CC BY
49
ИММУНОЛОГИЯ № 2, 2014
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 616.155-006.04-078.33-091.8-074
Дейнеко Н.Л.1, Булычева Т.И.1, Григорьев А.А.1, Ковригина А.М.1, Вольпина О.М.2, Владимирова Н.М.2
иммуноцитохимическая идентификация мономерных и олигомерных форм белка в23/нуклеофозмина в лимфоидных клетках у больных с различными лимфопролиферативными ЗАБOЛЕВАHИЯМИ
1ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России, 125167, г Москва; 2Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Ран, 117997, г Москва
Методом иммуноцитохимического окрашивания в реакции непрямой иммунофлюоресценции с использованием афинно-очищенных противопептидных антител (АТ), специфичных к мономерным (АТ 19-36) формам белка В23, и АТ к олигомерным формам (АТ 283-294), избирательно выявляющих изоформу В23.1, проведено сравнительное исследование лимфоидных клеток у больных с различными лимфопролиферативными заболеваниями (ЛПЗ) и больных с заболеваниями неопухолевой природы в сравнении с интактными лимфоцитами у здоровых лиц. Установлено, что при ЛПЗ с низким уровнем пролиферативной активности клеток, определяемой по содержанию Ki-67-позитивных клеток, и заболеваниях системы крови неопухолевой природы локализация мономерной и олигомерной форм белка В23, выявляемых обоими противопептидными АТ в лимфоидных клетках, оказалась сходной с локализацией их в лимфоцитах у здоровых лиц. При злокачественных ЛПЗ, характеризующихся резким повышением пролиферативной активности клеток, с помощью иммуноцитохимического исследования лимфоидных клеток с АТ 283-294 (специфично выявляющими на иммуноблоттах SDS-устойчивые олигомеры) впервые обнаружено не только резкое усиление интенсивности свечения, но и увеличение количества маркируемых в клетке ядрышек (с 1 до 3 и более), изменение их размера и формы в отличие от мономеров, выявляемых АТ 19-36, которые локализованы в цитоплазме и нуклеоплазме и не претерпевают существенных изменений при усилении злокачественности ЛПЗ.
Полученные результаты свидетельствуют об информативности иммуноцитохимического исследования олигомеров, которые содержат изоформу белка В23.1, специфически выявляемую АТ 283-294, отражающую степень пролиферативной активности клеток.
Ключевые слова: мономерная и олигомерная форма белка В23/нуклеофозмина; лимфопролиферативные заболевания; противопептидные антитела; пролиферация.
Deineko N.L1, Bulycheva T.I.1, Grigoryev A.A.1, Kovrigina AM.1, Volpina O.M.2, Vladimirova N.M.2 IMMUNOCYTOCHEMICAL IDENTIFICATION OF MONOMERIC AND OLIGOMERIC FORMS OF PROTEIN B23/NUCLEOPHOSMIN IN LYMPHOID CELLS FROM PATIENTS WITH vARIOUS LYMPHOPROLIFERATIvE DISEASES
National Center for Hematology, 125167, Moscow; institute of Bioorganic Chemistry, 117997, Moscow Using the method of immunocytochemical staining in the reaction of indirect fluorescence employing affinity purified antipeptide antibodies specific for monomeric forms of the protein B23 (AT 19-36) and antibodies against oligomeric forms (AT 283-294) that selectively detect the isoform B23.1 we conducted a comparative study of the lymphoid cells of the patients with various lymphoproliferative diseases and patients with diseases of nononcological nature in comparison with intact lymphocytes of the healthy people.
It was established that in lymphoproliferative diseases with a low degree of proliferative activity of the cells that is assessed by the levels of Ki-67 positive cells and in the diseases of the blood of nononcological nature localization of monomeric and oligomeric forms of the protein B23 revealed with both antipeptide antibodies in lymphoid cells was similar to their localization in the lymphocytes from the healthy people. In malignant lymphoproliferative diseases that are characterized by a sharp increase in the proliferative activity of the cells it was revealed for the first time using immunocytochemical study of lymphoid cells with AT 283-294 (that specifically stains SDS resistant oligomers on western blots) that the intensity of the staining increases and on top of that the number of stained nucleoli increases as well (from 1 to 3 and more) and their size and shape change in contrast to the nucleoli stained with monomers revealed with AT- 19-36 that are localized in the cytoplasm and nucleoplasm and that don't undergo considerable changes during the progression of lymphoproliferative diseases.
