CC BY
50
УДК [597-1.044:597.442-143.6]:[665.6:661.881]
И. М. Чернушкина, М. Н. Коляда*, В. П. Осипова*, Ю. Т. Пименов
Астраханский государственный технический университет Южный научный центр РАН Ростов-на-Дону
ИССЛЕДОВАНИЕ
СОВМЕСТНОГО ВЛИЯНИЯ СЫРОЙ НЕФТИ И ДИМЕТИЛОЛОВОДИХЛОРИДА НА СКОРОСТЬ ПЕРОКСИДНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ ГОМОГЕНАТА ПЕЧЕНИ РУССКОГО ОСЕТРА IN VITRO
Введение
Каспийское море входит в число наиболее загрязненных районов Мирового океана, при этом оно представляет собой уникальную экосистему, в которой обитают реликтовые виды гид-робионтов, а в недрах содержатся большие запасы углеводородов. Расширение нефтегазодобывающей деятельности на морском шельфе Каспия, имеющем рыбохозяйственное значение, обусловливает актуальность проблемы защиты экосистем Каспия от воздействия нефтегазодобычи [1]. Нефть, попавшая в море, может переноситься на многие сотни миль от места сброса, постепенно проникать в толщу морской воды, накапливаться в донных осадках, а затем вновь всплывать на поверхность, создавая вторичное загрязнение [2, 3]. Проблема загрязнения нефтепродуктами очень остра на Северном Каспии, т. к. в его акватории из-за несовершенства систем и оборудования нефтедобывающего комплекса, а также увеличения объемов перевозок танкерами сырой нефти и нефтепродуктов наблюдается систематическое скопление огромной массы нефтяных пятен. Значительное количество нефти попадает в моря при аварии судов, особенно нефтеналивных [4]. На экологическое состояние края, помимо внутренних источников, отрицательно влияют нефтепромысловые и газоперерабатывающие предприятия соседних областей. Серьезную экологическую угрозу представляют продукты трансформации нефти, способные к взаимодействию с другими токсикантами, такими как металлоорганические соединения тяжелых металлов.
В эколого-токсикологическом отношении нефть представляет собой комплексный токсикант неспецифического действия. В большой серии работ показана токсичность нефти, её фракций и продуктов нефтедобычи для растительных и животных организмов [5-9], в том числе и для русского осетра [10, 11]. Большую часть таких исследований составляют аквариальные эксперименты по влиянию отдельных ксенобиотиков. Исследований, в которых проводился бы анализ совместного влияния нефти и тяжелых металлов, недостаточно. Опубликованы лишь единичные работы, в которых изучены биохимические механизмы токсического влияния нефти и тяжелых металлов на гидробионтов [12-14].
Учитывая, что в последние годы отмечается тенденция к загрязнению вод Северного Каспия и р. Волги тяжелыми металлами и нефтепродуктами, целесообразно исследовать совместное влияние органических соединений тяжелых металлов и сырой нефти на гидробионтов.
Целью работы являлось изучение совместного влияния диметилоловодихлорида и сырой нефти на скорость пероксидного окисления липидов (ПОЛ) гомогената печени самки русского осетра (Acipenser guldenstadti Brandt) in vitro в условиях длительно протекающего процесса (72 часа), а также поиск детоксицирующих агентов.
Ниже представлены результаты исследований по совместному влиянию метильного двух-замещенного органического производного олова (CH3)2SnCl2* и сырой нефти на накопление карбонильных продуктов, определяемых с помощью тиобарбитуровой кислоты (ТБК) в гомогенате печени русского осетра (Acipenser guldenstadti Brandt) in vitro в условиях длительно протекающего окисления.
* Здесь и далее: исследованные соединения предоставлены сотрудниками лаборатории физической органической химии и лаборатории механизмов реакций кафедры органической химии химического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.
В качестве токсичного металлоорганического соединения был выбран (CH3)2SnCl2, т. к. ранее нами была показана высокая промотирующая активность данного соединения в модельной системе ПОЛ печени осетра in vitro. В исследованиях использовали сырую нефть Тенгизского месторождения, содержащую около 30 % парафинов, 2,5 % ароматических углеводородов (бензол, толуол) и 0,06 % серы.
В качестве детоксицирующего агента изучено влияние добавок (4-гидрокси-3,5-ди-трет-бутилфенил) метилендифосфоновой кислоты на скорость ПОЛ в сравнении с широко применяемым антиоксидантом - ионолом. Определение проводили по стандартной методике [15]. Пробу 0,5 г печени русского осетра гомогенизировали в 19,5 мл охлажденного до 0-4 °С раствора хлорида калия, поместив стакан гомогенизатора в лед или снег. Исследованные соединения вносили в гомогенат печени в виде раствора в хлороформе, предварительно подтвердив отсутствие в данных условиях влияния хлороформа на скорость ПОЛ в контроле.
