклеокапсида позволяет идентифицировать 7 индивидуальных эгагтопов в структуре белка. Нами впервые описаны МКА ( 1F9 и 6D1 ), взаимодействующие с центральной частью соге-белка. которая содержит антигенный участок, активно реагирующий с сыворотками больных гепатитом С [26].

7 гибридом стабильно продуцировали МКА к белку NS3 [1:11]. Аффинность взаимодействия МКА с rNS3 различалась на 1-2порядка. Все МКА с высокой активностью реагировали с рекомбипаптными белками, входящими в состав тест-систем НПО «Диагностические системы», «RIBA 3» обеих версий и «Murex» (версия 3). но не взаимодействовали с антигенами из тест-системы «Murex» (версия 4) (см. табл. 3). Ни одно из МКА не реагировало с шестью 20-мерными синтетическими пептидами. По характеру конкуренции в ИФА МКА можно было условно разделить на 4 группы: 2H4-2G12.5B2-5G2, 4Н8-6Е9 и 4G7. Однако МКА 4Н8 и 6Е9 значительно разл) I-чались по способности взаимодействовать с NS3 из набора «Рекомбн-Бест» и с протяженным пептидом ( 1363-1454 а.о.) [1]. Активность взаимодействия 5 клонов с денатурированными препаратами rNS3 резко падала или полностью отсутствовала, что свидетельствует о чувствительности большинства МКА к целостности конформашюн-ной структуры белка. 2 клона (2G12 и 2Н4) оказались более устойчивы к денатурации, сохраняя до 70% активности. Однакоэпнтоп,опознаваемый этими МКА,также.по-видимому. является конформационным. Такое предположение позволяют сделать результаты анализа M KA 2Н4 с помощью пептидной фаговой библиотеки. Секвениро-вание ДНК-фагов, взаимодействующих с МКА. в области встройки рандомизированных олигопуклеотндов и определение соответствующей аминокислотной последовательности показало, что в трех наиболее активных фаговых клонах из 6 отобранных присутствовал мотив Lys-Glu-Arg-Glu(miH Asp). Гомологичная последовательность в белке NS3 не встречается [27:37]. Логично предположить. что эти а.о. удалены друг от друта в полипептндной

непи. но сближены в пространстве и входят в состав кон-формационн «пит >г,а I{алеемся, что компьютерное сопоставление каргированныхе помощью фагов а.о. и пространственной структуры белка позволит локализовать данный »г.нтог. Су ммируя результаты, можно заключить, чт МКА* NS- гознают по крайней мере 5 индивидуальных конформацнонно зависимых эпитопов. Схематичти >е и » «Зраженне антигенной структуры исследованного участка хелнказного домена белка NS3 представлено на рис 2 Полученные результаты согласуются сданными [1S. 2": 40]. авторы которых установили, что взаимодействие антител m сывороток больных гепатитом С с белком NS3 имеет в основном конформацнонно зависимый характер.

6 МКА были получены к белку NS4 [35]. Активность взаимодействия МКА с rNS4, синтетическими пептидами и рекомбннантными белками из коммерческих наборов в ИФА и иммуноблоте различалась, при этом МКА 3F11 и 3FI2 были активны во всех изученных тест-системах (см. табл. 3). Все МКА реагировали в ИФА с набором НПО «Диагностическиесистемы» и окрашивали полосу белка NS4 в иммуноблоте «Murex». Наблюдались значительные различия в ре-актогенности МКА 1DI1 и 6В11 в тест-системах «Chiron RIBA 3» 2 версий. Оба МКА не взаимодействовали с набором версии 1, где белок NS4 представлен пептидом С-100-3. и активно реагировали с набором версии 2. в которую был дополнительно введен пептид 5-1-1 из центральной части белка. Эпитопное картирование МКА. проведенное с помощью набора из 33 синтетических пептидов, а также конкуре! гптый ИФА показали, что 6 МКА опознают по крайней мере 5 антигенных детермштнт. МКА6В11 и Cl не взаимодействовали с короткими пептидами [35] и были чувствительны к денатурации антигена [11]. Установлено, что эти МКА

NS3

•-•

10 211 «.о. 165 J а. п.

Хслитный домса NS3

Рис. 2. Схематичное изображение антигенной структуры белка NS3 ВГС. Окружностями обозначены эпигоны, опознаваемые МКА:

I - 2GI2 н 2Н4: [I - 5В2 н 5G2: III - 6Е9; IV 4Н8; V - 4G7. Степень перекрывания окружностей условно соответствует степени взаимного перекрывания эпнтопов

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАППВТИЧПСКИЙ ЖУРНАЛ

№3/том2/200.1

папрцвлены к 2 различным конформационным эпитопам иммунодомш!антного региона 5-1-1 белка NS4( 1689-1738 а.о.). MKA3F11 и 3FI2 опознают один общий линейный эпитоп наС-конце белка NS4A(1707-1707a.o.).MKA 1D11 и 1D3 направлены к двум различным линейным эпитопам на N-конце белка NS4B (1711 -1732 а.о.). С помощью пептидов, воспроизводящих последовательности различных генотипов ВГС, показано, что эпитоп 1700-1707 а.о. — общий для всех щученных генотипов (1; 2 и 3). тогда как эпитоп. обнаружь шый на участке 1711-1732 а.о.. специфичен для субтипа 1ЬВГС(МКА 1D3). Часть пептидов из области белка NS4. использованных для картирования МКА, приведена в табл. 2. Локализация эпитопа. к которому напраалены МКА 1D11. была уточнена с помощью пептидной фаговой библиотеки. Оказалось, что 3 наиболее активно взаимодействующих с МКА клона бактериофага содержали мотив Ser-His-Leu-x-Tyr. Гомологичная аминокислотная последовательность находится на белке NS4 ВГС генотипа 1 в позиции 1713-1717 а.о. [27]. Полученные данные впервые позволили определить минимальный антнгеиноактивный участок N-концевой области белка NS4B. Анализ опубликованных данных дает возможность констатировать, что иммуногенный район 5-1-1 белка NS4 ВГС имеет более сложную антигенную структуру, чем считалось ранее [21; 27; 40; 47]. и включает в себя по крайней мере 8 энитопов. 5 из которых идентифицированы впервые с помощью полученных нами МКА [35].

В результате опытов по получению МКА к белку NS5A было отобрано 5 гибрндомных клопов. Все МКА реагировали с антигеном NS5 из состава набора НПО Диагностические системы», с остальными коммерческими белками активностью обладали только 2 клона с МКА 2С9 положительные результаты получены в 3 из 4 исследованных тест-систем, с МКА 3F4 — в 2 из 5 (иммуноблот «RIBA 3» обеих версий) (см. табл. : I По результатам реципрокного конкурентного анаша МКА можно было разделить на 4 группы. При использовании МКА 3F4 в качестве конкурирующих антител наблюдалось несимметричное ннгибнрование в днмодействня копъюгатов МКА 2С9 и 1С5 с антигеном. По-видимому, связывание с МКА 3F4 так изменяет конформацию белка rNS5. что препятствует взаимодействию его с МКА 2С9 и 1С5. Клоны 6D12 и 5 \9 опознавали один общий эпитоп. не перекрываю-лнйся с другими эпнтопамн. На рис. 3 схематично изображена антигенная структура исследованного чистка молекулы белка NS5A. Опыты по денатура-:HHrNS5 показали, что 4 клона (2С9; 1С5; 6D12 и 5А9) были чрезвычайно чувствительны к конформациоиной целостности белка: они теряли активность при обра-" гке антигена даже низкими концентрациями ).025" »денатурирующих агентов. В противоположить этому активность МКА 3F4 сохранялась прак-I : ически полностью, что позволило сделать иредпо-тожение о линейной природе эпитопа. Уточнить лока-ш гацню эпитопа. опознаваемого MKA3F4. неудалось в виду ограниченного набора синтетических пептидов из ч"» 1асти белка NS5. Можно однако утверждать, что этот

• ;!гоп расположен в пределах 2193-2234а.о.: МКА 3F4 е взаимодействовали с белком NS5 в тест-системе

• Мигех» (версия 3). который содержит последователь-

NS5A

Рис. 3. Схематичное изображение антигенной структуры белка NS5A ВГС. Окружностями обозначены эпитопы. опознаваемые МКА:

I - 2С9; II - 3F4; Ш - 1С5; IV - 5А9 n6DI2. Степень перекрывания окружностей условно соответствует степени взаимного перекрывания энитопов

ность 2234-2318 а.о. [37]. В опубликованных ранее работах было установлено, что белок NS5A содержит множество линейных детерминант [27; 37; 40]; на участке белка NS5A. соответствующем использованному нами rNS5 (2193-2300 а.о.), было выявлено 2 линейных эпитопа (2271-2298 и 2295-2313 а.о) [27]. Полученные данные свидетельствуют, что белок NS5 А содержит не только линейные детерминанты, но и по крайней мере 3 кон-формационных эгштопа. узнаваемых МКА.

