CC BY
263
ИММУНОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 616.155.3-078.33-076.5-074
Булычева Т.И., Дейнеко Н.Л., Григорьев А.А.
ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА СТИМУЛЯЦИИ ЛИМФОЦИТОВ ФИТОГЕМАГГЛЮТИНИНОМ РЕАКЦИИ БЛАСТТРАНСФОРМАЦИИ ЛИМФОЦИТОВ С МОНОКЛОНАЛЬНЫМИ АНТИТЕЛАМИ №-67
ФГБУ "Гематологический научный центр" Минздрава России, 125167, Москва
Предложен новый (иммуноцитохимический) способ оценки реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) человека при их стимуляции фитогемагглютинином (ФГА) вместо общепринятого радиометрического метода с использованием в качестве метки 3Н-тимидина. Реакцию оценивали с помощью люминесцентного микроскопа при непрямой иммунофлюо-ресценции с использованием в качестве маркера пролиферирующих клеток ядерного антигенаKi-67, выявляемого с помощью моноклональных антител (МКА) Ki-67. О функциональной способности лимфоцитов судили по количеству визуализированных (светящихся) Ki-67-паложительных клеток, появляющихся после 3-суточной ФГА-стимуляции их пролиферации. Проведено сравнение иммуноцитохимического (с маркером Ki-67) и радиометрического (с меткой 3Н-тимидином) методов ФГА-стимуляции лимфоцитов. Обосновано преимущество иммуноцитохимического метода оценки РБТЛ перед радиометрическим относительно возможности его более широкого внедрения в лабораторную практику.
Ключевые слова: бласттрансформация лимфоцитов; иммуноцитохимическое исследование; Ki-67; ФГА-стиму-ляция; 3Н-тимидин.
T.I. Bulytcheva, T.I. Deiyneko, A.A. Grigoriyev
THE IMMUNE CYTOCHEMICAL EVALUATION OF REACTION OF PHYTOHEMAGGLUTININ STIMULATION OF LYMPHOCYTES WITH MONOCLONAL ANTIBODIES KI-67
The hematological research center of Minzdrav of Russia, 125167 Moscow, Russia
The article proposes new (immune cytochemical) mode of evaluation of reaction of blast-cell transformation of human lymphocytes under their stimulation with phytohemagglutinin instead of standard radiometric method using 3H-thymidine as a marker. The reaction was assessed by means of luminescent microscope under indirect immunofluorescence using nuclear antigen Ki-67 as a marker ofproliferating cells. The Ki-67 was detected using monoclonal antibodies Ki-67. The functional capacity of lymphocytes was evaluated by amount of visualized (luminescent) Ki-67 positive cells appearing after three day stimulation of proliferation with phytohemagglutinin. The comparison was made between immune cytochemical (with Ki-67 marker) and radiometric (with marking by 3H-thymidine) methods of phytohemagglutinin stimulation of lymphocytes. The article presents substantiation of advantage of immune cytochemical method of evaluation of reaction of blast-cell transformation of human lymphocytes as compared with radiometric method concerning possibility of its broader implementation in laboratory practice.
Keywords: blasst-cell transformation of human lymphocytes; immune cytochemical study; Ki-67; phytohemagglutinin stimulation; 3H-thymidine.
Введение. Исследование функционального состояния лимфоцитов, определяемого по пролиферативному ответу на митогены или антигены, является одним из наиболее информативных методов оценки показателей клеточного иммунитета. Среди митогенов наибольшее распространение получил фитогемагглютинин (ФГА) после того как в 60-х годах прошлого столетия было обнаружено, что под его влиянием большая часть лимфоцитов через 72 ч в результате пролиферации трансформируется в бласты [1, 2]. В связи с этим реакцию назвали реакцией бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ). Первоначально оценку реакции проводили на световом микроскопе с подсчетом морфологически различимых бластов. Однако из-за субъективности оценки метода морфологическая окраска была вскоре заменена на использование в конце реакции (после 3-суточного культивирования лимфоцитов с ФГА) радиоактивной метки 3Н-тимидина, включающегося в бласттрансформированные лимфоциты, с под-
Для корреспонденции:
Григорьев Андрей Александрович, .
