CC BY
69
УДК 599.323.4-113.2:546.81
М. Н. Коляда**, Е. М. Лагутина*, Н. Н. Федорова*, Н. С. Алтуфьева*,
Ю. Т. Пименов , Н. Т. Берберова
БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ВЛИЯНИЯ СОЕДИНЕНИЙ ОЛОВА И ТЕТРАФЕНИЛПОРФИРИНА НА ПИЩЕВАРИТЕЛЬНЫЕ ЖЕЛЕЗЫ КРЫС
Астраханский государственный технический университет Южный научный центр РАН, Ростов-на-Дону
Введение
Согласно последним исследованиям, определенный вклад в токсичность соединений триалкилолова вносит развитие неконтролируемого окислительного стресса [1-3]. Ранее было показано, что оловоорганические соединения вовлекаются в биологические окислительно-восстановительные процессы, при этом в результате разрыва связи углерод - олово образуются реакционноспособные частицы и вторичные продукты распада, также проявляющие токсические эффекты [4]. Существенная активация процесса образования свободных радикалов при токсическом воздействии данных соединений приводит к усилению перекисного окисления липидов (ПОЛ), являющегося биохимическим маркером окислительного стресса. ПОЛ обеспечивает в организме фаго- и пиноцитоз, синтез простагландинов, лей-котриенов, холестерина, прогестерона [5]. Это нормальный метаболический процесс, однако при значительном увеличении его уровня он становится патологическим и может приводить к повреждению клеточных мембран [6]. Образующиеся при этом продукты могут реагировать с нуклеиновыми кислотами, многими белками, в том числе и с антиоксидантными ферментами, что вызывает их инактивацию.
В первую очередь токсическому действию подвергаются клетки органов и тканей с высоким уровнем обменных процессов и повышенным содержанием липидов, где и наблюдается преимущественное накопление этих липофильных соединений. Как известно, первым органом, куда поступают проникающие в организм через желудочно-кишечный тракт ксенобиотики, является печень, которая благодаря строению и функциям чрезвычайно чувствительна к действию токсикантов. Это основной орган, ответственный за метаболизм чужеродных веществ.
Важная роль в организме принадлежит поджелудочной железе -она обеспечивает пищеварение, участвует в регуляции энергетического обмена и других важных процессах. Например, ферменты поджелудочной железы помогают перевариванию белков, жиров и углеводов в кишечнике, а гормоны поджелудочной железы (инсулин и др.) - регулируют уровень глюкозы в крови.
Согласно литературным данным, многие ООС вызывают повреждение клеток пищеварительных желез организма. Гепатотоксичность проявляют три- и дизамещенные бутильные производные [7-12] (дибутилоловодихлорид
проявляет большую гепатотоксичность [10], а также повреждает клетки поджелудочной железы крыс [13]); бис-оксид трибутилолова [14]; соединения трифенилолова [15]. Установлено ингибирование трифенилоловофторидом секреции инсулина поджелудочной железой кролика [16].
В качестве патобиохимических параметров повреждения клеток печени рассматривается повышение активности в плазме крови таких ферментов, как аланинаминотрансфераза, у-глутаминтрансфераза, амилаза [11], щелочная фосфатаза, а также увеличение количества билирубина в сыворотке [8], при повреждении клеток поджелудочной железы - повышение активности в сыворотке крови амилазы и липазы.
Гепатотоксичность ООС связывают с разобщением окислительного фосфорилирования в митохондриях клеток печени [14], с их способностью вызывать запрограммированную гибель клеток печени (апоптоз) [12].
В качестве важной биохимической составляющей повреждения печени и поджелудочной железы крыс под действием ООС в настоящее время рассматривается развитие окислительного стресса в результате снижения активности важных антиоксидантных ферментов - супероксиддисму-тазы, глутатионпероксидазы, глутатион^-трансферазы [9, 15]. С повреждающим действием на нервные клетки активных кислородных метаболитов (АКМ) связывают нейротоксичность производных триметилолова [1], которые могут образовываться из неорганических производных в результате многочисленных реакций биохимического метилирования [17].
Известно, что эти соединения хорошо абсорбируются из желудочно-кишечного тракта, нарушают функции митохондрий, которыми так богата печень. Обладая высокой гидрофобностью, они растворяются в фосфолипидном бислое мембраны. При этом бислой дестабилизируется, изменяются липид-белковые взаимодействия, что в конечном итоге приводит к разрушению мембраны.
