УДК 543.062.088.8
ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРОКОЛИЧЕСТВ РТУТИ(11) И МЕТИЛРТУТИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
АЛКОГОЛЬДЕГИДРОГЕНАЗ РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
Е.В. Жмаева, П.В. Бычков, Т.Н. Шеховцова
(Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет, кафедра аналитической химии; e-mail: [email protected])
Показано, что ртуть(11) и метилртуть являются эффективными ингибиторами (смешанного и бесконкурентного типа соответственно) алкогольдегидрогеназ, выделенных из пекарских дрожжей и печени лошади. При этом первый фермент значительно более чувствителен к действию указанных токсикантов. С использованием реакции окисления этанола никотинамидадениндинуклеотидом, катализируемой алкоголь-дегидрогеназами из пекарских дрожжей и печени лошади, разработаны методики определения ртути(11) и метилртути с разными нижними границами определяемой концентрации: 0,25; 10 нМ и 10 нМ, 1 мкМ соответственно. Методики апробированы при анализе природных вод на содержание Hg(II) и метилртути.
Ртуть является одним из основных и наиболее токсичных загрязнителей окружающей среды. Ртутные пары активно абсорбируются и аккумулируются в мозге, почках, яичках, вызывают разрушение легких; Hg0 и CH3Hg нарушают деятельность периферийной и центральной нервной системы, что приводит к возникновению нейропсихического комплекса, проявляется в патологически повышенной возбудимости [1]. Среди соединений ртути, участвующих в глобальном круговороте, органические производные, в частности метилртуть, занимают особое место в силу своей токсичности, обусловленной их способностью аккумулироваться в цепочках питания человека. В связи с этим актуальной является задача разработки чувствительных, селективных, экспрессных и простых в использовании методов определения ртути в любых ее химических формах. К методам анализа, сочетающим в себе все перечисленные выше требования, относятся ферментативные методы. Для определения ионов тяжелых металлов, в частности ртути(11), а также метилртути, имеющих большое сродство к сульфгидрильным группам белка (SH-), перспективно использовать алкогольдегидрогеназы, выделенные из клеток пекарских дрожжей и печени лошади, субъединица которых, как известно [2], содержит до 28 сульфгидрильных групп.
Цель настоящего исследования - разработка методик определения ртути(11) и метилртути с использованием алкогольдегидрогеназ, выделенных из клеток пекарских дрожжей (АДГ-I) и печени лошади (АДГ-II).
Экспериментальная часть
Использовали препараты алкогольдегидрогеназ (ЕС 1.1.1.1) из клеток пекарских дрожжей ("Reanal", Венгрия) и печени лошади ("Sigma", США) с удельной активностью 25 и 0,21 ед./мг соответственно. Образцы
ферментов готовили ежедневно растворением навесок препаратов в фосфатном буферном растворе (рН 7,6). Твердые препараты хранили в морозильной камере при температуре -18°. Образцы ß-никотинамидадениндинук-леотида ("Sigma", США) готовили ежедневно растворением его точной навески в воде. Твердый препарат хранили в холодильнике при температуре 4°. Образцы этанола готовили разбавлением водой точного объема 96%-го этанола-ректификата.
Исходный образец ртути(11) (~1 мг/мл) готовили в кварцевом бюксе растворением точной навески очищенного металла в минимальном количестве азотной кислоты "ос.ч." с последующим разбавлением до требуемого объема водой, подкисленной азотной кислотой до рН 2,5-3,0. Образцы с меньшим содержанием ртути(11) готовили непосредственно перед работой разбавлением исходного раствора подкисленной водой.
Образец цинка(11) концентрацией 1 мг/мл готовили растворением точной навески спектрально чистого цинка в минимальном количестве 0,1 М HCl "ос.ч." и последующим его разбавлением до нужного объема водой, подкисленной до рН 2,5-3,0. Исходные образцы (1 мг/ мл) ионов висмута(Ш), железа(Ш), кадмия(11), кобальта(П), никеля(11), меди(11), свинца(11), серебра(1) готовили растворением точных навесок их солей "ос.ч." (Bi(NO3)3-5H2O, FeCl3-6H2O, CdCl22.5H2O, CoCl26H2O, Pb(CH3COO)23H2O, AgNO3, NiSO4 6H2O, CuCl2 2H2O) в воде, подкисленной азотной кислотой "ос.ч." до значения рН 2,5-3,0.