Адрес: 125167, Москва, Новозыковский пр-д, дом 4а
E-mail: [email protected]
счетом радиоактивности на автоматическом сцинтилляци-онном р-счетчике [3, 4 и др.]. До настоящего времени метка 3Н-тимидином в РБТЛ остается единственным объективным и общепризнанным методом при исследовании функционального состояния лимфоцитов в качестве показателя клеточного иммунитета как в отечественной, так и в мировой литературе [5—11 и др.].
Спектр применения этого метода достаточно широк и включает оценку иммунного статуса, изучение механизмов активации клеток при пролиферации, оценку действия им-муномодуляторов, сравнение с активацией аллоантигенами в смешанной культуре лимфоцитов при пересадке костного мозга и т.д.
Однако необходимость использования радиоактивного 3Н-тимидина в качестве метки для оценки функционального состояния лимфоцитов при ФГА-стимуляции в РБТЛ резко ограничивает внедрение этого метода в широкую лабораторную практику при определении иммунного статуса, так как это требует специальных условий. В то же время данный тест особенно востребован в последнее время в связи с резким увеличением количества работ по иммунотерапевтиче-ским воздействиям у больных при онкологических и онкоге-
матологических заболеваниях, а также при трансплантации органов, костного мозга, пуповинной крови и др.
Цель исследования — изучение возможности применения в РБТЛ для оценки функционального состояния лимфоцитов вместо радиометрического способа с меткой 3Н-тимидином объективного иммуноцитохимического метода с использованием в конце реакции в качестве общеизвестного индикатора пролиферативного состояния клеток ядерного антигена Ki-67, выявляемого в реакции непрямой иммунофлюоресцен-ции (РНИФ) с помощью соответствующих моноклональных антител (МКА) к Ki-67.
Материалы и методы. Оценку реакции ФГА-стимуляции лимфоцитов проводили параллельно в РНИФ с МКА к Ki-67 и с помощью радиометрического метода с включением 3Н-тимидина.
I. Выделение лимфоцитов из периферической крови обследуемых лиц с последующей стимуляцией их пролиферации с помощью ФГА проводили по описанной нами ранее методике [12].
II. Иммуноцитохимическое исследование интактных (контрольных) и ФГА-стимулированных лимфоцитов в РНИФ выполняли по стандартной методике [13] с использованием в качестве первичных антител МКА к Ki-67 ("Sigma", США) в разведении 1:20 и вторичных ФИТЦ-меченных козьих антител к иммуноглобулинам мыши ("Сорбент", Россия). В качестве контроля для исключения прямого иммуномечения (окрашивания) клеток вторичны-
ми антителами использовали вместо первичных антител фосфатно-солевой буфер (PBS). Полученные препараты изучали с помощью люминесцентного микроскопа (в наших исследованиях Axiophot, "Carl Zeiss", Германия), применяя объективы х100/1,3 и окуляры *10 с подсчетом клеток, имеющих светящиеся фокусы в области ядра, и предварительной оценкой клеток при фазово-контрастной микроскопии. Захват изображения производили с помощью цифровой камеры Delta Pix, что не является обязательным условием в оценке реакции.
III. Радиометрический метод оценки реакции этих же образцов клеток с включением 3Н-тимидина в 3-суточные ФГА-стимулированные лимфоциты применяли по описанной ранее методике [14].
Всего проведено 12 серий опытов.
Результаты и обсуждение. Данные по экспрессии Ki-67 в процессе пролиферации при ФГА-стимуляции лимфоцитов с оценкой РНИФ в ходе контроля с параллельно проводимой радиометрической оценкой реакции включения 3Н-тимидина в свежевыделенные лимфоциты, а также через 24, 48 и 72 ч после начала их инкубации с ФГА представлены в табл. 1.
