CC BY
56
Гематол. и трансфузиол., 2013, т. 58, № 3
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 615.471.03:616.15
СРАВНЕНИЕ ОЦЕНКИ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ
ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА С ПОМОЩЬЮ СТАНДАРТНОГО ЖИДКОСТНОГО р-СЦИНТИЛЛЯЦИОННОГО СЧЕТЧИКА И СЦИНТИЛЛЯЦИОННОГО СЧЕТЧИКА НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ М1СРОББТА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТВЕРДОГО
СЦИНТИЛЛЯТОРА
А.П. Шпакова, Б.Б. Хасигова, Т.И. Булычева, Л.П. Менделеева, Л.Л. Головкина
ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России, Москва
Резюме. На в-сцинтилляционных счетчиках МкгоБеТа Plus и 1409 DSA ("Wallac", Финляндия) параллельно проведена оценка включения радиоактивного 3Н-тимидина в лимфоциты краткосрочных клеточных культур. У 16 человек в реакции стимуляции фитогемагглютинином (ФГА) и у 8 пар донор— реципиент в реакции смешанной культуры лимфоцитов (Mixed Lymphocyte Culture — MLC) на обоих счетчиках получены сопоставимые величины пролиферативной активности лимфоцитов. На счетчике MicroBeta Plus определена тенденция к снижению пролиферативных ответов на стимуляцию как ФГА, так и аллогенными клетками в MLC (р > 0,05); в нестимулированных культурах выявлено увеличение уровня пролиферации лимфоцитов (р = 0,05). Преимуществами работы на настольном счетчике MicroBeta являются мультидетекторная система, удобство использования 96-трубочного клеточного харвестера и твердого сцинтиллятора, быстрота обработки данных, что позволяет рекомендовать его для определения пролиферативной активности лимфоцитов человека в культуре in vitro.
Ключевые слова: в-сцинтилляционный счетчик MicroBeta Plus, 96-трубочный клеточный харве-стер, в-сцинтилляционный счетчик 1409 DSA, пролиферативная активность лимфоцитов человека, реакция ФГА-стимуляции, реакция смешанной культуры лимфоцитов, Mixed Lymphocyte Culture (MLC)
EVALUATION OF HUMAN LYMPHOCYTE PROLIFERATIVE ACTIVITY BY STANDARD LIQUID p-SCINTILLATION COUNTER AND BY MICROBETA NEW GENERATION COUNTER WITH USING SOLID SCINTILLATOR
A.P. Shpakova, B.B. Khasigova, T.I. Bulycheva, L.P. Mendeleyeva, L.L. Golovkina Hematology Research Center, Moscow, Russia
Summary. Incorporation of 3H-thymidine in the lymphocytes of short-term cultures was evaluated by MicroBeta Plus and 1409 DSA в-scintillation counters ("Wallac", Finland). Comparable values of lymphocyte proliferative activity were obtained by both counters in specimens from 16 individuals in response to phytohemagglutinin (PHA) stimulation and in 8 donor-recipient pairs in mixed lymphocyte culture (MLC). MicroBeta Plus counter detected a trend to reduction of proliferative responses to stimulation by PHA and by allogeneic cells in MLC (p < 0.05); an increase of lymphocyte proliferation was detected in cultures without stimulation (p = 0.05). The advantages of the desktop MicroBeta Plus counter are multidetector system, convenient 96-pipe cell harvester and solid scintillator and rapid data processing. This recommends the counter for evaluation of proliferative activity of cultured lymphocytes.
Key words: MicroBeta Plus в-scintillation counter, 96-pipe cell harvester, 1409 DSA в-scintillation counter, human lymphocyte proliferative activity, PHA stimulation test, mixed lymphocyte culture (MLC)
ально предназначенные для работы с 96-луночными микротитровальными платами с возможностью использования твердого сцинтиллятора.
Однако при использовании счетчиков принципиально новой модели возникают определенные трудности. Для работы на Р-счетчике модели MicroBeta требуются значительные дополнительные затраты на приобретение необходимых комплектующих приборов и нового типа расходных материалов, а главное, нужно удостовериться в том, что при использовании MicroBeta существенно не уменьшится эффективность счета радиоактивности, что всегда можно ожидать при переходе с макромодели на микромодель прибора.