The obtained results point to the high value of the immunocytochemical study of oligomers that contain the isoform of the protein B23.1 that specifically stains AT 283-294 that localizes in the nucleoli of cells and changes in the process of proliferation that reflects the degree of proliferative activity of cells.
Key words: monomeric and oligomeric forms of the protein B23/nucleophosmin; lymphoproliferative diseases; antipeptide antibodies; proliferation.
Введение. Многочисленные исследования последних лет касаются изучения белка В23/нуклеофозмина, являющегося структурным элементом ядрышка и играющего важную роль в пролиферации, малигнизации и апоптозе клеток. В связи с этим все большее число авторов рассматривают В23 в качестве онкомаркерного белка [1-6], функционирующего в виде олигомерной и мономерной форм, которые выявляют на иммуноблоттах [7].
Нами было показано [8-11], что белок В23 является более ранним маркером активации клеток к пролиферации лимфоцитов, чем общепринятый маркер пролиферации белок Ki-67, что оказалось важным для своевременной диагностики онкогематологических заболеваний. Однако вопрос, какая из форм белка (мономерная или олигомерная) и какая из изоформ белка (В23.1 или В23.2) отражает состояние пролиферативной активности лимфоидных клеток и может служить
68 -
иммуноонкология
маркером пролиферации, оставался не решенным до последнего времени.
Для детальной характеристики мономеролигомерного состояния В23 и изучения локализации его форм в 2008 г. мы получили аффинно-очищенные противопептидные антитела (АТ 19-36), направленные к синтезированному N-концевому участку аминокислотной последовательности нуклеофозми-на 19-36, содержащемуся во всех известных формах белка и вовлеченному в межмолекулярный контакт в олигомерах [12], а также АТ 283-294 к синтезированному к С-концевому участку аминокислотной последовательности 283-294, содержащемуся только в изоформе В23.1 [13]. Результаты иммунохимического и иммуноцитохимического анализа нуклеофозмина в опухолевых клетках различного типа позволили нам показать [14-17], что АТ 19-36 на иммуноблот-тах избирательно выявляют мономеры нуклеофозмина, локализованные в цитоплазме и нуклеоплазме. В отличие от них АТ 283-294, направленные к изоформе В23.1, выявляют олигомерные формы нуклеофозмина и имеют ядрышковую локализацию. Практически вся изоформа В23.1 включена в состав олигомеров, обладающих аномальной устойчивостью к обработке SDS и различимых в условиях денатурирующего электрофореза.
В результате иммуноцитохимических исследований изменения в динамике форм нуклеофозмина лимфоцитов при искусственно вызванной их пролиферации с помощью ФГА-стимуляции с противопептидными АТ обнаружили, что олигомерная форма локализована в ядрышке, возрастание пролиферативной активности клеток связано именно с олигомерной формой и выражается в увеличении количества маркируемых ядрышек и интенсивности их окрашивания [16, 17].
С учетом того, что определение пролиферативной активности клеток имеет важное, а иногда и определяющее значение в дифференциальной диагностике и прогнозировании онкогематологических заболеваний, целью данной работы стало иммуноцитохимическое исследование мономеролигомерного состояния В23 с помощью полученных противопептидных АТ в клетках у больных с различными лимфопролиферативными заболеваниями (ЛПЗ) и заболеваниями неопухолевой природы.
