CC BY
45
УДК 577.152.31 : 577.164.111
СРАВНИТЕЛЬНАЯ КИНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТИАМИНКИНАЗ ИЗ ПИВНЫХ ДРОЖЖЕЙ И ГОЛОВНОГО МОЗГА СВИНЬИ
И. П. Черникевич, д.х.н, профессор Кафедра общей и биоорганической химии УО «Гродненский государственный медицинский университет»
Методами ацетонового и аммонийного фракционирований, ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-тойо-перле 650М, гель-фильтрации на сефадексе G-100 и аффинной хроматографии на голубой сефарозе из мозга свиньи выделена электрофоретически гомогенная тиаминкиназа с суммарным выходом 15% и степенью очистки 2240раз. По физико-химическим и кинетическим параметрам мембранно-ассоциированная тиаминкиназа из мозга существенно не отличается от одноимённого цитозольного белка из пивных дрожжей: имеет оптимум рН 8,6, молекулярную массу 52,8 ±1,2 кДа, металл-зависима и состоит из двух идентичных субъединиц. KS для свободных ионов магния и Km для тиамина и комплексаMg • А ТФ2- соответствует внутриклеточному содержанию их в мозге. Исходя из свойств тиаминовых ферментов, высказано предположение, что тиаминкиназа животных и микроорганизмов выполняет роль буферной системы, препятствующей немедленным изменениям концентраций активных форм витамина и обеспечивающей постоянство скорости сопряжённых реакций, использующих исходный общий кофактор - тиаминдифосфат.
Ключевые слова: тиаминкиназа, мозг, пивные дрожжи, параметры.
Employing the methods of acetone and ammonium sulfate fractionation ion exchange chromatography on a DEAE Toyoperl 650M, gel-filtration of Sefadex G-100 and affin chromatography on blue sepharose, the electrophoretically homogenous 15% thiamine kinase having 2240 times as high the degree of purity has been extracted from the swine brain. By physicochemical and kinetic parameters the membrane-associated thiamine from the brain does not differ greatly from similar cytosol proteine from beer yeast: it has optimum 8.6 pH, molecular mass 52.8±1.2 kDa, it is metal-dependent and consists of two subunits. Ks for free ions of magnesium and Km for thiamine and Mg • А TP2- complex correspond to their intracellular content in the brain. On the basis of thiamine enzymes properties it has been assumed that thiamine kinase of animals and microorganisms serve as a buffer system which hinders immediate changes in concentrations of vitamin active form and provides the permanent rate of conjugated reactions using the initial common cofactor - thiamine diphosphate.
Key words: thiamine kinase, brain, beer yeast, parameters.
Биосинтез коферментной формы витамина В1 - тиа-миндифосфата (ТДФ) - осуществляется тиаминкиназой (АТФ: тиаминдифосфотрансфераза; КФ 2.7.6.2), катализирующей двухсубстратную реакцию переноса дифос-фатной группировки от молекулы АТФ на тиамин: АТФ + тиамин ^ ТДФ + АМФ.
Гомогенные препараты фермента выделены с низким выходом из печени крыс [10], листьев петрушки [11], пивных дрожжей [1]. Белковые системы синтеза фосфатов тиамина нервных клеток практически не исследованы, хотя дифосфорному эфиру, вместе с тиаминтрифос-фатом, отводится важная роль в свете решения проблемы биоэлектрогенеза и физиологии нервного импульса [2, 8]. При дифиците этих соединений в мозге развиваются дегенеративные изменения нервов с сопутствующими нарушениями сердечно-сосудистой регуляции, функции желудочно-кишечного тракта, водно-солевого обмена и др. [3].
Задача настоящей работы - очистка тиаминкина-зы из мозга свиньи до электрофоретически гомогенного состояния и сравнительная характеристика физико-химических и кинетических параметров молекул белка из пивных дрожжей и ткани мозга.