3. Сравнение эпитопной специфичности МКА и антител из сывороток ВГС-инфицированных пациентов

Представляло интерес выяснить, способны лн полу-чешгые МКА конкурировать с антителами больных гепатитом С за связывание с рекомбинантными белками ВГС. Конкурентный анализ показал, что все МКА конкурировали с антителами, обнаруженными в сыворотках пациентов, за связывание с рекомбннантными белками. При этом коэффициент ннгибировання составлял 25-100% для разных МКА и разных сывороток (табл. 4) [1; 11; 35]. МКА. распознающие антигенные детерминанты белка NS3, конкурировали с антителами в сыворотках пациентов 11анбо-лее активно, среди остальных МКА достаточно активно конкурировали МКА 1F9; 37; D4; 6D1 (анти-соге МКА) и МКА 1D11: 6В11 (airni-NS4 М КА). В то же время связывание МКА, напрааленных к конформационным эпитопам белка NS5A, очень слабо шнибировалось сывороточными антителами. Различия в конкурентоспособности МКА. видимо, свидетельствуют о неодинаковой иммуногешюй потенции индивидуальных энитопов неструктурных белков ВГС. Выявленная способность МКА к конкуренции позволяет предположить, что большинство М КА и антитела к натуральным вирусным белкам реагируют с одними и теми же эпнтопамн. Полученные даш1ые показали также, что набор эпитопов. с которыми взаимодействовали эти антитела, значительно отличался у разных паци-

Таблица 4

Анализ конкуренции МКА с антителами из сывороток больных ХГС

Белки ВГС Конъюгаты МКА Ингибиция связывания МКА с гАГ сыворотками больных ХГС

1 2 3 4 5 6 7 8

Core 1F9 + + + + + + + + + + + + + + + +

6D1 + + + + + + + + + + + + + + +

1А12 + + - + + + + - + -

27 + + 4* +■ + + - - + +

37 + + + + + + ++ + + + + + + +

D4 + + + + + + + + + + + + + +

G7 + + + + + + - + + + + + +

NS3 2G12 + + + + + + + + + - + +

2Н4 + + + + + + + + + + + + + + + +

4Н8 + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

5В2 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

5G2 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

6Е9 + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

4G7 + + + + -t- + + + + + + + + + + +

NS4 3F11 + + + + + + + + - -

3F12 + + + + + + + + + + - -

1D11 + + + + + + + + + + + + + + + + +

1D3 + + + + + + + + + + - + +

6В11 + + + + + + + + + + + +

Cl + + + + + + + - + +

NS5A 2С9 - - - - + - - -

3F4 + - + - + + + + + + - +

1С5 - + - + - - + +

Примечания: все исследованные сыворотки взаимодействовали с белками ВГС в тест-системе "ИФА-анти-НСУ-спсктр" НПО "Диагностические системы", Н. Новгород; степень подавления сыворотками связывания конъюгатов МКА с рекомбинантными белками: + + + на 75-100%; ++ на 50-74%; + на 25-49%; -<25%.

ентов. Это обстоятельство имеет практическое значение, так как указывает на один из путей совершенствования лабораторной диагностики гепатита С за счет включения в состав тест-систем всего спектра антигенных детерминант ВГС. способных индуцировать иммунный ответ. О том, что такая необходимость существует, свидетельствуют данные о различной чувствительности и специфичности производимых в настоящее время тест-систем. Так. при сравнении 5 тест-систем для иммуноблота обнаружено совпадение результатов только в 56% случаев, основные расхождения наблюдатись при выявлении белков NS3 и NS4 [19]. Взаимодействие МКА с суррогатными антигенами из коммерческих тесг-систем наглядно демонстрирует различия в составе включенных в них белков. В версии 2 тест-системы «Chiron RI В А 3», например, можно отметить включение 2 дополнительных антигенных детерминант, опознаваемых M КА 6В11 и 1D11, что повысило чувствительность второй версии по сравнению с первой (см. табл. 3). В новой, четвертой версии тест-системы для 11ФА фирмы «Murex», напротив, отсутствуют аналоги всех 5 конформациониых антигенных детерминант белка NS3. опознаваемых полученными МКА. В то же время известно, что 90% естественных антител к этому белку направлены именно к конформационным эпн-топам хеликазного домена NS3 [18].

4. Использование МКА для изучения локализации белков ВГС в эукарнотических трансфицированных

клетках

Вторым этапом работы по изучению свойств полученных МКА было исследование tlx способности распознавать не только рекомбинантные белки, полученные в бактериальной системе экспрессии, по и антигены, эксп-рессированные в эукарнотических клетках, трансфицированных рекомбннантной ДНК-плазмидой. Трансфипи-рованные клетки линии ВНК были любезно предоставлены Dr. V. Bichko (США). Для трансфекции использовалась плазмида содержавшая гены 5 неструктурных белков ВГС — NS3. NS4A. NS4B. NS5A и NS5B. С использованием метода непрямого иммунопероксидазного окрашивания in situ установлено, что все исследованные МКА выявляли синтезированные в клетках вирусные белки (табл. 5). МКА различались по интенсивности окрашивания, по количеству окрашенных клеток и по субклеточной локализации выявляемых ими белков. Неструктурные белки ВГС обнаруживали исключительно в цитоплазме клеток. При использовании МКА 5G2(NS3); 6В11; 3FI2 (NS4): 2С9 и 3F4(NS5) накопление белков ВГС наблюдали преимущественно около мембраны клеток, тогда как с помощью

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

№3/том2/2(Ш

друшх МКА выявляли диффузное распределение белков в цитоплазме. Различия в локализации связаны, видимо, с особенностями экспрессии, накопления и секреции белков ВГС в транефнцированпьгх клетках, тогда как рахш-чня в активности можно объяснить различной экспоии-рованносгыо эпитопов. к которым направлены МКА.

5. Изучение способности МКА

взаимодействовать с натуральными белками ВГС

Антигенная структура рекомбинантных и натуральных белков может различаться, и достаточно часто антитела. полученные к суррогатным белкам ВГС, не взаимодействуют с натуральными вирусными белками [21 ; 22; 46]. Для анализа способности полученных МКА опознавать антигенные детерминанты натуральных белков ВГС мы использовали материаты (ткань печени, лимфоциты и сыворотку периферической крови) от больных ХГС, а также плазму крови от добровольных доноров, имеющих антитела к ВГС. Биологические образцы от пациентов были предоставлены Т В. Шкурко (НИИ вирусологии РАМН),сотрудниками 1 ИКБг. МосквыО.О.Знойкои Е.А. Климовой. В.Д. Ткачевым (ЦНИИ гастроэнтероло-ии ). плазмы от доноров—Т.В. Голосовой и A.B. Сомовой (Гематологический научный центр, г. Москва).

5.1 Выявление белка нуклеокапсида в сыворотках с помощью МКА Одним из важных этапов наших исследований была разработка метода выявления белка нуклеокапсида в сыворотках ВГС-инфнцированных лице помощью МКА к соте-белку ВГС. В настоящее время диагностика гепатита С основывается главным образом на выявлении антител к вирусным белкам. Существенный недостаткок этого теста невозможность ранней диагностики инфекции до серо-конверешт. Известно, что вирусспецифнческие антитела в сыворотках крови шфщнрованпых лиц можно выявить в

среднем спустя 6-7 недель после зараже!шя. иногда период так называемого «окна» может составлять до 20 недель [ 17; 53]. В этот период ВГС можно обнаружить только с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). которая характеризуется чрезвычайно высокой чувствительностью. К недостаткам метода следует отнести его сложность, потребность в дорогостоящем оборудовании и пока недостаточная воспроизводимость результатов. Так. по сообщениям экспертов ВОЗ. данные разных лабораторий, исследовавших одш1 и тот же набор сывороток при помощи ПЦР. существенно отличаются друг от друга из-за возштк-новения ложнопозитивных и ложнонегативных результатов [29]. При установлении диагноза гепатита С и назначении противовирусной терапии важно проводить динамический контроль за активностью заболевания, одной из характеристик которой является уровень виремии. В то же время коммерческие тест-системы для количественного определения вирусной нагрузки (например, набор «Amplicor Roche» для измерения концентрации РНК ВГС) малодоступны в связи с высокой стоимостью. Поэтому нужен был альтернативный метод количественного обнаружения ВГС, более простой и дешевый, но высоко чувствительный и специфичный.