Материалы и методы. Лимфоциты из периферической крови у здоровых лиц и больных с ЛПЗ выделяли с помощью описанного нами ранее метода [16]. Иммуноцитохимическое исследование клеток в реакции непрямой иммунофлюоресценции проводили описанным нами способом [16]. В качестве первичных тест-АТ использовали аффинно-очищенные поликлональные (кроличьи) противопептидные АТ (ИБХ РАМН) в разведении 1:50: -АТ 19-36, выявляющие на им-муноблоттах пул белка В23 в виде мономеров; АТ 283-294, выявляющие на иммуноблоттах пул белка В23 в виде SDS-устойчивых олигомеров.
В качестве контрольных первичных АТ использовали МКА к белку Ki-67 (Dako, Дания) в разведении 1:20; к белку B23 анти-В23(кат. № М724001, Sigma, США) в разведении 1:100. Обязательным отрицательным контролем служили клетки без внесения специфических первичных АТ.
Результаты и обсуждение. Иммуноцитохимическое исследование клеток провели у 40 больных с различными ЛПЗ (см. таблицу), 11 с заболеваниями нелимфоидной природы и 13 здоровых лиц (доноры). Окончательный диагноз устанавливали на основании гистологических, цитогенетических, иммуноморфо- и гистоцитохимических исследований. В связи с тем что мы проводили исследования до установления окончательного диагноза, группы больных не были однородными по количеству обследованных.
Результаты сравнительного иммуноцитохимического анализа локализации и интенсивности экспрессии мономерных и олигомерных форм белка В23 в лимфоцитах у здоровых лиц и лимфоидных клетках при различных ЛПЗ представлены в таблице.
Как видно из таблицы, при исследовании лимфоцитов у здоровых лиц (контрольная группа) с АТ 19-36 выявили све-
чение, локализованное в цитоплазме и нуклеоплазме в виде многочисленных фокусов средней интенсивности в большинстве (в среднем в 75%) клеток. В то же время АТ 283-294 выявляли свечение пула белка, локализованного в ядрышке в виде одного фокуса средней интенсивности приблизительно в 80% клеток, что оказалось сходным с локализацией и интенсивностью свечения белка, выявляемого контрольными МКА к белку В23 (см. рисунок, а, б).
При исследовании лимфоидных клеток у больных с нелимфопролиферативными заболеваниями и ЛПЗ без признаков прогрессии и активации (с низким содержанием Ш-67+-клеток - 2-я и 3-я группы) обнаружили, что процент позитивных клеток с окрашиванием противопептидными АТ был также очень высоким (около 75-85%). При этом локализация и степень интенсивности свечения с АТ 283-294 были сходны с таковыми интактных лимфоцитов у здоровых лиц, маркируя с АТ не более 1 ядрышка со слабой интенсивностью свечения (см. рисунок, а, 2). Лишь у 1 больного с максимально высоким (8%) для 3-й группы количеством Ш-67+-позитивных клеток в некоторых клетках выявляли по 2 светящихся ядрышка. В то же время следует отметить, что у больных с идиопатической тромбоцитопенической пурпурой (ИТП) в реакции с AT 283-294 не обнаружили положительных реакций в ядрышках, а свечение наблюдали лишь в области нуклеоплазмы, что отличалось от лимфоцитов у здоровых лиц и лимфоцитов у больных с заболеваниями нелимфоидной природы. При этом общее количество позитивных клеток, выявляемых обоими противопептидными АТ, в клетках у больных ИТП оказалось ниже, чем у больных с другими нелимфопролиферативными заболеваниями (в среднем 55% против 75% с АТ 19-36 и 37% против 53% с АТ 283-294). Кроме того, меньшее количество клеток маркировалось и с МКА к цельному белку В23 (в среднем 21% против 55% соответственно).
У больных с ЛПЗ с признаками прогрессии и трансформации (4-7-я группы) общее количество позитивных клеток с АТ 19-36 составило 80-100%, при этом свечение наблюдали только в цитоплазме и нуклеоплазме. Однако с увеличением количества Ki-67+свыше 25% (7-я группа) свечение смещалось преимущественно в область нуклеоплазмы, при этом количество позитивных клеток могло достигать 100%. Однако у 2 больных с диффузной В-крупноклеточной лимфомой с наличием очень высокого количества Ш-67+-клеток (75 и 81%) можно было наблюдать появление ядрышкового свечения с AT 19-36. У этих больных АТ маркировали 2-3 ядрышка и более (в 8 и 5% клеток соответственно), в остальных клетках отметили свечение в области нуклеоплазмы (см. рисунок, б, 4).
