CC BY
20ХИМИЧЕСКИЕ НАУКИ
УДК 591.133:577.15:599.723.2
ОПТИМИЗАЦИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДА Г.А. КОЧЕТОВА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ФЕРМЕНТА АЛКОГОЛЬДЕГИДОРОГЕНАЗЫ
ИЗ ПЕКАРСКИХ ДРОЖЖЕЙ
Н.В. Парфентьева
Тверской государственный университет
Произведена модификация применяемой методики Г.А. Кочетова выделения и очистки фермента алкогольдегидрогеназы (АДГ) из пекарских дрожжей. Выявлено следующее: использование буферных растворов рН 6,0 и 7,5, проведение экстракции двухзамещенным фосфатом натрия и тепловой обработки при 35°С позволило усовершенствовать методику Кочетова и увеличить концентрацию АДГ с 0.0235 г/мл до 0,0357 г/мл (почти в 1,5 раза), сохранив при этом ее активность. Ключевые слова: алкогольдегидрогеназа (АДГ), пекарские дрожжи, выделения и очистки фермента, экстракция, тепловая обработка, фракционирование ацетоном, кристаллизация, перекристаллизация, активность ферментов, калибровочная зависимость
Введение. Начальный этап выделения ферментов - это получение экстрактов из предварительно измельченного биологического материала. Будучи выделенными из клетки без повреждения нативной структуры, ферменты сохраняют свою активность, что делает возможным их использование в бесклеточных реакциях. Нами использован один из методов выделения и очистки фермента алкогольдегидрогеназы - метод Г.А. Кочетова. Следует отметить, что большинство ферментов являются лабильными белками, поэтому при выделении и очистке ферментов необходимо соблюдать целый ряд условий, предотвращающих их денатурацию и инактивацию под действием различных факторов [1,4,6].
Рис. Схема выделения и очистка АДГ из пекарских дрожжей по методу Г.А. Кочетова (1998)
с собственными изменениями [5]
Процесс выделения и очистки фермента заключался в следующем (рис.): в первую очередь подготовили исходный материал, измельчив и высушив пекарские дрожжи (1кг) при
комнатной температуре. Затем провели экстракцию, залив 200 г сухих дрожжей 600 мл двузамещенного фосфата натрия с последующим центрифугированием для того, чтобы разрушить клеточную оболочку фермента и извлечь его из клетки. Далее вели тепловую обработку алкогольдегидрогеназы при температуре 35 °С и фракционирование ацетоном в целях избавления от лишних балластных белков, вызвав их денатурацию и коагуляцию, а затем применили кристаллизацию АДГ из раствора сульфата аммония и перекристаллизацию.
Подготовка исходного материала. Свежие пекарские дрожжи измельчали и сушили на воздухе при комнатной температуре. Дрожжи высохли через 5 дней. Хранили их в холодильнике в герметически закрытой посуде.
Экстракция. 200 г сухих дрожжей залили 600 мл двузамещенногогидрофосфата натрия, поместили на 2 ч в водяной термостат при 37°С (перемешивая до получения однородной суспензии), оставили на 3 ч при комнатной температуре и затем центрифугировали 30 мин при 18 000 g.
Тепловая обработка. Центрифугат нагревали до 35°С в водяной бане на 70-75°С, помещали на 15 мин в водяной термостат при 55°С, охлаждали во льду, центрифугировали 7 мин при 40 000 g и осадок отбрасывали. Центрифугат хранили в холодильнике.
Фракционирование ацетоном. Центрифугат помещали в ацетоновую баню на -4°С - (-8°С) и добавляли к нему предварительно охлажденный до -5°С ацетон из расчета 50 мл на каждые 100 мл дрожжевого экстракта. Температура ферментного раствора при этом была быстро понижена до -2°С.
Центрифугировали при -2°С 5 мин при 18 000 g и к центрифугату, как и в первый раз, добавляли еще ацетон - 55 мл на каждые 100 мл дрожжевого экстракта. Центрифугировали 5 мин при -2°С и 40 000 g, осадок суспендировали в 40 мл холодной бидистиллированной воды и диализировали при перемешивании 3 ч против 1 л фосфатного буфера с его четырехкратной сменой[2].