Полученную смесь сливали в колбы и инкубировали с добавками исследуемых соединений в течение 48 часов при температуре 5 °С, отбирая через определенный интервал времени по 2 мл гомогената в пробирки для дальнейшего центрифугирования. В эти же пробирки добавляли по 0,1 мл растворов аскорбиновой кислоты и соли Мора, 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Пробирки помещали на 10 минут в водяную баню при температуре 37 °С, центрифугировали 10 минут при частоте оборотов 3 000 об/мин. Затем отбирали в чистые пробирки по 2 мл надосадочной жидкости, приливали по 1 мл раствора ТБК, помещали пробы в кипящую водяную баню на 10 минут и затем охлаждали их в ледяной воде до комнатной температуры. После охлаждения в пробы добавляли 1,0 мл хлороформа для получения прозрачного раствора и центрифугировали 15 минут при частоте оборотов 3 000 об/мин. Отбирали надосадочную жидкость и измеряли экстинкцию пробы на спектрофотометре СФ-103 при 532 нм относительно контрольной пробы.
Расчет проводили по формуле
X = (Е ■ 3 ■ 3,2)/(0,156 ■ 2),
где X - содержание малонового диальдегида (МДА) в исходном гомогенате, нмоль; Е - экстинкция проб; 3,2 - общий объем исследуемых проб, мл; 2 - объем надосадочной жидкости, взятой на определение МДА, мл; 3 - объем проб, мл; 0,156 - экстинкция 1 нмоль МДА в 1 мл при 532 нм.
Скорость ПОЛ определяли по количеству накопленных в образце продуктов, реагирующих с ТБК. Для каждого экспериментального определения проводили несколько опытов (6-10). Характер влияния определяли по средним значениям величин активности с учетом ошибки эксперимента.
Как следует из рис. 1, в контрольном опыте содержание МДА закономерно увеличивается со временем. В случае раздельного действия токсикантов на начальном этапе ПОЛ (0,5 ч) большая степень промотирования данного процесса наблюдалась при добавлении нефти.
На средних и отдаленных этапах ПОЛ наибольшим промотирующим действием обладала добавка диметилоловодихлорида. При комбинированном действии нефтяных углеводородов и (CH3)2SnCl2 на всех исследованных этапах ПОЛ промотирующий эффект был выражен в большей степени, чем при раздельном действии этих ксенобиотиков.
Для снижения скорости ПОЛ печени осетра при комбинированном действии нефтяных углеводородв и (CH3)2SnCl2 использовали добавку фосфорилсодержащего производного ионола (4-гидрокси-3,5-ди-трет-бутилфенил) метилендифосфоновой кислоты. Фосфорилзамещенные пространственно-затрудненные фенолы представляют интерес как полифункциональные ингибиторы окислительных процессов (комбинация антирадикальной и хелатирующей активности).
Антиоксидантные свойства исследуемого соединения на различных этапах ПОЛ печени в условиях автоокисления и промотирования ПОЛ нефтяными углеводородами и (CH3)2SnCl2 при их совместном добавлении изучали в сравнении с известным антиоксидантом 2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенолом (ионолом).
МДА, нмоль/ч
В 0,5 ч
□ 24 ч Н 48 ч
□ 72 ч
Рис. 1. Изменение скорости накопления ТБК-активных продуктов в гомогенате печени русского осетра в присутствии исследуемых веществ: 1 - контроль; 2 - сырая нефть; 3 - (CH3)2SnCl2;
4 - сырая нефть + (CH3)2SnCl2; концентрация сырой нефти - 0,049 мг/л, [(CH3)2SnCl2] - 2 ■ 10-4 М
Моделирование in vitro поведения антиоксидантов на отсроченных этапах ПОЛ позволило выявить их отдаленные эффекты при длительном окислительном стрессе организма, вызванном совместным действием исследуемых токсикантов, когда концентрация антиоксидантов уменьшается, а интенсивность ПОЛ возрастает.
Рис. 2. Изменение скорости накопления ТБК-активных продуктов в гомогенате печени русского осетра in vitro в присутствии исследуемых веществ: 1 - контроль; 2 - сырая нефть + (CH3)2SnCl2;
3 - 2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол (ионол); 4 - сырая нефть + (CH3)2SnCl2 + ионол;
5 - (4-гидрокси-3,5-ди-трет-бутилфенил) метилендифосфоновая кислота; б - сырая нефть + (CH3)2SnCl2 + (4-гидрокси-3,5-ди-трет-бутилфенил) метилендифосфоновая кислота. Концентрация сырой нефти - 0,05 мг/л, концентрация (CH3)2SnCl2 - 2-10-4 М
Согласно полученным результатам (рис. 2), наибольшее снижение скорости ПОЛ установлено при добавлении в гомогенат печени (4-гидрокси-3,5-ди-трет-бутилфенил) метиленди-фосфоновой кислоты как при автоокислении, так и при промотировании ПОЛ совместной добавкой нефтяных углеводородов и (СИ3)28пС12. Следует отметить, что антиоксидантная активность исследуемой стерически-затрудненной фосфоновой кислоты незначительно увеличивается в ходе протекания процесса ПОЛ, так что, в отличие от ионола, скорость ПОЛ в этом случае несколько снижается на отдаленных этапах данного окислительного процесса.
