CC BY
55
УДК 571.151.4 : 591.481.1
МЕХАНИЗМ КАТАЛИТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ТИАМИНКИНАЗЫ ИЗ МОЗГА СВИНЬИ
И. П. Черникевич
УО «Гродненский государственный медицинский университет»
Проведен кинетический анализ бисубстратной ферментативной реакции, катализируемой электрофорети-чески гомогенной тиаминкиназой из мозга свиньи. Кинетические исследования начальных скоростей в отсутствие продуктов и ингибирования продуктами реакции, а также данные равновесного диализа указывают на то, что реакция протекает через образование тройного фермент-субстратного комплекса. Присоединение субстратов и освобождение продуктов является строго упорядоченным. Обсуждается возможная схема механизма реакции.
Ключевые слова: тиамин, тиаминкиназа мозга, механизм реакции.
The kinetic analysis of bisubstrate enzymatic reaction catalyzed by electrophoretically homogenous thiamine kinase (E. C. 2.7.6.2), isolatedfrom pig brain has been carried out. Kinetic studies of the initial rates in the absence ofthe products and inhibition by the reaction products as well as the data from the equilibrium dialysis suggest that the reaction proceeds through the formation of a ternary enzyme-substrate complex. The combination with substrates and release of the products appears to be highly ordered. A possible scheme of the reaction mechanism is discussed.
Key words: thiamine, thiamine kinase of the brain, mechanism of the reaction.
Значение тиаминдифосфата* определяется его ролью как кофермента ключевого энзима углеводного обмена - транскетолазы - и таких важнейших мультиферментных комплексов, как пируватдегид-рогеназного и а-кетоглутаратдегидрогеназного. TDP синтезируется в микробных клетках [10], исключая мутант Escherichia coli K12, животных [7] и растительных [9] тканях, согласно общепринятой схеме
Тиамин + ATP
Mg
TDP + AMP.
Реакция катализируется тиаминкиназой (ATP: тиаминпирофосфотрансфераза, КФ 2.7.6.2).
К настоящему времени фермент выделен в гомогенном состоянии из пивных дрожжей [1], листьев петрушки [9], сердца [5] и мозга [14] свиньи, изучены его кинетические характеристики, определены молекулярные массы [1, 9], показано наличие четвертичной структуры и аллостерической регуляции ионами Mg2+ [1]. Кроме того, относительно недавно стало известно, что для осуществления каталитической функции киназе также необходим кофермент мио-инозитол-1-пирофосфат [8].
Относительно механизма переноса пирофосфат-ной группировки с ATP на тиамин сведения малочисленны и довольно противоречивы [1, 5]. Это можно объяснить различной видовой специфичностью фермента и, кроме того, неодинаковой степенью его очистки. Поскольку нами ранее установлены основные кинетические характеристики и изучены некоторые свойства электрофоретически
*Принятые сокращения: Т - тиамин, TDP - тиамин-дифосфат, Т-киназа - тиаминкиназа.
гомогенной T-киназы из мозга свиньи, представлялось интересным выяснить механизм действия катализируемой ферментом бисубстратной реакции. В данной работе излагаются полученные результаты.
Матералы и методы
T-киназа из мозга свиньи была очищена до гомогенного состояния, как описано ранее [14]. Все опыты проводились в 0,02 М трис-малеатном буфере pH 5,2, что соответствует оптимуму реакции. При этом pH диссоциируют три ОН-группы ATP (pK четвёртой ОН группы равна 6,5). Вследствие сильно выраженной способности пирофосфатных групп связываться с двухвалентными катионами, можно считать, что АТФ вступает в реакцию в виде комплекса ATP-H-Mgl . Соотношение концентраций Mg2+ и ATP всегда было постоянным и равным 10. В реакции использовались ненасыщающие концентрации обоих субстратов. Инкубацию проводили при 40оС 1 ч, после чего реакцию останавливали кипячением в течение 1 мин. Смесь разбавляли в 2-3 раза 0,05 М фосфатным буфером pH 6,8 и соответствующие аликвоты отбирали для количественного определения TDP, которое осуществляли ферментативным методом [13] с некоторыми модификациями [1], при помощи апопируватдекар-боксилазы. Активность рекомбинированной в течение 30 мин при комнатной температуре (pH 6,8) холопируватдекарбоксилазы, пропорциональной содержанию TDP в пробах, определяли по убыли НАД^Н в присутствии алкогольдегидрогеназы. Калибровочный график строили с хроматографи-чески чистым препаратом TDP.