Материалы и методы
Для получения препарата тиаминкиназы свежий, отмытый от крови мозг свиньи освобождали от сосудов, измельчали, продавливали через пресс с диаметром пор 1 мм, заливали охлаждённым до -20ОС ацетоном (мозг/ ацетон - 1/10) и гомогенезировали в стеклянном гомогенизаторе 30 с при 5000 об/мин. Ацетон немедленно удаляли, а белок просушивали при 4ОС на бумажных фильтрах до порошкообразного состояния.
4 г высушенной биомассы мозга повторно гомогенезировали с 60 мл 0,05М трис-НС1 буфера рН 7,4, содержащего 0,01% тритон Х-100 и 0,2 мМ ЭДТА, после чего центрифугировали в течение 30 мин. при 20000 q и 1 ч при 105000. Тиаминкиназу надосадочной жидкости осаждали сульфатом аммония, собирая белок в интервале 5080% насыщения. Полученный осадок растворяли в минимальном объёме 0,02М трис-НС1 буфера рН 7,4, содержащего 0,05М №С1, 0,2мМ ЭДТА, и диализовали (12 ч) против этого же буферного раствора. Диализован-ный препарат в дальнейшем очищали методом колоночной хроматографии (1,3 х 70 см) на носителе ДЕАЕ-тойо-перл 650М, уравновешенном 0,02М трис-НС1 буфером рН 7,4, с 0,05М №С1, 0,2мМ ЭДТА и 20%-м глицерином. Связавшийся белок элюировали линейным возрастающим градиентом №С1 от 50 до 400 мМ (по 150 мл в каждой камере) в этом же буфере со скоростью потока 18 мл/ч. Фракции, элюируемые при концентрации соли 69-77 мМ, объединяли, концентрировали против поли-этиленгликоля и хроматографировали на колонке (2 х 65 см) с сефадексом G-100 в вышеописанном буфере при скорости потока жидкости 24 мл/ч. Элюаты с наиболее высокой активностью фермента объединяли, после чего добавляли глицерин до его конечной концентрации 40%. В результате удельная активность тиаминкиназы, по сравнению с исходным экстрактом, возрастала в 946 раз.
На заключительной стадии очистки нами использованы гидрофобные и слабые катионообменные свойства триазинового красителя цибокрона голубого F3GA. Объединённый после гель-фильтрации элюат белка наносили на колонку (0,8 х 3,4 см) с голубой сефарозой, уравновешенной 0,02М трис-НС1 буфером рН 8,2, содержащим 0,05М №С1, 0,2мМ ЭДТА и 40% глицерин. Объём резер-
вуара и смесителя по 15 мл, скорость элюции - 12 мл/ч. В подобранных нами условиях тиаминкиназа не связывалась с носителем, в отличие от сопутствующих примесных белков. Полученный препарат фермента являлся хро-матографически (рис. 1) и электрофоретически (рис. 2) гомогенным. Результаты разработанного способа выделения и очистки белка обобщены в таблице 1, откуда следует, что наряду с цитозольными макромолекулами ки-наз из листьев петрушки [11] и пивных дрожжей [1], с хорошим выходом может быть получена и мембранно-ассоциированная тиаминкиназа из мозга свиньи. На мембранную локализацию фермента указывает значительное повышение выхода белка (3,2 раза) после внесения в среду выделения неионного детергента тритона Х-100, сохраняющего нативность структур органелл клетки, но подавляющего гидрофобную сорбцию макромолекул, и невозможность экстракции тиаминкиназы без предварительной стадии ацетонового фракционирования. Подтверждением мембранной ассоциации может служить и низкая устойчивость белка в отсутствие вязкой среды -40% глицерина.
Ог»0.5 г £
0.4 | 0,3
0.1 ; о
0 5 3 3 4 5 6 № фракции
Рисунок 1 - Хроматография препарата на голубой сефарозе: 1 - выход белка, 2 - выход активных фракций тиаминкиназы
Активность тиаминкиназы определяли по скорости образования тиаминдифосфата [5]. Реакционная смесь содержала 2 ■ 10-3М АТФ, 2 ■ 10-5М тиамина, 2 ■ 10-3М трис-НС1 буфера рН 8,6, 1 ■ 10-2М MgSO4 и 20-30 мкг препарата белка в общем объёме 1 мл. В качестве контроля использовали те же ингредиенты, к которым добавляли 20-30 мкг предварительно денатурированного фермента. Удельную активность выражали в наномолях тиаминдифосфата, образовавшегося за 1 ч при 37оС в расчёте на 1 мг белка. Концентрацию белка находили по методу Ло-ури и по поглощению в УФ-области при 280 нм.
