CC BY
29
О.Ю. Орлова, профессор А.Г. Мешандин
СОПОСТАВЛЕНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ ТВЕРДЫХ ФАЗ ПРИ СИНТЕЗЕ ГИДРОЗОЛЬНЫХ ИММУНОХИМИЧЕСКИХ ДИАГНОСТИКУМОВ
Кировская государственная медицинская академия
Гидрозольные диагностические препараты являются перспективными препаратами широ кого спектра действия. Их возможными потре бителями могут быть: практическое здравоохра нение, ветеринария и биотехнология. Гидро зольные препараты дешевы в производстве. Для постановки с ними анализов не требуется каких- либо приборов и специального оборудования. Сама по себе диагностика занимает (теоретичес ки) от 15 мин. до нескольких секунд. Постанов ка может т\рои'зводупъся в иусловиях самой про стой лаборатории, типа лаборатории фельд шерско-акушерского пункта, в полевых уело виях, в кабинете практикующего врача и т.д. В связи с вышеизложенным очень важным пред ставляется выявить, какие конкретно из гидро зольных препаратов в наибольшей степени удовлетворяют всему комплексу перечислен ных требований. Гидрозольные препараты в своей основе имеют частички ультрадисперс ного материала с определенными заранее за данными свойствами, такими как плотность, удельная геометрическая поверхность, адсорб ционный потенциал по отношению к биоли- гандам и т.д. В свою очередь плотность, удель ная геометрическая поверхность, адсорбцион ный потенциал по отношению к биолигандам определяются химической природой исходной твердой дисперсной фазой.
Материалы и методы
Нами в качестве ультрадисперсной фазы были взяты СиО, Ге,03, Ге4|Те(С]М)6]гСинтез гидрозольных препаратов осугцеств лялся путем хемосорбционной пришивки биоли- ганда по N11, группе либо по сульфгидрильной группе. В качестве антигенов использовали ан тиген микобактерий туберкулеза, дифтерийный анатоксин, а в качестве модельного антигена - противокоревой человеческий у-глобулин. Реак ции гидрозольной агглютинации осуществляли постановку в двух вариантах: в Ц-образной лун ках пластмассового иммунологического план шета и на стекле.
Методы постановки реакции гидрозолыюй агглютинации
1. Метод постановки реакции в планшетах с 11-образными лунками.
В первый ряд лунок вносили конкретный бу ферный раствор для разведения сывороток, за тем в те же лунки добавляли сыворотку отрица тельную и положительную, раститровывали многоканальной пипеткой с первого ряда лунок, обычно с разведения 1:10 с двухкратным шагом, затем вносили готовый гидрозоль в каждую лун ку, последние лунки оставляли для контроля. Объем аналита и гидрозоля составлял во всех случаях 50 мкл.
2. Метод постановки реакции на предметном стекле.
На предметное стекло наносили при помощи пипетки две капли (по краям стекла) разведен ной сыворотки 1:10 положительной и отрицательной в количестве 25 мкл. Затем в капли добавляли 25 мкл готового гидрозоля, предварительно фракционированного 1:600 (в 10 мл физраствора разводили 600 мкл СиО), и растирали капли стеклянной палочкой.
Первым этапом нашей работы явился выбор наиболее оптимального носителя для реакции гидрозольной агглютинации. Интересные, с на шей точки зрения, носители представлены в табл. № 1.1.
Таблица №1.1
Некотооые ВИНЫ ПИГМ( Тип пигмента, формула нтов. поедставляюшие интеюес в кач Плотность, г/см3 гстве основ гидоозолыюагглютинани Размер частиц, нм энных диагностику мои Цвет
Желтая окись железа Ге20зН20 3,85-3,9 200-600 Желтый
Красная окись железа Ге203 4,80-5,0 300-1500 Красный
Цинковая белизна ZnO 5,45-5,65 150-5000 Белый
Свинцовые белила РЬО 6,40-6,80 500-12000 Белый
Титановые белила ТЮт 3,82-3,85 200-800 Белый
Черная окись железа (магнетит) Ге304 4,73 200-500 Черный
Технический углерод (сажа) С 2,7 (теоретически) 30-200 (в зависимости от типов) Черный
Железная лазурь Ре4|Те(С]\Г)61 1,92 80-200 Синий
Носители для иммуиохимических тестов дол жиы удовлетворять целому ряду требований: способность образовывать устойчивые коньюга- ты с белками - биолигандами, дешевизна, дос тупность препарата, экспрессность.
