CC BY
73
2009
Известия ТИНРО
Том 159
УДК 664.951.7:577.15
Е.В. Михеев, Н.Н. Ковалев*
Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр, 690091, г. Владивосток, пер. Шевченко, 4
СПОСОБ КОМПЛЕКСНОЙ ПЕРЕРАБОТКИ ГАНГЛИЕВ ГОЛОВОНОГИХ МОЛЛЮСКОВ С ПОЛУЧЕНИЕМ ФЕРМЕНТА ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ И БАД "ТИНРОСТИМ"
Впервые определена величина удельной активности холинэстеразы нервной ткани ганглиев головоногих (Sepiola birostrata, Rossia pacifica, Sepioteuthis les-soniana). Показано, что наименьшая активность фермента характерна для осьминога. Различия в активности холинэстераз ганглиев каракатиц разных видов составляли 1,7 раза. Активность фермента нервной ткани кальмара S. lessoniana сравнима с таковой тихоокеанского кальмара Todarodes pacificus. Из ганглиев T. pacificus выделен фермент с удельной активностью 24,7 ед. и высокой чувствительностью к действию фосфорорганических ингибиторов. Методом фракционирования сульфатом аммония из того же сырья получен фермент с удельной активностью 106 ед. Показана возможность комплексной переработки ганглиев с использованием метода ультрафильтрации, что позволило получить в одном технологическом процессе препарат холинэстеразы и комплекс пептидов, известный как БАД "Тинростим". По физико-химическим показателям "Тинростим", полученный с использованием ультрафильтрации, не отличается от препарата, полученного методом осаждения ацетоном. Выход препарата, полученного разными методами, различался в три раза.
Ключевые слова: кальмар, холинэстераза, ультрафильтрация, Тинростим.
Mikheev Е-V., Kovalev N.N. Method for complex processing of cephalopods ganglia for production the cholinesterase enzyme and BASF Tinrostim // Izv. TIN-RO. — 2009. — Vol. 159. — P. 362-367.
Specific cholinesterase activity of nervous tissue from different species of ceph-alopods (Sepiola birostrata, Rossia pacifica, Sepioteutis lessoniana) is determined for the first time. The lowest enzyme activity is found for octopus. Activity of the cholinesterase from cuttlefishes S. birostrata and R. pacifica differs in 1.7 times and activity of the enzyme from squid S. lessoniana is comparable to that from japanese common squid Todarodes pacificus. The enzyme with specific activity 24.7 and high sensitivity to organophosphorus compounds is extracted from nervous tissue of T. pacificus, with output 30 %. The enzyme with specific activity 106 is received from the same raw material with using the ammonium sulfate sedimentation method. And the ultra filtration method allows to receive from ganglia both cholinesterase preparation and peptide complex known as BASF Tinrostim within one technological process. Physical and chemical parameters of the BASF Tinrostim extracted by ultra
* Михеев Евгений Валерьевич, младший научный сотрудник, e-mail: mikheev@ tinro.ru; Ковалев Николай Николаевич, доктор биологических наук, заведующий лабораторией, e-mail: [email protected].
filtration do not differ from the parameters of this preparation received by acetone sedimentation method. However, the output of preparation differs in 3 times for different methods.
Key words: squid, Cholinesterase, ultra filtration, BASF Tinrostim.
Введение
Исследованию свойств холинэстераз гидробионтов посвящено значительное количество работ. Показаны особенности субстратной специфичности ферментов пресноводных (Козловская и др., 1990), морских рыб (Ковалев и др., 2003; ^bali et al., 2006; Podolska, Napierska, 2006), а также моллюсков (Бресткин, 1997; Ковалев, 2003; Михеев, Ковалев, 2007) и млекопитающих (Ковалев, Михеев, 2006).