Образцы с меньшим содержанием ионов металлов готовили непосредственно перед работой последовательным разбавлением исходных растворов подкисленной водой. Препарат иодида метилртути был синтезирован и очищен в институте Геохимии и аналитической химии им. В.И. Вернадского РАН.
Образцы метилртути готовили растворением их твердых препаратов в этаноле-ректификате и хранили в темноте без доступа воздуха при температуре 4°.
Фосфатный буферный раствор готовили смешением 0,1 М растворов дигидрофосфата калия "ч." и гидрофосфата натрия "х.ч.", дважды перекристаллизованных из воды, доводя рН до нужного значения 0,1 М КаОН "ос.ч." Трис-НС1-буферный раствор (0,05 М) готовили растворением точной навески его препарата ("Serva", США) в воде, доводя рН до требуемого значения 0,1 М НС1 "ос.ч.".
Для приготовления всех водных растворов и перекристаллизации реагентов использовали воду, очищенную с помощью системы очистки воды "Simplicity" фирмы "Millipore" (Франция), с удельной электропроводностью не более 1,5 мОм.
Оптическую плотность растворов во времени измеряли на фотоэлектроколориметре КФК-2, спектрофотометрах СФ-46 ("ЛОМО", Россия) и "Shimadzu UV-2201" ("Shimadzu", Япония). рН буферных растворов измеряли с помощью потенциометра рН-121 и рН-мил-ливольтметра ("Эконикс-эксперт", Россия) с точностью ±0,04 и ±0,005 соответственно. Для отбора малых количеств растворов (1 мл) использовали микродозаторы фирмы "Biohit" (Финляндия).
Определение ртути(11) с использованием АДГ-I и АДГ-II. В стеклянную пробирку с притертой пробкой вводили последовательно 1,1 мл трис-НС1-буферного раствора (рН 9,0 (АДГ-I) или 9,5 (АДГ-II)), по 0,1 мл 90 мМ раствора НАД+, этанол (6 М (АДГ-I) или 0,45 М (АДГ-II)), раствор ртути(П), по 0,1 мл 3 мкМ
Т а б л и ц а 1
Характеристики ингибирующего действия ионов металлов на каталитическую активность АДГ-I и АДГ-II и pK сульфидов металлов
Ион металла Диапазон концентраций, в котором проявляется ингибирующее действие ионов (мкг/мл) P^S
I II
Hg(II) 110-6-110-2 0,01-1,0 52
Cd(II) 110-6-110-2 1-100 28
Ag(I) 110-3-110-2 49
Pb(II) 510-3-110-2 - 27
Cu(II) 0,0-1,0 0,1-100 35
Zn(II) 0,1-1,0 0,1-1,0 24
Bi(III) 0,1 - 1,0 - 97
Co(II) не влияет 10-100 20
: Не изучено.
АДГ-1 или 60 мкМ АДГ-11. Общий объем смеси составлял 1,5 мл. В момент смешения растворов включали секундомер и измеряли оптическую плотность растворов через каждые 15 с в течение 2 мин. Скорость ферментативной реакции характеризуют тангенсом угла наклона а) начального участка кинетических кривых в координатах оптическая плотность - время. Градуировоч-ные графики строят в координатах - концентрация ингибитора.
Определение метилртути с использованием АДГ-1 и АДГ-11. В стеклянную пробирку с притертой пробкой вводили последовательно 1,75 мл трис-НС1-буферного раствора (рН 9,0 (АДГ-1) или 9,5 (АДГ-11)), по 0,1 мл 90 мМ раствора НАД+, этанол (6 М (АДГ-1) или 0,45 М (АДГ-11)), 0,025 мл раствора метилртути, по 0,1 мл растворов 3 мкМ АДГ-1 или 60 мкМ АДГ-11. Далее определение метилртути выполняют по методике, приведенной выше.