При расчёте скорости ферментативной реакции использовали стационарные участки кинетических кривых. Концентрацию свободных ионов металла рассчитывали путём решения квадратного уравнения:
с2 - (М+^ + 1/к,) • с+мt ■ ^=0,
где С - концентрация комплекса металл ■ АТФ2-, М4 - общая концентрация металла, St - общая концентрация АТФ, К - константа диссоциации комплекса, с подстановкой полученного значения в выражение: М(. = Mt - С, где М(. - концентрация свободного металла.
Электрофорез белка (10-30 мкг) в 7% и 10%-м полиак-риламидных гелях выполняли по Орнстейну и Дэвису [4] при рН 8,9 в течение 5 ч при силе тока 20 мА в первые 60 мин,, а затем 40 мА на пластинку. Белковые полосы проявляли 0,1%-м кумасси R-250 на 30% ТХУ в течение 20-30 мин. Окрашенные гели отмывали 7% уксусной кислотой и хранили в смеси: метанол-вода-глицерин-ледяная уксусная кислота в соотношении 50 : 50 : 20 : 1. Молекулярную массу тиаминкиназы рассчитывали по калибровоч-
12 5 4 5 6
' -
Рисунок 2 - Гель электрофорез препаратов тиаминкиназы из мозга свиньи в 7%-м полиакриламидном геле: 1 — исходный экстаркт, 2 — фракционирование сульфатом аммония, 3 — ионообменная хроматография, 4 — гель-хроматография, 5 — аффинная хроматография, 6 — молекулярные массы (Мг) белков-маркёров (135, 94, 69, 57, 43 кДа)
ному графику, выражающему зависимость логарифма молекулярной массы от относительной подвижности стандартных белков-маркеров.
Результаты и их обсуждение
Очищенная в 2240 раз тиаминкиназа (таблица 1) нестабильна при хранении. Её активность оставалась без изменений в пределах 2-3-х суток при температуре 4-6ОС в 40% глицерине. Согласно удельной активности высоко-очищенного фермента, максимальное количество синтезированного в среде ТДФ не превышало 10-7М, тогда как концентрации взятых в реакцию АТФ и тиамина составили 10-3 и 10-5М, соответственно. Поскольку состояние равновесия системы не достигалось, тиамаинкиназ-ная реакция протекает пропорционально времени инкубации. В наших опытах скорость биосинтеза ТДФ оставалась пропорциональной времени в течение 2 ч (таблица 2). Линейный характер зависимости скорости реакции от концентрации фермента в пробе соблюдался до 160 мкг. В указанных интервалах поддерживается стационарность состояния системы, что важно для сравнительной характеристики ферментов.
Почти все тиаминовые киназы активируются ионами двухвалентных металлов. Лучшими эффекторами являются Mg2+, Мп2+ и Со2+, причём для фермента из печени крыс наиболее предпочтительны ионы Mg2+ [10], а из пекарских дрожжей - Мп2+ [9]. Активация Мп2+ характеризуется выраженным максимумом при концентрации 3,3 • 10-3М. Увеличение содержания металла приводит к резкому ингибированию тиаминкиназы [9]. Ионы Mg2+ даже в концентрации 5 • 10-2М не давали такого эффекта. Биосинтез ТДФ в мозге свиньи также нуждается в присутствии двухвалентных катионов (таблица 2). По способности к активации катионы металлов располагаются в следующем порядке: Мп2+ > Mg2+ > Са2+ > Со2+ > Fe2+ > №2+. Мп2+ в малых концентрациях (5 • 10-4М) активирует тиаминкиназу мозга даже намного больше, чем Mg2+. Дальнейшее увеличение содержания Мп2+ приводит к угнетению ферментативной активности, а Mg2+ - к резкой её активации. Оптимальная концентрация Mg2+, по отношению к АТФ, в среде инкубации составляет 4 : 1, Мп2+ - 1 : 1.