В последние годы значительно возрос интерес к головоногим моллюскам. Причины этого интереса разнообразны, но его основой являются: высокие питательные свойства тканей, необыкновенно быстрый рост моллюска, короткий жизненный цикл. В Мировом океане насчитывается более 300 видов кальмаров, в тихоокеанском бассейне эксплуатируются в промышленном масштабе не более 20 (Инструкция ..., 1971). Ранее с использованием набора холиновых эфиров карбоновых кислот было показано, что оптические ганглии кальмаров семейства Ommastrephidae по величине удельной активности холинэстераз (ХЭ) могут являться перспективным сырьем для выделения фермента. ХЭ данного вида сырья, в зависимости от вида кальмара, имеет достаточно высокую удельную ферментативную активность — от 0,24 до 1,05 Е/мг (субстрат — АХ) (Эпштейн и др., 1987). ХЭ, полученная из ганглиев тихоокеанского кальмара, обладает высокой термостабильностью и чувствительностью к фосфорорганическим соединениям (ФОС) (Михеев, Ковалев, 2008). Вышеуказанные показатели важны при характеристике ХЭ как биохимического реактива. В то же время известно, что ганглии кальмаров являются сырьем и для получения биологически активной добавки "Тинростим" (Боровская и др., 2006).
Процесс сбора этого биосырья трудоемкий, выход составляет около 0,3 % массы кальмара, поэтому сырье достаточно дорогое (~ 500 руб. за 1 кг), что значительно влияет на себестоимость готовых препаратов. Исходя из вышеуказанного был проведен поиск новых потенциальных источников сырья, а также исследована возможность получения ХЭ и БАД "Тинростим" из одной партии сырья. Теоретической предпосылкой технологической части работы явилась возможность раздельного экстрагирования компонентов нервной ткани: ХЭ — водой, а "Тинростима" — раствором уксусной кислоты.
Материалы и методы
В качестве сырья были использованы мороженые ганглии головоногих моллюсков различных видов. Деструкцию клеточных мембран проводили методом ограниченного ферментолиза протеолитическим ферментом пилорин марки А с удельной активностью 204 Е/г (ТУ 9280-1203-00472012-96). Процесс ферменто-лиза останавливали добавлением ингибитора трипсина из яичного белка индейки (Sigma). Ультрафильтрацию проводили на колонке с мембранами волоконного типа с пределом пропускания молекул 1 и 100 кДа. Параметры процесса: скорость — 500 мл/ч; давление — 0,1 кПа; температура — 5 0С. Удельную ферментативную активность холинэстеразы в центрифугатах (800 g) водных го-могенатов (3 мг/мл) ганглиев определяли методом Элмана (Ellman et al., 1961) с использованием в качестве субстрата ацетилтиохолина (АТХ) (ICN, США). Бимолекулярную константу ингибирования (кп) рассчитывали по скорости взаимодействия фермента с ингибиторами (Садыков, 1976). В качестве необратимых ингибиторов использовали диизопропилфторфосфат (ДФФ) — [(CH3)2CHO]2P(O)F и ГД-42 — C2H5O(CH3)P(O)SC2H4S+(CH3)C2H5 (Кабачник, 1964). Массовую долю воды в препаратах тинростима и его растворимость определяли по фармакопей-
ной статье (Государственная фармакопея СССР, 1987). Изоэлектрическую точку определяли по методу Н.С. Дроздова и Н.П. Материнской (Дроздов, 1970). Максимум поглощения оптической плотности раствора "Тинростима" концентрацией 1 мг/см3 определяли на спектрофотометре UV-3101 фирмы "Shimadzu" в кювете вместимостью 3 см3, в области длины волн от 250 до 300 нм.
Результаты и их обсуждение
Нами проведен скрининг холинэстеразной активности в зрительных ганглиях головоногих моллюсков (табл. 1). Как видно из представленных данных, нервная ткань большинства видов кальмаров характеризуется высокой ХЭ-актив-ностью. Исключение составляют ганглии командорского (B. magister) и светящегося (W. scintillans) кальмаров, активность ХЭ которых сопоставима с таковой каракатиц. Наименьшая активность фермента обнаружена в зрительных ганглиях осьминога, что, по-видимому, можно объяснить особенностями биологии данного вида (Михеев, Ковалев, 2007). Следует отметить, что полученные нами данные для некоторых видов кальмаров совпадают с ранее известными (Ковалев и др., 1986). Сравнение с "реперным" ферментом — ХЭ стромы эритроцитов человека — показывает, что только ганглии тихоокеанского (T. pacificas) и кальмара Бартрама (O. bartrami) сравнимы с данным сырьем по величине удельной активности. Таким образом, на основании проведенного исследования можно сделать вывод о перспективности использования ганглиев тихоокеанского кальмара и кальмара Бартрама в качестве сырья для получения фермента ХЭ.
