CC BY
33
С. А. Куклина, А. А. Мальщукова, профессор А. Г. Мешандин ОПТИМИЗАЦИЯ КОМПОНЕНТОВ ГИДРОЗОЛЬНЫХ ДИАГНОСТИКУМОВ
Кировская государственная медицинская академия
Гидрозольные препараты известны как экспресс
- диагностикумы для определения наличия антител и антигенов - маркеров различных нозологий [2].
Гидрозольные препараты представляют собой коллоидные растворы, на основе неорганических объектов - в частности, гексацианоферрата (II) железа (III), более известного под тривиальным названием "Берлинская лазурь". На поверхности микрочастиц данного препарата адсорбируются по определенной технологии различные биолиганды - антигены, либо - антитела против того или иного конкретного маркера. В результате появляется возможность проводить иммунохимические реакции и оценивать факт наличия того или иного маркера, связанного с тем или иным инфекционным либо соматическим заболеванием.
Гидрозольные диагностикумы имеют ряд важнейших преимуществ перед другими иммунохимически-ми препаратами: высокая специфичность (более 90%), длительные сроки хранения готовых препаратов, не требуют лиофилизации. Меньшая затрата времени на постановку анализа и простота считывания результатов дают возможность ставить реакции с малыми объемами биоматериала [6].
Гидрозольные препараты представляют собой коллоидные растворы частиц неорганической природы, на поверхности которых адсорбированы биоспе-цифические лиганды (антигены, антитела). Для того, чтобы повысить чувствительность реакции гидрозольной агглютинации, а также уменьшить время постановки анализа, необходимо определить оптимальное содержание компонентов гидрозольного препарата.
Поэтому целью настоящей работы является оптимизация компонентов гидрозольных препаратов для бесприборного экспресс-метода определения наличия антител и антигенов - маркеров различных нозологий.
Материалы и методы
При смешивании гидрозольных препаратов с биологической жидкостью, подлежащей тестированию (сыворотка крови, слюна, объекты смыва из окружающей среды и т.д.), в случае положительной реакции происходит агглютинация, видимая невооруженным глазом. Собственно постановка реакции гидрозольной агглютинации сводится к практическому выполнению закона коллоидной химии: при отрицательной реакции нет взаимодействия антигена с антителом, и раствор остается агрегативно устойчивым, сохраняя цвет раствора. В случае положительной реакции происходит взаимодействие антигена с антителом и как следствие - укрупнение коллоидных частиц и потеря ими агрегативной устойчивости (то есть выпадение в осадок видимых невооруженным глазом частиц агг-лютината) [1].
Саму постановку реакции гидрозольной агглютинации осуществляли следующим образом: производили сорбцию биолигандов на гидрозольном препарате, созданном на основе "Берлинской лазури" (коллоидный раствор гексацианоферрат (II) железа (III)), поверхность которого модифицирована катионом d -переходного металла [2]. В качестве биоспецифичес-
кого лиганда использовали комплексный туберкулезный диагностикум ППД, производства С.-Петербургского НИИ вакцин и сывороток им. Мечникова. Реакцию гидрозольной агглютинации осуществляли в хроматографической колонке. Во вспомогательном планшете осуществляли разведение "положительной" и "отрицательной" сывороток в буферном растворе в титрах 1:10. Далее сыворотки помещали в хроматографические колонки, после чего вносили равные аликвоты гидрозольного препарата. Время реакции - 30 секунд. Далее осуществляется визуальная оценка при помощи пористого нетканого материала, либо фильтровальной бумаги, либо хроматографической колонки с носителем.
Работа проводилась в несколько этапов: выбор оптимального твердофазного носителя; выбор модификатора для твердой фазы и оптимальной концентрации для осуществления реакции агглютинации; выбор и оптимизация состава разводящего буферного раствора; сопоставление различных способов проведения иммунохимического анализа с использованием гидрозольных препаратов для определения оптимального способа постановки реакции агглютинации и визуализации результатов.
Выбор оптимальных твёрдофазных носителей
В данной работе использовали гидрозольный препарат на основе коллоидного раствора гексацианоферрата (II) железа (III), более известного под тривиальным названием "Берлинская лазурь", - в качестве твердой фазы.
Его синтезировали по стандартной методике [7]. Раствор К4[Ге(СМ)6] при интенсивном перемешивании вводили в раствор Ге03 аналогичной концентрации.
З^е^] + 4ГеС1з 12КС1 + Ге4[Ге(С^]з
Указанный препарат интересен для использования прежде всего за счёт интенсивной и устойчивой окраски, высокой плотности и очень большой удельной поверхности. Высокая плотность препарата и приводит к быстрой агглютинации.