Результаты реакции с AT 283-294 в 4-7-й группах показали, что у больных с низкой степенью пролиферативной активности (4-я группа) белок локализовался в ядрышке в большинстве клеток в основном в виде одного фокуса средней интенсивности. С увеличением количества Ki-67+ наблюдали (см. рисунок, а, 3) постепенное усиление интенсивности флюоресцентного окрашивания (с + до +++) с увеличением количества маркируемых ядрышек от 1 до 3 и более (см. таблицу). В 7-й группе (больные с наиболее злокачественными заболеваниями и наивысшим содержанием Ki-67+), помимо общего увеличения количества ядрышек в клетках и усиления интенсивности их свечения, наблюдали увеличение размера ядрышек по сравнению с таковым интактных лимфоцитов, при этом границы ядрышек теряли четкие очертания (см. рисунок, а, 4). Обнаружили, что количество клеток, маркируемых АТ 283-294, нарастало параллельно с количеством клеток, выявляемых контрольными МКА к Ki-67 и В23, с усилением интенсивности их свечения, но при этом МКА анти-В23 чаще всего маркировали не более 1 ядрышка, которые не были увеличены в размере и имели очень четкие очертания. Полученные нами в этих исследованиях данные по сравнению экспрессии белков Ki-67 и В23 при различных стадиях пролиферативной активности клеток были сходны с результатами наших предыдущих исследований по искусственному
- 69 -
ИММУНОЛОГИЯ № 2, 2014
Таблица
Количество антигенпозитивных клеток с различными АТ, %
Ki-67, анти-В23, противопептидные синтетические АТ
(Dako, Дания) (Sigma, США) А 19-36 (к мономерным формам нуклеофозмина) АТ 283-294 (к олигомерным формам нуклеофозмина)
Группа Диагноз локализация свечения общее коли- локализация свечения
общее в ядрышках
количество позитивных клеток, % в цитоплазме и нуклеоплаз- в ядрыш- чество пози- тивных клеток, в цитоплазме количество позитивных ядрышек в клетках, % наличие видо- изме-
ме ках % 1 2-3 более 3 ненных ядрышек
1-я Здоровые лица (п = 13) 0 60 (45-80) (+) 75(70-95) (+) 75 (+) в цитоплазме 0 80 (65-90) (+) (+/-) 80 (+) 0 0 -
2-я Нелимфопролиферативные заболевания (МДС, АА и др.) (п = 8) 0 55 (45-63) (+) 75(25-95) (+) 75 (+) в цитоплазме 0 53 (35-75) (+) (+/-) 53 (+) 0 0
В том числе ИТП (п = 3) 0 21(19-25) (+) 55 (30-70) (+) 55 (+) в цитоплазме 0 37 (30-42) (+) 0 0 0
3-я В-клеточная лимфома селезенки из клеток маргинальной зоны (п = 11) 3(1-8) 45 (40-60) (+) 85 (80-90) (++) 85 (++) в цитоплазме 0 75 (60-80) (++) (+/-) 73 (++) 2 (++) 0
4-я В-ХЛЛ (п = 6) 6(5-8) 55 (45-60) (++) 87 (85-88) (++) 90 (++) в цитоплазме и нуклеоплазме 0 90 (86-95) (++) (+/-) 73 (++) 12 (++) 0
В-ХЛЛ с наличием признаков прогрессии и активации (п = 1) 65 63 (++) 90 (++) 90 (++) в ну-клеоплазме, цитоплазма (+/-) 0 95 (++) (+/-) 52 (++) 43 (++) 0 +
5-я В-клеточная лимфома селезенки из клеток маргинальной зоны, богатая бластами (п = 9) 14 (5-23) 59(41-76) (++) 85 (80-95) (++) 85 (++) в цитоплазме и нуклеоплазме 0 90 (86-95) (++) (+/-) 55 (++) 33 (++) 2 (++) + (при Ki-67+ > 10%)
6-я Лимфома из клеток мантии с преимущественным вовлечением селезенки (селезеночная форма) (п = 3) 17 (10-23) 60(58-92) (++) 85 (80-95) (++) 85 (++) в цитоплазме и нуклеоплазме 0 74 (58-92) (++) (+/-) 42 (++) 26 (++) 6 (++) + (при Ki-67+ > 10%)
7-я Диффузная В-крупноклеточ-ная лимфома (п = 10) 52 (17-81) 83 (58-100) (++) 95 (90-100) (+++) 95 (+++) нуклеоплазма У 2 больных 5 и 8% 91 (75100) (+++) 2 (+++) 32 (+++) 62 (+++) + (у всех больных)
Примечание. (+) - (++++) - интенсивность свечения; МДС - миелодиспластический синдром; АА - апластическая анемия; В-ХЛЛ -В-клеточный хронический лимфолейкоз.