Для получения ХЭ использовали сублимированные ганглии тихоокеанского кальмара, так как это позволяет измельчить их в тонкий порошок для более полного экстрагирования фермента. Для этого замороженные ганглии дефростировали, измельчали, полученную массу тонким слоем раскладывали в кюветы и сушили в сублимационной камере при -1... + 1 оС, досушивали при 20 оС. Высушенную ткань ганглиев измельчали в порошок, просеивали через сито с диаметром пор 0,5 мм. Экстракцию ХЭ водой проводили при соотношении сырье : вода — 3 мг/мл в присутствии пилорина в концентрации 1 Е/г сырья. Экстракцию осуществляли в течение 8 ч при температуре 20 ± 2 0С. По окончании процесса экстракции в раствор добавляли ингибитор трипсина из яичного белка индейки в количестве 0,25 % от массы сырья. Гомогенат (суспензию) центрифугировали, отделяя раствор ХЭ от осадка. Осадок направляли на получение БАД "Тинростим", а центрифугат — раствор ХЭ — подавали на ультрафильтрационную колонку с пределом пропускания молекул 100 кДа. Известно, что высокоочищенная АХЭ мозга существует в трех формах различной молекулярной массы — 130, 270 и 390 кДа (Chan et al., 1972). Молекулярная масса протеаз составляет 20-25 кДа. Эта особенность позволяет применять метод ультрафильтрации для отделения про-теолитического фермента и ингибитора от раствора ХЭ.
Таблица 1
Удельная активность ХЭ зрительных ганглиев головоногих моллюсков, мкМ АТХ/мин ' мг ткани
Table 1
Activity of squids ganglia, mM ATCh/min per mg of tissue
Вид Удельная активность
Осьминог
Octopus dofleini 0,18 ± 0,006
Каракатицы
Sepiola birostrata 0,25 ± 0,03
Rossia pacifica 0,43 ± 0,02 Кальмары
Ommastrephes bartrami 1,20 ± 0,03
Todarodes pacificus 0,70 ± 0,02
Berryteuthis magister 0,36 ± 0,01
Watasenia scintillans 0,40 ± 0,02
Sepioteuthis lessoniana 0,60 ± 0,01 Строма эритроцитов сублимированная
АХЭч 0,80 ± 0,04
Фильтрат, раствор веществ с молекулярной массой менее 100 кДа, прошедший через колонку, смешивали с осадком и направляли на получение БАД "Тинростим". Раствор веществ с молекулярной массой более 100 кДа, содержащий ХЭ, концентрировали диафильтрацией до минимального объема, разливали во флаконы и направляли на сублимационную сушку. Сушку проводили при -1...+1 оС, досушивание — при 20 оС.
По окончании процесса сушки осуществляли контроль активности ХЭ. Ферментативная активность полученного препарата составляла 14,9 Е/мг навески препарата. Баланс материального потока показывает, что удельная ферментативная активность сырья равнялась 0,7 Е/мг ткани, а сублимированного сырья — 5,5 Е/мг, т.е. увеличение активности готового препарата ХЭ произошло в 21,0 раза по сравнению с мороженым сырьем и 2,7 раза по сравнению с сублимированным сырьем (табл. 2).