Целью исследования явилась сравнительная оценка использования Р-сцинтилляционного счетчика нового поколения модели MicroBeta Plus и стандартного жидкостного Р-сцинтилляционного счет-
Стандартные жидкостные Р-сцинтилляционные счетчики (Liquid Scintillation Coulter—LSC): 1409 DSA ("Wallac", Финляндия), LS 5000 TD ("Beckman", США) и др. в настоящее время широко используют в повседневной практической и научной работе для определения пролиферативной активности лимфоцитов человека. Недавно были разработаны и появились в продаже более удобные в использовании Р-сцинтилляционные счетчики нового поколения MicroBeta: сначала MicroBeta Plus, а затем MicroBeta TriLux и MicroBeta Jet ("Wallac", Финляндия)/("Perkin Emler", США), специ-
Для корреспонденции:
Шпакова Анна Петровна, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории иммунологической гематологии ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России.
Адрес: 125167, Москва, Новый Зыковский проезд, д. 4 а.
Телефон: +7(915) 013-30-54.
E-mail: annaschp@gmail.com
24
Гематол. и трансфузиол., 2013, т. 58, № 3
Рис. 1. Стандартный жидкостный Р-сцинтилляционный счетчик 1409 DSA ("Wallac", Финляндия) (а) в комплекте с 12-трубочным клеточным харвестером ("Flou Laboratories", Великобритания) (б).
Рис. 2. Счетчик Р-сцинтилляционный нового поколения MicroВetа Plus (а) в комплекте с 96-тру-бочным клеточным харвестером Harvester 96, модель Mach III ("Wallac", Финляндия) (б).
чика при определении пролиферативной активности лимфоцитов периферической крови человека.
Материалы и методы
Оценку пролиферативной активности лимфоци-
тов человека проводили на стандартном жидкостном Р-сцинтилляционном счетчике и на сцинтилляционном счетчике нового поколения с твердым сцинтиллятором.
Сущность метода заключалась в радиометрической оценке на р-сцинтилляционном счетчике уровня пролиферативной активности стимулированных в краткосрочной культуре лимфоцитов по включению меченного тритием радиоактивного 3Н-тимидина в ДНК их ядер. Использовали клетки 3-суточной
Рис. 3. Прибор Micro Sealer ("Perkin Elmer", США).
культуры в реакции стимуляции фитогемагглютинином (ФГА) и 6-суточной культуры в реакции смешанной культуры лимфоцитов (Mixed Lymphocyte Culture — MLC), в которой стимулятором служили у-облученные на источнике 137Cs аллогенные клетки — лимфоциты HLA-неидентичных неродственных доноров [1]. Указанные реакции служат как для оценки иммунитета больных, так и для определения совместимости потенциального донора с реципиентом по HLA класса II наряду с генотипированием в полимеразной цепной реакции (ПЦР) перед трансплантацией костного мозга (ТКМ) больным гемобла-стозами в Гематологическом научном центре (ГНЦ, Москва).
До недавнего времени оценку пролиферативной активности лимфоцитов в указанных выше реакциях проводили на стандартном жидкостном Р-сцинтилляционном счетчике 1409 DSA ("Wallac", Финляндия) в комплексе с 12-трубочным клеточным харвестером ("Flou Laboratories", Великобритания) (рис. 1, а, б) с использованием многочисленных сцинтилляционных флакончиков из кварцевого стекла, заполняемых жидким сцинтиллятором, и последующей раскладкой вручную в них фильтров с пробами клеточных культур [1].
Для работы на счетчике нового поколения MicroBeta (MicroBetа Plus) используют стекловолокнистые фильтры (Glass-fibre Printed Filtermat A 90 x 120) и пластины твердого сцинтиллятора (MeltiLex) в комплексе с 96-трубочным автоматическим программированным клеточным харвестером — Harvester 96 (модель Mach III, "Wallac", Финляндия) (рис. 2, а, б) и прибором Micro Sealer ("Perkin Elmer", США) (рис. 3), на котором при температуре 90оС происходит расплавление пластины твердого сцинтиллятора и впаивание в него фильтра с пробами клеточных культур [1].
Для сравнения эффективности счета при использовании MicroВetа Plus и 1409 DSA определяли уровень радиоактивности включенного в клетки 3Н-тимидина в одних и тех же клеточных культурах параллельно на счетчике MicroBetа Plus и на стандартном счетчике 1409 DSA. Величины спонтанной пролиферации лимфоцитов и пролиферативных ответов лимфоцитов на стимуляцию определяли на обоих счетчиках в 6 постановках реакции ФГА-стимуляции у 17 обследованных (рис. 4): у 6 больных гемобластозами, из которых 5 (больная И. — постановка 1; больные К. и Ш. — постановка 2; больной Т. — постановка 3; больной С. — постановка 4) находились в состоянии ремиссии, 1 больная (больная Ц. — постановка 5) в рецидиве заболевания, а также у остальных 11 здоровых людей.