Как видно из табл. 1, до стимуляции клеток ФГА антиген Ki-67 практически отсутствовал в ядрах интактных лимфоцитов здоровых лиц (окрашивая не более 1% клеток). После внесения ФГА антиген Ki-67 появлялся в постепенно нарастающем количестве клеток спустя 24 ч от начала ФГА-стимуляции, маркируя после 3-суточной инкубации в сред-
До стимуляции ФГА (свежевыделенные лимфоциты)
&ч9 1 -
о Г.с о «¿i
о<9°о С " «о®
Г
Jk П ° Q
гои О <Ъ ^ л о
О ъ о
5 Л о
ОсР
ос
Через 72 ч после стимуляции клеток ФГА
¥ у J vv j > ,
'Л «
Экспрессия антигена К1-67 в лимфоцитах крови здорового человека до и после стимуляции их пролиферации с помощью ФГА. а, в — реакция иммунофлюоресценции; б, г — фазовый контраст.
Таблица 1
Сравнительные данные по экспрессии в клетках антигена Ш-67 и включению 3Н -тимидина в процессе ФГА-стимуляции
лимфоцитов
Время инкубации с ФГА, ч Ki-67 Включение H тимидина
количество Ki-67+ клеток, % количество имп/мин, • 103 ИС (ФГА+/ФГА-)
0 0 (0—1) 0,498 —
24 5 (3—8) 1,7 2,4
48 45 (28—52) 25,2 38,7
72 74 (59—86) 28,7 55,2
Примечание. ИС — индекс стимуляции, равный количеству имп/мин с ФГА / имп/мин без ФГА.
нем до 74% клеток в виде светящихся в люминесцентном микроскопе фокусов в ядрах клеток (см. рисунок).
Применявшиеся параллельно в реакции ФГА-стимуляции те же образцы лимфоцитов с включением в качестве метки 3Н-тимидина практически показали отсутствие включения 3Н- тимидина в лимфоциты от начала до 24 ч инкубации с ФГА при резком повышении уровня радиоактивности в клетках, достигающего максимальных значений через 72 ч от начала стимуляции (в среднем до 28,7 103 имп/мин) при ИС в среднем 55,2, что соответствовало не только полученным нами ранее данным [14—17], но и результатам других авторов [10, 11, 18, 19].
Данные по включению 3Н-тимидина в лимфоциты в процессе ФГА-стимуляции подтверждали наличие адекватного ответа исследуемых лимфоцитов здоровых лиц на стимуляцию их ФГА, что позволило достоверно оценивать и результаты иммуноцитохимических исследований.
В то же время без внесения ФГА в контрольные культуры интактных лимфоцитов экспрессия ядерного антигена К1-67 в клетках и включение в них 3Н-тимидина на всех сроках исследования практически не изменялись и соответствовали показателям непролиферирующих клеток.
Это позволило нам считать оправданным возможность использования МКА К1-67 не только для характеристики пролиферативной активности клеток (особенно опухолевых), но и для иммуноцитохимической оценки реакции ФГА-стимуляции лимфоцитов (согласно прежнему обозначению — РБТЛ).
Таким образом, результаты сравнительного изучения радиометрического (с меткой 3Н-тимидином) и иммуноци-тохимического (с маркером К1-67) методов оценки реакции ФГА-стимуляции лимфоцитов показали, что метка пролифе-рирующих клеток 3Н-тимидином может быть заменена использованием в качестве маркера ядерного антигена К1-67, выявляемого соответствующими МКА в РНИФ, когда результаты реакции оценивают по количеству клеток, имеющих в ядрах фокусы свечения после 3-суточной ФГА-стимуляции.