Определение оптимального модификатора для твёрдой фазы
Далее осуществляли взаимодействие исходной твёрдой фазы с модификатором, то есть смешивали раствор модификатора и соответствующее количество твёрдофазного носителя: Ге4[Ге(СМ)6]3. В качестве модификаторов, осуществляющих хемосорбцию белка по КН2-группе (преимущественно по лизину), и по 8Н- группе (по цистеину) с неорганической твёрдой фазой, использовали препараты, представленные в таблице.
Данные соединения d-переходных металлов способны адсорбироваться на поверхности твердой фазы и одновременно связывать белок в реакциях нуклеофильного замещения по КН2- и 8Н- группам.
При попытках использования хлорида хрома (III) и азотнокислого серебра получали гидрозоли, нормально дифференцирующие "+" и "-" сыворотки.
Хлорид ртути (II) I IgCI. /511 /Sv Prot + Hg2+ ► Pt /Hg SH ^S
Хлорид хрома (III) CrC’b /SH . /s\ . Prot + CrJ+ ► Pt / Cr SH 4 s'
Нитрат серебра AgNO, /SH + /s \ + Prot . + Ag1—► Pt Ag,+ SH \ s 7
Однако при хранении эти препараты теряли агрега-тивную устойчивость в течение суток. Следовательно, использование этих препаратов "extempore" приемлемо, но невозможно в задачах длительного хранения препаратов.
Наиболее оптимальным вариантом, проявляющим свойства гидрозольных препаратов, являются препараты, модифицированные катионом Hg2+.
Далее определяли оптимальную концентрацию модификатора. Были взяты следующие концентрации модификатора - 1,0%; 1,25%; 1,33%; 1,5%; 2,0%. Оптимальным вариантом концентрации модификатора при проведении реакции гидрозольной агглютинации оказалась - 1,25%, обеспечивающая четкую дифференциацию "+" и "-" сывороток.
Выбор и оптимизация состава разводящего буферного раствора
На поверхности микрочастиц данного препарата адсорбируются по определенной технологии различные биолиганды - антигены, либо - антитела против того или иного конкретного маркера. В качестве специфических биолигандов использовали комплексный туберкулезный антиген - диагностикум ППД. В качестве биологического материала - сыворотки от лиц с верифицированным диагнозом "туберкулез" и сыворотки от доноров.
Для раститровки сывороток использовали разводящий буферный раствор. При постановке реакции агглютинации исключительно важно обеспечить высокое значение константы аффинитета и авидности реагирующих между собой антигена и антитела. В свою очередь аффинитет и авидность напрямую зависят от типа жидкой фазы, то есть разводящего буфера, в котором и осуществляется иммунохимичес-кая реакция [4]. Следовательно, задача оптимизации буферного раствора: его природы, величины ионной силы - является необходимым элементом в создании иммунохимического препарата. Были опробованы буферные растворы в количестве 4 объектов: растворы KCl, NaCl в чистом виде и с добавлением поли-этиленгликоля (ПЭГ), производства фирмы "Сигме"
(США). Для оценки эффективности была проведена реакция гидрозольной агглютинации, в результате оптимальным вариантом разводящего раствора выбран раствор KCl, обеспечивающий наилучшую диф-ференцировку "+" и "-" сывороток.
Величина ионной силы буферного раствора была рассмотрена в количестве 5 объектов: ионные силы растворов - 0,5%; 0,9%; 1,0%; 1,2%; 1,3%. Оптимальным вариантом при проведении иммунохимического анализа оказались концентрации 0,9% и 1,0% раствора.
Выбор оптимального способа постановки реакции агглютинации
Гидрозольные препараты - это системы с прямой меткой, поэтому могут визуализироваться различными способами. Традиционным может быть способ получения данных путём постановки реакции на стекле [2].
Постановка реакции гидрозольной агглютинации на стекле предусматривает внесение образцов растит-рованной сыворотки и гидрозоля на стекло и размазывание препарата тонким слоем. За счёт естественного испарения происходит концентрирование раствора, что неизбежно приводит к потере коллоидным раствором агрегативной устойчивости. При этом в "положительных" и "отрицательных" реакциях характер этой потери будет различным. В случае грубодисперсных и мелкодисперсных суспензий наиболее показательные различия теоретически могут наблюдаться там, где частицы гидрозоля очень мелкие. Крупные частицы не способны перемещаться в тонком слое тестируемого раствора, размазанного по поверхности стекла, поэтому внешний вид реакций в "плюсе"-точка в центре капли, в "минусе"- "перевёрнутый зонтик", как показано на рисунке 1.