В последнее время стремительно растет интерес к исследованию природных и синтетических порфиринов, на основе которых синтезируются лекарственные препараты. Изучаются их про- и антиоксидантные свойства [18]. Следует отметить недостаточную изученность синтетических порфиринов с точки зрения их биологической активности. В связи с этим целесообразно исследовать влияние этих соединений на живые организмы.
Таким образом, цель данного исследования состояла в изучении влияния производных олова (хлоридов триметил- и трибутилолова) и тетрафе-нилпорфирина на морфологию тканей пищеварительных желез - печени и поджелудочной железы и скорость ПОЛ в печени крыс. Для сравнения изучалось также влияние и неорганической соли олова - дихлорида олова.
Материал и методы
Экспериментальная часть работы выполнена с использованием 40 лабораторных половозрелых крыс-самцов линии «Wistan^ возрасте 3-х месяцев. В опытах in vivo исследовали 5 групп крыс (по 8 крыс). При проведении исследования руководствовались базисными нормативными документами: Рекомендациями Комитета по экспериментальной работе с использованием
животных при Минздраве РФ, Рекомендациями ВОЗ. Животные содержались в виварии НИИ по изучению лепры в контролируемых условиях: 12-часовой период освещения, комнатная температура 20 ± 2 °С, влажность 50-70 %, корм ad libitum. Крысам I группы ежедневно скармливали дихлорид олова, II группы - триметилоловохлорид, III группы - трибутилолово-хлорид, IV - фенилпорфирин, V группа была контрольной.
Добавки оловоорганических соединений и тетрафенилпорфирин вносили в корм в концентрации 12,5 мг/кг. Трибутилоловохлорид, тетра-фенилпорфирин растворяли в хлороформе, корм с этими добавками выдерживали 3 часа для испарения хлороформа.
Эксперимент продолжался 20 дней. По окончании опыта животных подвергли эвтаназии передозировкой хлороформа. Взятые кусочки печени и поджелудочной железы были зафиксированы в растворе 12 %-го нейтрального формалина. Гистологическое исследование тканей печени и поджелудочной железы было проведено по общепринятым методикам: из взятого материала были изготовлены парафиноцеллоидиновые блоки, затем гистологические препараты, которые окрашивались гематоксилин-эозином [19].
Определение скорости пероксидного окисления липидов в гомогенатах печени проводили по стандартной методике [20] по накоплению малонового диальдегида (МДА), дающего окрашенный комплекс с тиобар-битуровой кислотой (ТБК). Развитие окраски определяли спектрофотометрически при 532 нм.
В течение всего эксперимента все животные были здоровы, изменений в поведении не отмечено. Во всех группах крысы прибавили в весе (в среднем на 5 г, во II группе - на 2 г).
Результаты и обсуждение
Данные по определению скорости ПОЛ представлены на рисунке.
МДА,нмоль
6 б 4 3 2 1 0
Контр SnCl2
Ме3
Bu3
ТРР
Влияние соединений олова и тетрафенилпорфирина на ПОЛ печени крыс in vivo:
Ме3 - хлорид триметилолова; Bu3 - хлорид трибутилолова; ТРР - тетрафенилпорфирин
Наибольшая скорость ПОЛ в печени крыс отмечена в III группе, при добавлении в корм хлорида трибутилолова (содержание МДА в печени увеличилось по сравнению с контролем в 4,6 раза). Известно, что бутиль-ные производные олова достаточно быстро проникают внутрь клеток печени [21], где аккумулируются в области аппарата Гольджи и эндоплазма-тического ретикулума.
Хлорид трибутилолова оказывал инициирующее действие на окисление олеиновой кислоты и в модельных экспериментах [22]. В этой группе крыс были обнаружены и самые значительные патологические изменения в печени и поджелудочной железе.
В печени обнаружено нарушение дольковой структуры органа: массивные некрозы располагались в основном в междольковом пространстве. Отмечен значительный отек печеночной ткани. В цитоплазме гепатоцитов наблюдались крупные пустоты, что является характерным для токсической дистрофии печени. В межклеточных пространствах имелось много гранул гемосидерина, что свидетельствует о гемолизе эритроцитов в местах кровоизлияний. Известно, что соединения олова способны накапливаться в мембранах эритроцитов [23], вызывать их гемолиз [24].
Все эти изменения указывали на печеночную недостаточность. Как известно, продукты ПОЛ инициируют липид-липидные и белок-липидные сшивки в клеточных мембранах, что обусловливает нарушение различных функций гепатоцитов.
В поджелудочной железе отмечен обширный некроз ацинусов, в оставшихся ацинусах изменился цвет секреторных гранул. Эндокринные клетки островков Лангерганса полностью некротизированы.
