CC BY
51
ХИМИЯ И ХИМИЧЕСКАЯ ТЕХНОЛОГИЯ
УДК 612.26.014.46:547.979.733
Н. А. Антонова, В. П. Осипова*, М. Н. Коляда*,
Н. О. Мовчан , Ю. Т. Пименов, Е. Р. Милаева
Астраханский государственный технический университет Южный научный центр РАН Ростов-на-Дону
Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СКОРОСТИ ПЕРОКСИДНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ В ПЕЧЕНИ РУССКОГО ОСЕТРА В ПРИСУТСТВИИ СОЕДИНЕНИЙ РТУТИ, ОЛОВА,
КАДМИЯ И ПОРФИРИНОВ IN VITRO
Введение
Ранее нами было показано, что токсичность соединений тяжелых металлов может быть связана не только с комплексообразованием важных биомишеней, но и с развитием радикальных процессов [1]. Вследствие этого в качестве антидотов можно использовать ловушки активных радикалов - антиоксиданты (АО). Предположительно, наиболее эффективными токсико-протекторами будут являться соединения, содержащие в молекуле как антиоксидантную часть, так и комплексообразующие группы. В качестве таких соединений могут выступать порфири-новые системы, которые участвуют в глобальном биоэнергетическом механизме - в процессе биологического окисления. В последние десятилетия природные, а также синтетические порфи-рины применяются в технике, промышленности и медицине [2]. Активно изучается возможность проявления синтетическими порфиринами про-, антиоксидантных свойств [3-4]. Эти соединения, в силу уникальности своей электронной структуры, обладают широким спектром полезных свойств, в частности способны эффективно проникать в клетки [2].
Постановка задачи
Как известно, процессы пероксидного окисления липидов (ПОЛ) вносят основной вклад в общую интенсивность свободнорадикальных реакций in vivo [5-7]. В связи с этим целью данной работы явилось изучение скорости ПОЛ печени русского осетра in vitro в присутствии соединений ртути, олова, кадмия и порфиринов, а также исследование детоксицирующего действия порфиринов при токсическом воздействии соединений тяжелых металлов. В данной работе использовали модельную систему с длительным протеканием ПОЛ для выявления действия АО при продолжительном окислительном стрессе организма, когда интенсивность ПОЛ возрастает, а концентрация АО падает.
Проведены исследования по влиянию тетрафенилпорфирина (ТРР), 3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенилпорфирина (ТРР-ОН) на накопление карбонильных продуктов, определяемых с помощью тиобарбитуровой кислоты (ТБК) в печени русского осетра (Acipenser güldenstädti Brandt) in vitro в присутствии Hg(NO3)2, CH3HgI, CdCl2 и (CH3)2SnCl2 в условиях длительно протекающего окисления. Исследованные соединения предоставлены сотрудниками лаборатории физической органической химии и лаборатории механизмов реакций кафедры органической химии химического факультета Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова.
Определение проводили по стандартной методике [8]. Пробу печени 0,5 г русского осетра гомогенизировали в 19,5 мл охлажденного до 0-4 °С раствора хлорида калия, поместив стакан гомогенизатора в лед или снег. Исследуемые соединения вносили в гомогенат печени в виде раствора в хлороформе, предварительно подтвердив отсутствие в данных условиях влияния хлороформа на скорость ПОЛ в контроле. Начальная концентрация исследуемых соединений составляла 1 ■ 10-4 моль/л.
Полученную смесь сливали в колбы и инкубировали с добавками исследуемых соединений в течение 48 ч при температуре 5 °С, отбирая через определенный интервал времени по 2 мл гомогената в пробирки для дальнейшего центрифугирования. В эти же пробирки добавляли по 0,1 мл растворов аскорбиновой кислоты и соли Мора, 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Пробирки помещали на 10 мин в водяную баню при температуре 37 °С, центрифугировали 10 мин при частоте оборотов 3 000 об/мин. Затем отбирали в чистые пробирки по 2 мл надоса-дочной жидкости, приливали по 1 мл раствора ТБК, помещали пробы в кипящую водяную баню на 10 мин и затем охлаждали их в ледяной воде до комнатной температуры. После охлаждения в пробы добавляли 1,0 мл хлороформа для получения прозрачного раствора и центрифугировали 15 мин при частоте оборотов 3 000 об/мин. Отбирали надосадочную жидкость и измеряли экстинкцию пробы на спектрофотометре СФ-103 при 532 нм относительно контрольной пробы.
Расчет проводили по формуле
X = (Е • 3 • 3,2)/(0,156 • 2),
где X - содержание малонового диальдегида (МДА) в исходном гомогенате, нмоль; Е - экстинкция проб; 3,2 - общий объем исследуемых проб, мл; 2 - объем надосадочной жидкости, взятой на определение МДА, мл; 3 - объем проб, мл; 0,156 - экстинкция 1 нмоль МДА в 1 мл при 532 им.