Слож] юсть созда! шя такого теста заключалась в том. что вирус накапливается в сыворотке крови в чрезвычайно низкой концентрации и. крометого. находится в значительной степени в составе иммунных комплексов, экранирующих антигенные детерминанты виру сных белков [39; 49; 50]. В нашей лаборатории разработан оригинальный подход, вы-якшоущш соте-белок ВГС в сыворотках крови \9; 32]. Объектом исследования служили плазмы крови добровольных доноров. содержащие антитела к белкам ВГС.

Метод включает:

1) осаждение вируссодержащего материала;

2) его обработку детергентом в присутствии высокой ионнойсилы;

3) ИФА с использованием МКА к белку нуклеокапсида.

Таблица 5

Использование моноклинальных an i in ел для выявления белков BI С в клетках линии ВНК. трансфицированных рскомбинантной плазмнлон, содержащей гены неструкту рных белков ВГС

Количество Интенсивность

Белки ВГС МКА окрашенных клеток, % окрашивания (условные обозначения) Локализация в клетке

2G12 7,4 + Цитоплазма/клеточная мембрана

2Н4 0,5 + Цитоплазма/клеточная мембрана

4Ш 6 + Цитоплазма/клеточная мембрана

NS3 5В2 60 +++ Цитоплазма/клеточная мембрана

5G2 7,2 + Преимуществешю * клеточная мембрана

1 6Е9 8 + Цитоплазма

3F12 17,5 ++ Преимущественно * клеточная мембрана

NS4 1D11 10 + Цитоплазма/клеточная мембрана

6В11 12 ++ Преимущественно * клеточная мембрана

NS5A 2С9 12,5 + Клеточная мембрана

3F4 13,3 + Клеточная мембрана

* Окрашивалась преимущественно мембрана клеток и в меньшей степени - цитоплазма.

V 5. том2/2003

российский биотерапевтический журнал

Концентрирование вируссодержащего материала проводили путем высокоскоростного центрифугирования плазм; обработка осадков заключалась в солюбили-зации липиднон оболочки вируса детергентами и дезинтеграции иммунных комплексов с помощью хаотроп-ных агентов; антигенную активность вирусного белка определяли в ИФА по схеме «двойного антительного сэндвича». Содержание соге-белка в плазмах оценивали по калибровочной кривой с рекомбинантным белком. Максимальная чувствительность выявления рекомби-нантного белка получена при использовании двух МКА (D4 и 27) для конструирования сэндвича [6]. тогда как оптимальная детекция натурального антигена достигалась при сорбции четырех МКА (27; 37; D4; G7) разной специфичности [32]. Наиболее важно здесь включение в состав сэндвича М КА 27, опознающих эпитоп на N-конце белка в качестве как улавливающих, так и детектирующих антител. Вероятно, этот участок наиболее экспонирован и/или антнгенно активен в пространственной мультимерной структуре молекул соге-белка. образующих капсид вирусных частиц. Метод позволяет выявить до 5 пг антигена на I мл плазмы, и он более прост и дешев по сравнению с ПЦР. При одновременном анализе в ИФА осадков, обработанных разными способами, новый подход позволяет дифференцировать различные формы вирусных частиц, циркулирующих в периферической крови: безоболочечиые нуклеокапсиды. вирио-ны. иммунные комплексы (ПК). При исследовании 80 анти-ВГС позитивных плазм доноров РНК ВГСбыла обнаружена только в 49% из них [9]. Выявление соге-белка совпадало с результатами ПЦР: 94.4% РНК-пози-тивных образцов содержали и белок нуклеокапсида. В циркуляции были обнаружены и свободные вирусные частицы, и ПК в сочетании с вирнонами или нуклеокап-ендами. причем в 43% плазм соге-белок быт выявлен только посте разрушения ПК. Сопоставление результатов обнаружения вирусного антигена в образцах, содержащих ВГС разных генотипов, показало, что МКА выявляли ВГС по крайней мере трех генотипов: I (1Ь) — в 24 плазмах из 27 исследованных (89%). 3 (За) — в 4 из 4 (100%) и 2 (2а и 2с) — в 4 из 6 (67°/.) [9; 32; 34]. Полученные данные свидетельствует о консервативности выявленных эпитопов соге-белка ВГС и их высокой актиген-ной активности. Большим преимуществом разработанной методики является возможность количественного анализа соге-белка. Это важно в связи с имеющимися сведениями о том. что концентрация соге-белка в сыворотках пациентов может служить прогностическим критерием как при оценке стадии заболевания, так и при мониторинге интер<||еронотерапии [39; 50].

Тест-система для прямого определения антигена ВГС необходима для ранней диагностики ГС. что особенно важно при первичной инфекции и скрининге пулов крови для приготовления препаратов на их основе. Основными препятствиями к внедрению разработанного метода в практику здравоохранения были требования большого объема сыворотки и применение высокоскоростного центрифугирования. Выход из указанного положения подсказали опьггы. в результате которых был разработан альтерна тивный способ концентрирования вируссодержащего материала. Применение с этой целью полиэти-ленпгаколя позволило определять соте-белок, используя

3-5 мл сывороток крови [34]. Дальнейшие эксперименты по усовершенствовашио метода направлены на повышение чувствительности ИФА благодаря включению в состав сэндвича анти-соте МКА разной специфичности и более высокой аффинности, а также применению различных систем усиления сигнала. О целесообразности отечественной тест-системы и внедрения ее в практику говорит тот факт, что недавно коммерческие диагностику-мы для обнаружения антигена ВГС предложены и двумя зарубежными фирмами («Kokusai Shiyaku Co.», Япония и «Ortho Diagnostic«. США).

5.2. Изучение способности МКА к белкам ВГС выявлять натуральные антигены в клетках печени пациентов с ХГС

Следующий этап работы заключался в исследовании способности МКА выявлять натуральные антигены ВГС в инфицированных клетках печени больных ХГС. Положительными предпосылками при этом служили полученные нами данные о выявлении антигенов. экспрессируюшихся в эукариотических трансфи-цированных клетках, и способности МКА выявлять те же антигенные детерминанты, что и антитела из сывороток анти-ВГС позитивных лип При исследовании ткани печенн активность взаимодействия МКА с белками ВГС оценивали по результатам иммуиоперокси-дазного окрашивания ( И ПО) криостатных срезов печени, полученных из бнопсийных материалов от 69 пациентов с ХГС [И; 12; 35]. Серийные срезы окрашивали с использованием 11 МКА к белкам соте. NS3. NS4 и NS5. отобранных по принципу различной эпи-топной специфичности, п. кроме того, смесями МКА. Все исследованные МКА к белкам ВГС выявляли антигены в клетках печенн, но с разной эффективностью (табл. 6). Приведенная в таблице группа, состоящая из 15 пациентов, была выбрана как отражающая результаты детекции белков ВГС у всех 69 пациентов: в дополнении к таблице приведены данные выявления белков у всех изученных пациентов.

Наиболее активно взаимодействовали с натуральными белками ВГС МКА к неструктурным белкам NS4 и NS5. выявляющие эти антигены более, чем у половины пациентов. Для обнаружения натурального белка NS4 использовали МКА с различной эпитоппой специфичностью— МКА 3F12; 1DI1 и 6В11. Результаты, представленные в табл. 6. показывают, что наибольший уровень детекции получен с применением МКА 1DII и 6В11. МКА 3FI2. наиболее активно взаимодействующие с рекомбинантными белками и пептидами (см. табл. 3). выявляли натуральный белок NS4 с меньшей активностью по сравнению с МКА 6В11 и 1D11. Только в одном случае белок NS4 был обнаружен с помощью МКА 3FI2 при отрицательных результатах с 2 другими airrn-NS4 МКА. МКА отличались друг от друга и по характеру окрашивания: МКА 6BI 1; 1D11 и 3F12 продуцировали достаточно интенсивную (в условных обозначениях +++ и ++) окраску гепатоцитов у 71%, 54% и 36% пациентов соответственно: среднее количество окрашенных клеток в препаратах сосгааляло для этих M KA соответственно 44"/»; 36%и 30%[12:35]. При использовании МКА 6В11 наблюдалось характерное крупнозернистое окрашивание. редко обнаруживаемое при применении других

РОССИЙСКИЙ БИОТПРАПЕВТИЧПСКИЙ ЖУРНАЛ

№3/том2/2003

Таблица 6

Способность МКЛ различной эпитопной специфичности кымн. ihгь белки ВГС' в клетках печени батьных ХГС

