CC BY
56
УДК 612.26.014.46:546.49
В. П. Осипова, С. А. Ильина*, О. И. Есина,
Ю. Т. Пименов , Н. Т. Берберова, Е. Р. Милаева
Южный научный центр РАН Ростов-на-Дону Астраханский государственный технический университет Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова
ПРИМЕНЕНИЕ ВИТАМИНА Е В КАЧЕСТВЕ АНТИДОТА ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ВОЗДЕЙСТВИИ ХЛОРИДА КАДМИЯ
Введение
Осетровые породы рыб относятся к реликтовым видам рыб. Они обладают исключительной биологической ценностью, т. к. являются источником высокоэффективных биологически активных веществ, проявляющих антимутагенную активность. Несмотря на растущие потребности человечества в рыбной продукции, численность представителей осетровых пород постоянно снижается. Так, в результате антропогенного воздействия [1] численность осетровых рыб в Каспийском море в 1995 г. по сравнению с 1978 г. упала со 140 млн шт. до 25 млн шт. [2], а в настоящее время она снизилась ещё в 2 раза.
Одной из причин сокращения популяции осетровых рыб является загрязнение рыбохозяйственных водоемов региона Северного Каспия тяжелыми металлами. В 2000-2001 гг. зафиксировано превышение ПДК по ртути в 3-6 раз в различных районах экосистемы и в 7 раз - в придонном слое Северного Каспия. С освоением Аксарайского месторождения связывают загрязненность р. Ахтубы медью (8,3 мгк/л), цинком (31,5 мгк/л), свинцом (16,0 мгк/л), никелем (5,1 мгк/л), кадмием (1,1 мгк/л), ртутью (1,16 мгк/л) [3].
Опасность загрязнения природной среды тяжелыми металлами заключается в том, что они вызывают нарушения функций многих жизненно важных систем даже в очень низких концентрациях [4]. Кроме того, тяжелые металлы способны накапливаться в тканях гидробионтов с огромной скоростью - так, например, через 30 дней устанавливается равновесие между содержанием кадмия в воде и тканях гидробионтов [5].
Кадмий относится к редким элементам, однако он широко используется в промышленности. Источниками загрязнения окружающей среды кадмием являются предприятия цветной металлургии, машиностроительной, химической, лёгкой промышленности, а также процессы сжигания топлива [6]. Большую опасность для водных экосистем в Нижнем Поволжье представляет газоперерабатывающий комплекс. В целом интенсивность антропогенного поступления кадмия на водную поверхность достигает 132 т в год. Хотя природные концентрации кадмия обычно невелики и не превышают 1 мкг/л, в загрязненных водах его находится значительно больше, кроме того, он способен адсорбироваться на твердых частицах и переноситься на большие расстояния.
Некоторые авторы считают, что 30-55 % кадмия, поступающего в почву, имеет биологическое происхождение. К биологическим источникам при этом относят процессы микробиологического метилирования, приводящие к образованию органических соединений кадмия (образующиеся соединения летучи и из почвы они испаряются в атмосферу) [7].
В организме кадмий связан преимущественно с металлопротеином, белком низкой молекулярной массы. Этот белок участвует как в транспорте кадмия, так и преимущественном его хранении. У некоторых животных кадмий может вызывать гипертонию. Известно также, что кадмий увеличивает обратную реабсорбцию натрия почечными канальцами и повышает содержание ренина в плазме крови. Кадмий может также препятствовать всасыванию меди из кишечника. Скармливание кадмия приводит к дегенеративным изменениям эластина аорты.
Несмотря на то, что исследования механизма токсического влияния кадмия на организм ведутся еще с XX в., в настоящее время не существует единой концепции, объясняющей вклады различных возможных механизмов в общей механизм токсичности.
Большинство исследователей объясняют токсичность соединений тяжелых металлов способностью к комплексообразованию с аминокислотами - компонентами белков. В результате нарушается структура белков, в том числе ферментов, а это в свою очередь приводит к серьезным нарушениям обменных процессов и различным патологиям в живых организмах.
Исследования, проведенные нами ранее, показали, что токсические эффекты соединений тяжелых металлов могут быть следствием окислительного стресса, промотированного данными токсикантами, которые инициируют перекисное окисление липидов (ПОЛ). В связи с этим предложен доступный способ снижения окислительного стресса и повышения устойчивости организма к воздействию соединений тяжелых металлов путем добавления природных антиоксидантов в корма рыб [8].