Радиометрический метод определения тиамин-киназной активности [3]. Условия проведения реакции и концентрации всех ингредиентов были
Т-киназа
Журнал ГрГМУ 2008 № 4
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
такими, как указано выше. В качестве субстрата фермента использовали [тиазол-2-14С]-тиамин. После остановки реакции пробы разбавляли 8-10 мл 0,02 М трис-HCl буфера рН 8,9, смесь количественно переносили на колонку (1,5-3см) с ДЭАЭ-сефадексом А-25, уравновешенную 0,02 М трис-HCl буфером рН 8,0. Незафосфорилированный [14С]-тиамин снимали исходным буфером до исчезновения радиоактивности в элюате. TDP вымывали 25 мл 0,5 н. HCl. Для определения количества синтезированного в реакции меченого TDP отбирали аликвоты по 1 мл и помещали во флаконы с 10 мл диоксанового сцинтиллятора. Концентрацию [14С]- TDP находили, исходя из известной удельной радиоактивности [14С]-тиамина.
Равновесный диализ. Ячейку для диализа [11] изготавливали из плексигласа. Между двумя цилиндрическими камерами помещали полупроницаемую мембрану, которую для увеличения пористости перед употреблением кипятили в дистиллированной воде в течение 5 мин. Через имеющиеся в корпусе ячейки капилляры в одну из камер вносили 1 мл 2-10-5 М раствора [14С]-тиамина в 0,01 М трис-HCl буфере рН 7,7 с 0,05 М NaCl, во вторую -такой же объём электрофоретически гомогенного белка с концентрацией 1,1-10-5 М в том же буфере. Камеры плотно прижимали друг к другу металлическим винтом и ячейку закрепляли на встряхивающем аппарате. Через определенные интервалы времени из ячеек отбирали пробы (0,1 мл) и помещали во флаконы с 10 мл диоксанового сцинтил-лятора. Количество связанного с T-киназой субстрата находили по разности радиоактивности между обеими сторонами мембраны после установления равновесной концентрации. Белок определяли по методу Лоури и спектрофотометрически по поглощению при 280 нм. Радиоактивность измеряли на сцинтилляционном счётчике Mark-11 («Nuclear Chicago», США).
Результаты и их обсуждение
К наиболее распространённым методам установления формального механизма ферментативной реакции относится изучение начальных скоростей процесса, т.е. того периода реакции, когда концентрацией продукта можно пренебречь. Для реакции типа А + В о P + Q анализ начальных скоростей заключается в изменении концентрации каждого субстрата (вариабельный субстрат) при нескольких фиксированных уровнях другого. Зависимость начальной скорости от концентрации субстрата (А) выражается линейной функцией, в которой фиксируемая концентрация (В) является экзогенно задаваемым параметром. Возможны два варианта такой зависимости. В одном случае фиксируемая концентрация определяет лишь значение свободного члена в уравнении (1), в другом - она входит в выражение как углового коэффициента, так и свободного члена этой функции - уравнение (2):
1 К 1 1 к^
-=—а — +—(1+—в) о V А V В
1 к 1 1л Квч -=—а—+—(1+—в) о V А V В
(1)
(2)
где А и В - концентрации субстратов; Кб и Кв -константы Михаэлиса для А и В; К а - константа диссоциации А. Очевидно, что при варьировании параметра В алгебраическая интерпретация первого уравнения представляет собой семейство параллельных прямых - случай механизма, основанного на образовании замещённой формы фермента (синонимы: механизм двухтактного замещения, механизм типа «пинг-понг»).