увеличению пролиферативной активности клеток на модели ФГА-стимулированных лимфоцитов [9, 10, 16, 17].
Таким образом, в результате проведенных исследований лимфоидных клеток у больных с различными формами ЛПЗ и лимфоцитов у здоровых лиц с противопептидными АТ к мономерным и олигомерным формам белка В23 выявили изменения, связанные со степенью пролиферативной активности клеток. В интактных лимфоцитах у здоровых лиц и больных с нелимфопролиферативными заболеваниями при практическом отсутствии Ю-67+-клеток результаты иммуноцитохимических реакций оказались сходными. Пул белка,
выявляемый с помощью АТ 19-36 в виде мономеров, оказался локализованным в цито- и нуклеоплазме и не претерпевал существенных изменений, связанных с пролиферативной активностью клеток. Умеренное повышение пролиферативной активности клеток при ЛПЗ (не более 25 % Ю-67+-клеток) практически не отражалось на характере свечения и цитоплазматической локализации мономерной формы B23. Однако при резком повышении пролиферативной активности (при количестве Ю-67+-клеток, превышающем 75%), а следовательно, и злокачественности процесса, мономерная форма белка B23 не только выявлялась в основном в нуклеоплазме,
- 70 -
иммуноонкология
Иммунофлюоресцентное окрашивание олигомерной формы, выявляемой антителами АТ 283-294 (а) и мономерной формы, выявляемой антителами АТ 19-36 (б) белка В23/нуклеофозмина в лимфоидных клетках больных различными формами ЛПЗ.
1 - лимфоциты здоровых лиц (контроль); 2 - лимфоидные клетки больного с В-клеточным хроническим лимфолейкозом; 3 - лимфоидные клетки больного с лимфомой из клеток мантии с преимущественным вовлечением селезенки (селезеночная форма); 4 - лимфоидные клетки больного с диффузной В-крупноклеточной лимфомой.
но и могла изменять свою локализацию, окрашивая ядрышки единичных клеток в виде 2-3 фокусов свечения.
В то же время пул нуклеофозмина, выявляемый АТ 283294 (определяемый на иммуноблоттах виде SDS-устойчивых олигомеров) при практически полном отсутствии Ki-67+ -клеток, помимо цитоплазмы, обнаружили в виде 1 фокуса свечения в ядрышке в большинстве клеток. Более значительные изменения этой формы белка В23 наблюдали в процессе нарастания пролиферативной активности клеток, характерной для различных нозологических форм ЛПЗ. Так, для заболеваний с умеренной степенью пролиферации (В-клеточный хронический лимфолейкоз, В-клеточная лимфома селезенки из клеток маргинальной зоны, лимфома селезенки из клеток
маргинальной зоны, богатой бластами, лимфома из клеток мантии с преимущественным вовлечением селезенки (селезеночная форма)), где количество Ki-67-позитивных клеток не превышало 25% , основная масса лимфоидных клеток также имела 1 фокус свечения. Однако при этом уже появлялись клетки с 2 (12-33%) и даже с 3 (2-6%) окрашенными ядрышками. При более злокачественных заболеваниях (диффузная В-крупноклеточнаяой лимфома и др.), характеризующихся резким повышением пролиферативной активности клеток (при количестве КВ67+-клеток, достигающем 81%, а В23+ - 100%), наблюдали не только повышение количества маркируемых клеток, но и характерное только для олигомерной формы В23 увеличение количества светящихся в клетках ядрышек. При этом практически исчезали клетки с маркируемым в норме 1 ядрышком, а основную массу (56-68%) составляли клетки с 3 ядрышками и более.