Номер Моноклональные антитела к белкам

истории Core NS3 NS4 NS5

болезни 27 D4 1F9 2G12 4Н8 6Е9 5G2 3F12 1D11 6В11 2С9

3530 - - + - - + + + + + +

7180 + - + - + - + + + + +

4676 - - - - - + + - + + +

4047 - - + - - - - + + + +

6624 - - - - - + - - + + +

6523 - - - - - - - + + + +

5565 - + - - + - - + + + +

5692 - - + + - - - + + + +

5553 + - - + - - - - + + -

6262 - - - - - - - - + - -

8663 - - - - - - - - - - -

8348 - - - - - - - - - - -

6638 - - - - - - - - - - -

8265 - - - - - - - - - - -

8240 - - - - - - - - - - -

Дополнение

МКА1 3/26 1/17 9/35 2/17 3/30 8/37 8/41 17/40 31/56 26/50 29/50

12% 6% 26% 12% 10% 22% 20% 43% 55% 52% 58%

Смесь : 17/61 18/42 46/69 29/50

28% 43% 67% 58%

белки ВГС обнаружены; - белки ВГС не обнаружены; ' отношение количества положительных образцов к коли МКА (%);

честву исследованных с помощью индивидуальных

отношение количества положительных образцов к количеству исследованных с помощью смеси МКЛ (%).

МКЛ Различия во взаимодействии МКА 6В11 и ЗР12с гхк; мбинантным и натуральным белком N54 указывают на различия в их тонкой антигенной структуре. Таким -"разом, согласно нашим данным, наиболее экспониро-; ванные и/или иммунодомииантные в натуральном белке NN4 2 эпитопа: конформашюнньш. опознаваемый МКА В11. и линейный (1713-1717 а.о.) на белке N548. опознаваемый МКА 1011. Отметим, что суммарный уровень :егекции белка N54 (67%) с использованием всех МКА :■ азался выше, чем при любом одном МКА. так как по-: югтельиые результаты И ПО дня различных МКА часто I не совпадали. Данные других авторов также указывают а высокий уровень экспрессии белка N54 в клетках печени [21:22]*.

Конформационно зависимая детерминанта на белке ХБЗА. к которой направлены МКА 2С9. также ока-I зась экспонированной в натуральном вирусном белке, поскольку была обнаружена в 58% случаев (см. :абл 6) [11: 12]. Представляет интерес тот факт, что МКА 2С9 практически не были способны конкуриро-ва гь с антителами в сыворотках больных за связывание с рекомбннантным белком (см. табл. 4). Это мо-*ет быть связано с несовпадением антигенной и имму-ногенной активности эпнтопа: подобные результаты I получены также другими авторами при исследовании свойств МКА к белку нуклеокапсида ВГС [20].

Для детекции белка N53 были использованы 4 МКА (см. табл. 6) [11; 12]. Все они выявляли нату-

ральный белок с невысокой частотой, наибольшей активностью (около 20%) обладали 2 МКА, опознающие

2 индивидуальные конформационпые детерминанты (5G2 и 6Е9). 2 других конформациоиных эпитопа (МКА 4Н8 и МКА 2G12) выявлялись в 2 раза реже. В то же время суммарный уровень детекции белка NS3 с учетом всех использованных МКА был значительно выше (43%), так как положительные результаты НПО для различных МКА часто не совпадали (см. табл. 6). Так. например. МКА 2G12 обнаружили антиген в 2 биопсиях, где применение других a»mi-NS3 М К А давало отрицательный результат. В одном случае только МКА 4Н8 выявляли белок NS3. в то время как у 2 других пациентов совпадали положительные результаты с МКА 5G2. Детекция антигена с помощью МКА 6Е9 в

3 случаях была независимой и в 5 совпадала с выявлением NS3 с использованием МКА 5G2. Данные о различной частоте выявления одних и тех же белков ВГС антителами разной эпитопной специфичности представляют интерес и заслуживают подтверждения на большем экспериментальном материале, так как могут свидетельствовать о точечных аминокислотных заменах в белках ВГС. синтезируемых в гепатоцитах. О том. что точечные замены могут сильно редуцировать взаимодействие конформационно-зависимых эпи-топов с антителами, сообщили авторы, изучавшие белок нуклеокапсида ВГС [38].

Самый низкий уровень выявления (28%) получен

ятя белка нуклеокапсила [11:12; С помощью М КА 1F9 соге-белок был обнаружен чаше по сравнению с другими МКА (см. табл. 6). В одном обра ше N1KA D4 позволили выяв!пъ нуклеокапсидный белок, тогда как др>тие анти-соге МКА оказались неэффективными 11одобная ситуа-ция имела место и в случае М КА 27 В то же время М КА 27 и D4 выявляли натуральный антиген в печени лишь в единичных срезах. Такая низкая активность МКА оказалась неожиданной, так как было показано, что МКА 27 и D4 с высокой чувствительностью обнаруживали соге-бе-лок в составе вирусных часпш, циркулирующих в плазме крови [9:32]. Средний уровень детекции core белка, согласно данным ряда авторов, составляет около 50%, варьируя в зависимости от специфичности антител, метода окрашивания и категорш! пациентов от 0 до 83% [21; 24: 54]. Полученные в настоящем исследовании относительно низкие значения могут свидетельствовать о недостаточной экспоннрованностн эшгтопов этого балка для изученных МКА в клетках печени. Ранее было показано, что белок нуклеокапсида иногда находится в различных кон-формацнонных формах [55]. По-видимому, посттрансляционные изменения влияют на пространствеитто структуру эшгтопов. к которым направлены МКА 27 и D4. вследствие чего эти эпнтопы становятся более доступными для взаимодействия с антителами в составе циркулирующих вирусных частиц, чем в клетках печени, инфицированных ВГС. МКА 1F9 распознают эпитоп в центральной части соге-белка (76-90 а.о.); в сходной области (82-102 а.о.Локализован главный домен межмолекулярного взаимодействия. который в полноразмерном белке экранирован С-кониом молекулы [38]. Данные настоящего исследования позволяют предположить, что антигенная структура незрелого соге-белка в гепатошггах и мульти-мерпого соге-белка, «собранного» в капсид в составе вирионов. различаются.

В целом, хотя бы один из белков ВГС обнаружен у 51 из 69 пациентов (74%). что соответствует уровеню детекции белков при использовании МКА. полученных другими авторами [21; 22:54], или превышает его. При изучении внутриклеточного распределения белков ВГС специфическое окрашивание было обнаружено только в цитоплазме гепатошпов, что согласуется с большинством опубликованных работ [21:22:24; 46; 54]. Характер окраски клеток различными МКА в основном был сходен. Окрашивание носило диффуз1 гый характер в виде мелких гранул, чаще оно i шб.людалось в перинуклеарной зоне, иногда окрашивалась только часть цитоплазмы. Белки в печени выявлялись чаше по сравиешпо с РНК ВГС в сыворотке крови (6 Г/о) [12]. Это указывает i ia большую чувствительность данного теста при выявлении ВГС-ннфекции. Таким образом, полу-четшая панель МКА к белкам ВГС может служить эффективным иммунным реагентом для совершенствования диагностики гепатита С.

5.3. Исследование белков ВГС в лимфоцитах периферической крови больных ХГС

Исследовали способность МКА выявлять белки ВГС в лимфоцитах периферической крови (ЛПК). Проводили непрямое НПО in situ, для чего готовили цитологические препараты ЛПК. выделенных из периферической крови 52 пациентов с ХГС [10]. Для изучения экспрессии белков ВГС в этих клетках использовали

МКА. направленные к белкам core (смесь МКА 27 и D4). NS3 (смесь МКА 6Е9 и 5G2) и NS4 (смесь МКА 6В11:3F12 1D11). Эффективность выявления этих белков в ЛПК составила 21%; 16% и 13% соответственно. Доля антиген-позитивных клеток в препаратах ЛПК варьировала от 1% до 21%i и составляла в среднем 6% [10]. Вирусные антигены выявлены исключительно в цитоплазме лимфоцитов. Суммируя данные по всем изученным белкам ВГС. можно констатировать, что они обнаружены в ЛПК 23% больных.