Заключение
Таким образом, в модельной системе ПОЛ гомогената печени осетра установлено усиление промотирования ПОЛ при комбинированном действии сырой нефти и (СИ3)28иС12 на всех исследованных этапах ПОЛ. Показана высокая антиоксидантная активность (4-гидрокси-3,5-ди-трет-бутилфенил) метилендифосфоновой кислоты в условиях промотирования ПОЛ совместной добавкой нефтяных углеводородов и (СИ3)28иС12.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Вронский В. А. Эколого-географические проблемы Каспийского моря // География и природные ресурсы. - 2006. - № 1. - С. 31-35.
2. Черкашин С. А. Отдельные аспекты влияния углеводородов нефти на рыб и ракообразных // Вестн. ДВО РАН. - 2005. - № 3. - С. 83-91.
3. Соколова М. Н. Индивидуальные органические соединения в осадках Северного Каспия как индикаторы природных и техногенных источников поступления органического вещества: Автореф. дис. ... канд. геол.-минерал. наук. - М., 2007. - 22 с.
4. Слащева А. С. Источники загрязнения окружающей среды нефтепродуктами // Проблемы безопасности при чрезвычайных ситуациях: ОИ / ВИНИТИ, 1997. - Вып. 9. - С. 54-59.
5. Нельсон-Смит А. Нефть и экология моря. - М.: Прогресс. 1977. - 302 с.
6. Патин С. А. Нефть и экология континентального шельфа. - М.: ВНИРО, 2001. - 248 с.
7. Михайлова Л. В. Действие водорастворимой фракции усть-балыкской нефти на ранний онтогенез стерляди Аз1рвтвг гыгкепт // Гидробиологический журнал. - 1991. - Т. 27, № 3. - С. 77-86.
8. Пфейфере М. Ю., Платипира В. П. Углеводороды и морская микрофлора // Экспериментальная водная токсикология. - Рига: Зинатне, 1986. - Вып. 11. - С. 37-43.
9. Степаньян О. В., Воскобойников Г. М. Влияние нефти и нефтепродуктов на морфофункциональные особенности морских макроводорослей // Биология моря. - 2006. - Т. 32, № 4. - С. 241-248.
10. Кинетические закономерности нефтяной интоксикации сеголеток русского осетра / А. М. Бутаев, А. Р. Исуев,
У. Г. Магомедбеков, С. К. Монах // Вестн. Дагестан. науч. центра РАН. - 2001. - № 9. - С. 89-93.
11. Геоэкологические последствия аварийных морских разливов нефти / Д. Я. Фащук, С. Н. Овсиенко, А. В. Леонов и др. // Изв. РАН. Сер. геогр. - 2003. - № 5. - С. 57-73.
12. Исследование повреждающего действия нефти и продуктов ее переработки на Баркта та^а /
А. А. Ратушняк, М. Г. Андреева, В. З. Латыпова, Л. Г. Гарипова // Гидробиологический журнал. - 2000. -Т. 36, № 6. - С. 92-101.
13. Петухова Г. А. Эколого-генетические последствия воздействия нефтяного загрязнения на организмы: Автореф. дис. ... д-ра биол. наук. - 48 с.
14. Липидный состав амфипод Белого моря при разных типах антропогенного воздействия / В. В. Богдан, Н. Н. Немова, Т. Р. Руоколайнен, Г. А. Шкляревич // Проблемы изучения, рационального использования и охраны ресурсов Белого моря: Материалы IX междунар. конф., 11-14 октября 2004 г., Петрозаводск. - Петрозаводск, 2005. - С. 47-50.
15. Строев Е. Н., Макарова В. Г. Практикум по биологической химии. - М.: Высш. шк., 1986. - 280 с.
Работа выполнена при поддержке программы ОНЗ РАН «Развитие технологий мониторинга, экоси-стемное моделирование и прогнозирование при изучении природных ресурсов в условиях аридного климата», программы ОБН РАН «Биологические ресурсы России: Фундаментальные основы рационального использования», РФФИ (грант № 07-03-96602- р_поволжье_а).
Статья поступила в редакцию 29.11.2006
THE STUDY OF THE JOINT INFLUENCE OF CRUDE OIL AND DIMETHYLTIN DICHLORIDE UPON VELOCITY OF LIPID PEROXIDATION OF THE STURGEON'S LIVER HOMOGENATE IN VITRO
I. M. Chernushkina, M. N. Kolyada, V. P. Osipova, Yu. T. Pimenov
It is shown that the promoting effect of a mixture of crude oil and di-methyltin dichloride on the oxidation of the sturgeon's liver homogenate lipids is higher than the effects of these compounds used separately in the same concentrations under conditions of long running oxidation. For the first time the detoxification effect of [(3,5-di-/er/-butyl-4-hydroxyphenyl) hydroxymethyl] diphos-phonic acid - phosphoryl compound containing sterically hindered phenol fragment in comparison with standard antioxidant - 2,6-di(/er/-butyl)-4-
methylphenol (ionol) - is considered. The greater efficiency of antioxidative action for the novel antioxidant of multifunction action is observed in autoxidation of the sturgeon's liver homogenate lipids as well as in conditions of promotion of this process by a mixture of the crude oil and dimethyltin dichloride.