Таблица 2
Характеристика препаратов ХЭ, полученных различными методами
Table 2
Characteristics of Cholinesterase preparations received by different methods
Удельная Выход по массе, % ГД-42, ДФФ,
Метод активность ХЭ, от сублимированных к„ ■ 109 к„ ■ 107
мкМ АТХ/мин ' мг ганглиев М ■ мин-1 М ■ мин-1
Ультрафильтрация 24,7 15 11,5 1,20
Фракционирование 106,0 1 1,3 0,59
При получении ХЭ с использованием для частичной очистки ультрафильтрации выход препарата по активности от сублимированного сырья составлял 30 % — такой же, как и в случае получения ХЭ классическим методом (фракционированием сульфатом аммония) (Михеев, Ковалев, 2008). Однако удельная ферментативная активность оказалась значительно ниже (в 4,3 раза) по сравнению с таковой для ХЭ, полученной методом фракционирования сульфатом аммония, что показывает низкую степень очистки препарата. Препараты были охарактеризованы по чувствительности к фосфорорганическим ингибиторам. Следует отметить, что чувствительность препарата, полученного методом ультрафильтрации, к исследованным ингибиторам была в 2-9 раз выше по сравнению с препаратом, полученным методом фракционирования сульфатом аммония. Различия в чувствительности к ингибиторам ХЭ разной степени очистки объясняются эффектом паразитической сорбции ингибиторов на балластных белках (Садыков, 1976). Таким образом, характеристику ингибиторной специфичности необходимо учитывать при паспортизации препаратов ХЭ как биохимического реактива.
Осадок и фильтрат после отделения раствора ХЭ подвергали экстрагированию в 3 %-ной уксусной кислоте при соотношении 4 части кислоты на 1 г осадка. Экстракцию проводили в течение 48 ч при температуре 10 оС. Далее процесс осуществляли согласно ТИ 36-278-05.
Выход препарата "Тинростим" и его характеристики в зависимости от метода получения приведены в табл. 3.
Как видно из данных табл. 3, выход "Тинростима" составил 0,3 % от массы использованного сырья, в то время как выход препарата, получаемого традиционным способом (осаждением ацетона), составляет 1,0 % (Боровская и др., 2006). Значительное различие в величине выхода БАД, по-видимому, может быть объяснено наличием белковых фракций с молекулярной массой более 100 кДа в препарате, получаемом традиционным способом.
Органолептические и физико-химические показатели "Тинростима", полученного методом комплексной переработки сырья, не отличаются от таковых препарата, полученного обычным способом.
Tаблица 3
Opганoлeптичecкиe и физико-химические показатели 'Тинростима"
Table 3
Organoleptic and physical-chemical parameters of BASF Tinrostim
Метод получения Внешний вид Цвет pH Изоэл. точка, pH Pаcтвo-римость, мг/мл Массовая доля воды, % Мах. поглощен., X, нм Выход, % от массы сырья
Комплексный Аморфный порошок Светло-кремовый 6,8 4,35 15 1,2 267 ± 3 0,3
Стандартный Аморфный порошок Светло-кремовый 6,8 4,35 15 1,7 267 ± 3 1,0
Заключение
Впервые проведенное определение активности ХЭ нервных ганглиев головоногих моллюсков показало перспективность их использования в качестве сырья для получения фермента. Исследования показали возможность комплексной переработки ганглиев с получением ХЭ и БАД "Тинростим". Препарат холинэсте-разы обладает высокой чувствительностью к ФОС, а БАД "Тинростим" по орга-нолептическим и физико-химическим показателям соответствует препарату, полученному стандартным способом.
Предлагаемый метод получения ХЭ из головоногих моллюсков с помощью ультрафильтрации, по сравнению с методом фракционирования, имеет значительно меньше технологических стадий и требует меньших временных и материальных затрат за счет получения из отходов производства ХЭ другого продукта — БАД "Тинростим".
Список литературы
Боровская Г.А., Михеев Е.В., Эпштейн Л.М. и др. Метод ультрафильтрации в технологии получения тинростима // Изв. ТИНРО. — 2006. — Т. 146. — С. 294-299.
Бресткин А.П. Холинэстеразы наземных животных и гидробионтов : монография / А.П. Бресткин, Л.П. Кузнецова, С.Н. Моралев, Е.В. Розенгарт, Л.М. Эпштейн. — Владивосток : ТИНРО-центр, 1997. — 466 с.
