CC BY
54
УДК 612.26.014.46:547.979.733
Н. А. Антонова, В. П. Осипова, М. Н. Коляда, Н. О. Мовчан, Ю. Т. Пименов
ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИОКСИДАНТНЫХ СВОЙСТВ ПОРФИРИНОВ В МОДЕЛЬНОЙ СИСТЕМЕ ПЕРОКСИДНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ СПЕРМЫ ОСЕТРОВЫ1Х В ПРИСУТСТВИИ СОЕДИНЕНИЙ ТЯЖЕЛЫ1Х МЕТАЛЛОВ1
Введение
Наиболее чувствительной к токсическому влиянию ксенобиотиков является воспроизводительная система гидробионтов. По литературным данным, качество спермы, являющееся одним из определяющих факторов выживаемости рыб на ранних стадиях развития, очень тесно коррелирует с уровнем загрязнения [1]. Несмотря на то, что гидробионтам присущ относительно высокий уровень антиоксидантной защиты [2], при усилении токсического воздействия факторов окружающей среды механизмы антиоксидантной защиты гидробионтов могут оказаться неэффективными.
В сперме велико содержание полиненасыщенных кислот, поэтому она весьма чувствительна к вредному воздействию свободных радикалов, кроме того, она содержит небольшое количество ферментов-антиоксидантов, которые предупреждают или устраняют ущерб, наносимый окислением [3]. Усиление окислительных процессов в сперме способствует повреждению мембран, что приводит к снижению смачиваемости сперматозоидов и вследствие этого -уменьшению их подвижности, аномальному строению, потере жизнеспособности [4].
В последнее время наблюдается тенденция к применению в качестве детоксикантов соединений, обладающих множественным механизмом действия. В качестве таких соединений могут выступать порфириновые системы, которые участвуют в глобальном биоэнергетическом механизме - процессе биологического окисления. Эти соединения в силу уникальности своей электронной структуры обладают широким спектром полезных свойств, в частности способны эффективно проникать в клетки.
Нами ранее было показано [5] снижение скорости пероксидного окисления липидов (ПОЛ) печени в присутствии добавок порфиринов как при автоокислении, так и при промоти-ровании процесса соединениями тяжелых металлов. Установлено, что эффективность антиоксидантного действия порфиринов зависит от химической природы, а также от длительности процесса окисления.
Целью работы, результаты которой изложены ниже, явилось исследование антиоксидант-ных свойств тетрафенилпорфирина (ТРР) и 3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенилпорфирина (ТРР-ОН) в модельной системе ПОЛ спермы русского осетра в условиях автоокисления, а также в присутствии ^С12, СН3^1, CdCl2 и (С4Н9)38пС1.
он
3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенилпорфирин (ТРР-ОН) тетрафенилпорфирин (ТРР)
1 Работа выполнена при поддержке программы ОНЗ РАН «Развитие технологий мониторинга, экосистемное моделирование и прогнозирование при изучении природных ресурсов в условиях аридного климата», программы ОБН РАН «Биологические ресурсы России: Фундаментальные основы рационального использования», РФФИ (грант № 07-03-96602- р_поволжье_а).
Для выявления антиоксидантных свойств порфиринов при продолжительном окислительном стрессе организма использовали модельную систему с длительным протеканием ПОЛ, когда интенсивность ПОЛ возрастает, а концентрация антиоксидантов падает.
Определение проводили по стандартной методике [6]. В раствор хлорида калия, охлажденного до 0-4 °С, вносили 1 мл спермы русского осетра и исследованные соединения (их концентрация в среде инкубирования составила 1 • 10-4 моль/л).
Полученную смесь сливали в колбы и инкубировали с добавками исследуемых соединений в течение 48 часов при температуре 5 °С, отбирая через определенный интервал времени по 2 мл смеси в пробирки для дальнейшего центрифугирования. В эти же пробирки добавляли по 0,1 мл растворов аскорбиновой кислоты и соли Мора, 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Пробирки помещали на 10 минут в водяную баню при температуре 37 °С, центрифугировали 10 минут при частоте оборотов 3 000 об/мин. Затем отбирали в чистые пробирки по 2 мл над-осадочной жидкости, приливали по 1 мл раствора тиобарбитуровой кислоты, помещали пробы в кипящую водяную баню на 10 минут и затем охлаждали их в ледяной воде до комнатной температуры. После охлаждения в пробы добавляли 1,0 мл хлороформа для получения прозрачного раствора и центрифугировали 15 минут при частоте оборотов 3 000 об/мин. Отбирали надоса-дочную жидкость и измеряли экстинкцию пробы на спектрофотометре СФ-103 при 532 нм относительно контрольной пробы.
Расчет проводили по формуле
X = (Е • 3 • 3,2)/(0,156 • 2),
где х - содержание малонового диальдегида (МДА) в сперме, нмоль; Е - экстинкция проб; 3,2 - общий объем исследуемых проб, мл; 2 - объем надосадочной жидкости, взятой на определение МДА, мл; 3 - объем проб, мл; 0,156 - экстинкция 1 нмоль МДА в 1 мл при 532 нм.