5.4. Выявление белков ВГС в лизатах ткани печени Изучали возможность определения антигенов ВГС в печени больных с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Он имеет ряд преимуществ для практических лабораторий: доступность, высокую чувствительность, возможность стандартизации и автоматизации. Для выявления вирусных антигенов требовалось лизировать мембраны гепатоцитов. чтобы сделать белки ВГС доступными для взаимодействия с ai [тителами. Лизаты клеток печени готовили с помошыо специально подобранных сочеташш ионных и неионных детергентов, которые солюбилизировали цитоплазматнческие мембраны, но не инактивировалн вирусные белки. Апробированы различные варианты МКА в качестве сорбентов на твердую фазу и в качестве конъюгатов с ферментативным маркером. Испытанные сочетания МКА в составе ИФА-сэндвичей обладали разной чувствительностью. По-видимому, это объясняется разной устойчивостью эпито-пов к обработке детергентами. Белки NS3 и NS5 выявить да!шым методом не удалось, вероятно, из-за разру-шепня конформашюнно зависимых эпитопов. Белок NS4 при оптимальном подборе сочеташш МКА определялся с чувствительностью около 80 пг на мг ткани печени, результаты выявления белка хорошо коррелировали с наличием РНК в печени этих пациентов [33]. Наиболее чувствительное определение соге-белка достигалось при конструировании сэндвича с использованием МКА D4 и 27. При изучении образцов ткани печеш! от 24 больных с ХГС минимальная концентрация белка нуклеокапсида. обнаруженная в лизатах пече! ш, составляла 0.1 ш на мг ткани. а максимальная—около 3 нг [7]. Это значительно больше. чем было выявлено в сыворотках ВГС-инфицирован-I гых лиц, где концентрация соге-белка не превышала пиког-раммовых количеств [9; 32]. Разработанные методы позволили верифицировать гепатит С у 7 из 15 пациентов с гепатитом неясной этиологии, у которых не были обнаружены серологические маркеры инфекции [7]. Таким образом. ИФА лизатов печени представляет интерес как стеорети-ческой точки зрения —для гоучения природы В-клеточных эпитопов натуральных белков, так и с практической—для экспресс-диагностики гепатита С.

6. Использование МКА для изучения патогенеза гепатита С

В заключите хотелось бы остановиться на использовании полученных МКА для исследования роли белков ВГС в патологическом процессе. Хрошгческнй гепатитС(ХГС) характеризуется широким спектром клинических проявлений: тяжестъ заболевания варьирует в больших пределах от бес-CI мптом! юго i юапельства до тяжелых форм с поврежде> в i-ем печеш! [ 17; 53]. Многие проблемы, связанные с этим за-

РОССИЙСКИЙ БИОТПРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

,Ч»3/том2/2003

БИОМАРКЕРЫ

болеванием, в настоящее время изучены недостаточно. Одним го нерешенных вопросов патогенеза ГС является выяс-iieinie роли вирусных факторов (РНК и белков). Не ясно, например. как влияет вирусная нагрузка на прогрессированис ГС. происходит ли репликация вируса только в печени или также в других органах и тканях. Не определены пока механизмы. с помощью которых иммунная система хозяина минет на развитие патологического процесса. В настоящее время предполагается, что ВГС не обладает прямым цитопатн-ческим действием, и этот процесс опосредован иммунной системой, ключевая роль при этом отводится Т-клелочному иммунному ответу [ 14:17]. Однако точный меха!шзм повреж-.хаюшего действия вируса на клетки печени полностью не раскрыт, а данные по перечисленным выше вопросам весьма противоречивы [14; 17; 30: 31; 49].

Для изучения роли белков ВГС в патологическом процессе при ХГС мы применили комплекс иммунохн-мическнх методов, разработанных нами на основе панели полученных МКА к структурным и неструктурным белкам ВГС. Цель исследования состояла в изучении роли таких вирусных факторов, как вирусная нагрузка, циркуляция в крови различных популя-11ий вирусных частиц, накопление белков ВГС в клетках печени и ЛПК на активность заболевания и им-м> нный ответ пациентов с ХГС.

Исследовали материалы (ткань печени и кровь) более чем от 150 пациентов с разными формами забо-■свания ХГС. В одних и тех же материалах параллель-но с изучением белков определяли наличие вирусной РНК(геномной и репликативиой форм) методом ПЦР. Результаты детекции ВГС у пациентов сравнивали с активностью и стадией ХГС, а также с показателями В- и Т-клеточного иммунного ответа статистически-мн методами, в том числе и корреляционным анали-v Морфологические изменения в печени оценивали в баллах в соответствии с международной классификацией с определением индекса гистологической активности (ИГА), на основе которого определялась сте-снь активности гепатита и индекса фиброзироваиия пе-iCHH (ИФ), характеризующего стадию заболевания (эта истъ работы была выполнена Е.И. Келли, 1 И КБ. Моск-за Функциональную активность печени оценивали по • р> нню сывороточной аланннаминотрансферазы (AJ1T). С пестр антител к отделышш белкам ВГС и нх активность :;! т ры) определяли с использованием подтверждающей ее; -системы «11ФА-анти-ВГС-спектр» (НПО «Диагнос-н чес кие системы». Н.Новгород). Для изучения феноти-а ЛПК пациентов использовали непрямой иммунофлю-ресцентный метод с применением МКА к поверхностным рецепторам лимфоцитов различных субпопуляций: v D4 : CD8-; CD16"; CD20*; CD95" («СорбенР», Москва).

Данные о существовании связи между экспрессией :ков ВГС в печени и активностью ХГС противоречивы II. 22; 24:46; 54]. В нашем исследовании пациенты, в с-чени которых был обнаружен хотя бы один из белков ВГС. достоверно чаше встречались среди больных с повышенным уровнем АЛТ (табл. 7) [12]. Это свидетель-v: вует о влиянии экспресаш белков ВГС па активность катологического процесса в печени. С другой стороны, инфицированные гепатоцнты в большинстве случаев аыглядели морфологически нормальными, топографической связи между очагами воспаления и некроза ткани

и антиген-позитивными клетками у изученных больных не обнаружено. Это позволяет предположить отсутствие прямого цитопатического действия ВГС у хронических больных. Мы предполагаем, что морфологические изменения в ткани печенн могут происходить более медленно по сравнению с нарушением функциональной активности клеток. Возможно, для изменения морфологии и гибели клеток в инфицированных гепатошггах должен быть достигнут «критический» уровень накопления вирусных белков. Показано, что сочетание положительных результатов обнаружения белков в печенн и РНК ВГС в сыворотке достоверно ассоциировалось с более высокой активностью ХГС (по ИГА и АЛТ) [12].

Анализ экспресаш индивидуальных белков в печени пациентов с ХГС представляет особый интерес в связи с тем. что ранее оценивали, как правило, накопление не более 1 -2 белков ВГС [21; 22; 52; 54]. Результаты нашего исследования показали, что существуют значительные качественные и количественные отличия в соотношении изученных белков. Белки core: NS3: NS4A; NS4B и NS5A выяалены у 28'У«; 43%; 43%; 55% и 58%больных соответственно (табл. 6). Одновременно 5 исследованных белков найдены только у 4 пациентов in 69. у остальных больных обнаружено от 1 до4 индивидуальных белков ВГС. Количество антиген-позитивных клеток в печени разных пациентов и интенсивность окрашивают значительно варьировали [12].

Показано, что накопление белка соте в клетках печени ассоциировалось с более высокой активностью АЛТ, что указывает на связь экспрессии этого структурного белка с цитолизом гепатошггов (см. табл. 7). Количество клеток, экспреагирующих белок core, положительно коррелировало с обнаружением минус-цепей (репликативиой формы) РНК ВГС в печени пациентов. О способности белка нуклеокапсида ВГС вызывать повреждение и апоптоз клеток, трансфицнрованных геном соте-белка, имеется несколько сообщений [23; 43]. Для понимания связи между сборкой нуклеокапсида. репликацией вируса и повреждающим действием ВГС на клетки печени требуются дальнейшие исследования.

При анализе неструктурных белков NS3 и NS4B показано. что относительное количество гепатошгтов. содержащих эти белки, снижается при прогрессировали!! ХГС и нарас-тагаш воспалительно-некротических изменений в печени (см.табл. 7) [12]. На основании полученных данных можно предположить, что более активная экспрессия белков NS3 и NS4B в печени происходит на ранних этапах инфицирования вирусом. Это предположение согласуется с полученными данными по гоучешпо минус-цепей РНК ВГС в печенн: при переходе от слабо выраженного к умеренному ХГС репликация ВГС подавлялась [4; 5]. Белок NS3—один го важнейших вирусных ферментов, поскольку сочетает функции сернновой протсазы, хеликазы и металлопротеиназы [15]. Функции белка NS4B в жизненном цикле ВГС не выяснены, и можно надеяться, что МКА. имеющиеся в нашем распоряжении, помогут в решении этого вопроса.