Уравнение (2) интерпретирует собой пучок прямых, т.е. совокупность прямых, пересекающихся в одной точке. Координаты точки пересечения двух прямых у = Цх + в1 и у = к2х + в2, вид которых и является общей записью уравнения (2), равны
X =
в1 - в
2
У =
где
К2 - К1 К2в1 - К1в2 К2 - К1
(3)
(4)
К1 = - (Ка + Ь^); = 1 (Ка + КаКв);
1 V а Bi 2 V а В2
В1
в1 = -(1+К), 1 V В1
в2 = !(1+Кв). 2 vv В/
Подставив эти значения в выражения (3) и (4), получим 1
X = - = ; (5) К а
У =
Ка -Ка KaV ^
(6)
Поскольку вычисленные координаты не зависят от параметра В, то очевидно, что все прямые, интерпретируемые уравнением (2), пересекаются в точке с этими координатами.
Возможен случай, когда ордината точки пересечения семейства прямых равна нулю (см. результаты эксперимента). Согласно (2), имеем
к ау = ^
Это справедливо при условии а а ' Таким образом, абсцисса совокупности прямых, возникающих при варьировании параметра В в уравнении (2), равна отрицательному значению обратной величины константы диссоциации фермент-субстратного комплекса Е+А о ЕА. Эти же результаты справедливы и в случае, когда В - вариабельный субстрат, а А - фиксированный.
На рисунке 1 графически представлены результаты исследования начальных скоростей тиамин-
и
К а - К а
//[Т]. мкМ"
Рисунок 1 - Влияние концентрации АТР на начальную скорость тиаминкиназной реакции. T - вариабельный субстрат. Концентрация АТР, мМ: 1 - 0,2; 2 - 0,4; 3 - 0,6; 4 - 0,8
о 1 Z 3 Ц 5 1/[АТР]} мМ'1
Рисунок 2 - Влияние концентрации T на начальную
скорость тиаминкиназной реакции. АТР - вариабельный субстрат. Концентрация T, мкМ: 1 - 0,5; 2 - 1,0; 3 - 2,0; 4 - 4,0
киназной реакции. Из двойных обратных величин зависимости скорости реакции от концентрации T при фиксированных уровнях АТР получена серия прямых, пересекающихся на горизонтальной оси. Такое же семейство прямых наблюдается для случая, когда АТР - вариабельный субстрат, а T - фиксированный (рис. 2). Как указывалось выше, такие данные свидетельствуют о том, что реакция протекает с образованием тройного фермент-субстратного комплекса, т.е. оба субстрата должны быть добавлены до освобождения любого из продуктов. Аналогичные данные были получены с гомогенными препаратами T-киназы, выделенной из пивных дрожжей [1] и листьев петрушки [9]. Что касается результатов начальных скоростей с частично очищенными препаратами фермента из сердца свиньи [5] и пекарских дрожжей [12], то они оказались, по признанию самих авторов, неожиданными и, пожалуй, необъяснимыми. В обоих случаях прямые, выражающие зависимость х-1 от обратной концентрации АТР, пересекались в точке, лежащей на оси абсцисс. В случае же зависимости х-1 от обратной концентрации T было получено семейство параллельно прямых. Учитывая, что при перестановке местами в приведенных выше уравнениях (1) и (2) фиксированного и вариабельного субстратов результаты кинетического анализа не должны изменяться, их можно объяснить лишь ошибкой эксперимента.
Из приведенных на рисунках 1 и 2 данных нельзя сделать окончательного вывода относительно типа ферментативной реакции, так как уравнения начальной скорости, а следовательно, и графическое описание упорядоченного механизма, механизма Теорелла-Чанса, а также неупорядоченного с быстрым установлением равновесия между всеми формами, кроме двух тройных комплексов, имеют одну и ту же форму. Их можно различить, исследуя ингибирование продуктами реакции. На
преимущество этого метода, позволяющего установить порядок присоединения субстратов и освобождения продуктов, указывали ряд авторов [2,
4].