Ранее было показано отсутствие взаимодействия токсикантов с порфиринами и тиобарби-туровой кислотой [5], что позволяет использовать данную методику для определения антиокси-дантных свойств порфириновых соединений.
Показано, что добавки в сперму исследуемых соединений тяжелых металлов приводили к увеличению скорости ПОЛ на всех исследованных этапах (рис. 1).
Рис. 1. Влияние соединений ртути, олова и кадмия на содержание МДА в сперме русского осетра in vitro: 1 - контроль; 2 - CdCl2; 3 - HgCl2; 4 - (C^^SnCl; 5 - CH3HgI
На начальном этапе ПОЛ наибольшей промотирующей активностью обладает метилртуть, на средних и отдаленных этапах ПОЛ - трибутилоловохлорид. Необходимо отметить, что именно органические производные тяжелых металлов обладают наибольшей способностью к аккумулированию в гонадах рыб. По литературным данным, метилртутная соль вызывает атрофию семенников у самцов Poecilia reticulata, нарушает образование сперматозоидов, вызывает некроз спермы [7], а (C4H9)3SnCl приводит к развитию импосекса у моллюсков [8].
Полученный нами результат подтверждает высокую промотирующую активность соединений тяжелых металлов и в отношении липидов спермы осетровых.
Далее были исследованы антиоксидантные свойства порфиринов при автоокислении липидов спермы (рис. 2), для них рассчитана эффективность антиоксидантного действия (ЭАД) по формуле [9]:
ЭАД = [(Со - Сі)/Со] • 100 % ,
где С0 - концентрация МДА в сперме (контроль); С1 - концентрация МДА в сперме, содержащей исследуемое соединение. В случае положительного значения показателя ЭАД тестируемое вещество проявляет антиоксидантное действие; в случае отрицательного значения - прооксидантное действие.
□ 3 ч а 24 ч в 4
ТРР
ТРР-ОН
............І
V
20
40 60
ЭАД, %
80
Рис. 2. Эффективность антиоксидантного действия ТРР и ТРР-ОН на различных этапах ПОЛ спермы русского осетра в условиях автоокисления
Антиокислительная активность порфириновых соединений в наибольшей степени проявляется на среднем этапе ПОЛ. Отмечено, что ТРР-ОН проявляет большую ЭАД на всех исследованных этапах ПОЛ. Можно предположить, что высокая антиоксидантная активность ТРР-ОН проявляется за счет наличия фенольных фрагментов (схема), т. е. 3,5-ди-трет-бутил-
4-гидроксифенилпорфирин, благодаря образованию стабильной структуры, является ловушкой активных радикалов, участвующих в процессе ПОЛ [10].
-2]—2 _
+2+2'
с
0
В ходе исследования не обнаружена прооксидантная активность порфиринов, в то время как в модельной системе ПОЛ печени русского осетра на среднем и отдаленном этапах этого процесса ТРР выступал в качестве прооксиданта [5].
При совместном внесении токсикантов и ТРР-ОН наблюдалось снижение промотирущего действия соединений тяжелых металлов на скорость ПОЛ, которое зависело от длительности процесса окисления (рис. 3). При добавлении ТРР-ОН антиоксидантное действие наблюдалось уже на ранних этапах окисления, максимальный эффект, т. е. больше 50 % снижения промоти-рования ПОЛ спермы, через 24-48 часов.
С М лд> %
Рис. 3. Влияние добавки ТРР-ОН на накопление МДА в сперме русского осетра в присутствии соединений тяжелых металлов: 1 - СёС12 + ТРР-ОН; 2 - Н^С12 + ТРР-ОН; 3 - (С4Ы9)38пС1 + ТРР-ОН; 4 - СН3Н^1 + ТРР-ОН (уровень МДА в сперме в присутствии соответствующего токсиканта без добавки порфирина принят за 100 %)
1
2
3
4
Наибольшее снижение скорости ПОЛ под действием добавки ТРР-ОН наблюдалось в присутствии (С4Н9)38иС1 на среднем этапе окисления, в присутствии СН3^1 - на отдаленном этапе окисления.
При одновременном добавлении ТРР и CdQ2 на отдаленном этапе ПОЛ спермы русского осетра обнаружено усиление прооксидантного действия данного токсиканта (рис. 4). В остальных случаях установлено снижение промотирующего влияния соединений тяжелых металлов, наибольшее - на отдаленном этапе ПОЛ в присутствии метилртути. Подобное усиление проок-сидантного действия токсиканта добавлением ТРР установлено также в модельной системе ПОЛ рыбных кормов в присутствии оловоорганических соединений [11].