При изучении накопления белка NS5A обнаружена позитивная корреляция (т=0,5; р=0,007) между числом клеток, экспресснруюших этот белок, и стадией заболе-ваш1я: белок NS5A у пациентов с выраженным фиброзом и циррозом определялся в большем числе гепато-цитов. чем у больных со слабым фиброзом (см. табл. 7). Этот белок достоверно чаше обнаруживался у пациен-

Связь между выявлением б* л ков и РНК ВГС и тяжестью ХГС

Таблица 7

Белки и РНК ВГС Гистологические показатели Биохимическая активность (АЛТ)

Локализация Маркеры Средняя частота ИГА (активность Индекс фиброза

выявления (%) ХГС) (стадия ХГС)

Белки* смесь 74 <-> <-> т

Соте 28 <-> <-> т

N83 43 4 <->

X о N54 А 43 <-> <-> <->

и f» 55 1 <-> t

58 т <-»

Плюс-РНК 86 <-> t

Минус-РНК 32 4 <-»

Белки* смесь 23 «-* т

1 Плюс-РНК 67 <-> т

Минус-РНК Не обнаружена

Соге-белок** 76 <-> т т

Вирионы 30 Т «-»

о. с Иммунные комплексы 70 <-> т

3 и Соте-белок** (концентрация) 274±59 пг/мл <-> <->

Плюс-РНК 55 <-> <->

Одновременно белки в печени и РНК в 41 т т

сыворотке

Т - выявлена позитивная корреляция между частотой выявления маркера и показателями тяжести ХГС;

1 - выявлена негативная корреляция;

<-> - корреляции не выявлено;

* белки ВГС определяли методом ИПО;

** белки ВГС определяли методом ИФА;

РНК ВГС определяли методом ПЦР._

тов с большей продолжительностью инфицирования ВГС [12]. Выявлена закономерность, что более активная экспрессия белка NS5A в печени стимулировала выработку- высокотнтражных антител к нему (в других исследованных белках подобного феномена не наблюдалось). При этом anTii-NS5A антитела выявлялись значительно чаше у больных с выраженным фиброзом печени и ги-перферментемией [13]. Высокие титры антител к белку NS5 при ХГС считают одним из неблагоприятных признаков [16]. Впервые выявленная нами корреляция между накоплением белка NS5A в клетках печени, выработкой антител к этому белку и прогрессированием заболевания позволяет предположить, что белок NS5A может рассматриваться как один из маркеров тяжести патологического процесса при хроническом гепатите С. Имеющиеся данные указывают на многофункциональность белка NS5A [48]. Одна из его предполагаемых функций — ответственность за чувствительность к интерферону [1 5; 48]. Подтвердить это предположение помогут исследования экспрессии белка NS5A у больных, получающих интерферонотерапшо.

При анализе маркеров поверхности ЛПК впервые показано, что у пациентов с активной экспрессией белков ВГС в печени по сравнению с больными без определяемых вирусных маркеров (антигенами в печени и/ или РНК в сыворотке) происходят более глубокие на-

рушения Т-клеточного звена иммунитета, которые выражаются в снижешш соотношения CD4VCD8' (ТЫ CTL) и количества CD16* (NK) [13]. Эти данные могут свидетельствовать о более слабом пролифератив-ном ответе CD4' Т-клеток на антигены ВГС и более слабую противовирусную резистентность макроорганизма. обусловлентто NK-клетками, у пациентов с активной репликацией ВГС. Соотношения ЛПК изученных субпопуляшш не различались у больных с разной активностью и стадией ХГС.

У 28 пациентов (54%) на поверхности ЛПК был обнаружен рецептор Fas-зависимого апоптоза CD95*. В последнее время проблема апоптоза активно изучается и обсуждается в связи с гипотезой о ключевой роли этого механизма в повреждающем действии ВГС на клетки, однако получешше экспериментальные данные противоречивы [14; 42]. Любопытно, что в наших экспериментах выявлена обратная корреляция между относительным количеством ЛПК, экспрессируюших CD95". и частотой выявле!шя белков (core, NS3. NS4A и NS4B) в клетках печени. У пациентов с виремией, напротив, CD95*-K/ieTKii встречались в 2 раза чаше, чем у больных без виремни [ 13]. Роль белков ВГС в апопто-зе исследована главным образом в модельных системах (трансфицированные клетки и трансгенные животные). Одни авторы считают, что при вирусном гепатите

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ №Э/том2/2003

С, в частности, пол влиянием белка нуклеокапсида. происходит активация Fas-опосредованной гибели клеток [23; 43]. В других работах показано, что белок core ингибирует апоптоз [30:31]. Эти противоречия авторы объясняют особенностями клеточных линий, использованных для трансфекции [23]. Результаты наших исследований свидетельствуют об ннгибируюшем влиянии экспрессии вирусных белков в печени на процесс Fas-опосредованного апоптоза в ЛПК. Полученные данные позволяют предположить, что подавление вирусными белками апоптоза. реализуемого через Fas-систему, — одна из причин перснстенции ВГС-инфекции.

В ряде исследований было показано, что Л ПК могут инфицироваться В ГС [17; 47:51], однако вопрос об активной репликации вируса в клетках периферической крови до сих пор остается спорным. Вирус-специфические белки в ЛПК были обнаружены нами только . 23". .больных, при этом основным детектируемым белком являлся белок нуклеокапсида (см. выше раздел 5.3) 10]. Это коренным образом отличалось от соотношения белков ВГС, выявляемых в печени, где обнаружи-вались в основном неструктурные белки, которые нг-рают важную роль в решпгкацни ВГС. Средняя доля инфицированных лимфоцитов составляла около 6%, юг да как аналогичный показатель в клетках печени — :• о.ю 30% [12; 35]. При изучении РНК у 64% больных в !11К были обнаружены плюс-иепн (геномные) РНК ВГС. тогда как ни у одного пациента не выялепы ми-. -цепи (репликатнвные) РНК ВГС [4; 10]. Маркеры ВГС (белки и РНК) достоверно чаше обнаруживались а 1ПК пациентов с повышенным уровнем АЛТ (см.

" ! 7). Корреляция между выявлегшем белков ВГС и гис-- : »гической активностью не установлена. Концентрация . • ---белка в сыворотках пациентов с инфицированными 1 ' Ж быта в несколько раз выше, при этом ВГС-познтив-I ■■ : . i имфошггы с большей частотой обнаруживались у I : лгтов, всыворотке крови которых циркулировали вп-г. i:ij. а не ПК. Полученныедапныс свидетельствуют в I :iy предположения, что в ЛПК активная репликация ■иг. са не происходит, либо находится на очень низком ) «вне. Эти клетки могут играть роль «резервуара» нн-фо гни и/или участвовать в распространении вируса по ч р анкзму. Инфицирование лимфоцитов вирионамн мо-• е- происходить либо в печени, либо непосредственно в г.и '.ме крови и чаще осуществляется, по-видимому, у тех 1.. !снтов. у которых ВГС циркулирует в виде свободных гчмнов. не неГпраштзованных антителами.

При исследовании белка нуклеокапсида в сыворот-

> ах пациентов с ХГС аитиген бьит выявлен в 78%образ-13. при этом у большинства больных (>65%) обнаруже-I л циркуляция ПК [34]. Результаты выявтегшясоге-белка

РНК ВГС в сыворотках совпали у 85% пациентов. Пока-•ино. что средний уровень виремин. оцениваемый по

> ■ центрации соге-белка. не отличатся достоверно у па-I гнентов с различными формами и стадиями ХГС. однако ■ «"»наружены рахчичия всоотношешш попу.ляцнй внрус-ных частиц, циркулирующих в крови в виде вириопов или ПК Оказалось, что тяжелый фиброз и цирроз ассоцни-г- вались с двукратным увеличением доли ПК в периферической крови, тогда как усиление воспалггтельно-некро-: ическнх реакций в печени — с повышением доли сво-" иных вирионов в 3 раза (см. табл. 7). Циркуляцию в

крови различных популяций вирусных частиц ВГС можно оценивать неоднозначно. Относительно роли иммунных комплексов в мехашгзме патогенеза ГС имеются противоречивые суждения. С одной стороны. ИК ассоциируются с меньшей инфекционностью in vivo и in vitro по сравнешпо со свободными внрионами [49]. по-видимо-му. из-за ней грализашш антителами. С другой стороны, ИК снижают иммунный ответ, блокируя белки ВГС, и могут вызывать аутоиммунные заболевания [17; 47]. Вы-явленне свободных вирионов может свидетельствовать о произошедшей мутации ВГС и появлении более вирулентных вирусных частиц, «ускользающих» от нейтрализации иммунной системой.