Триметилоловохлорид проявил меньшую гепатотоксичность. Если в III группе крыс некрозы располагались в основном в междольковых пространствах клеток печени, то при действии триметильного производного олова некрозы находились внутри долек, в центральной их части. Некротические массы окружены тонким инфильтратом из лейкоцитов. Кроме того, инфильтрация лейкоцитами наблюдалась вокруг стенок многих внутрипеченочных сосудов. Таким образом, в этом случае в клетках печени преобладали воспалительные процессы.
Изменения в поджелудочной железе также были менее выражены. Наблюдался значительный отек ткани железы. Полностью отсутствовала четкость границ ацинозных клеток. Отмечалось много ацинусов в состоянии некробиоза. Эндокринные клетки многих островков Лангерганса были некротизированы. Содержание МДА свидетельствовало о незначительном усилении ПОЛ (в 1,2 раза).
Добавки тетрафенилпорфирина в корм приводят к снижению концентрации МДА в печени в 1,4 раза по сравнению с контролем, причем никаких патологических изменений в тканях печени и поджелудочной железы не наблюдалось. Необходимо отметить, что в опытах in vitro ТРР практически не влиял на процесс окисления олеиновой кислоты [25].
В группе крыс, получавших корм с добавками неорганического олова, изменений скорости ПОЛ и значительных повреждений тканей исследуемых
органов не отмечено. В клетках печени выявлено разрушение только 10 % центральных отделов печеночных долек. В клетках поджелудочной железы величина ацинусов и их функциональная активность были вариабельными. В секреторных отделах ацинусов имелись погибшие секреторные клетки.
В модельных опытах in vitro дихлорид олова оказывал промотирующее действие на окисление олеиновой кислоты [22]. Возможно, это связано с тем, что, подобно ионам переходных металлов (железо, кобальт и др.), ионы олова(И) также дают реакцию Фентона, так как потенциал ионизации Sn(II)/Sn(III) близок к потенциалу ионизации Fe(II)/Fe(III) (30,498 эВ/моль и 30,643 эВ/моль соответственно) [26]. В результате этой реакции образуется чрезвычайно реакционноспособный гидроксильный радикал - ОН*, который может разрывать любую С-Н или С-С связь. Очевидно, что на уровне целого организма токсичность неорганических производных олова незначительна по сравнению с токсичностью органических производных этого металла, что, вероятно, не только связано с незначительным поглощением дихлорида олова и его быстрым оборотом в тканях, но и является следствием повреждающего действия образующихся из ООС активных частиц.
Влияние органических производных олова на процессы в липидном слое непосредственно связано с тем, что их токсическое действие рассматривается, как правило, в среде, насыщенной кислородом, поскольку молекулярный кислород, как известно, лучше растворяется в липидной фазе, чем в воде и гидрофильных областях клетки. В этих условиях про-мотирование ПОЛ, повреждение белков, ДНК могут вызывать также и образующиеся в физиологических условиях из кислорода активные кислородные метаболиты - H2O2, HO*, O2*- [6].
Активные радикалы образуются и при микросомальном метаболизме алифатических оловоорганических соединений при действии монооксигеназ-ных систем с участием цитохромов Р-450 [27, 28]. При этом отмечалась способность производных Sn индуцировать перекисное окисление липидов мик-росом. Некоторые из метаболитов, например (СН3СН(ОН)СН2СН2) (n-C4H9)2SnOCOCH3 и (CH3CH2CH(OH)CH2)(n-C4H9)2SnOCOCH3, обладали токсичностью, которая проявлялась в набухании митохондрий и ингибировании АТФ-азы.
Проникновение органических соединений олова в мембрану, их растворение в фосфолипидном бислое приводит к изменению липид-белковых взаимодействий, что неизбежно сказывается на активности таких мембранно-связанных ферментов, как АТФ-аза, Na /К -зависимая АТФ-аза, Са2-зависимая АТФ-аза [29], а также цитохромы Р-450. Таким образом, данные токсиканты ингибируют фермент собственного метаболизма, кроме того, они могут изменять метаболизм других поллютантов, а также эндогенных соединений [30].
Выводы
Возрастание скорости ПОЛ в печени крысы, патологические изменения тканей пищеварительных органов при добавлении в корм органических производных олова свидетельствуют о том, что существенную роль
в механизме их токсичности играет окислительный стресс. Снижение интенсивности ПОЛ под действием тетрафенилпорфирина свидетельствует об антиоксидантной активности этого соединения in vivo.