Кристаллизация. Осадок, выпавший при диализе, удаляли центрифугированием в течение 5 мин при 40 000 g. К центрифугату медленно, при перемешивании, добавляли сульфат аммония (3,6 г на каждые 10 мл) и через 20 мин центрифугировали 15 мин при 40 000 g. Осадок растворяли в 15-20 мл холодной бидистиллированной воды, добавляли сульфат аммония (2 г на каждые 10 мл) и центрифугировали 10 мин при 40 000 g. К центрифугату при осторожном перемешивании медленно в течение нескольких часов добавляли сульфат аммония до 0,6 насыщения.
Перекристаллизация. Суспензию кристаллов центрифугировали 15 мин при 40 000 g, осадок растворяли в минимальном объеме холодной бидистиллированной воды и медленно, при помешивании, добавляли насыщенный раствор сульфата аммония до 0,4-0,5 насыщения. После окончания кристаллизации суспензию центрифугировали 15 мин при 40 000 g, осадок суспендировали в небольшом объеме сульфата аммония 0,5 насыщения и хранили в холодильнике [3].
Далее определяли содержание общего белка по биуретовой реакции. По интенсивности окрашивания, которое пропорционально количеству белка, определяли его содержание в пробе. Развитие окраски обусловлено наличием в белке пептидных связей [1]. Провели расчет по калибровочной кривой концентрации АДГ (0,0357 г/мл) по величине значения оптической плотности (0,50 опт. ед.) при длине волны 540 нм.
Таким образом, модификация применяемой методики заключалась в следующем: использовали буферные растворы рН 6,0 и 7,5, экстракцию проводили двухзамещенным фосфатом натрия, тепловую обработку вели при 35°С. Усовершенствование методики Кочетова позволило увеличить концентрацию АДГ с 0.0235 г/мл до 0,0357 г/мл (почти в 1,5 раза) и сохранить ее активность.
Список литературы
1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. - М.: Медицина, 1998. - 398
с.
2. Сладков А.З. Таблицы буферных растворов // Заводск. лаб. - 1997. - Т. 35. -№9. - С. 1146-1148.
3. Практикум по биохимии / под ред. С.Е. Северина, Г.А. Соловьевой. - М.: Моск. гос. ун-т, 2007. - 288 с.
4. Досон М., Элиот Д. Справочник биохимика. - М.: Мир, 1991. - 543 с.
5. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. - М.: Высшая школа, 1998. - 267 с.
6. Рогожин В.В., Говорова Т.П. Очистка и некоторые свойства алкогольдегидрогеназы растений // Этанол и его метаболизм в высших организмах. - Якутск, 1995. - С. 14-19.
Сведения об авторе
Парфентьева Наталья Владимировна - кандидат биологических наук, доцент кафедры биохимии и биотехнологии химического факультета Тверского государственного университета, e-mail: [email protected].
OPTIMIZATION USING THE METHOD OF G.A. KOCHETOV FOR ISOLATION AND PURIFICATION OF ALCOHOLDEHYDROGENASE FROM BAKER'S YEAST
N.V. Parfenteva
Tver State University
The initial stage of enzyme extraction is the production of extracts from pre-crushed biological material. Being isolated from the cell without damaging the native structure, enzymes retain their activity, which makes it possible to use them in cell-free reactions.
Keywords: alcoholic dehydrogenase (ADH), Baker's yeast, enzyme isolation and purification, extraction, heat treatment, acetone fractionation, crystallization, recrystallization, enzyme activity, calibration dependence.
References
1. Berezov T.T., Korovkin B.F. Biologicheskaya himiya. - M.: Medicina, 1998. - 398 s.
2. Sladkov A.Z. Tablicy bufernyh rastvorov // Zavodsk. lab. - 1997. - T. 35. - №9. -S. 1146-1148.
3. Praktikum po biohimii / pod red. S.E. Severina, G.A. Solov'evoj. - M.: Mosk. gos. un-t, 2007. - 288 s.
4. Doson M., Eliot D. Spravochnik biohimika. - M.: Mir, 1991. - 543 s.
5. Kochetov G.A. Prakticheskoe rukovodstvo po enzimologii. - M.: Vysshaya shkola, 1998. - 267 s.
6. Rogozhin V.V., Govorova T.P. Ochistka i nekotorye svojstva alkogol'degidrogenazy rastenij // Etanol i ego metabolizm v vysshih organizmah. - Yakutsk, 1995. - S. 14-19.
About author
Parfentieva N.V. - Ph. D. in Biological Sciences, Associate Professor of the Department of Biochemistry and Biotechnology of the Faculty of Chemistry of Tver State University, e-mail: [email protected].