Совместимость в реакции MLC определяли на обоих счетчиках у 8 пар донор—реципиент + неродственный донор (в качестве контроля) (пары: С., О., З., П., М., Ч., Д. и А.). Реципиенты — больные гемобластозами, находящиеся в состоянии ремиссии. У этих 24 человек были определены как величины пролиферации в нестимулированных культурах лимфоцитов (в интактных культурах лимфоцитов, в аутологичных смешанных культурах лимфоцитов и в смешанных культурах лимфоцитов с лимфоцитами HLA-идентичного
26
Гематол. и трансфузиол., 2013, т. 58, № 3
донора-сибса), так и величины пролиферативных ответов в стимулированных культурах лимфоцитов: аллогенными клетками HLA-неидентичного неродственного донора и пулом лимфоцитов неродственных доноров.
Статистическая обработка данных выполнялась по методу Фишера—Стъюдента. Данные выражены в виде М ± m.
Результаты и обуждение
При стимуляции ФГА (см. рис. 4) величины пролиферативных ответов при определении на двух счетчиках оказались практически одинаковыми у 10 (59%) из 17 человек (постановки 1, 2, 4, 5); у остальных 7 (41%) человек (постановки 3 и 6) пролиферативные ответы на счетчике MicroВetа Plus были ниже, чем на счетчике 1409 DSA. При этом у больной Ц. в рецидиве заболевания пролиферативный ответ на ФГА был крайне низким по данным обоих счетчиков. Наиболее низкие значения пролиферативных ответов лимфоцитов на ФГА на счетчике MicroВetа Plus по сравнению со счетчиком 1409 DSA наблюдались именно в тех постановках, где имелся минимальный (постановка 3) или максимальный (постановка 6) пролиферативный ответ. Для оценки пролиферативной активности лимфоцитов использовали индекс ФГА-стимуляции — ИСФГА : Х + ФГА, где Х — лимфоциты обследуемых в реакции ФГА-стимуляции.
Сравнение на обоих счетчиках уровней пролиферативных ответов совместимой в реакции MLC пары донор—реципиент и пары, несовместимой в реакции MLC (рис. 5, а, б), также показало сопоставимые результаты. Однако по данным счетчика MicroВetа Plus в нестимулированных аллогенными клетками культурах наблюдался более высокий уровень спонтанной пролиферации, чем на счетчике 1409 DSA; величины пролиферативных ответов на стимуляцию аллогенными клетками в некоторых смешанных культурах были одинаковыми на обоих счетчиках, в некоторых — они были выше на счетчике MicroВetа Plus, в других — выше на счетчике 1409 DSA.
В реакции ФГА-стимуляции у 16 человек (здоровых и больных гемобластозами в состоянии ремиссии) средняя величина спонтанной пролиферации лимфоцитов (0,62 ±
0,08 тыс. имп/мин; n = 16) и средняя величина пролиферативных ответов лимфоцитов на ФГА (44,4 ± 6,0; n =16), полученные по данным счетчика MicroВetа Plus, были ниже, чем аналогичные средние величины по данным счетчика 1409 DSA (0,78 ± 0,11 и 54,4 ± 9,0 соответственно), но эти различия не были статистически значимыми (р > 0,05). При этом средние величины ИСФГА, рассчитанные по данным счетчиков MicroВetа Plus (71,8 ±
9,7; n = 16) и 1409 DSA (74,8 ±
9,1; р > 0,05), практически не различались. В реакции MLC,
■1000 имп/мин 160-1
140-
120-
100-
80-
60-
40-
20-
0
в 6 постановках для 6 пар донор — реципиент + неродственный донор (пары С., О., З., П., М. и Ч.) в стимулированных культурах лимфоцитов (42 варианта смешанных культур) средняя величина пролиферативных ответов на стимуляцию аллогенными клетками по данным счетчика MicroВetа Plus (30 ± 2,92) также была ниже средней величины, полученной по данным счетчика 1409 DSA (35,4 ± 3,87). Эти различия также не были статистически значимыми (р > 0,05). Однако средняя величина пролиферации в нестимулированных культурах лимфоцитов (48 вариантов смешанных культур), полученная на основании данных счетчика MicroВetа Plus (1,85 ± 0,16), оказалась выше таковой по данным счетчика 1409 DSA (1,32 ± 0,13), и различия эти были статистически значимыми (р = 0,05).