Влияние АМР на АТР изучалось при фиксированных концентрациях T. Метод двойных обратных величин дает семейство прямых, точка пересечения которых лежит на оси ординат (рис. 3), что свидетельствует о конкурентном виде ингибирования. Такой же результат получен при работе с частично очищенным ферментом из этого же источника [6]. Константа диссоциации комплекса фермент - АМР, рассчитанная по формуле для обратимого конкурентного ин-гибирования, оказалась равной 2-10-2 М. Таким образом, можно полагать, что физиологические концентрации этого метаболита вряд ли оказывают какую-либо роль в регуляции активности изучаемого фермента.
В опытах по ингибированию вторым продуктом реакции - TDP - определить количество синтезированного TDP ферментативным методом не удалось, поскольку для того, чтобы уложиться в калибровочный график, нужны большие разведения, и доля TDP, образовавшегося в процессе реакции, становится крайне малой. По этой причине был использован модифицированный изотопный метод определения активности T-киназы. Для опыта был взят меченый [14С] - тиамин. Реакция протекала по схеме: АТР + [14С]-Т ^ [14C]-TDP + АМР. Поскольку содержание [14С] - TDP определялось ионообменной хроматографией, по радиоактивности образующегося кофермента, экзогенно внесенный TDP не влиял на точность анализа.
На рисунке 4 изображена зависимость скорости реакции от концентрации T при постоянной концентрации АТР и вариабельного количества TDP. Прямые, вычерченные по методу двойных обратных величин, имеют общую точку пересечения, лежащую на оси абсцисс. Такая ситуация возникает в случае одновременного воздействия ингибитора как на свободный фермент, так и на фермент-субстратный комплекс, т.е. в случае неконкурентного ингибирования. Оказалось, что этот продукт тиаминкиназной реакции является её мощным ингибитором: константа диссоциации комплекса фермент - TDP равна 3-10-5 М. Этот факт помогает понять отсутствие значительного прироста кофер-мента в тканях при введении высоких доз T in vivo.
С учетом правил Клеланда [4], полученные результаты по ингибированию продуктами реакции, удовлетворяют условиям двух механизмов: 1) неупорядоченного механизма с быстрым установлением равновесия между всеми формами, кроме
Журнал ГрГМУ 2008 № 4
оригинальные исследования
1 о
двух тройных комплексов, содержащего стадию образования тупикового комплекса; 2) упорядоченного механизма с обязательной последовательностью присоединения субстратов и диссоциации продуктов, описываемого схемой: АТР + T ^ TDP + АМР.
Для того чтобы исключить один из этих вероятных механизмов, было изучено взаимодействие тиаминкина-зы с тиамином методом равновесного диализа через полупроницаемую мембрану. Отправной точкой был тот факт, что для неупорядоченного механизма необходимым условием является независимость связывания субстратов на двух центрах фермента, т.е. как АТР, так и T должны связываться с белком. В результате образования фермент-субстратного комплекса концентрация метки в камере, содержащей белок, должна быть выше, чем в камере с радиоактивным T, на величину, соответствующую концентрации связанного с белком субстрата. В случае же упорядоченного механизма комплекс T-киназа -T образовываться не должен. Результаты эксперимента, представленные на рисунке 5, показывают, что состояние равновесия, к которому приходит система, характеризуется нулевым градиентом концентрации [14С]-Т по обе стороны мембраны, что свидетельствует об отсутствии какой-либо протеидизации субстрата.
Таким образом, кинетические исследования начальных скоростей в отсутствие продуктов и ингибирование продуктами реакции, а также данные равновесного диализа указывают на то, что бисубстратная ферментативная реакция, катализируемая электрофоретически гомогенной тиаминки-назой, выделенной из мозга свиньи, протекает через образование тройного фермент-субстратного комплекса, причем, присоединение субстратов и освобождение продуктов являются строго упорядоченными и протекают, согласно представленной схемы (рис. 6).