С увеличением величины этого отношения скорость биосинтеза кофермента падает.
Как видно из рис.3, кривая зависимости начальной скорости тиаминкиназной реакции от концентрации общего Mg2+ носит S-образный характер (кривая 1) и не спрямляется в системе двойных величин (кривая 3). Ко-
Таблица 1 - Схема выделения и очистки тиаминкиназы из мозга свиньи
Стадия очистки Общее содержание белка, мг Общая активность, -1 нмоль•ч Удельная активность -1 -1 нмоль•ч • мг Степень очистки Выход, %
Исходный экстракт 42476±147 8920±24 0,21±0,02 1,0 100
Ацетоновое фракционирование* 12000±61 9200±16 0,77±0,01 3,7 103
Аммонийное фракционирование 4306±39 5600±21 1,3±0,01 6,4 63
Ионообменная хроматография на ДЕАЕ-тойоперле 650М 93±12 2976±17 32± 1,3 152 34
Гель-хроматография на сефадексе G-100 10±0,7 1970±11 198±9 946 23
Хроматография на голубой сефарозе 2,9±0,1 1369±8 472±13 2240 15
* Увеличение выхода после ацетонового фракционирования связано с удалением фосфатаз.
Таблица 2 - Сравнение характеристик и кинетических параметров мембранно-ассоциированной тиаминкиназы из мозга свиньи и цитоплазматической тиаминкиназы из пивных дрожжей: 37оС, 10 мМ трис-НС1 буфер рН 8,6
Параметры Тиаминкиназа мозга Тиаминкиназа дрожжей
Молекулярная масса нативного фермента, кДа 52,8 ±1,2 96 ± 5
Молекулярная масса (кДа) и число субъединиц 26 (2) 23 и 26 (4)
V макс., М • с-1 2,76 1,97
к кат., 10-1, с-1 0,84 0,6
Активность, нмоль • ч -1 • мг -1 472 400
Кт для тиамина • 10-6, М 0,72 6
Кт для комплекса Mg • АТФ-2 • 10-4, М 8,3 10
К для Mg2+ • 10-4, М 4 9,8 - 10
Оптимум рН 8,6 8,6 - 8,8
Ионы - активаторы Мп2+, Mg2+, Са2+, Со2+, Fe2+, Ni2+ Мп2+, Mg2+, гл 2+ Со
Устойчивость при 4оС, сут. 2 - 3 4 - 5
Линейность от времени, ч 2 4
Линейность от концентрации белка, мкг 160 410
Рисунок 3 - Зависимость начальной скорости тиаминкиназной реакции от концентрации общего (1,3) и свободного (2,4) Mg2+ в прямых (1,2) и двойных обратных координатах (3,4). Концентрация АТФ 8 ■ 10- 4 М
эффициент Хилла пн , характеризующий степень S- образности, составляет при этом 1,9. Аналогичная зависимость для свободных ионов Mg2+, вне комплекса Mg • АТФ-2, представляет собой гиперболу (кривая 2) хорошо линеаризующуюся в координатах : 1/[ Mg2+] (кривая 4) с коэффициентом кооперативности 1,0. Это позволяет рассчитать константу диссоциации для свободных катионов, которая была в пределах истинного содержания Mg2+ в мозге и равнялась 4 • 10-4М (таблица 2). Полная линеаризация кинетической кривой и снижение величины пн от 1,9 до 1,0 свидетельствует, что молекула тиаминкиназы содержит участок сорбции свободного Mg2+, присоединение к которому не оказывает заметного воздействия на связывание субстратного комплекса Mg • АТФ-2 в активном центре.
Определение оптимальных значений рН тиаминкиназ-ной реакции при насыщающих концентрациях ионов
металлов показало, что для Mg2+ и Мп2+ наибольшая активация наблюдается при рН 8,6 (таблица 2). Это предполагает, что «истинным» субстратом фермента является комплекс металл • АТФ, причём Mg2+ обладает более слабой способностью к хелатированию. Содержание хелатного комплекса зависит от рН и природы иона активатора. Очевидно, при высоких концентрациях ионов металла образуется неактивный комплекс металл2 • АТФ, как это происходит в случае тиаминки-назы из пекарских дрожжей [9], что будет вести к уменьшению содержания «истинного» субстрата металл • АТФ, либо к нарушению взаимодействия субстрата с ферментом.