Обсуждение результатов
Выбор оптимального носителя проводили в модельной системе противокоревой у-глобу лин человека -мышиные антиглобулиновые сыворотки. Результаты постановки реакции в планшетном варианте представлены на рисун ке 1.1.
Результаты этого эксперимента позволили отказаться от основного ацетата железа (II) как препарата, не обеспечивающего достаточно вы сокую чувствительность анализа. Самое дли тельное время постановки реакции оказалось в случае с гексацианоферратом железа в виде геля. Время считывания реакции составляло 12 часов. Последнее обстоятельство может быть объясне но достаточно низкой плотностью частиц геля
■? 1200 1
-с
2 1000
п
|-в 800
>в 600
л 400
I
1-
ге а 200
ю
О 0
Ц 100 5 Б 80
60 40 20 0 X
н га а ю О
Я
Тип носителя 3 4 5 6 Тип носителя
Рис. 1.1. Влияние типа твёрдой фазы на чувствительность иммунохимической реакции (постановка в лунках 11-образного
планшета)
2- Ре,04
*3 Ре4|Те(С]\Г)6],
* время фиксации реакции 12 часов
4СиО
5- Бе,0,
6Ре(ОН),СН,СОО
по сравнению с плотностью частиц оксидов. Из наиболее интересних носителей для синтеза ко- ньюгатов мы выделили Ре,Ог Ре,04, СиО. Одна ко при дальнейшем рассмотрении нами был ис ключей Ре.04. т.к. исходная документация на его стандартизацию оказалась для нас малодоступ ной.
Обращает внимание тот факт, что при поста новке реакции на стекле не удалось достигнуть удовлетворительного результата с РелО . Это
Следующим этапом явилось сопоставление различных методов постановки реакции гидро зольной агглютинации. Была осуществлена по становка реакции с модельным антигеном на стекле и в лунках Ц-образного планшета. Ре зультаты представлены на рис. 1.2 и 1.3. При рассмотрении постановки на стекле можно кон- статировагь гораздо более быстрое время счи тывания результатов иммунохимических реак ций в сравнении с постановкой в планшете.
180 160 140 120 100 80 -60 40 -20 -о :
1 2 Тип носителя
Рис. 1.2. Время постановки реакции с различными видами твердых фаз при постановке в \3-образных планшетах. 1
РедреСОад 2-СиО
Рис. 1.3. Время постановки реакции на стекле
1- СиО,
2- РедреССВД
может быть объяснено тем, что при постановке на стекле Ре4|Ре(С]\Г).Т, находился в виде золя, СиО - в виде очень мелкодисперсного геля, а Бе,0, - в виде крупно-дисперсного геля. Исходя из первично поставленных опытов с модельным антигеном мы можем предварительно выделить: Бе,Ог СиО, Ре4|Ре(С]\Г).Тз в виде геля в качестве перспективных твёрдых фаз.
Исследование взаимодействия антител к диф терийному тоскину с анатоксином проводилось нами с использованием трёх оптимальных твёр дых фаз: Бе,03, СиО, Ре4|Ре(С]\Г).Т,. В качестве положительного контроля использовали пул сы вороток от пациентов, иммунизированных диф терийным анатоксином и имеющих в ИФА вы сокий титр противодифтерийных антител: 1/ 3200. В качестве отрицательной сыворотки ис пользовали пул сывороток детей, не имеющих в анамнезе прививки от дифтерии. Постановка ре акций с применением этих отрицательных сыво роток показала нулевой титр, т. е. отрицатель ная реакция не определялась даже при использо вании неразведённых сывороток.
С5-С5ЭЬ5К
35х
I- (0 а ю О
Рис. 1.4. Чувствительность реакции на стекле сРе№е(СМ).Т] (мг/мп)
Результаты этих постановок с положитель ной сывороткой в сопоставлении чувствительно сти реакции с изучаемыми твёрдыми фазами представлены на рис. 1.4 и 1.5.