Выводы. Предложенный нами метод иммуноцитохими-ческой оценки реакции ФГА-стимуляции лимфоцитов имеет ряд преимуществ перед морфологическим и радиометрическим методами оценки реакции с изотопом 3Н-тимидином, а именно:
• он объективен в отличие от морфологического метода, так как позволяет по наличию светящейся метки (Кл-67-антигена) в люминесцентном микроскопе точно рассчитать количество ответивших на стимуляцию ФГА пролифериру-ющих лимфоцитов;
• он безопасен, доступен и экономически более выгоден для лабораторий, проводящих иммунофенотипирование с использованием диагностического набора МКА, включающего К1-67 в качестве антигена пролиферирующих клеток, при иммунодиагностике различных гематологических и онкологических заболеваний [20—24]. Не требует дорогостоящего оборудования (сцинтилляционного Ь-счетчика радиоактивности, харвестера и др.) и реагентов, необходимых при радиометрическом способе учета реакции включения радио-
активного изотопа 3Н-тимидина, на работу с которым необходимо получать специальное разрешение;
• позволяет проводить раннюю диагностику онкогемато-логических заболеваний у больных по наличию в их крови до внесения ФГА увеличенного количества Ki-67-позитивных пролиферирующих клеток;
• дает возможность для расширения контингента лиц, обследуемых для определения иммунного статуса, благодаря автоматизации учета реакции по экспрессии Ki-67 при ФГА-стимуляции лимфоцитов и оценке реакции на проточном ци-тофлюориметре по стандартной методике иммунофенотипи-рования [25].
ЛИТЕРАТУРА
1. Nowell P. Phytohemagglutinin: an initiator of mitosis in cultures of normal human leukocytes. Cancer Res. 1960; 20: 462-6.
2. Вершигора А.Е. Основы иммунологии. Киев: Вища школа; 1975.
3. Report of the Commetee on Clinical Immynology of the IUIS. Eur. J. Immunol. 1976; 6: 231-4.
4. Фримель Г., ред. Иммунологические методы. М.: Медицина; 1987: 294—302.
5. Клаус Дж., ред. Лимфоциты. Методы. М.: Мир; 1990: 292-6.
6. Йогер Л., ред. Клиническая иммунология и аллергология. т. 1. М.: Медицина; 1987.
7. Новиков Д.К., Новикова В.И. Оценка иммунного статуса. М.: Медицина; 1995: 23.
8. Петров Р.В.Иммунология. М.: Медицина; 1987.
9. Beresford M.J., Wilson G.D., Makris A. Measuring proliferation in breast cancer: practicalities and applications. Breast Cancer Res. 2006; 8(6): 216.
10. Chien C.H., Lai J.N., Liao C.F., Wang O.Y., Lu L.M., Huang M.I. et al. Mifepristone acts as progesterone antagonist of non-genomic responses but inhibits phytohemagglutinin-induced proliferation in human T cells. Hum. Reprod 2009; 24(8): 1968-75.
11. Dabrowski M.P., Stankiewicz W., Plusa T., Chcialowski A., Szmi-gielski S. Competition of IL-1 and IL-1ra determines lymphocyte response to delayed stimulation with PHA. Mediators Inflamm. 2001; 10(3): 101-7.
12. Булычева Т.И., Дейнеко Н.Л., Вольпина О.М., Владимирова Н.М. Иммуноцитохимическая визуализация мономерных и олигомерных форм ядрышкового белка В23/нуклеофозмина в лимфоцитах человека в процессе пролиферации. Иммунология. 2011; 5: 231-6.
13. Малышева М.В., Дейнеко Н.Л., Булычева Т.И., Зацепина О.В., Капланская И.Б., Магоулас Х. Сравнительный анализ экспрессии ключевых белков ядрышка в лимфоцитах периферической крови здоровых доноров, активированных к пролиферации in vitro. Иммунология. 2010; 1 (31): 13-7.
14. Дергунова Н.Н., Шпакова А.П., Гемждан Э.Г., Булычева Т.И., Дейнеко Н.Л. Митогенное и токсическое действие фитогемаг-глютинина на лимфоциты периферической крови в культуре. Иммунология. 2003; 4: 205-8.
15. Булычева Т.И., Шпакова А.П., Дронова В.М., Саркисян Г.П., Любимова Л.С., Менделеева Л.П. Особенности иммунной системы у больных лейкозами после трансплантации аллогенного костного мозга. Иммунология. 2000; 5: 46—52.