Для зависимости начальной скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата - Mg • АТФ-2, при соотношении ^2+] / [АТФ4-] = 1, также характерна S-образность. В данном случае характер кривой определяется содержанием активатора (Mg2+) в среде инкубации. Увеличение содержания активатора приводит к уменьшению величины И05 для субстрата, с одновременным снижением степени S-образности. В присутствии избытка ионов магния, при [Mg2+ ] / [АТФ4-] > 4, сигмоидная кривая трансформируется в гиперболическую с кажущейся Кт для комплекса Mg • АТФ-2, равной 8,3 • 10-4 М (таблица 2). Насыщение тиаминкиназы вторым субстратом - тиамином, - наблюдается при более низких концентрациях - кажущаяся Кт 7,2 • 10-7 . Обе величины близки к аналогичным характеристикам для фермента из других источников [1, 7, 9] и приблизительно соответствуют физиологическому содержанию субстратов в тканях мозга.
В плане регуляции метаболизма витамина В1 важно проследить за состоянием молекулы фермента при воздействии на неё лигандов, поскольку известно, что тиа-минкиназа из пивных дрожжей представлена ассоции-рующе-диссоциирующей системой олигомеров, состояние равновесия между которыми определяется концентрациями тиамина, связанного с обменом тиамина пи-рувата и ионов двухвалентных металлов [6] . Анализ скорости биосинтеза ТДФ тиаминкиназой из мозга свиньи показывает (рис. 4, кривая 1), что преинкубация белковой молекулы с 3.6 мкМ тиамином приводит к активации ферментативного процесса, при этом время полуперехода (^/2 = 9,7 мин) существенно превосходит величину, которую можно ожидать, исходя из кинетики образования фермент-субстратного комплекса. Ни АТФ, ни Mg • АТФ-2, в условиях эксперимента (кривая 2), не оказывали воздействия на интенсивность биотрансформации витамина.
Для выяснения вопроса, влияет тиамин на степень олигомеризации или конформационное состояние белка нами определена молекулярная масса тиаминкиназы гель-фильтрацией через сефадекс G-100. Как видно из
Рисунок 4 - Зависимость относительной скорости тиаминкиназой реакции (v/vj от времени преинкубации фермента с тиамином (1), АТФ или комплексом Mg • АТФ-2 (2). 30°C; 0,02 М трис-HCl буфер рН 8,6
рис. 5, она составляет 52800±1200. Аналогичная характеристика для частично очищенного фермента из печени крысы равна 57000±2000 [1], а из Paracoccus dinitrificans - 44000 [12]. Для фермента из листьев петрушки (гомогенный препарат) эта величина составила 30000 [11]. Принципиальным для данной ситуации, вероятно, является то, что в первых двух источниках тиаминкиназа представлена каталитически активными димерными формами, диссоциирующими на мономеры с массами 28000 и 23000, соответственно, а в последнем - одной функциональной цепью. Сопоставление молекулярных масс уже известных киназ позволяет полагать, что фермент из мозга также будет характеризоваться четвертичной структурой.
Рисунок 5 - Определение молекулярной массы нативной тиаминкиназы из мозга свиньи методом гель-фильтрации (а). Белки-маркеры:
1 — цитохром С (Мг 12400); 2 — трипсин (Мг 23800); 3 - пероксидаза (Мг 44000); 4 - гемоглобин - (Мг 67000); 5 — лактатдегидрогеназа (Мг 135000)
Рисунок 6 - Электрофорез денатурированного додецил-сульфатом натрия белка в 10% полиакриламидном геле:
1 — белки-маркеры; 2 — тиаминкиназа после хроматографии на голубой сефарозе
Электрофорез в 10% полиакриламидном геле предварительно денатурированного 2% додецилсульфатом натрия (20 мин. при 100°C) белка в присутствии следующих стандартов: цитохрома С (Mr 12400), гемоглобина (Mr 15500), а-химотрипсингена (Mr 25700), овальбумина (Mr 45000), пируваткиназы (Mr 57000) и человеческого сывороточного альбумина (Mr 67000) показал, что масса его мономера равна 26000 Да. Полученные данные свидетельствуют, что в мозге свиньи тиаминкиназа находится в виде двух идентичных субъединиц.