Результаты настоящего исследования показали, что при решении ряда основополагающих проблем гепатита С одним из эффективных экспериментальных подходов является использование гнбридомной технологии получения МКА. С помощью МКА были выявлены новые данные о роли белков в механизме повреждения печени при гепатите С. Проанализированы наиболее значимые вирусные и иммунные факторы, влияющих на течение и исход гепатита С и играющие важную роль в патогенезе заболевания, вызываемого ВГС.

Выводы

1. Получено 25 гибридом, продуцирующих монокло-нальные антитела (МКА) к рекомбинантным белкам ВГС. экснресснрованным в бактериальных клетках. МКА опоз-I iaroT по крайней мере 21 эшггоп на белках core. NS3, NS4A. NS4B н NS5A. Большинство эпитопов, картированных с помощью МКА, обнаружены в составе как рекомбинан-тных, так и натуральных вирусных белков и описаны впервые.

2. При использовашш полученных МКА разработаны иммунобпотехиологическне основы для создания трех новых тест-систем, позволяющих: а) — выявлять белки ВГС в зараженных клетках in situ: б) — обнаруживать белки ВГС в лизатах тканей; в) — определять белок нуклеокапсида в сыворотках крови. Примене-ние этих методов в практическом здравоохранении может значительно улучшить качество диагностики гепатита С.

3. С помощью нммунохимических методов, разработанных на основе МКА. получены новые данные о роли белков ВГС в патогенезе гепатита С. Установлено. что накопление в печени белка NS5A прямо зависит. тогда как накопление белков NS3 и NS4B обратно зависит от тяжести гепатита С; показана положительная корреляция между накоплением белков ВГС в печени и лимфоцитах периферической крови с биохимической активностью гепатита С: накопление белков ВГС в печени оказывает ннгибируюшее влияние на Fas-опосредованный апоптоз лимфоцитов периферической крови.

4. Полученные МКА могут быть использованы в разных областях биотехнологии: для контроля качества и стан-дартизашш рекомбинантных белков при протводстве диагностических тест-систем, предназначенных для выявления антител к белкам ВГС в сыворотках: как аффинные сорбенты при очистке рекомбинантных белков; для разработки более чувствительных вариантов ИФА-диагности-кумов («capture»- ИФА и варианты, основанные па конку-

реншш); для анали и белков BII в лкариатичесиьч клетках при создании новых векторных eueren и ДНК-вакш1Н.

Работа выполнена г:рн частичной поддержке РФФИ, грант01-04-48890.

ЛИТЕРАТУРА

1. Л бдулмеджидова А. Г \4а<аъ*яОВ 1 танадзе С. Н. и др. Характеристика панели моноклональных антител к рекомбинантному бслк% NS3 вируса гепатита СII Вопр. Вирусологии. — 2002. — Т 47. 1 —С. 21-5.

2. Вольпин М.Е.. Парча i Н . Ро манова В.С Аминокислотные и пептидные производные фуллерена. II Изв. Акад. наук. Серия химическая — 1998. — № 5. — С. 1050-4.

3. Вольпшш О М.. Ж.\шк М Н . Куприянова МЛ. и др. Фулле-реновые производные гдикопептта. обладающие адъ-ювантной активностью. Патент 2124022 // Бюлл. Изобрел— 1998.—№36.

4. Ликина Е И, Самохвалов Е И.. Левченко О. Г и др. Выявление положительных (геномных) и отрицательных (репликативных) цепей РНК вируса гепатита С в сыворотке крови, лимфоцитах и ткани печени больных хроническим гепатитом С с помощью полнмеразной цепной реакции // Вопр Вирусологии — 2000. — Т. 45. N° 4. _ с. 37-42.

5. Лакина E.H.. Масалова О В.. А бдулмеджидова A.A.. Кущ A.A. Вирусная нагрузка и тяжесть заболевания гепатитом С — есть ли связь? // Вирусные гепатиты — достижения и перспективы. — 2001. — 3. — С.11-6.

6. Масалова О.В.. Атанадзе С.Н.. Калинтш Т.Н. идр. Имму-нохнмичсские свойства и специфичность моно-клональпых антител в отношении N- и С-концевых участков рекомбинантного белка нуклеокапсида вируса гепапгга С(HCcAg)// Вопр. Вирусологии. — 1996. — Т 41. № 4. — С. 150-3.

7. Масалова О В.. Логинов A.C.. Атанадзе С.Н. идр. Имму-нохимнческое выявление белков вируса гепатита С в печени с помошыо моноклональных антител II Росс. Гастроэнтер. Журн — 1997. — № 3. — С. 15-23.

8. Масалова О. В . Шепелев A.B.. Атанадзе С. Н. идр. Иммуностимулирующее действие водорастворимых производных фуллерена — перспективных алъювантов для вакцин нового поколения //Докл. Акал. Наук. — 1999.

— Т. 369, № 3. — С.411-3.

9. Масалова О.В., Самохвалов E.H.. Петракова И В идр. Выявление маркеров вируса гепапгга С— белка нуклеокапсида вируса гепатита С. РНК и внрусспецнфнчес-ких антител в плазмах доноров // Вопр. Вирусологии.

— 2000. — Т. 45, № 2. — С. 12-8.

10. Масалова О. В.. Лакина Е.И.. Абдулмеджидова А.Г и др. Исследование РНК ВГС и вирусспеинфических белков в лимфоцитах периферической крови пациентов с хроническим гепатитом СII Гепатит В. С и D — проблемы диагностики, лечения и профилактики. — Москва. 2001.

— С.222-3.

11. Масалова О. В.. А бдулмеджидова А. Г.. Атанадзе С. Н идр. Характеристика панели моноклональных антител и эпитоппое картирование белков вируса гепатита С // Докл. Акал. Наук. — 2002. — Т. 383. N* 4. — С. 545-550.

12. Мисалова OB. Абду.гмеджидова А.Г.. Шкурко ТВ. идр. Анализ белков вируса гепатита С в клетках печени больных хроническим гепатитом СП Вопр. Вирусологии. — 2003.

— Т. 48. №1 (в печати).

13. Масалова О. В.. А бдулмеджидова А. Г., Моргунов К.В идр. Изменение параметров гуморального и клеточного иммунного ответа у пациентов с хроническим гепатитом С различной тяжести // Вопр. Вирусологии. — 2003. — Т. 48 (принято в печать).

14. Antonaci S.. Schiraldi О. Costimulatory molecules and cytotoxic T cells in chronic hepatitis C: defence mechanisms

devoted to host integrity or harmful events favoring liver injury progression? A review II lmmunopharmacology and Immunotoxicology. 1998. — Vol. 20. — P. 455-472.

15. Bartenschlager R . Lohmann V Replication of hepatitis C virus IIJ. Gen. Virol. — 2000. — Vol. 81. — P 1631-1648.

16. Beld M. Penning M.. van Putien M et al. Quantitative antibody responses to structural (Core) and nonstructural (NS3. NS4, and NS5) hepatitis C virus proteins among seroconverting injecting drug users: impact of epitope variation and relationship to detection of HCV RNA in blood//Hepatology. — 1999. — Vol. 29, — P. 1288-1298.

17 Bayer N.. Marcellin P Pathogenesis, diagnosis and management of hepatitis C II J. Hepatol. — 2000. — Vol. 32—P. 98-112.

18. Cheit M.. Sallberg M. Sonnerhorg A. et al. Human and murine antibody recognition is focuscd on the ATP/helicase. but not the protease domain of hepatitis C vims nonstructural 3 protein. II Hepatology. — 1998. — Vol. 28. — P. 219-224.

19. CourouseA., Noel L. BarinF. etui. A comparative evaluation of the sensitivity of 5 anti-hepatitis C virus immunoblot assavs II Vox sanguinis. — 1998. — Vol. 74. № 4 — P 217-224.

20. Fern.\ R.B.. Tuke P . Sweenie C. H Characterisation of a panel of monoclonal antibodies raised against recombinant HCV core protein II J. Med. Virology. — 1996.— Vol. 50.— P. 221-9.

21. Gonzalez-Peralta R P.. Fang J IV.. Davis G. L et al. Optimization for the detection of hepatitis C virus antigens in the liver IIJ Hepatol. — 1994. — Vol. 20. — P. 143 — 147.

22. Gonzalez-Peralta R.P.. Fang J . Gary L el at. Significance of hepatic expression of hepatitis C viral antigens in chronic-hepatitis C. // Dig. Dis. Sci. — 1995. — Vol. 40. - P. 2595 — 2601.