Результаты и их обсуждение
В качестве индикаторной выбрали катализируемую АДГ-1 и АДГ-11 реакцию окисления этанола Р-никоти-намидадениндинуклеотидом (НАД ), кинетика и механизм которой достаточно хорошо изучены [3, 4].
АДГ
С2Н5ОН + НАД+ ^ НАДН + СН3СОН + Н+.
Для выяснения оптимальных условий протекания индикаторной реакции в присутствии алкогольдегидрогеназ разного происхождения изучили зависимости ее скорости от рН среды в трис-НС1-буферном растворе, концентраций этанола, НАД+, ферментов (рис. 1, а-г). Выбор трис-НС1-буферного раствора связан с тем, что именно в нем в интервале значений рН 9,0-11,0 [3] каталитическая активность АДГ-1 и АДГ-11 максимальна. На рис. 1, а показано, что в случае АДГ из дрожжей и печени лошади скорость реакции максимальна при рН 9,5 и 9,0 соответственно. В качестве оптимальных концентраций кофер-мента (НАД ) и этанола выбрали их наименьшие концентрации, при которых достигается максимальная и постоянная скорость реакции (рис. 1 б, в).
Таким образом, оптимальными являются следующие условия проведения индикаторной реакции: [НАД ] = 6 мМ, [АДГ-1] = 0,2 мкМ, [АДГ-11] = 4,0 мкМ, концентрация этанола - 0,4 (АДГ-1) и 0,03 (АДГ-11) М; трис-НС1-буферный раствор с рН 9,0 (АДГ-1) и 9,5 (АДГ-11).
Влияние ионов металлов изучали в указанных оптимальных условиях, варьируя рН в интервале 7,6-9,5, так как при более высоких значениях рН (>9,5) фермент денатурируется, а при более низких (<7,6) реакция протекает с малой скоростью, недостаточной для ее точного фиксирования. Установлено, что N1(11) и Ре(Ш) не оказывают никакого действия на оба фермента даже при концентрации 100 мкг/мл; Н§(П), С^П), Си(11) и 2п(П) ингибируют обе АДГ; Со(11) является ингибитором АДГ-11 и не влияет на активность АДГ-1 (табл. 1).
tg а-10 16
15 14 13 12 11 10 9
tg а-102 20 I
0.2 0.4 0.6 0.8
Сеюн
Рис. 1. Зависимость скорости ферментативного окисления этанола НАД от рН трис-НС1-буферного раствора (а), концентраций НАД+ (б), этанола (в) и АДГ (г) (концентрации: АДГ- I (1) 0,2 мкМ, АДГ- II (2) - 4,0 мкМ (о-в), этанола - 0,4 М (5) и 0,03 М (4) (а, б, г), НАД+ - 6 мМ (а, в, г), трис-НС1-буферный раствор, рН 9,0 (1|) и 9,5 (2|) (б-г)
Полученные данные свидетельствуют о том, что степень ингибирующего действия ионов металлов на каталитическую активность АДГ определяется их природой, а также сродством катионов к сульфгидрильным группам в молекуле фермента.
Таким образом, Hg(II) является наиболее эффективным ингибитором обеих алкогольдегидрогеназ. Предварительное инкубирование ртути(11) с ферментами не приводит к усилению ее ингибирующего действия, что указывает на обратимость процесса ингибирования.
Известно [5], что метилртуть - (органическое соединение ртути(11)) оказывает наибольший токсический эффект на человеческий организм по сравнению с остальными химическими формами ртути(11), и при этом является специфическим реагентом на SH-груп-пы белков [6]. В связи с этим нами было изучено влияние метилртути на скорость катализируемой АДГ-I и АДГ-II реакции окисления этанола НАД . Обнаружено, что CH3Hg+ ингибирует АДГ из дрожжей и печени лошади в широких интервалах их концентраций: (0,001-1000) мкМ и (0,1-1000) мкМ соответственно. Максимальное ингибирующее действие метилртути проявляется так же, как и в случае Hg(II), в оптимальных условиях проведения индикаторной реакции и не зависит от времени инкубирования ферментов с ингибитором.