При этом значения фоновых уровней радиоактивности (счет в 6 пустых дублирующих лунках платы) в 5 постановках реакции MLC, полученные на счетчике MicroBetа Plus (1,46 ± 0,51; 0,51 ± 0,02; 0,26 ± 0,18; 0,32 ± 0,06; 0,32 ± 0,05 тыс. имп/мин; везде n = 6), практически не отличались от значений фоновых уровней радиоактивности, полученных параллельно, в 6 сцинтилляционных флакончиках со сцинтиллятором без фильтров на счетчике DSA 1409 (0,68 ± 0,15; 0,37 ± 0,029; 0,43 ± 0,05; 0,29 ± 0,03; 0,35 ± 0,04 тыс. имп/мин соответственно; р > 0,05).
Одновременно с этим мы провели анализ величин пролиферации между аналогичными вариантами смешанных культур попарно, просчитанных параллельно на обоих счетчиках, по средним из 6 дублирующих лунок (M ± m; n = 6) у 3 пар донор—реципиент (пары: А., З., Ч.) в реакции MLC. Сравнительный анализ показал, что из 20 пар аналогичных вариантов стимулированных смешанных культур, статистически значимо не различающихся между собой, на обоих счетчиках пар вариантов было 6 (р > 0,05), статистически значимое снижение счета (р < 0,05)
С. И.
к. м. ш. х.
н. т. в.
с. л.
L
Ж
X. Ц. Р.
М. М. 3.
Спонтанная (MicroBeta Plus) ФГА (MicroBeta Plus)
М Спонтанная (1409 DSA) Ш ФГА (1409 DSA)
Рис. 4. Сравнительные данные пролиферативной активности лимфоцитов в реакции ФГА-стимуляции, полученные параллельно на счетчиках М1сгоВе1:а Plus и 1409 DSA.
По оси абсцисс: заглавные буквы с точкой — начальные буквы фамилий обследованных. Слева направо через интервалы расположены 1, 2, 3, 4, 5 и 6-я постановки реакций ФГА-стимуляции.
27
Гематол. и трансфузиол., 2013, т. 58, № 3
■1000 имп/мин
90 и 80706050403020100
Л
[
. I
& ^ ^ ^ &&
?<£<£<£<£ о* О О О О О* >5 ч> ч> О*
Варианты смешанных культур
I I Microbeta Plus I 11409 DSA
Рис. 5. Сравнительные данные пролиферативной активности лимфоцитов в реакции MLC, полученные параллельно на счетчиках MicroBeta Plus и 1409 DSA. а — MLC-совместимость (пара D—R № 4, см. табл. 2); б — MLC-несовместимость (пара D—R № 5, см. табл. 2).
КС — культуральная среда, R — лимфоциты реципиента, D — лимфоциты донора костного мозга, U — лимфоциты неродственного донора; RX, DX, UX, Рх — у-облученные лимфоциты реципиента, донора костного мозга, неродственного донора и пул облученных лимфоцитов от неродственных доноров.
на MicroBeta Plus наблюдалось у 7 пар вариантов и статистически значимое увеличение счета (р < 0,05) также у 7 пар вариантов. Из 21 пары аналогичных вариантов нестимулированных культур, статистически значимо не различающихся между собой, на обоих счетчиках пар вариантов было 9 (р > 0,05), статистически значимое снижение счета (р < 0,05) на MicroBeta Plus имелось только у 2 пар вариантов, но статистически значимое увеличение счета (р < 0,05) на MicroBeta Plus было у целых 10 пар вариантов смешанных культур!
Выявленное увеличение величин пролиферации в нестимулированных культурах без увеличения значений фонового уровня радиоактивности является существенным преимуществом счетчика MicroBeta Plus, так как позволяет отличить даже очень низкий уровень пролиферации лимфоцитов в нестимулированных культурах, часто встречающийся у больных гемобластозами, от фонового уровня радиоактивности, что было трудно делать на счетчике DSA 1409.
Таблица 1
Пролиферативная активность лимфоцитов в вариантах смешанных культур в реакции MLC пары донор—реципиент (А.) (см. также рис. 5) на счетчиках MicroВeta Plus и DSA1409
Bарианты смешанных культур Пролиферативная активность, имп/мин (М ± m; n = 6 лунок платы)
MicroBeta Plus 1409 DSA
Нестимулиро- R+КС 4954± 571 2609 ± 425
ванные R+Rx 5228 ± 682 1194 ± 171
D+DX 5964± 812 1729± 215
U+КС 5350± 818 1570± 105
U+UX 4673 ± 525 3566± 605
Стимулированные R+Dx 50 439 ± 3343 30 279 ± 4020
R+Ux 38 084 ± 788 39 149 ± 2947
R+Px 52 673 ± 2372 34 119 ± 4461
D+Rx 32 295 ± 2141 74 672 ± 7749
D+Ux 30 335 ± 1485 42 191 ± 3738
U+Rx 57 918 ± 3154 78 596 ± 5135
U+Dx 74 416 ± 3237 48 559 ± 5296
U+Px 67 244 ± 3424 43 926 ± 6184
Примечание. КС — культуральная среда, R — лимфоциты реципиента, D — лимфоциты донора костного мозга, U — лимфоциты неродственного донора; RX, DX, UX, РХ — у-облученные лимфоциты реципиента, донора костного мозга, неродственного донора и пул облученных лимфоцитов от неродственных доноров.