Государственная фармакопея СССР. — 1987. — Вып. 1.
Дроздов Н.С. Практикум по биохимии / Н.С. Дроздов, Н.П. Материнская. — М. : Высш. шк., 1970. — 255 с.
Инструкция по сбору и определению видов промысловых кальмаров в Тихом океане / сост. Г.А. Шевцов. — Владивосток : ТИНРО, 1971. — 10 с.
Кабачник М.И. Фосфорорганические физиологически активные вещества // Вестн. АН СССР. — 1964. — № 40. — С. 60-68.
Ковалев Н.Н. Холинэстеразы двустворчатых моллюсков // Изв. ТИНРО. — 2003. — Т. 133. — С. 264-270.
Ковалев Н.Н., Михеев Е.В. Холинэстеразы мозга морских млекопитающих // Изв. РАН. Сер. биол. — 2006. — № 3. — С. 377-380.
Ковалев Н.Н., Розенгарт Е.В., Хованский А.Е. Различия в свойствах холинэс-теразы командорского кальмара из разных районов обитания // Вопр. эволюц. физиол.: Десятое совещ. по эволюц. физиол. : тез. сообщ. — Л. : Наука, 1986. — С. 126.
Ковалев Н.Н., Розенгарт Е.В., Чепкасова А.И. Субстратная специфичность холинэстеразной активности ткани головного мозга особей различных популяций морской тихоокеанской сельди Clupea hallasii Val. // ДАН. — 2003. — Т. 392, № 3. — С. 402-405.
Козловская В.И., Мензикова О.В., Чуйко Г.М., Майер Ф.Л. Холинэстеразы водных животных // Физиология, биохимия и токсикология пресноводных животных. — Л., 1990. — С. 42-66.
Михеев Е.В., Ковалев Н.Н. Обоснование биотехнологии производства ферментного препарата из зрительных ганглиев кальмаров // Мат-лы науч. конф. "Современное
состояние водных биоресурсов", посвященной 70-летию С.М. Коновалова. — Владивосток, 2008. — С. 904-907.
Михеев E.B., Ковалев H.H. Роль видовых различий холинэстеразы нервной ткани тихоокеанских головоногих моллюсков // Изв. ТИНРО. — 2007. — Т. 151. — С. 460-465.
Садыков А'С' Холинэстеразы. Активный центр и механизм действия : монография / А.С. Садыков, Е.В. Розенгарт, А.А. Абдувахабов, Х.А. Асланов. — Ташкент : Изд-во "ФАН" Узбекской ССР, 1976. — 204 с.
ТИ 36-278-05' Инструкция по изготовлению гидролизата ганглиев кальмаров "Тинростим"'
ТУ 9280-1203-00472012-96' Пилорин марки А.
Эпштейн Л'М', Шевцов Г.А., Ковалев H.H., Розенгарт E.B. Субстратная специфичность холинэстераз зрительных ганглиев кальмаров как показатель ценности сырья // Технология гидробионтов : сб. науч. тр. — Владивосток : ТИНРО, 1987. — С. 37-45.
Chan S'L', Shirachi D.Y., Hargava H.N. et al. Purification and properties of multiple forms of brain acetylcholinesterase // J. Neurochem. — 1972. — Vol. 19, № 12. — P. 2747-2758.
Ellman G'L', Courtney K.D., Andres V.Jr., Featherstone R.M. A new and repid colorimetric determination of acetylcholinesterase activiti // Biochem. Pharmocol. — 1961. — Vol. 7, № 1. — P. 88-95.
Jebali J., Bani M., Guerbej H. et al. Effects of malathion and cadmium on acetylcholinesterase activity and metallothionein levels in the fish Seriola dumerilli // Fish Phys-iol. Biochem. — 2006. — Vol. 32. — P. 93-98.
Podolska M., Napierska D. Acetylcholinesterase activity in host (herring Clupea harengus) and parasites (Anisakis simplex larvae) from the southern Baltic // J. Mar. Sci. — 2006. — Vol. 63. — P. 161-168.
Поступила в редакцию 29.07.09 г.