16. Булычева Т.И., Артеменко Е.Г., Дергунова Н.Н., Дудник О.А.,Шпакова А.П., Малашенко О.С., Зацепина О.В. Анализ пролиферативной активности клеток с помощью новых моно-клональных антител к ядрышковому белку В23/нуклеофозмину. Цитология. 2000; 42 (10): 944-54.
17. Dergunova N.N., Bulycheva T.I., Artemenko E.G., Shpakova A.P., Pegova A.N., Gemijan E.G., Dudnik O.A., Zatsepina O.V., Malashenko O.S. A major nucleolar protein B23 as a marker of proliferation activity of human peripheral lymphocytes. Immunol. Lett. 2002; 83: 67—72.
18. Яздовский В.В., Дмитриева Н.Г., Алексеев Л.П. Динамика про-лиферативного ответа лимфоцитов на митогенные лектины и анти-CD3-антитела в культурах цельной крови и выделенных клеток у здоровых людей. Иммунология. 1994; 5: 21-4.
19. Deniz G., Erten G., Kucuksezer U.C., Kocacik D., Karagiannidis C., Aktas E. et al. Regulatory NK cells suppress antigen-specific T cell responses. J. Immunol. 2008; 180(2): 850-7.
20. Самойлова Р.С., Булычева Т.И. Иммунофенотипирование в диагностике хронических лимфоидных заболеваний. Клиническая лабораторная диагностика. 2003; 11: 35-9.
21. Endl E., Gerdes J. The Ki-67 protein: fascinating forms and an unknown function. Exp. Cell Res. 2000; 257(2): 231-7.
22. Gerdes J., Schwab U., Lemke H., Stein H. Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation. Int. J. Cancer. 1983; 31(1): 13—20.
23. Stuart-Harris R., Caldas C., Pinder S.E., Pharoah P. Proliferation markers and survival in early breast cancer: a systematic review and meta-analysis of 85 studies in 32,825 patients. Breast. 2008;17(4): 323-34.
24. Urruticoechea A., Smith I. E., Dowsett M. Proliferation marker Ki-67 in early breast cancer. J. Clin. Oncol. 2005; 23(28): 7212-20.
25. Воробьев И.А., Худолева О.А., Рощупкина Т.Д., Грецов Е.М. Иммунофенотипирование опухолей системы крови и лимфатических опухолей. Гематология и трансфузиология. 2005; 3: 8—14.
REFERENCES
1. Nowell P. Phytohemagglutinin: an initiator of mitosis in cultures of normal human leukocytes. Cancer Res. 1960; 20: 462-6.
2. Vershigora A.E. The annals of immunology. Kiev: Visha shkola; 1975. (in Russian)
3. Report of the Commetee on Clinical Immynology of the IUIS. Eur. J. Immunol. 1976; 6: 231-4.
4. Frimel G., ed. Immunological methods. Moscow: Meditsina; 1987: 294—302. (in Russian)
5. Klaus G., ed. Lymphocytes. Methods. Moscow: Mir; 1990: 292-6. (in Russian)
6. Joger L., ed. Clinical immunology and allergology. vol. 1. Moscow: Meditsina; 1987. (in Russian)
7. Novikov D.K., Novikova V.I. Estimation of the immune status. Moscow: Meditsina; 1995: 23. (in Russian)
8. Petrov R.V. Immunology. Moscow: Meditsina; 1987. (in Russian)
9. Beresford M.J., Wilson G.D., Makris A. Measuring proliferation in breast cancer: practicalities and applications. Breast Cancer Res. 2006; 8(6): 216.
10. Chien C.H., Lai J.N., Liao C.F., Wang O.Y., Lu L.M., Huang M.I. et al Mifepristone acts as progesterone antagonist of non-genomic
responses but inhibits phytohemagglutinin-induced proliferation in human T cells. Hum Reprod. 2009; 24(8): 1968-75.