Для подтверждения обратимости процесса ингибирования ферментов ионами Н§(П) и СН3Н§+ использовали метод разбавления [7]. Согласно этому методу в случае обратимости процесса при разбавлении смеси фермента с ингибитором в 10 раз должно выполняться соотношение: активность (разб.) > 1/10 активности (неразб.). Нами установлено, что характер взаимодействИЯ АДГ (1 И 11) с И°НамИ ВДЦ (А(неразб.)/А(разб.) = 6,6 и 9,4) и СН3НВ+ (А(неразб.)/А(разб.)= 7,0 и 10,0 соответственно) является обратимым. Методом линеаризации кинетических кривых в координатах Лайнуивера-Берка (1/^ - 1/[5]0) и Диксона (1/^ - [7]0) показано, что ингибирование обеих АДГ ртутью(11) происходит по смешанному типу (рис. 2, а, б), а метилртутью - по бесконкурентному (рис. 3, а, б). Бесконкурентный тип ингибирования предполагает, что ингибитор не способен присоединяться к ферменту, но присоединяется к комплексу фермент-субстрат. При смешанном ингиби-ровании ингибитор действует как на участок связывания, так и на каталитический центр фермента, независимо от того, перекрываются они или нет; образуются как двойной комплекс фермент-ингибитор, так и тройной комплекс ингибитор-фермент-субстрат (оба комплекса каталитически неактивны).
Рассчитанные нами константы ингибирования и Ми-хаэлиса (табл. 2) наглядно иллюстрируют тот факт, что
1/W, мин/мМ 18 16
30
1/С, М-1 1/W, мин/мМ 1
1/W, мин/мМ
1/С, М-1
1/W, мин/мМ
0,2 0,6 С, мкг/мл
Рис. 2. Зависимость обратной скорости индикаторной реакции от обратной концентрации этанола при различных концентрациях Н§(П) (координаты Лайнуивера-Берка) (а) и от концентрации Н§(П) при разных концентрациях этанола (координаты Диксона) (б) (оптимальные условия определения Н§(П); (а) концентрации Н§(П), мкМ: 1 - 2,5; 2 - 1,5; 3 - 1; 4 - 0,5; 5 - 0; (б) концентрации этанола, М: 1 - 0,05;
2 - 0,1; 3 - 0,2; 4 - 0,4; 5 - 0,6)
Н§(П) - более сильный ингибитор алкогольдегидроге-наз, чем СН3Н§+. Следует отметить, что степень инги-бирования (/,%) этими эффекторами активности для АДГ-1 существенно выше, чем для АДГ-11: 85 и 10% в случае ртути(11) (С^^ 0,1 мкМ) и 68 и 7% - метилру-ти (ССН3Нё+ = 1 мкМ) соответственно.
Наличие обратной пропорциональной зависимости скорости индикаторной реакции, катализируемой алко-гольдегидрогеназами I и II, от концентрации Н§(П) и метилртути позволило разработать методики их определения с метрологическими характеристиками, представленными в табл. 3.
Методики определения указанных эффекторов с применением АДГ-1, отличающиеся более высокой чувствительностью (рис. 4), были использованы для определения Н§(П) и метилртути в природных водах. Занижение (по сравнению с ожидаемыми) результатов определения Н§(П) и метилртути в воде Красного моря, имеющей высокую соленость, обусловлено, по-видимому, влиянием большой ионной силы, а также связыванием Н§(П) и метилртути в комплекс с различными ли-гандами, присутствующими в морской воде, например, С1 , Бг , I , НБ , Б2 , лимонной кислотой, аминокислотами, гуминовыми и фульвокислотами и т.д. Полученные
2 3
С, мкМ
Рис. 3. Зависимость обратной скорости индикаторной реакции от обратной концентрации этанола при различных концентрациях метилртути (координаты Лайнуивера-Берка) (а) и от концентрации метилртути при различных концентрациях этанола (координаты Диксона) (б) (оптимальные условия определения метилртути; (a) концентрации метилртути, мкМ: 1 - 1,5; 2 - 0,75; 3 - 0,25; 4 - 0,025; 5 - 0; (б) концентрации этанола, М: 1 - 0,2; 2 - 0,3; 3 - 0,4; 4 - 0,6; 5 - 0,8)
данные об ингибировании алкогольдегидрогеназ, выделенных из разных источников, ртутью(П) и метилртутью, свидетельствуют о сопоставимости структур активных центров ферментов. В то же время существенные различия в степенях ингибирующего действия на ферменты специфических реагентов на сульфгидрильные группы белков указывают на то, что доступность этих групп в молекулах АДГ различного происхождения определяется природой ее продуцента и выше в случае фермента из клеток пекарских дрожжей.