В табл. 1 представлена сравнительная характеристика разброса исходных данных в различных вариантах смешанных культур в реакции MLC на счетчиках MicroBeta Plus и DSA 1409 в 6 дублирующих лунках платы для одной пары донор—реципиент (А.).
Критерием совместимости в реакции MLC служит показатель "относительный ответ" (Relative Response — RR) для каждого направления: реципиент против донора — "R vs D" и донор против реципиента — "D vs R" [2]. RR представляет собой частное от деления двух разностей: разности между пролиферативным ответом "отвечающих" лимфоцитов одного из сибсов, например реципиента, в ответ на стимуляцию у-облученными лимфоцитами другого сибса, например донора (R + DJ и ответом "отвечающих" лимфоцитов реципиента в ответ на стимуляцию у-облученными аутологичными лимфоцитами (R + R^, деленной на разность между ответом лимфоцитов реципиента в ответ на стимуляцию у-облученными лимфоцитами неродственного донора (R + их) и ответом лимфоцитов реципиента в ответ на стимуляцию аутологичными у-облученными лимфоцитами (R + RJ, умноженное на 100%:
RR
(R + Dx)
(R + Ux)
(R + R )
------^ x 100%
(R + Rx)
RR
(D + Rx) (D + Ux)
(D + Dx) (D + Dx)
x 100%.
где: R — лимфоциты реципиента; D — лимфоциты донора костного мозга; U — лимфоциты неродственного донора: RX, DX, UX — у-облученные лимфоциты реципиента, донора костного мозга и неродственного донора.
Индекс стимуляции (ИС^с) в направлении R vs D равен частному от деления величины пролифератив-
28
Гематол. и трансфузиол., 2013, т. 58, № 3
ного ответа лимфоцитов реципиента на стимуляцию у-облученными лимфоцитами донора (R + Dx) на величину пролиферативного ответа лимфоцитов реципиента на стимуляцию у-облученными аутологичными лимфоцитами (R + Rx): таким образом, ИСЯтеД
и ^dvSr равны:
R + D D + R
_____х . _____x
R + R’ D + D
x
Построение графиков (см. рис. 5) пролиферативных ответов в реакции MLC и расчет показателей RR, ИСмьс и ИСФГА выполняли на персональном компьютере по формулам с использованием программы (рис. 6), специально разработанной для этой цели (разработчики — вед. науч. сотр. А.П. Шпакова и программист Л.И. Эрлих).
Нам необходимо было также убедиться, что величины показателей RR и ИСмьс, служащие для установления HLA-идентичности донора—сибса и реципиента, рассчитанные на основании исходных данных, полученных на обоих счетчиках, не будут существенно отличаться между собой.
В табл. 2 представлены значения показателей RR и ИСмьс, рассчитанные для определения в реакции MLC совместимости 6 больных гемобластозами с их донорами—сибсами — пары: С.(№1), О.(№2), З.(№3), П.(№4), А.(№5) и Д.(№6), по данным, полученным параллельно на обоих счетчиках. Как видно, для совместимых по HLA класса II пар донор—реципиент (D—R) (№1, 2, 3, 4, 6) медиана RR, рассчитанная по данным счетчика MicroВetа Plus, составляет 1,6% (амплитуда — А 0,5—9,5%), по данным счетчика 1409 DSA — 0,9% (А 0,5—7,3%) при максимально допустимой величине RR для совместимых пар, равной 15,0% (знаки — и + не учитываются). Медиана ИСмьс этих пар, рассчитанная по данным счетчика MicroВetа Plus, составляет 0,7 (А 0,6—1,8), по данным счетчика 1409 DSA — 1,1 (А 0,4—1,8) при максимально допустимом значении ИСмьс для совместимых пар донор—реципиент, равном 2,0. Для несовместимой по HLA класса II пары D—R № 5 величины RR и ИСмьс, рассчитанные по данным обоих счетчиков, также оказались сходными. Таким образом, величины RR и ИСмьс, определенные параллельно на обоих счетчиках, практически не отличались между собой.
Рис. 6. Панель управления компьютерной программой, разработанной для расчета по формулам показателей RR, ИС^с и ИСФГА и для построения графиков по данным, полученным в реакциях мьс и ФГА-стимуляции.