23. Halm C, Clio Y. Kang B et al. The HCV Core protein acts as a positive regulator of Fas-mediated apoptosis in a human limphoblastoid T-cells line // Virology. — 2000. — Vol. 276. —P. 127-137.

24.Hiramatsu N.. Hayashi N.. Hurana Y. et al. Immunohistochemical detection of hepatitis C virus-infected hepatocytes in chronic liver disease with monoclonal antibodies to core, envelope and NS3 regions of the hepatitis C virus genome// Hepatology. — 1992. — Vol. 16. —P. 306-311

25. Jensen A. W„ Wilson S. R.. Schuster DI Biological application of fullerenes. Review article II Bioorganic & Medicinal Chemistry. — 1996. — Vol. 4. № 6. — P. 767-779.

26. Jolivet-Reynaud C.. Dalbon P . Viola F. et al. HCV core immunodominant region analysis using mouse monoclonal antibodies and human sera: characterization of major epitopes useful for antigen detection II J. Med. Virol. — 1998. — Vol. 56. >6 4.— P. 300-309.

27. Khudyakov Y.E.. Khudyakova N S.. Jue D L. et al. Linear B-cell epitopes of the NS3-NS4-NS5 proteins of the hepatitis C virus as modeled with synthetic peptides // Virology. — 1995. — Vol. 206. — P. 666-672.

28. Kohler G.. Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity // Nature. — 1975. — Vol. 256. — P. 495-7.

29. Lelie P N.. Damen M.. Cuvpers H et al. International collaborative studv on the second eurohep HCV-RNA reference panel//J". Virol. — 1996. — Vol. 81. № 1. P, 347-352.

30. Machida K. Tsukiyama-Kohara K.. Seike E etal. Inhibition of cytochrome — release in Fas-mediated signaling pathway in transgenic mice induced to express hepatitis C viral proteins Hi Biol. Chemistry. — 2001. — Vol. 276. — P. 12140-6.

31 Marusawa H. Hijikata M. Chiha T. Sliimotohno K. Hepatitis C virus core protein inhibits Fas-mediated and TNF-alpha-mediated apoptosis via NF-Kappa-B activation //J. Virol. — 1999, —Vol. 73. —P. 4713-4720.

32. Masalova O V., Atanadze S.N., Samohhvalov E.I. et al.

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

М>3/том2/2003

Detection of Hepatitis C virus core protein circulating within different virus particle population Hi. Med. Virology.—1998. — Vol. 55. .Ns 1. — P. 1-6. 33. Masalova O.V., Lakinu E.I.. Sarnokhvalov E.I. et al. Comparative analysis of hepatitis C virus RNA and proteins in the liver tissue of patients with chronic hepatitis Cll Abstracts of the XI International Congress of Virology, Sidney. Australia. 9-13 August 1999. — V PI 3.06. — P. 277.

34 Masalova O.V., Vishnevskaya T.V., Lakina E.I. et al. Quantitative detection of hepatitis C core protein circulating within virions and immune complexes in serum of HCV-mfectcd patients II Abstracts of the European Virology 2000, Glasgow,Scotland. 17-21 September2000 —J.Clin. Virol.. —2000 —Vol. 18, № 1-3, — P 81-2.

35 Masalova O.V., Lakina E.I.. Ahduhnedzhidova AG el al. Characterization of monoclonal antibodies and epitope mapping of the NS4 protein of hepatitis C virus II Immunol. Letters. — 2002. — Vol. 83, № 3. — P. 187-196. Murphy F A. Fauquel C M. Bishop D. H L. et al. Virus Taxonomy. Sixth Report of the International Committee on Taxonomv of Viruses // Vienna & New York: Springer-Verlag. 1995 —P 424-6.

\t \illeJ. A.. Prescoti L. E. Bhatiacherjee V. el al. Antigenic •• ariation of core. NS3. and NS5 proteins among genotypes of hepatitis C virus II 1. Clin. Microbiol. — 1997. — Vol. 35 P. 3062-3070.

■ V. amlt O.. Kern V., Muller H. et al. Analysis of hepatitis C • irus core protein interaction domains Hi. Gen. Virology.

- 1997, — Vol. 78,—P 1331-1340.

■ Onto E Mizokavi M . Tanaka T. el al. Quantification of < -am hepatitis C virus core protein level in patients chronically infected with different hepatitis C genotypes//Gut. — 1996.

-Vol.39.—P. 876-880.

- Ptreboeva L. A., Perehoev A. V., H ang L. F. Hepatitis C -r: lopes from phage-displayed cDNA libraries and -proved diagnosis with a chimeric antigen//J. Med. Virol.

2000. — Vol. 60 — P. 144-151.

- .'■'•;. i C. Suzzo M. Delmastro P. et al Selection of antigenic . i J immunogenic mimics of hepatitis C virus using sera from r^icnts//J Immunol — 1996. —Vol. 156. — P.4504-4513.

- gucs CM.. BriicsD., SerejoF el al. Apoptotie cell death Joes not parallel other indicators of liver damage in chronic hepatitis C patients Hi. Viral Hepatitis.— 2000. — Vol. 7.

P 175-183.

-' R izgien I. llarada T.. Maiscuera Y. Miyamitra T. Sensitization i .^-mediated apoptosis by hepatitis C virus core protein Virology. - 1997. — Vol. 229 — P. 68-76. W SoHberg M . Pumpen P.. Zhang Z.X. el al. Location of • n body-binding sites within conserved regions of the

hepatitis C virus core protein Hi. Med. Virol. — 1994. — Vol. 43, № 1. — P. 62-8.

45. Sansonno D., Cornacchiulo V.. IacohelliA.R. etal. Localization of hepatitis C virus antigens in liver and skin tissues of chronic hepatitis C virus-infected patients with mixed cryoglobulinemia // Hepatology. — 1995. — Vol. 21. — P. 305-312.

46. Sansonno D. Danmacco F Hepatitis C virusclOO antigen in liver tissue from patients with acute and chronic infection II Hepatology. — 1993. — Vol. 18. — P. 240-5.

47. Sansonno D.. IacohelliA.R.. Cornacchiulo V. etal. Detection of hepatitis C virus (HCV) proteins by immunofluorescence and HCV RNA genomic sequences by non-isotopic in situ hybridization in bone marrow and peripheral blood mononuclear cclls of chronically HCV-infectcd patients // Clin. Exp. Immunol. — 1996. — Vol. 103, № 3. — P. 414-421.

48. Shi S. T.. Polyak S.J.. Tu H et al. Hepatitis C virus NS5A colocalizes with the core protein on lipid droplets and interacts with apolipoprotcins // Virology. — 2002. — Vol. 292, —P. 198-210

49. Shimizu YK.. Hijikala M. Iwamoto A. et ai Neutralizing antibodies against hepatitis C virus and the emergence of neutralization escape mutant viruses//J. Virol. — 1994 — Vol. 68 —P. 1494-1500.

50 Shiratori >'., KatoN.. Yokosuka O. el al Quantitative assays for hepatitis C virus in serum as predictors of long-term response to interferon//J. Hepatol. — 1997. — Vol. 27. — p. 437-444.

51. TavaN., Torimolo Y.. ShindoM. etal. Fas-mediated apoptosis of periferal blood mononuclear cells in patients with hepatitis C // Br. J Haematol. — 2000. — Vol. 110. — P 89-97.

52. Tsuisumi M.. Urashima S.. Takada A. et al. Detection of antigens related to hepatitis C virus RNA encoding the NS5 region in the livers of patients with chronic type C hepatitis // Hepatology. — 1994. — Vol. 19. — P. 773-8.

53. Viliano P.. Vlanav D. Nelson K, et al. Persistence of viremiaand the importance of long-term follow-up after acute hepatitis C infection II Hepatology. — 1999. — Vol. 29. — P 908-914.

54. Yap S-H . Willems M.. Van den Oord J. el al. Detection of hepatitis C virus antigen by immunohistochcmical staining: a histological marker of hepatitis C virus infection // J. Hepatology. — 1994. — Vol 20. — P. 275-281.

55. Yasui K.. Wakita T.. Tsukivama-Kohara K. etal. The native form and maturation process of hepatitis C virus core protein. // J. Virol. — 1998. — Vol. 72. — P. 6048-6055.

56. Zhou Y, Takekoshi M.. Maeda Fetal. Recombinant antibody Fab against the hypervariable region 1 of hepatitis C virus blocks the virus adsorption to susceptible cells in vitro II Antiviral Res. — 2002. — Vol. 56. № 1. — P. 51.

tional RNA

— P.

bition laling titis С !76.—

;patitis alpha-Virol.

el al.