Недостатками данного способа постановки можно считать:
1. Длительное время учета результатов анализа.
2. Недостаточная чувствительность агглютинаци-онного иммунологического анализа. На результат анализа могут повлиять внешние факторы (например необработанная пластина и др.)
Рис. 1. Постановка реакции на стекле ("+" положительная сыворотка, отрицательная сыворотка)
«отрицательный» результат «положительный» результат
Рис. 2. Постановка реакции в хроматографической колонке
«отрицательный» результат
«положительным» результат Рис. 3. Визуализация результатов на фильтровальной бумаге
Указанные недостатки преодолеваются, если для постановки реакции агглютинации использовать не стеклянную пластину, а хроматографические колонки. В данные емкости помещают гидрозоль и тестируемую биологическую жидкость, тем самым устраняются недостатки - длительность постановки, влияние внешних факторов на постановку реакции гидрозольной агглютинации.
Регистрацию результатов осуществляют на пористых носителях: хроматографические колонки, нетканый материал и фильтровальная бумага.
Оценка результатов и их интерпретация на пористых носителях: при наличии достаточно высокого
титра антител в сыворотке больного наблюдалась задержка в пропитывании гидрозолем порошка, заполняющего хроматографическую колонку, в виде короткого столбика синего цвета. При отсутствии антител
- гидрозоль впитывается, что дает длинный синий столбик - отрицательный результат, как показано на рисунке 2. Время реакции - от 30 секунд до 2 минут.
Результаты на фильтровальной бумаге: при положительной реакции - плотный, компактный комплекс с четкой границей, диаметром 2-4 мм; отрицательная реакция - распределение частиц реагирующих веществ без четкой границы в виде пятна синего цвета, как показано на рисунке 3.
Представленные результаты указывают на возможность использования предложенного способа постановки анализа в диагностике различных соматических и инфекционных патологий.
Таким образом, в ходе проведенных исследований были выявлены: оптимальное содержание модификатора, тип буферного разводящего раствора, величина ионной силы буферного раствора, оптимальный способ постановки реакции гидрозольной агглютинации и визуализации результатов.
Благодаря оптимизации свойств компонентов гидрозольного препарата появляются такие необходимые качества, как высокая (более 90%) специфичность, длительность сроков хранения готовых гидрозольных препаратов, простота считывания результатов, возможность ставить реакции с малыми объемами биоматериала (сыворотка крови, слюна и т.д.), собственно препарата требуется для единичного анализа 2550 мкл, биоматериала - еще меньше - 1-5 мкл.
В результате получены рекомендации по синтезу и оптимальному применению гидрозолей, которые могут представлять интерес для практического здравоохранения, ветеринарии, промышленной биотехнологии и, возможно, спецслужб.
Список литературы
1. Медицинские лабораторные технологии. Справочник / под ред. проф. А.И. Карпишенко, С-Пб: Интермедика, 2002. - С. 217-227, 577-578.
2. Орлова О.Ю. Синтез гидрозольных препаратов на основе нерастворимых соединений d - элементов. Дисс. ... к. х. н. Киров, КГМА, 2005.
3. Петров Р.В., Хаитов Р.Н. и др. Оценка иммунологического статуса. Иммунологический мониторинг
- современные проблемы иммунологии и аллергологии // Иммунология. - 1994. - №6. - С. 74-76.
4. Попечителев Е.П. Методы иммунологических исследований. М.: Медицина, 1999. - 74 с.
5. Мешандин А.Г., Мальщукова А.А. Постановка реакции гидролизной агглютинации по тестированию вирусных нозологий на нетканом материале // Вятский медицинский вестник. - 2003. - №3. - С. 87-90.
6. Куклина С.А., Мешандин А.Г., Мальщукова А.А. Способ диагностики инфекционных заболеваний // Инф. лист ЦНТИ № 24-025-06, 2006.
7. Карякин Ю.В. Ангелов И.И. Чистые химические вещества. М.: Химия. - 1974.
Summary
S.A. Kuklina, A.A. Malchukova, A.G. Meshandin OPTIMIZATION OF COMPONENT INGREDIENTS OF HYDROSOL DIAGNOSTICUMS
Kirov state medical academy
The article presents possibilities of synthesis optimization of the diagnostic preparations - hydrosols. Optimal types of the modifiers, buffer solutions and ways of performance of immunochemical agglutination reactions and results visualizations were elaborated.