Постановка задачи
Цель работы - оценить токсичность хлорида кадмия на основе рыбоводно-биологических и биохимических показателей, а также рассмотреть возможность повышения резистентности молоди осетровых пород Северного Каспия за счет действия стресс-протекторов антиоксидантного действия.
Методы и результаты исследования
Нами проведены эксперименты по выращиванию молоди осетровых рыб при добавлении в корма хлорида кадмия CdCl2 и природного антиоксиданта - витамина Е.
Опыты проводились в установке с замкнутым водоснабжением (УЗВ), которая включает в себя ряд ёмкостей объёмом 400 л для выращивания рыбы, биофильтр, насос и системы трубок-флейт.
В опытах использовали сеголеток русского осетра (Acipenser guldenstadti Brandt).
Кормление проводилось вручную, расчёт нормы кормления производили исходя из массы тела и температуры воды.
Гидрохимические показатели воды за период проведения эксперимента находились в норме, температура воды поддерживалась в интервале 23-25 °С.
Хлорид кадмия добавляли в корм в виде водного раствора. В течение 30 дней велось наблюдение за темпами роста и развития молоди в каждой группе.
Рыбоводно-биологические показатели рассчитывали следующим образом:
- среднесуточная скорость роста сеголеток (по формуле сложных процентов [9]):
А = [(тк / Шо)1/‘ - 1] • 100 %,
где тк и т0 - масса рыбы в конце и начале опыта; ґ - продолжительность опыта, дни;
- абсолютный прирост:
Раб = тк - т00Г ,
где тк - конечная масса молоди; г; т0 - начальная масса молоди, г;
- среднесуточный прирост:
Рсреднесут (тк т0) / Аі, г/сут,
где Аі - период выращивания, сут.
Определение скорости перекисного окисления липидов в гомогенатах печени проводили по стандартной методике [10] по накоплению малонового диальдегида (МДА), дающего окрашенный комплекс с тиобар-битуровой кислотой (ТБК). Развитие окраски определяли спектрофотометрически при 532 нм.
Гомогенат печени получали следующим образом: навеску печени 0,5 г гомогенизировали в 19,5 мл охлаждённого до 0-40 °С 1,2 % раствора КС1, поместив стакан гомогенизатора в лёд. Для определения скорости спонтанного (ферментативного) перекисного окисления липидов (СпПОЛ) в одну пробирку наливали 2,0 мл гомогената и 0,2 мл дистиллированной воды, во вторую - 2 мл гомогената и по 0,1 мл 2,6 мМ раствора аскорбиновой кислоты и 4 • 10- М раствора соли Мора для определения скорости неферментативного аскорбатза-висимого перекисного окисления липидов (АсПОЛ), в третью - те же вещества, что и во вторую, и, кроме того, добавляли 1 мл 40 % раствора трихло-руксусной кислоты для осаждения белка. Через 10 минут после инкубации в водяной бане при температуре 37 °С в первые две пробирки добавляли 1 мл раствора СС13СООН и все пробы центрифугировали в течение 10 минут при 3 000 об/мин. Отбирали по 2 мл недостаточной жидкости и в каждую пробирку добавляли по 1 мл 0,8 % раствора ТБК, помещали в кипящую водяную баню на 10 минут после охлаждения до комнатной температуры отбирали верхнюю фазу и измеряли экстинкцию пробы против контрольного раствора на ФЭК (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1,0 см по отношению к контрольному раствору.
Расчет проводят по формуле
X = (Е • 3 • 3,2) / (0,156 • 2),
где X - содержание малонового диальдегида в исходном гомогенате, нмоль; Е - экстинкция проб; 3,2 - общий объем исследуемых проб, мл; 2 - объем надосадочной жидкости, взятой на определение малонового диальдегида, мл; 3 - объем проб, взятых на фотометрию, мл; 0,156 -экстинкция 1 нмоль малонового диальдегида в 1 мл при 532 им.
Обсуждение результатов
Для определения токсичности хлорида кадмия были проведены эксперименты по выращиванию молоди осетровых рыб при добавлении в корм токсиканта. Первоначально была определена действующая концентрация хлорида кадмия, при которой не наблюдается резкого снижения выживаемости осетровой молоди, но отчетливо прослеживается уменьшение массы тела. Исследования показали, что действующая концентрация CdCl2 составляет 10 мг на кг корма, т. к. средний прирост осетровой молоди уменьшался на 2,2 г (табл. 1).