Р(СР
/
Hfl PI
СЦИя1
Рис. 4. Сравнение чувствительности методик определения ртути(11) и метилртути с использованием АДГ-I (1) и АДГ-II (2)
а
б
б
1
Т а б л и ц а 2
Кинетические характеристики ингибирующего действия ртути(11) и метилртути на алкогольдегид-рогеназы из клеток пекарских дрожжей (I) и печени лошади (II)
Ингибитор Концентрация, мкМ KI, мкМ Кмэф M
I II I II I II
0 0 0,015±0,004 0,041±0,005
0,5 0,25 0,020±0,006 0,057±0,007
Hg(II) 1,0 0,50 0,04 2,1 0,025±0,006 0,059±0,008
1,5 0,75 0,030±0,005 0,072±0,007
2,5 1,00 0,035±0,006 0,095±0,009
0 0 1,40±0,40 0,196±0,035
0,025 0,25 0,60±0,08 0,092±0,020
CH3Hg+ 0,25 0,50 1,6 3,2 0,42±0,08 0,057±0,008
0,75 0,75 0,33±0,07 0,041±0,017
1,50 1,00 0,27±0,09 0,023±0,009
Т а б л и ц а 3
Метрологические характеристики методик определения Hg(II) и метилртути при помощи АДГ-I и АДГ-II
Ингибитор Диапазон определяемых содержаний, нМ (I) и мкМ (II) Уравнение градуировочного графика Смин, нМ (I) и мкМ (II)
I Hg(II) 0,25-2,50 y' = 12,40-0,35х" (m = 10) 0,15
CH3Hg+ 10-250 y = 11,11-0,25х (т = 8) 3
II Hg(II) 0,05-1 y = 9,07-0,70x (m = 7) 0,02
CH3Hg+ 1-10 y = 9,28-0,53x (m = 6) 0,7
* y = tga-102; ** x = концентрация ингибитора (С-10", нМ (I) или мкМ (II)).
Т а б л и ц а 4
Метрологические характеристики методик определения Hg(II) и метилртути при помощи
АДГ-I и АДГ-II
Введено Найдено s, Введено Найдено s,
Колодезная вода
Hg(II) (нг/мл) Метилртуть (мкМ)
0,75 0,73±0,07 0,03 0,6 0,60±0,07 0,01
3,75 3,8±0,1 0,02 4,2 4,3±0,1 0,01
Вода Красного моря
Hg(II) (нг/мл) Метилртуть (мкМ)
3,75 2,83±0,09 0,01 0,75 0,60±0,09 0,03
18,75 17,9±0,2 0,02 5,25 4,25±0,1 0,01
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Зигель Х., Зигель А. Некоторые вопросы токсичности ионов ме-
таллов. М.: Мир.1993.
2. Aurichio F., Brum C. Biochim. Biophys. Acta. 1969. 185. P. 461-
463.
3. Boyer P., Lardy H., Myrback K. The Enzymes. New-York-London:
Academic Press. 1963.
4. J. van Eys, Giotti M., Kaplan N. J. Biol. Chem. 1958. 231. P.571.
5. Winfrey M., Rudd J. Environ. Contam. Toxicol. 1990. 9. P. 853-869.
6. Торчинский Ю.М. Сера в белках. М.: Наука. 1997.
7. Попова И.М. Ферментативные методы определения физиологи-
чески активных веществ с применением пероксидазы. Дисс. к.х.н. М.: МГУ 1981. 232 С.
Поступила в редакцию 25.10.02