При работе на счетчике MicroВetа Plus выявили тенденцию к снижению уровня пролиферативных ответов как на ФГА-стимуляцию, так и на стимуляцию аллогенными клетками в реакции MLC по сравнению с данными, полученными на стандартном счетчике 1409 DSA. В то же время в нестимулированных культурах уровень пролиферации на счетчике мюгоВеШ Plus оказался существенно выше, чем на счетчике 1409 DSA, при этом различия были статистически значимыми (р = 0,05).
Таким образом, данные, полученные на счетчике мюгоВеШ Plus и на стандартном жидкостном Р-счетчике, сопоставимы.
В настоящее время для лечения больных множественной миеломой используется комплексная терапия, включающая наряду с химиотерапией [3] трансплантацию аутологичного костного мозга [4]. Для лечения этих больных используется бортезомиб (велкейд) [5, 6]. Исследование по оценке воздействия 8 курсов лечения препаратом велкейд на пролиферативную активность лимфоцитов периферической крови больной (И.) множественной миеломой в реакциях ФГА-стимуляции и MLC при параллельном исследовании на всех указанных сроках пролиферативной активности лимфоцитов крови здорового человека (рис. 7) показало, что после 4- и 5-го курсов лечения наступало выраженное снижение способ-
Таблица 2
Показатели совместимости RR и ИСмьс в реакции MLC у 6 пар донор—реципиент (D—R), полученные по данным счетчиков
MicroBeta Plus и 1409 DSA
Направление стимуляции Значения RR (в %) и ИС,„ _ v ' мьс
Показатель совме- пара D—R №1 пара D—R №2 пара D—R №3 пара D—R №4 пара D—R №5 пара D—R №6
стимости мкгоВе1а 1409 DSA мюгоВе!а 1409 DSA мюгоВе!а 1409 DSA мюгоВе!а 1409 DSA мюгоВе!а 1409 DSA мюгоВе!а 1409 DSA
RR, R vs D -4,1 -3,6 -1,5 2,8 -1,2 0,8 1,7 1,0 95,1 85,4 1,0 0,7
(совместимость при RR < 15,0%) D vs R 5,6 2,0 -2,0 -7,3 -1,2 0,6 -0,5 -0,5 97,1 180,0 9,5 0,7
ИСмьс R/D 0,7 0,9 0,7 1,7 0,9 1,1 1,8 1,8 9,7 11,5 1,2 1,3
(совместимость при ИСмьс < 2,0) D/R 0,7 0,4 0,8 0,5 0,6 1,2 0,7 0,7 5,5 43,9 0,9 1,3
Примечание. Пары D—R № 1, 2, 3, 4, 6 — совместимые в реакции мьс; пара D—R № 5 — несовместимая в реакции мьс.
29
Гематол. и трансфузиол., 2013, т. 58, № 3
Обследование после курсов лечения
—#— Стимуляция ФГА 4 Стимуляция пулом лимфоцитов
+ Стимуляция лимфоцитами неродственного донора
Рис. 7. Изменение в динамике пролиферативной активности лимфоцитов в реакциях ФГА-стимуляции и MLC больной (И.) множественной миеломой в течение 8 курсов лечения препаратом велкейд при оценке с помощью счетчика MicroВetа Plus.
ности лимфоцитов больной к пролиферативному ответу как на стимуляцию ФГА, так и на стимуляцию пулом лимфоцитов в реакции MLC: до 70 и 52% от исходного уровня соответственно. Снижение способности к пролиферативному ответу продолжало увеличиваться вплоть до 8-го курса лечения, когда он составил в реакциях ФГА-стимуляции и MLC 30 и 44% от исходного уровня, соответственно. Через 3,5 нед после окончания 8-го курса лечения пролиферативный ответ лимфоцитов на стимуляцию ФГА восстановился до нормы и составил 118% от исходного уровня; ответ на пул лимфоцитов в реакции MLC восстанавливался медленнее, в этот период он составлял только 58% от исходного уровня.