С целью выявления возможного вовлечения соединений ртути, олова, кадмия в химические реакции с порфиринами и ТБК на молекулярном уровне в модельных условиях были проведены спектрофотометрические исследования. Электронные спектры поглощения исследуемых соединений регистировали на приборе СФ-103 в кварцевых кюветах. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии взаимодействия токсикантов с порфиринами и ТБК.
Скорость ПОЛ определяли по количеству накопленных в образце продуктов, реагирующих с ТБК. Для каждого экспериментального определения проводили несколько опытов (6-10). Характер влияния определяли по средним значениям величин активности с учетом ошибки эксперимента.
На рис. 1-4 приведены средние значения серии опытов, проводившихся в одинаковых условиях, с разными пробами печени рыб, по влиянию соединений ртути, олова, кадмия и порфи-ринов на скорость накопления ТБК-активных продуктов в печени русского осетра.
В контрольном опыте содержание МДА закономерно увеличивается со временем. Наибольшее промотирующее действие в ряду исследованных токсикантов проявлял (СН3)28иС12 на начальном этапе ПОЛ (1-3 ч), увеличивая содержание ТБК-активных продуктов примерно в 2 раза по сравнению с контролем (рис. 1).
МЦА, нмоль/ч
1ч 3 ч 24 ч 48 ч
Средние значения опытов
Рис. 1. Изменение скорости накопления ТБК-активных продуктов в печени русского осетра in vitro в присутствии исследуемых веществ: 1 - контроль; 2 - (CH3)2SnCl2; 3 - (CH3)2SnCl2 + ТРР-ОН;
4 - (CH3)2SnCl2 + ТРР; 5 - ТРР; 6 - ТРР-ОН
Метилиодид ртути и хлорид кадмия оказывали наибольшее промотирующее действие на средних этапах ПОЛ (24 ч), увеличивая скорость в среднем на 62-8 % (рис. 2, 3).
Рис. 2. Изменение скорости накопления ТБК-активных продуктов в печени русского осетра in vitro в присутствии исследуемых веществ:
1 - контроль; 2 - CdCl2; 3 - CdCl2 + ТРР; 4 - CdCl2 + ТРР-ОН; 5 - ТРР; 6 - ТРР-ОН
Рис. 3. Изменение скорости накопления ТБК-активных продуктов в печени русского осетра in vitro в присутствии исследуемых веществ:
1 - контроль; 2 - CH3HgI; 3 - CH3HgI + ТРР; 4 - CH3HgI + ТРР-ОН; 5 - ТРР; 6 - ТРР-ОН
Наименьшее прооксидантное действие проявлял нитрат ртути, при добавлении которого скорость возрастала примерно на 36 %, причем на средних (24 ч) и отдаленных (48 ч) этапах ПОЛ (рис. 4).
Рис. 4. Изменение скорости накопления ТБК-активных продуктов в печени русского осетра in vitro в присутствии исследуемых веществ:
1 - контроль; 2 - Hg(NO3)2; 3 - ТРР; 4 - ТРР-ОН; 5 - Hg(NO3)2 + ТРР-ОН; 6 - Hg(NO3)2 + ТРР
Таким образом, добавки ^(К03)2, СН3Н§1, С<1С12 и (СН3)28пС12 промотировали ПОЛ на всех этапах исследования. Поскольку липиды являются основными компонентами биомембран, данное усиление ПОЛ может привести к изменению структурной и функциональной организации клеточных мембран, нарушению проницаемости и ионному дисбалансу. В связи с этим наиболее целесообразным представляется использование в качестве детоксикантов соединений, обладающих антиоксидантными свойствами. В качестве таких соединений в работе были исследованы порфирины, которые имеют множественный механизм действия, т. е. они могут являться ловушками активных радикалов и одновременно комплексообразователями. Двойственный характер их действия способен повысить эффективность детоксицирующих свойств.
3,5-ди-треда-бутил-4-гидр°ксифенилп°рфирин Тетрафенилпорфирин (ТРР)
(ТРР-ОН)
При добавлении порфиринов в гомогенат печени русского осетра без добавок токсикантов скорость ПОЛ снижалась. Показано, что эффективность антиоксидантного действия зависит от химической структуры порфиринового соединения. Как видно на диаграммах, 3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенилпорфирин на всех этапах ПОЛ снижал скорость накопления малонового диальдегида примерно на 50 %. Тетрафенилпорфирин на ранних этапах ПОЛ проявлял незначительное антиоксидантное действие, снижая скорость в среднем на 20-30 %, на средних и отдаленных этапах ПОЛ наблюдалась инверсия антиоксидантных свойств в прооксидантные.