11. Dabrowski M.P., Stankiewicz W., Plusa T., Chcialowski A., Szmi-gielski S. Competition of IL-1 and IL-1ra determines lymphocyte response to delayed stimulation with PHA. Mediators Inflamm. 2001; 10(3): 101-7.
12. Bulycheva T.I., Deineko N.L., Volpina O.M., Vladimirova N.M. Immunocytochemical visualization of monomeric and oligomeric forms of the nucleolar protein B23/ nucleophosmin in the human lymphocytes in the process of proliferation. Immunologiya. 2011; 5: 231-6. (in Russian)
13. Malisheva M.V., Deineko N.L., Bulycheva T.I., Zatsepina O.V., Kaplanskaya I.B., Magoulas H. Comparative analysis of expression of key nucleolar proteins in lymphocytes of peripheral blood of healthy donors, activated to proliferate in vitro. Immunologiya. 2010: 1 (31): 13-7. (in Russian)
14. Dergunova N.N., Shpakova A.P., Gemshdan E.G., Bulycheva T.I., Deineko N.L. Mitogenic and toxic effect of PHA on lymphocytes in the peripheral blood in cultures. Immunologiya. 2003; 4: 205-8. (in Russian)
15. Bulycheva T.I., Shpakova A.P., Dronova V.M., Sarkisyan G.P., Lyo-ubimova L.S., Mendeleeva L.P. Distinctive features of the immune system in patients with leukemia after transplantation of allogeneic blood marrow. Immunologiya. 2000; 5: 46—52. (in Russian)
16. Bulycheva T.I., Artemenko E.G., Dergunova N.N., Dudnik O.A., Shpakova A.P., Malashenko O.S., Zatsepina O.V. Analysis of prolif-erative activity of cell using new monoclonal antibodies against the nucleolar protein B23/nucleophosmin. Tsitologiya. 2000; 42 (10): 944-54. (in Russian)
17. Dergunova N.N., Bulycheva T.I., Artemenko E.G., Shpakova A.P., Pegova A.N., Gemijan E.G., Dudnik O.A., Zatsepina O.V., Malashenko O.S. A major nucleolar protein B23 as a marker of proliferation activity of human peripheral lymphocytes. Immunol. Lett. 2002; 83: 67—72.
18. Yasdovski V.V., Dmitrieva N.G., Alekseev L.P. Dynamics of prolif-erative response of the lymphocytes to mitogenic leckins and anti CD3 antibodies in the cultures of the whole blood and extracted cells in healthy people. Immunologiya. 1994; 5: 21-4. (in Russian)
19. Deniz G., Erten G., Kücüksezer U.C., Kocacik D., Karagiannidis C., Aktas E. et al. Regulatory NK cells suppress antigen-specific T cell responses. J. Immunol. 2008; 180(2): 850-7.
20. Samoilova R.S., Bulycheva T.I. Immunophenotyping in the diagnosis of lymphoid diseases. Klinicheskaya laboratornaya diagnostica. 2003; 11: 35-9. (in Russian)
21. Endl E., Gerdes J. The Ki-67 protein: fascinating forms and an unknown function. Exp. Cell Res. 2000; 257(2): 231-7.
22. Gerdes J., Schwab U., Lemke H., Stein H. Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation. Int. J. Cancer. 1983; 31(1): 13—20.
23. Stuart-Harris R., Caldas C., Pinder S.E., Pharoah P. Proliferation markers and survival in early breast cancer: a systematic review and meta-analysis of 85 studies in 32,825 patients. Breast. 2008; 17(4): 323-34.
24. Urruticoechea A., Smith I.E., Dowsett M. Proliferation marker Ki-67 in early breast cancer. J. Clin. Oncol. 2005; 23(28): 7212-20.
25. Vorobyev I.A., Hudoleva O.A., Roshupkina T.D., Gretsov E.M. Immunophenotyping of tumors of the blood and lymphatic tumors. Gematologiya i transfusiologiya. 2005; 3: 8—14. (in Russian)
Поступила 30.10.13 Received 30.10.13