В процессе работы на Р-сцинтилляционном счетчике MicroBetH Plus в комплекте с харвестером Harvester 96 и с использованием твердого сцинтиллятора выявились следующие преимущества:
— счетчик MicroBetа Plus в противоположность стандартному жидкостному Р-сцинтилляционному счетчику — малогабаритный, настольный прибор;
— при работе на счетчике MicroBetu Plus все пробы непосредственно из 96-луночной платы одномоментно переносятся на фильтр Printed Filtermat харвестера Harvester 96, чем полностью исключается возможность перепутать порядок проб культивированных клеток, как это может произойти при работе на счетчике 1409 DSA в комплекте с 12-трубочным клеточным харвестером в процессе размещения проб на фильтре при необходимости передвигать его вручную;
— счетчик MicroBetа Plus имеет мультидетекторную систему — три детектора одновременно счи-
30
тывают радиоактивность трех проб культивированных клеток, помещенных на фильтр, между тем как стандартный жидкостный счетчик представляет собой однодетекторную систему;
— использование твердого сцинтиллятора MeltiLex исключает необходимость работы с многочисленными стеклянными сцинтилляционными флакончиками, требующими мытья, или с одноразовыми пластиковыми сцинтилляционными флакончиками с пониженной эффективностью радиоактивного счета, а также необходимость вручную заполнять флакончики токсичным жидким сцинтиллятором, раскладывать в них, а затем удалять из них фильтры с последующей утилизацией жидких радиоактивных отходов;
— использование компьютерной программы счетчика MicroBetа Plus в комплексе с разработанной специальной программой расчета по формулам показателей RR, ИСмьс и ИСфга позволяет значительно облегчить
и ускорить работу по оценке совместимости и иммунитета больных в реакциях MLC и ФГА-стимуляции.
Выводы
1. Проведенное параллельное определение уровней радиоактивности при включении 3Н -тимидина в одни и те же клеточные культуры на Р-сцинтилляционном счетчике нового поколения MicroBetа Plus и на стандартном жидкостном Р-сцинтилляционном счетчике 1409 DSA показало сопоставимость результатов, полученных в реакциях MLC и ФГА-стимуляции.
2. Работа на счетчике MicroBetn Plus намного легче, удобнее, надежнее и быстрее по сравнению с работой на стандартном жидкостном Р-сцинтилляционном счетчике 1409 DSA.
3. На счетчике MicroBetа Plus выявлена тенденция к снижению величин пролиферативных ответов лимфоцитов в ответ на стимуляцию ФГА и аллогенными клетками в реакции MLC по сравнению с данными, полученными на стандартном счетчике 1409 DSA (р > 0,05).
4. На счетчике MicroBetа Plus по сравнению с данными счетчика 1409 DSA в нестимулированных культурах лимфоцитов выявлено статистически значимое увеличение пролиферации (р = 0,05).
5. Величина фонового уровня радиоактивности на счетчике MicroBetа Plus практически не отличается от таковой на счетчике 1409 DSA.
6. Проведенное на счетчике MicroBetа Plus исследование воздействия лечения бортезомибом больной множественной миеломой на способность
Гематол. и трансфузиол., 2013, т. 58, № 3
ее лимфоцитов к пролиферативному ответу при стимуляции ФГА и аллогенными лимфоцитами в реакции MLC выявило закономерные динамические изменения пролиферативной активности лимфоцитов, выразившиеся в снижении уровня их пролиферативного ответа после 5-го курса лечения препаратом велкейд и в его восстановлении через 3,5 нед после окончания последнего, 8-го курса лечения.
Таким образом, выявленные преимущества работы на Р-сцинтилляционном счетчике нового поколения MicroВetа Plus позволяют рекомендовать использование одной из его моделей для определения пролиферативной активности лимфоцитов человека в культуре in vitro — в реакции ФГА-стимуляции и для определении совместимости донора с реципиентом по HLA класса II в реакции MLC.
Работа выполнена по теме НИР "Изучить эффективность трансплантации аллогенных и аутологичных гемопоэтических клеток в комплексной терапии острых лейкозов и хронического миелолейкоза" (№ гос. регистр.: 012000602115, рук. — академик РАМН Валерий Григорьевич Савченко. Срок выполнения: 2006—2010 гг.).
Авторы статьи выражают благодарность ст. инженерам ГНЦ Анатолию Георгиевичу Медведско-му и Олегу Захаровичу Журавлеву, проводившим на у-источнике облучение лимфоцитов, и сотрудникам фирмы "Приборы" Виталию Николаевичу Корнееву и Валерию Николаевичу Черникову за участие в техническом обеспечении проведенного исследования.
ЛИТЕРАТУРА
1. Шпакова А.П., Булычева Т.И., Головкина Л.Л., Кутьина Р.М., Пушкина Т.Д., Хасигова Б.Б. и др. Реакция смешанной культуры лимфоцитов — MLC и генотипическая значимость ее пролиферативного ответа при подборе HLA-идентичного донора сибса для трансплантации костного мозга (итоги 30-летней работы). Гематология и трансфузиология. 2012; 3: 13—21.