Таблица 1
Рыбоводно-биологические показатели выращивания молоди осетра при добавлении в корм хлорида кадмия и а-токоферола (период выращивания - 30 суток)
Варианты рецептур Показатели
Начальная масса тела, г Конечная масса тела, г Средний индивидуальный прирост, г
Контроль 48,3 і 0,14 50,3 і 0,15 2,0
5 мг С^12 на кг корма 56 і 0,12 54,2 і 0,13 -1,8
10 мг С^12 на кг корма 43 і 0,12 40,8 і 0,11 -2,2
15 мг С^12 на кг корма 44,3 і 0,11 42,5 і 0,12 -1,8
ТКФ 150 мг/кг корма 49,6 і 0,16 57.83 і 0,15 8,23
С^12 10 мг/кг корма + ТКФ 150 мг/кг корма 60,8 і 17,5 66,5 і 28,0 5,7
Одновременно с определением роста и развития молоди осетровых рыб при внесении в корм хлорида кадмия были сделаны опыты по определению скорости перекисного окисления липидов в печени осетровых рыб in vivo, т. к. известно, что тяжелые металлы, попадая в живой организм аккумулируются преимущественно в печени.
Из полученных данных (табл. 2) видно, что показатели ПОЛ в рыбах, подвергшихся воздействию токсиканта in vivo, больше по сравнению с контролем в 1,5—2,5 раза, причём с увеличением концентрации токсиканта наблюдается значительное увеличение ПОЛ в печени осетровых. Эти результаты подтверждают промотирующее влияние хлорида кадмия на перекисное окисление липидов, происходящее в живом организме.
Таблица 2
Влияние хлорида кадмия и а-токоферола на показатели перекисного окисления липидов в печени русского осетра in vivo
МДА, нмоль
Контроль 3,952 ± 0,5
5 мг С^12 на кг корма 5,039 ± 1,4
10 мг С^12 на кг корма 6,758 ± 2,2
15 мг С^12 на кг корма 9,339 ± 3,4
Контроль 1,31 ± 0,3
ТКФ 150 мг/кг корма 1,57 ± 1,3
10 мг/кг корма С^12 +ТКФ 150 мг/кг корма 3,44 ± 2,0
Токсичность соединений кадмия в первую очередь связывают с координацией металла с 8И-группами белка - это проявление первичной токсичности металла. В связи с этим основными средствами, применяемыми в настоящее время при отравлениях соединениями тяжелых металлов и кадмия, в частности, являются тиопроизводные и комплексоны. Однако известно, что в живых организмах идет процесс химического и биохимического метилирования неорганических солей тяжелых металлов, и образующиеся в результате этих реакций органические производные обладают токсичностью, на несколько порядков превышающей токсичность их неорганических предшественников [11].
Проявление вторичной токсичности металлоорганическими соединениями тяжелых металлов связано с образованием активных радикалов, возникающих в результате разрыва связи углерод - металл при вовлечении этих соединений в биологический окислительно-восстановительный процесс, поэтому для снижения окислительного стресса, вызванного соединениями тяжелых металлов, можно использовать типичные ингибиторы радикальных процессов. В настоящее время антиоксиданты как антидоты при отравлениях соединениями кадмия не используются.
В работе рассматривается возможность использования природного антиоксиданта - витамина Е (а-токоферола) в качестве детоксицирующего средства при отравлении солями кадмия.
Эксперименты с одновременным введением хлорида кадмия и витамина Е в корма рыб (табл. 1, 2) показали, что добавки а-токоферола способствуют снижению токсического эффекта CdCl2, причем рыбы набирали вес даже лучше, чем в контрольной группе. Аналогичная картина наблюдается при определении скорости перекисного окисления липидов в печени молоди осетра по накоплению конечного продукта - МДА. Содержание МДА в печени рыб, получавших корм с добавками хлорида кадмия и витамина Е, сравнимо с содержанием малонового диальдегида в печени рыб контрольной группы. Таким образом, добавки витамина Е не только уменьшают негативное влияние хлорида кадмия, но и позволяют достичь в дальнейшем положительных результатов при выращивании осетровых рыб.