Таким образом, по количеству окрашиваемых в клетках ядрышек с АТ 283-294 можно визуально судить о пролиферативной активности каждой клетки в отдельности и степени злокачественности процесса, что невозможно сделать при использовании наиболее известных для оценки пролиферации МКА к белкам Ki-67 и В23. Полученные результаты еще раз подтверждают, что, хотя белок В23, являющийся одним из основных структурных элементов ядрышка, и относится к антигенам, отражающим пролиферативную активность клеток, за состояние пролиферации отвечает не весь пул белка, а только изоформа В23.1, образующая олигомеры, локализованные в ядрышках и изменяющиеся в процессе пролиферации. В то же время мономерная форма белка В23 является более инертной, практически не изменяясь на всем протяжении пролиферативного процесса. Однако появляющаяся при наиболее злокачественных формах ЛПЗ с максимальным количеством КВ67+-клеток миграция мономерной формы белка В23 в ядрышки является новым фактором, требующим дальнейших фундаментальных исследований.
Полученные результаты свидетельствуют об информативности и диагностической значимости характера экспрессии не полного пула белка В23, а олигомеров, включающих в свой состав изоформу В23.1. Эти олигомеры могут служить маркерами злокачественности процесса. АТ 283-294, избирательно выявляющие эту форму белка В23, могут быть использованы для детекции таких олигомеров и применимы для дополнительной диагностики онкогематологических заболеваний.
Работа по получению противопептидных АТ была выполнена в ИБХ РАН при финансовой поддержке программы Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» 2012-2013 гг.
ЛИТЕРАТУРА
1. Chan P.K., Chan F.Y. Nucleophosmin/B23 (NPM) oligomer is a major and stable entity in HeLa cells. Biochim. Biophys. Acta. 1995; 1262: 37-42.
2. Lim M.J., Wang X. Nucleophosmin and human cancer. Cancer Detect. Prev. 2003; 30: 481-90.
3. Grisendy S., Meccuci C., Falini B., Pandolfi P. . Nucleophosmin and cancer. Nature. Rev. 2006; 6: 493-505.
4. Falini B., Nicoletti I., Bolli N., Martelli M.P., Liso A., Gorello P. et al. Translocations and mutations involving the nucleophosmin (NPM1) gene in lymphomas and leukemias. Haematologica. 2007; 92: 519-32.
5. Сауткина Е.Н., Потапенко Н.А., Булычева Т.И., Владимирова Н.М. Выделение белка В23/нуклеофозмина из ядер клеток HeLa. Прикладная биохимия и микробиология. 2008; 44 (3): 287-95.
6. Grummit C.G., Townsley F.M., Johnson C.M., Warren A.J., Bycroft M. Sructural wnsequences of 'rncleophosmin мutations in ncute мyeloid leukemia. J. Biol. Chem. 2008; 283: 23326-32.
7. Владимирова Н.М., Сауткина Е.Н., Табданов Е.Б. Идентификация и характеристика мономерных и олигомерных изо-
- 71 -
ИММУНОЛОГИЯ № 2, 2014
форм ядрышкового белка 23/нуклеофозмина в клетках HeLa. Биологические мембраны. 2004; 21: 94-101.