2. Шпакова А.П., Булычева Т.И., Любимова Л.С., Менделеева Л.П. Значение и особенности реакции смешанной культуры лимфоцитов в определении гистосовместимости донора и реципиента при трансплантации аллогенного костного мозга у больных гемобластозами. Терапевтический архив. 2000; 11: 62—7.
3. Кобзева И.В., Тепляков В.В., Карпенко В.Ю., Бухров А.В., Тюрина Н.Г. Комплексный подход к лечению больных множественной миеломой. Терапевтический архив. 2008; 7: 70—2.
4. Менделеева Л.П., Савченко В.Г., Тюрина Н.Г., Варламова Е.Ю., Момотюк К.С., Любимова Л.С. и др. Высокодозная химиотерапия и аутотрансплантация при множественной миеломе. Современная онкология. 2006; 1: 55—7.
5. Войцеховский В.В., Ландышев Ю.С., Есенин В.В., Есенина Т.В., Скрипкина Н.С., Малиновская Е.А. и др. Лечение
больных множественной миеломой препаратом "Велкейд". Дальневосточный медицинский журнал. 2009; 4: 63—5.
6. Митина Т.А., Голенков А.К., Луцкая Т.Д., Катаева Е.В., Трифонова Е.В., Дудина Г.А. и др. Эффективность лечения больных множественной миеломой, осложненной почечной недостаточностью, бортезомибсодержащими программами в сочетании с гемодиализом. Гематология и трансфузиология. 2011; 4: 12—6.
Поступила 14.01.13
REFERENCES
1. Shpakova A.P., Bulycheva T.I., Golovkina L.L., Kutjina R.M., Pushkina T.D., Khasigova B.B., et al. Mixed lymphocyte culture reaction — MLC and genotypical significancy of its proliferative response in search of HLA-identical sibling for bone marrow transplantation (results of 30-years of researches) Ge-matology and transfusiology [Reaktsiya smeshannoy kul’tury limfotsitov — MLC i genotipicheskaya znachimost’ ee pro-liferativnogo otveta pri podbore HLA-identichnogo donora sibsa dlya transplantatsii kostnogo mozga (itogi 30-letney raboty). Gematologiya i transfuziologiya] 2012; 3: 13—21. (in Russian)
2. Shpakova A.P., Bulycheva T.I., Lyubimova L.S., Mendeleeva L.P. The significance and features of mixed lymphocytes culture reaction in the determination of histocompatibility of donor and recipient in allogenic bone marrow transplantation in patients with hematological malignancies. Therapeutic archive (Znachenie i osobennosti reaktsii smeshannoy kul’tury limfotsitov v opredelenii gistosovmestimosti donora i retsipienta pri transplantatsii allogennogo kostnogo mozga u bol’nykh gemoblastozami. Terapevticheskiy arkhiv). 2000; 11: 62—7. (in Russian)
3. Kobzeva I.V., Teplyakov V.V., Karpenko V.Yu., BukhrovA.V., Ty-urina N.G. Integrated approach to the treatment of multiple myeloma patients. Therapeutic archive. (Kompleksnyy podkhod k lecheniyu bol’nykh mnozhestvennoy mielomoy. Terapevticheskiy arkhiv).2008; 7: 70—2. (in Russian)
4. MendeleevaL.P., Savchenko V.G., TyurinaN.G., VarlamovaE.Yu., Momotyuk K.S., Lyubimova L.S., et al. High-dose chemotherapy and autologous transplantation in patients with multiple myeloma. Modern Oncology (Vysokodoznaya khimioterapiya i autotrans-plantatsiya pri mnozhestvennoy mielome. Sovremennaya onkol-ogiya) 2006; 1: 55—7. (in Russian)
5. Voytsekhovskiy V.V., Landyshev Yu.S., Esenin V.V., Esenina T.V., Skripkina N.S., Malinovskaya E.A., et al. Treatment of patients with multiple myeloma with drug "Velcade". Far East Medical Journal. (Lechenie bol’nykh mnozhestvennoy mielomoy pre-paratom Velkeyd. Dal’nevostochnyy Meditsinskiy Zhurnal). 2009; 4: 63—5. (in Russian)
6. Mitina T.A., Golenkov A.K., Lutskaya T.D., Kataeva E.V., Trifonova E.V., Dudina G.A., et al. Effectiveness of therapy of the patients with multiple myeloma, complicated by the kidney insufficiency with bortezomib containing protocols in combination with hemodialysis. Gematology and transfusiology (Effektivnost’ lecheniya bol’nykh mnozhestvennoy mielomoy, oslozhnennoy pochechnoy nedostatochnost’yu, bortezomibsoderzhashchimi programmami v sochetanii s gemodializom. Gematologiya i transfuziologiya) 2011; 4: 12—6. (in Russian)
31