Заключение
Полученные результаты показали детоксицирующий эффект витамина Е при отравлении хлоридом кадмия, следовательно, можно предположить, что проявление токсичности ионов кадмия связано не только с комплексообразованием, но и с генерированием активных радикальных частиц, являющихся причиной развития окислительного стресса. Поэтому можно предложить использовать в качестве антидотов не только известные комплексообразователи, но и природные антиоксиданты.
Работа выполнена при поддержке программы ОБН РАН «Фундаментальные основы управления биологическими ресурсами» по теме № 00-04-21 «Исследование влияния соединений ртути и олова на рыбоводно-биологические и биохимические показатели молоди русского осетра и повышение резистентности осетровых при промышленном выращивании», программы ОНЗ РАН «Развитие технологий мониторинга, экосистемное моделирование и прогнозирование при изучении природных ресурсов в условиях аридного климата по теме «Каспийское море как объект мониторинга и моделирования региональных и глобальных биосферных процессов», РФФИ (грант № 05-03-96504).
СПИСОК ЛИТЕРА ТУРЫ
1. Евланов И. А. Этапы антропогенного воздействия на ихтиофауну Средней Волги в XX веке // Тез. докл. I конгресса ихтиологов России, Астрахань, сентябрь 1997. - М.: Изд-во ВНИРО. - С. 150.
2. Hossain Abdolhay. Fingerling prodaction and stock enchancement of sturgeon in south of Caspian sea // Booklet of abstracts: 3 International symposium on sturgeon, Piacenza, Italy, 1997. - P. 21-23.
3. Андреев В. В., Федорова Н. Н. Влияние выбросов Астраханского газоперерабатывающего завода на содержание тяжелых металлов в водоемах Волго-Ахтубинской поймы // Проблемы экологической безопасности Нижнего Поволжья в связи с разработкой и эксплуатацией нефтегазовых месторождений с высоким содержанием сероводорода: Тез. докл. науч.-техн. конф. - Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 1996. - С. 40-41.
4. Garden G. R., Yevich P. P. Histological and hematological responses of an estuarine teleost to cadmium. Journal of Fish Research of Canadian. - 1970. - 27(12). - 2185-2196.
5. Алабастер Дж., Ллоид Р. Критерии качества воды для пресноводных рыб / Пер. с англ. - М.: Легкая и пищ. пром-сть, 1984.
6. Будников Г. К. Тяжелые металлы в экологическом мониторинге водных систем // Соросовский общеобразовательный журнал. - 1998. - № 5. - С. 23-29.
7. Геоэкологическая обстановка и оценка геоэкологической опасности детских дошкольных учреждений города Дубна // Эковестник Дубны. - 1999-2004.
8. Пименов Ю. Т., Давыдова С. Л., Милаева Е. Р. Ртуть, олово, свинец и их органические производные в окружающей среде. - Астрахань: Изд-во АГТУ, 2001.
9. Сastell J. D., Tiews K. // Report of the EIFAC, IUNS and ICES Working Group on standardization of methodology in fish nutrition research, European Inland Fisheries Advisory Commission Home Page Technical Papers. - 1979. - 36. - P. 1-24.
10. Строев Е. Н., Макарова В. Г. Практикум по биологической химии. - М.: Высш. шк., 1986.
11. Yannai S., Berdicevsky I. Formation of organic cadmium by marine microorganisms // Ecotoxicol. and Environ. Safety. - 1995. - 32, N 3. - P. 209-214.
Получено 1.11.05
THE VITAMIN E USING AS THE ANTIDOT UNDER THE TOXIC INFLUENCE OF CADMIUM CHLORIDE
V. P. Osipova, S. A. Il'ina, O. I. Esina, Yu. T. Pimenov,
N. T. Berberova, E. R. Milaeva
The influence of cadmium chloride on younger sturgeon growing and the development, and on lipides peroxidation velocity in Russian sturgeon liver in vivo was considered separately and simultaneously with vitamin E. The toxicity of the cadmium chloride reveals itself in the oppression of younger sturgeon growing and in the activation of lipides peroxidation velocity in liver. The younger sturgeon adds in weight when the vitamin E is added to the fish provender; the lipides’ peroxidation velocity in liver is comparable with the one in the checking variant. The obtained results allow to expect that free radical generation introduces the deposit to the general cadmium chloride toxicity that promotes the oxidative stress development in fish organism, so it is offered to use natural antioxidants as the detoxificating agents.