8. Булычева Т.И., Артеменко Е.Г., Дергунова Н.Н., Дудник
O. А., Шпакова А.П., Малашенко О.С, Зацепина О.В. Анализ пролиферативной активности клеток с помощью новых моноклональных антител к ядрышковому белку В23/нуклео-фозмину. Цитология. 2000; 42 (10): 944-54.
9. Dergunova N.N., Bulycheva T.I., Artemenko E.G., Shpakova A.P., Pegova A.N., Gemijan E.G. еt al. A major nucleolar protein B23 as a marker of proliferation activity of human peripheral lymphocytes. Immunol. Lett. 2002; 83: б7-72.
10. Булычева Т.И., Дейнеко Н.Л., Артеменко Е.Г., Самойлова
P. С., Зацепина О.В. Диагностическое значение ядрышкового белка В23/нуклеофозмина при хронических лимфопролиферативных заболеваниях. Terra Medica. Лабораторная диагностика. 2006; 2 (10): 16-21.
11. Булычева Т.И., Дейнеко Н.Л., Артеменко Е.Г., Самойлова Р.С., Зацепина О.В. Способ прогнозирования прогрессирования хронического лимфолейкоза по количественному содержанию ядрышкового белка В23/нуклеофозмина в лизатах лимфоидных клеток. Патент РФ № 2310201, 10.11.2007.
12. Короев Д.О., Шалгунов B.C., Владимирова Н.М., Лобанова Н.В., Волкова Т. Д., Вольпина О.М. Пептид, стимулирующий образование специфических антител против мономерной формы нуклеофозмина в опухолевых клетках. Патент РФ №
2401274, 06.04.2009.
13. Короев Д.О., Шалгунов B.C., Владимирова Н.М., Лобанова Н.В., Волкова Т. Д., Вольпина О.М. Пептид, стимулирующий образование специфических антител против олигомерной формы нуклеофозмина в опухолевых клетках. Патент РФ №
2401275, 06.04.2009.
14. Vladimirova N.M., Pisareva M.A., Zharskaya О.О., Deineko N.L., Bulycheva T.I., volpina o.M. Tumor specific oligomeric forms of nucleophosmin. J. Cancer Sci. Ther. 2011; 3 (8): 205-12.
15. Шалгунов В.С., Лобанова Н.В., Булычева Т.И., Дейнеко Н.Л., Волкова Т.Д., Филатова М.П. и др. Антитела к синтетическим фрагментам нуклеофозмина для специфического выявления его мономерных и олигомерных форм. Биоорганическая химия. 2009; 35 (6): 799-807.
16. Булычева Т.И., Дейнеко Н.Л., Вольпина О.М., Владимирова Н.М. Иммуноцитохимическая визуализация мономерных и олигомерных форм ядрыщшкового белка В23/нуклеофозми-на в лимфоцитах человека в процессе пролиферации. Иммунология. 2011; 5: 231-6.
17. Булычева Т.И., Дейнеко Н.Л. Способ иммуноцитохимической оценки пролиферативного состояния лимфоцитов по характеру экспрессии c-концевого фрагмента белка В23/ну-клеофозмина в реакции непрямой иммунофлюоресценции. Патент РФ № 2438135, 27.12.2011.
REFERENCES
1. Chan P.K., Chan F.Y. Nucleophosmin/B23 (NPM) oligomer is a major and stable entity in HeLa cells. Biochim. Biophys. Acta. 1995; 1262: 37-42.
2. Lim M.J., Wang X. Nucleophosmin and human cancer. Cancer Detect. Prev. 2003; 30: 481-90.
3. Grisendy S., Meccuci C., Falini B., Pandolfi P. . Nucleophosmin and cancer. Nature. Rev. 2006; 6: 493-505.
4. Falini B., Nicoletti I., Bolli N., Martelli M.P., Liso A., Gorello P. et al. Translocations and mutations involving the nucleophosmin (NPM1) gene in lymphomas and leukemias. Haematologica. 2007; 92: 519-32.