Работа выполнена при поддержке программы ОБН РАН «Фундаментальные основы управления биологическими ресурсами» по теме № 00-04-21 «Исследование влияния соединений ртути и олова на рыбоводно-биологические и биохимические показатели молоди русского осетра и повышение резистентности осетровых при промышленном выращивании», РФФИ (грант № 05-03-96504).
СПИСОК ЛИТЕРА ТУРЫ
1. Ali S. F., Lebel C. P., Bondy S. C. Reactive Oxygen Species Formation as a Biomarker of Methylmercury and Trimethyrtlin Neurotoxicity // Neurotoxicology. -1992. - Vol. 13, N 3. - P. 637-648.
2. Mizuhashi S., Ikegaya Y., Matsuki N. Cytotoxicity of tributyltin in rat hippocampal slice cultures // Neuroscience Research. - 2000. - Vol. 38. - P. 35-42.
3. Effect of in vivo treatment of rats with trimethyltin chloride on respiratory properties of rat liver mitochondria / C. R.-F. Skarning, L. N. Varhaug, F. Fonnum, H. Osmundsen // Biochem. Pharmacology. - 2002. - Vol. 64. - P. 657-667.
4. Пименов Ю. Т., Давыдова С. Л., Милаева Е. Р. Ртуть, олово, свинец и их органические производные в окружающей среде. - Астрахань: Изд-во АГТУ, 2001.
5. Воскресенский О. Н., Левицкий А. П. Перекиси липидов в живом организме // Вопросы медицинской химии. - 1970. - Т. 16, № 6. - С. 563-583.
6. Зенков Н. К., Меньшикова Е. Б., Шергин С. М. Окислительный стресс. Диагностика, терапия, профилактика / РАМН, Сибирское отделение. - Новосибирск, 1993.
7. Merkord J., Jonas L., Hennighausen G. Morphological lesions of pancreas and bile ducts in rats induced by dibutyltin dichloride // Arch. Toxicol. Suppl. - 199l. -Vol. l4. - P. 75-9.
8. Repeated administration of a mild acute toxic dose of di-n-butyltin dichloride at intervals of 3 weeks induces severe lesions in pancreas and liver of rats / J. Merkord, H. Weber, G. Kroning, G. Hennighausen // Human & Experimental Toxicology. - 2001. - Vol. 20, N 8. - P. 386-392.
9. Oxygen radical generation and acute pancreatitis: effects of dibutyltin dichloride / ethanol and ethanol on rat pancreas / H. Weler, S. Mercord, L. Sonas et al. // Da-creas. - 1995. - Vol. 11, N 4. - Р. 382-388.
10. Comparison of hepatotoxicity caused by mono-, di- and tributyltin compounds in mice / S. Ueno, I. N. Susa, V. Furukawa, M. Sugiyama // Arch. Toxicol. - 1994. -Vol. 69, N 1. - P. 30-34.
11. Oral (gavage), in utero and postnatal exposure of Sprague-Dawley rats to low doses of tributyltin chloride / G. M. Cooke, H. Tryphonas, O. Pulido et al. // Food. Chem. Toxicol. - 2004. - Vol. 42, N 2. - P. 211-20.
12. Involvement of mitochondrial and death receptor pathways in tributyltin-induced apoptosis in rat hepatocytes / M. Jurkiewiez, D. A. Averill-Bates, M. Marion, F. Denizeau // Biochim. Biophys. Acta. - 2004. - Vol. 1693, N 1. - P. 15-27.
13. Dibutyltin Dichloride Modifies Amylase Release from Isolated Rat PancreaticAcini / Nagashio, Yoshikuni; Hirohata, Yoshihide; Akiyama, Toshiharu; Otsuki, Makoto // Pancreas. - 2002. - Vol. 25, N 1. - Р. 57-62.
14. Studies on the hepatotoxicity induced by bis (tributyltin) oxide / M. Yoshizuka, K. Hara, N. Haramaki, M. Yokoyama et al. // Arch. Toxicol. - 1992. - Vol. 66, N 3. - Р. 182-187.
15. Changes in Hepatik and Renal Glutatione-depenent Enzyme Activities in Rabbits and Lambs Subchronicall Treated with Triphenyltin Acetate / D. P. Simplicio Dchem, M. Dacasto, Carletti et al. // Vet. Hum. Toxicol. - 2000. - Vol. 42, N 3. -P. 159-162.
16. Manabe S., Wada О. Triphenyltin fluoride (TPTF) as a diabetogenic agent. TPTF induces diabetic lipemia by inhibiting insulin secretion from morphologically intact rabbit B-cell // Diabetes. - 1981. - Vol. 30, N 12. - P. 1013-1021.