Таким образом, по своим физико-химическим и кинетическим параметрам фермент из мозга свиньи существенно не отличается от аналогичных белков из других источников, однако мембранная ассоциация молекулы требует осторожного подхода в интерпретации результатов эксперимента в ситуации in vivo. Кроме того, имеющиеся данные о структуре тиаминкиназы [1,5], относительно медленные внутримолекулярные переходы её под действием субстратов, кофакторов и эффекторов [6], а также катализ начального этапа биотрансформации тиамина до его коферментной формы позволяют говорить про фермент как про буферную систему, которая препятствует мгновенным изменениям других фосфорили-рованных производных витамина и обеспечивает постоянство скорости сопряжённых реакций, которые используют общий исходный метаболит - ТДФ. Существование такой буферной системы, вероятно, служит одним из механизмов регуляции зависимых от обмена тиамина метаболитов в клетке.
Литература
1. Воскобоев, А.И. Биосинтез, деградация и транспорт фосфорных эфиров тиамина / А.И. Воскобоев, И.П. Черникевич. -Минск.: Наука и техника, 1987. - 200 с.
2. Макарчиков, А.Ф. Тиаминтрифосфат и ферменты его гидролиза в биохимических объектах.: автореф. дис...докт. биол. наук: 03.00.04 / А.Ф. Макарчиков. - Минск - 2008. - 43 с.
3. Макарчиков, А.Ф. Тиаминтрифосфат: новый взгляд на не-коферментную функцию витамина В1 /А.Ф. Макарчиков. - Минск: Белорусская наука, 2008. - 433 с.
4. Остерман, Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие) / Л.А. Остерман. - М.: Высшая школа, 1981. -286 с.
5. Черникевич, И.П. Ферментные системы биотрансформации активных форм витамина В1 (структура, свойства, регуляция). : автореф. дис. . докт. хим. наук: 03.00.04 / И.П. Чернике-вич. - Минск. - 1996. - 35 с.
6. Черникевич, И.П. Влияние субстратов, кофакторов и эффекторов на структуру и динамику тиаминкиназы из пивных дрожжей./ И.П. Черникевич, А.А. Маскевич, Г.А. Гачко // Биоорганическая химия. - 1992. - Т. 18, N 4. - C.509-530.
7. Deus, B. Subcellular distribution of thiamine pyrophosphakinase activity in rat liver and erythrocytes. / B. Deus, H. Blum // Biachim. Biaphys. Acta. - 1970. - V. 219. - P. 489 - 497.
8. Haas, R.H. Thiamin and the brain. / R.H. Haas // Ann. Rev. Nutr. - 1988. - V.8. - P.483-515.
9. Kaziro, Y. Studies on thiaminokinase from baker's yeast. I. purification and properties. / Y. Kaziro // J. Biochem. - 1959. - V. 46, № 11. - P. 1523-1539.
10. Mano, Y. Studies on enzymatic synthesis of cocarboxylase in animal tissue. III. Purification and properties of thiaminekinase from rat liver. / Y.Mano // J.Biochem. - 1960. - V. 47, № 2. - P. 283 - 290.
11.Mitsuda, H. Pyrification and properties of thiamine pyrophosphokinase from parsley leaf. / H. Mitsuda, Y.Takii, K. Ivami // J.Biochem. - 1980. - V.88, № 1. - P.223-230.
12. Sanemori, H. Reversed-Phase High - Performance Liquid chromatography Analysis of Thiamine Phosphate Esters in Paracoccus denitrificans. / H. Sanemori, H. Ueki, T. Kawasaki // Anal. Biochem. - 1980. - V. 107. - P. 451-455.
Поступила 15.06.2011
1
2