5. Sautkina E.N., Potapenko N.A., Bulycheva T.I., Vladimirova N.M. Isolation of the protein B23/nucleophosmin from the nuclei of the cells HeLa. Prikladnaya biokhimiya i mikrobiologiya. 2008; 44 (3): 287-95 (in Russian).
6. Grummit C.G., Townsley F.M., Johnson C.M., Warren A.J., Bycroft M. Sructural ransequences of 'rncleophosmin мutations in аcute мyeloid leukemia. J. Biol. Chem. 2008; 283: 23326-32.
7. Vladimirova N.M., Sautkina E.N., Tabdanov E.B. Identification and characterization of monomeric and oligomeric isoforms of the nucleolar protein B23/nucleophosmin in cells HeLa. Biologicheskiye membrany. 2004; 21: 94-101 (in Russian).
8. Bulycheva T.I., Artemenko E.G., Dergunova N.N., Dudnik O.A., Shpakova A.P., Malashenko O.S., Zatsepina O.V Analysis of proliferative activity of cells using new monoclonal antibodies against the nucleolar protein B23/nucleophosmin. Tsitologiya. 2000; 42(10): 944-54 (in Russian).
9. Dergunova N.N., Bulycheva T.I., Artemenko E.G., Shpakova A.P., Pegova A.N., Gemijan E.G. еt al. A major nucleolar protein B23 as a marker of proliferation activity of human peripheral lymphocytes. Immunol. Lett. 2002; 83: 67-72.
10. Bulycheva T.I., Deineko N.L., Artemenko E.G., Samoilova R.S., Zatsepina O.V Diagnostic significance of the nucleolar protein B23/nucleophosmin during chronic lymphoproliferative diseases. Terra Medica. Laboratornaya diagnostika. 2006; 2 (10): 16-21 (in Russian).
11. Bulycheva T.I., Deineko N.L., Artemenko E.G., Samoilova R.S., Zatsepina O.V. A method of forecasting of the development of chronic lympholeukosis according to the levels of the nucleolar protein B23/nucleophosmin in lysates of lymphoid cells. Patent RF N 2310201, 10.11.2007 (in Russian).
12. Koroev D.O., Shalgunov V.S., Vladimirova N.M., Lobanova N.V., Volkova T.D., Vol’pina O.M. A peptide that stimulates formation of specific antibodies against a monomeric form of nucleophosmin in tumor cells. Patent RF N 2401274, 06.04.2009 (in Russian).
13. Koroev D.O., Shalgunov V.S., Vladimirova N.M., Lobanova N.V., Volkova T.D., Vol’pina O.M. A peptide that stimulates formation of specific antibodies against an oligomeric form of nucleophosmin in tumor cells. Patent RF N 2401275, 06.04.2009 (in Russian).
14. Vladimirova N.M., Pisareva M.A., Zharskaya O.O., Deineko N.L., Bulycheva T.I., Volpina O.M. Tumor specific oligomeric forms of nucleophosmin. J. Cancer Sci. Ther. 2011; 3 (8): 205-12.
15. Shalgunov V.S., Lobanova N.V., Bulycheva T.I., Deineko N.L., Volkova T.D., Filatova M.P. et al. Antibodies against synthetic fragments of nucleophosmin for specific detection of monomeric and oligomeric forms. Bioorganicheskaya khimiya. 2009; 35 (6): 799-807 (in Russian).
16. Bulycheva T.I., Deineko N.L., Vol’pina O.M., Vadimirova N.M. Immunocytochemic visualization of monomeric and oligomeric forms of the nucleolar protein B23/nucleophosmin in human lymphocytes during proliferation. Immunologiya. 2011; 5: 231-6 (in Russian).
17. Bulycheva T.I., Deineko N.L. A method of immunocytochemic evaluation of the proliferative state of lymphocytes based on the patterns of expression of the C terminus fragment of the protein B23/nucleophosmin in the reaction of indirect immunofluorescence. Patent RF N 2438135, 27.12.2011 (in Russian).
Поступила 01.08.13 Received 01.08.13
- 72 -