1
250] 200 - 150 - юо- 50 0 Тип носителя
Рис. 1.5. Чувствительность постановки реакции в лунках П-образных планшет с Fe,OJU СиО
1.СиО
2.Ре,0,
Помимо чувствительности реакции гидро зольной агглютинации, решающим фактором в оценке качества диагностических иммунохими- ческих препаратов является время постановки реакции. Мы проводили сопоставление по вре мени проведения реакции на Ре,0, с использова нием Ц-образных планшетов и постановки реак ции на стекле с РеЛРе(С]М)1з в реакции агглюти нации. Результаты представлены в таблице 1.2.
Таблица 1.2 Время проведения реакции для оценки антител к дифтерийному анатоксину с
разными твердыми фазами
Т вердая фаза Ре203 Ре4|Те(С]М)6]з
Время 25-30 мин. 30 сек.-2 мин.
Исходя из данных этой таблицы, мы можем рекомендовать по комплексу иммунохимических характеристик Ре4|Те(С]М).Г, в качестве твёрдой фазы для синтеза коныогатов для оценки анти тел к дифтерийному анатоксину.
При исследовании и оптимизации реальной системы туберкулёзного антигена и его конью- гата с твёрдой фазой изучали все три носителя, раннее выбранные нами: Ре,03, СиО, Ре4|Те(С]М).Гу В качестве положительной сыво ротки использовали пул сывороток от больных туберкулёзом, заведомо с верифицированным диагнозом туберкулёз, который был подтверж дён высеиванием из выделений больных мико- бактерий туберкулёза. В ряде случаев использо вали данные постановки реакции ИФА для вы явления антител к данной нозологии. В качестве отрицательного контроля использовали пул нормальных донорских сывороток, показавших в реакции ИФА с тест-системой на выявление антител к т-1иЬегси1ез1з отрицательный резуль тат. Опытные данные, относящиеся к сопостав лению эффективности твёрдых фаз, представле ны на рис. 1.6 и 1.7.
Как и в случае с ранее рассматриваемыми ре альными диагностикумами на дифтерию, отме чали существенную разницу во времени поста новки реакции. Все эти данные приведены в таб лице 1.3.
Таблица 1.3 Время проведения реакции для опенки антител к микобактериям туберкулёза
Тип Ре203 СиО Ре4|Те(С]М)6]з
твердой
фазы
Время 15- 20мин 15- 20мин 20сек.-1мин
Результаты этого сопоставления указывают на выбор Ре4|Те(С]М)6]з в качестве наиболее оп тимального носителя в синтезе твёрдофазных конъюгатов с заранее заданными иммунохими- ческими свойствами.
Выводы
Таким образом, исходя из представленных опыт ных данных можно сделать следующие заключения:
1.Наиболее оптимальным твёрдофазным носите лем является Ре4[Ре(СЫ)1г обеспечивающий в случае диагностики туберкулёза и факта наличия антител к дифтерийному анатоксину проявления анализа в те чение 30 сек.-1 мин.
2Те,Ог СиО оказались менее эффективными но сителями, для постановки реакции с ними требуется 15-20 мин., а также постановка в дорогих и дефицит ных иммунологических планшетах.
3.Постановка реакции на стекле по своей просто те и лёгкости интерпретации результатов с Ре4[Ре(СЫ)1, находится вне конкуренции
Литература
1 Мешандин А.Г. Гидрозольные препараты в ди агностике различных инфекционных и соматических патологий // Паллиативная медицина и реабилита ция. № 1. - 1997. - № 1 - С. 21-23.
Тип носителя
Рис. 1.6. Чуестеителъностъ различных твёрдых фаз при постановке в лунках 11-образного планшета 1- Ре,0, 2 СиО Мешандин А.Г ФиЗИКО-ХИМИЧеСКИе ЭСПеКТЫ СОрбцИОННЫХ ГфОЦеССОВ При СИНТезе биолигандов Дисс... докт. технических наук, 1994, - 216 с.