Можно предположить, что большая эффективность ТРР-ОН проявляется за счет наличия фенольных фрагментов, т. е. 3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенилпорфирин является ловушкой активных радикалов, участвующих в процессе ПОЛ, благодаря образованию стабильной структуры.
При совместном внесении токсикантов и ТРР-ОН в гомогенат печени антиоксидантное действие наблюдалось уже на ранних этапах окисления, максимальный эффект - через 24-48 ч (> 50 % снижения промотирования). В случае ТРР антиоксидантное действие проявляется на начальных этапах ПОЛ, причем в меньшей степени по сравнению с ТРР-ОН. На отдаленных этапах ПОЛ тет-рафенилпорфирин практически не снижал скорость ПОЛ в присутствии токсикантов.
Заключение
Таким образом, промотирование ПОЛ печени русского осетра в присутствии соединений ртути, олова и кадмия, а также снижение скорости ПОЛ в присутствии порфиринов подтверждают, что одной из причин высокой токсичности соединений тяжелых металлов является развитие радикальных процессов. Показано снижение промотирующего действия соединений ртути, олова и кадмия на ПОЛ печени осетровых в присутствии добавок порфиринов. Установлена большая эффективность 3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенилпорфирина по сравнению с тетра-фенилпорфирином. Найдено, что эффективность антиоксидантного действия порфиринов зависит от химической природы, а также от длительности процесса окисления.
Работа выполнена при поддержке программы ОНЗ РАН «Развитие технологий мониторинга, эко-
системное моделирование и прогнозирование при изучении природных ресурсов в условиях аридного климата» программы ОБН РАН «Биологические ресурсы России: фундаментальные основы рационального использования» РФФИ (грант № 07-03-96602- р_поволжье_а).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Пименов Ю. Т., Давыдова С. Л., Милаева Е. Р. Ртуть, олово, свинец и их органические производные в окружающей среде. - Астрахань: Изд-во АГТУ, 2001. - 147 с.
2. Effects of metalloporphyrin catalytic antioxidants in experimental brain ischemia / Huaxin Sheno, Jan J. Enghild, Russell Bowler et al. // Free Radical Biology & Medicine. - Vol. 33, N 7. - 2002. - P. 947-961.
3. Man a Jose Perez, Arthur I. Cederbaum. Antioxidant and pro-oxidant effects of a manganese porphyrin complex against CYP2E1-dependent toxicity // Free Radical Biology & Medicine. - Vol. 33, N 1. - 2002. -P. 111-127.
4. Tatsuru Hara, Dennis J. Grab, Masaaki Tabata, Toshihide Fukuma. Toxic effects of mercury(II), cad-mium(II) and lead(II) porphyrins on Trypanosoma brucei brucei growth // Chemico-Biological Interactions. - 2002. - 139. - P. 177-185.
5. Fridovich I. Oxygen toxicity: A radical explanation // J. Exp Biol. - 1998. - Vol. 201. - P. 1203-1209.
6. Halliwell B., Gutteridge J. M. C. Role of free radicals and catalytic metal ions in human disease: An overview // Methods Enzymol. - 1990. - Vol. 186. - P. 1-85.
7. Halliwell B., Gutteridge J. M. C. Free Radicals in Biology and Medicine. - Oxford: OxfordUniversity Press, 1999.
8. Строев Е. Н., Макарова В. Г. Практикум по биологической химии. - М.: Высш. шк., 1986. - 279 с.
Статья поступила в редакцию 19.12.2006
DETERMINATION OF LIPIDES PEROXIDATION VELOCITY IN RUSSIAN STURGEON LIVER IN PRESENCE OF MERCURY, TIN, CADMIUM AND PORPHYRINES COMPOUNDS IN VITRO
N. A. Antonova, V. P. Osipova, M. N. Kolyada,
N. O. Movchan, Yu. T. Pimenov, E. R. Milaeva
We have analyzed the influence of the (tetraphenylporphyrin (TPP), 3,5-di-tret-butil-4-hydroxyphenylporphyrin (TPP-OH)) on carbonylic products accumulation identifying with thiobarbituric acid - malondialdehyde (MDA) in liver of the Russian sturgeon (Acipenser guldenstadti Brandt) in vitro in presence of Hg(NO3)2, CH3HgI, CdCl2 and (CH3)2SnCl2 in condition of long running oxidation. It was shown the reduction of promoting action of mercury, tin and cadmium compounds on lipids peroxidation in sturgeon liver in presence of porphyrines additions. The greater efficiency was observed for TPP-OH in comparison with TPP. The efficiency of antioxidative action of studying porphyrines depends on duration of the oxidation process as well as chemical nature of porphyrines. Thus, promoting action of mercury, tin and cadmium compounds of the sturgeon liver lipids peroxidation, as well as decreasing of promoting action of lipids peroxidation at presence of porphyrines confirms that high toxic effect of heavy metal can be connected with their involving into radical processes.