17. ОrganometaUic compounds in the environment // Ed. P. J. Craig. Longman: UK, 1986. - P. 65.
18. Perez M. J., Cederbaum A. I. Antioxidant and pro-oxidant effects of a manganese porphyrin complex against CYP2E1-dependent toxicity // Free Radical Biology & Medicine. - 2002. - Vol. 33, N. 1. - P. 111-127.
19. Волкова О. В., Елецкий Ю. К. Основы гистологии с гистологической техникой. - М.: Медицина, 1982.
20. Строев Е. Н., Макарова В. Г. Практикум по биологической химии. - М.: Высш. шк., 1986.
21. Accumulation and biotransformation of tri-n-butyltin by isolated rainbow trout hepatocytes / S. Reader, R. S. Louis, E. Pelletier, F. Denizeau // Environ. Toxicol. And Chem. - 1996. - Vol. 15, N 11. - P. 2049-2052.
22. Oleic acid peroxidation in the presence of metalloporphyrins / E. R. Milaeva, Ya. A. Gracheva, D. B. Shpakovsky et al. // J. Porphyrins Phtalocyan. - 2003. -Vol. 8. - P. 701-706.
23. Interaction of organotins with biological system / М. T. Musmeci, Grazia Madonia, M. Teresa Lo Giudice, Arturo Silvestri et al. // Appl. Organomet. chem. - 1992. -Vol. 6. - P. 127-138.
24. Erythrocyte hemolysis by organic tin and leach compounds / H. Kleszcynska, S. Hladyszowski, H. Pruchnic, S. Przestalski // Z. Naturforsch C. - 1997. - Vol. 52. -P. 65-69.
25. Металлоорганические производные 2,6-ди-трет-бутилфенолов как специфические ингибиторы окисления метилолеата / Е. Р. Милаева, Д. Б. Шпаковский, Ю. А. Грачева и др. // Известия АН. Сер. хим. - 2001. - № 6. - С. 1049-1052.
26. Lethality Induced by Stannous Chloride on Escherichia coli AB1157 / F. J. S. Dantas, M. O. Moraes, E. F. Carvalho et al. // Food and Chemical Toxicology. - 1996. -Vol. 34. - P. 959-962.
27. Fish R. H., Kimmel E. C., Casida J. E. Bioorganotin chemistry. Biological oxidation of tributyltin derivalives // J. Organomet. №em. - 1975. - Vol. 93. - P. 1-4.
28. The microsomal metabolism of the organometallis derivatives of the group-IV elements, germanium, tin and lead / R. A. Prough, M. A. Stalmach, P. Wiebkin, S. M. Bridges // Biochem. J. - 1981. - Vol. 15.
29. Comporative studies on the in induction of muscle contracture in mouse diaphragm and Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum vesicles by organotin compounds /
S. S. Kang, S. H. Liu, I. L. Chen // Pharmacol. Toxicol. - 1998. - Vol. 82. - P. 23-27.
30. Oberdorster E., Rittschof D., Lie Blanc G. A. Alteration of ['4c] - festosterone metabolism after enronic ssposure of Daphnia magna to tributyltin // Arch. Environ. Contam. а^ Toxicol. - 1998. - 34, N 1. - P. 21-25.
Получено 25.05.05
BIOCHEMICAL MECHANISMS OF INFLUENCE OF TIN AND TETRAPHENYLPORPHYRIN COMPOUNDS ONTO RAT’S DIGESTIVE GLANDS
M. N. Kolyada, E. M. Lagutina, N. N. Fedorova, N. S. Altufjeva, Yu. T. Pimenov, N. T. Berberova
influence of inorganic tin (SnCl2), organic derivatives from tin (trimetyl- and tributyltin chlorides) and tetraphenylporphyrin onto the morphology of liver and pancreas tissues, onto the rate of peroxide oxidation of lipids (POL) in the rat’s liver has been studied. There has been found correlation of increasing POL in rat’s liver with the irregular changes in morphology of liver tissues and pancreas. According to the rate of promoting peroxide oxidation of lipids in rat’s liver and the rate of pathological changes in rat’s digestive glands, the tested compounds can be seen as following activity line: Bu3SnCl >> Me3SnCl > SnCl2. The highest rate POL was observed in rat’s liver, the most significant changes being obtained by adding tributyltin chloride into the fodder. Decrease of activity POL under the influence of tetraphenylporphyrin shows antioxidant activity of this compound in vivo, pathological changes in the liver tissues and pancreas not being observed.