Литература
1. Воскобоев, А.И. Биосинтез, деградация и транспорт фосфорных эфиров тиамина/ А.И. Воскобоев, И.П. Черникевич. - Минск : Наука и техника, 1987. - 200с.
2. Келети, Т. Основы ферментативной кинетики/ Т. Келети. -М.: Мир, 1990. - 348с.
3. Радиометрический метод определения активности тиамин-пирофосфокиназы / И.П. Черникевич [и др.] // Весщ АН БССР. Сер. бiял. навук. - 1976. - № 3. - С. 112-114.
4. Cleland, W.W. The kinetics of enzyme catalyzed reactions with two or more substrates or products. 1. Nomenclature and rate equations/ W.W. Cleland // Biochim. Biophys Acta. - 1963. - V 67. - P. 104-137.
- uo 1
<30 / A
/ У
S I zo fjfy*
10 .. ] I I I
4 5
1 Z 3 //ATP, мМ~1
Рисунок 3 - Ингибирование тиаминкиназной реакции АМР. T - фиксированный субстрат (4 мкМ); АТР - вариабельный субстрат. Концентрация АМР, мМ: 1 - 63; 2 - 49 ; 3 - 21; 4 - без ингибитора
имп/мин^ 10** 63
315
0J 02 03 ОН f/[T]'t мкМ"' ' Рисунок 4 - Ингибирование тиаминкиназной реакции TDP. АТР - фиксированный субстрат
(0,5 мМ); T - вариабельный субстрат. Концентрация TDP, мкМ: 1 - 55; 2 - 33; 3 - без ингибитора
АТР
TDP
АМР
Рисунок 5 - Равновесный диализ [14С]-
тиамина с тиаминкиназой. 1 - радиоактивность [14С]-тиамина в камере с буфером; 2 - в камере с белком
(Е-АТР) (Е-АТР-Т) (Е-АМР) Е "(Е-АМР-ТЛР)
Рисунок 6 - Предполагаемая схема механизма тиаминкиназной реакции
5. Hamada, M. Purification and properties of thiamine pyrophosphokinase from pig heart / M. Hamada // Seikiqaku. - 1970. -V41. - P. 310-324.
6. Mano, Y. Studies on enzymatic synthesis of cocarboxylase in animal tissue. Fundamental properties of the reactions / Y. Mano // I. Biochem. - 1960. - V 47, N 1. P. 24-36.
7. Mano, Y. Studies on enzymatic synthesis of cocarboxylase in animal tissue. Purification and properties of thiamine kinase from rat liver / Y. Mano // I. Biochem. - 1960. - V. 47, N 3. - P. 283-290.
8. Okazaki, K. Enzyme synthesis of cocarboxylase in animal tissues / K. Okazaki // Biophem. Biophys. Res. Communs. - 1975. - V 64. - P. 20-27.
9. Purification and proporties of thiamine pyrophosphokinase from parsley leaf / H. Mitsuda [et. al.] // I. Nutr. Sci. Vitaminol. - 1975. - V21, N 2. - P.103-115.
10. Soluble and membrane bound thiamine - binding proteins from S. cerevisiae. / A. Iwashima [et. al.] // Biochim. Biophys. Acta. - 1972.-V258.- P.333-336.
11. The interaction of ribonuclease with purine and pyrimidine phosphates. Binding of adenosine 5- monophosphate to ribonuclease / Y.P. Myer [et. al.] //Biochim. Biophys. Acta. - V 55. - P.361-373.
12. Thiamine pyrophosphotransferase. Purification et etude du mechanisme de reaction / F. Thome-Beau [et. al.] // Biochim. Biophys. Acta. - 1969.- V182, N 1. - P.111-121.
13. Ullrich, I. Assay of thiamine pyrophosphate / I. Ullrich // Methods in Enzymoloqy. - 1970. - V18. - P. 109-155.
14. Wakabayashi, Y. Thiamin Pyrophosphokinase. Purification of thiamin pyrophosphokinase from pig brain / Y. Wakabayashi // Vitamins. - 1978. - V52, N 5/6. - P.223-228.
Поступила 01.04.08