Рис. 4. Влияние добавки ТРР на накопление МДА в сперме русского осетра в присутствии соединений тяжелых металлов: 1 - СёС12 + ТРР; 2 - ^С12 + ТРР; 3 - (С4Н9)38пС1 + ТРР; 4 - СН3^1 + ТРР (уровень МДА в сперме в присутствии соответствующего токсиканта без добавки порфирина принят за 100 %)
Большее снижение промотирующего влияния металлоорганических соединений на ПОЛ спермы в присутствии порфиринов подтверждает сделанное ранее предположение о существенном вкладе в механизм токсичности органических производных тяжелых металлов развития окислительного стресса [12].
Заключение
Таким образом, снижение скорости ПОЛ спермы осетровых рыб в присутствии исследованных порфиринов в условиях автоокисления и при промотировании процесса соединениями
тяжелых металлов свидетельствует о возможности использования порфириновых систем в качестве антиоксидантов. Установлена большая эффективность 3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенилпорфирина по сравнению с тетрафенилпорфирином на всех этапах исследования как в условиях автоокисления, так и в присутствии соединений тяжелых металлов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Романов А. А., Шевелева Н. Н. Нарушение морфогенеза у осетровых Каспия II Pыбное хозяйство. -1993. - № 4. - С. 17-25.
2. Fiho D. W. Fish antioxidant defences - a comparative approach II Braz. J. Med. and Biol. Res. - 1996. -Vol. 29, N 12. - P. 1735-1742.
3. Акимова Н. В., Рубан Г. И. Систематизация нарушений воспроизводства осетровых (Atipenseridae) при антропогенном воздействии II 1 Конгр. ихтиологов Pоссии, Астрахань, сент., 1997: тез. докл. -Астрахань, 1997. - С. 138.
4. Цебржинський О. І. Оксидативна активність у сперматозоїдах II Фізіол. журнал. - 2000. - Т. 46, № 4. - C. 71-75.
5. Определение скорости пероксидного окисления липидов в печени русского осетра в присутствии соединений ртути, олова, кадмия и порфиринов in vitro I Н. А. Антонова, В. П. Осипова, М. Н. Коляда и др. II Вестн. Астрахан. гос. техн. - 2007. - № 3 (38). - С. 150-154.
6. Строев Е. Н., Макарова В. Г. Практикум по биологической химии. - М.: Высш. шк., 1986. - 279 с.
7. Wester P. W. Histopathological effects of environmental pollutants b-HCH and methylmercury on reproductive organs in freshwater fish II Compar. Biochem. and Physiol. C. - 1991. - Vol. 100, N 1-2. - P. 237.
8. Effects of Tributyltin(IV)chloride (TBT) exposure on gametes and fertilization of Ascidia malaca (Ascidiacea,
Tunicata) I L. Villa, P. D’Agati, C. Mansueto et al. II Appl. Organomet. Chem. - 2003. - 16. - 106-112.
9. Зайцев В. Г. Модельные системы перекисного окисления липидов и их применение для оценки антиокси-
дантного действия лекарственных препаратов: автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Волгоград, 2001. - С. 23.
10. Милаева Е. Р. Биомолекулярное моделирование редокс-процессов с участием комплексов металлов II Журнал PХО им. Д. И. Менделеева. - 2004. - Т. XLVIII, № 4. - С. 20-29.
11. Есина О. И. Действие органических соединений олова на молодь осетровых рыб: автореф. дис. .
канд. биол. наук. - Астрахань, 2006. - 24 с.
12. Давыдова С. Л., Пименов Ю. Т., Милаева Е. Р. Pтуть, олово, свинец и их органические производные в окружающей среде. - Астрахань: Изд-во АГТУ, 2001. - 148 с.
Статья поступила в редакцию 5.11.2008
INVESTIGATION OF ANTIOXIDANT FEATURES OF PORPHYRINS IN THE MODEL SYSTEM OF THE PEROXIDE OXIDATION OF THE LIPIDS OF STURGEON SPERM
IN THE PRESENCE OF HEAVY METALS COMPOUNDS
N. A. Antonova, V. P. Osipova, M. N. Kolyada,
N. O. Movchan, Yu. T. Pimenov
We have analyzed the influence of the (tetraphenylporphyrin (TPP), 3,5-di-tret-butil-4-hydroxyphenylporphyrin (TPP-OH)) on carbonylic products accumulation identified with the help of thiobarbituric acid in the sperm of the Russian sturgeon (Acipenser guldenstadti Brandt) in vitro in the presence of Hg(NO3)2, CH3HgI, CdCl2 and (CH3)2SnCl2 in conditions of long running oxidation. It was shown the reduction of the rate of the peroxidation of lipids of sturgeon sperm in the presence of studied porphyrins under conditions of autooxidation and at promoting the process of heavy metals combination, that gives the possibility to use porphyrin systems as antioxidants. The greater efficiency of TPP-OH in comparison with TPP was observed at all stages of investigation both in conditions of auto-oxidation and in the presence of heavy metals compounds.
Key words: the lipid peroxidation, porphyrins, antioxidant, the sperm of sturgeon fish.
