CC BY
86
УДК [577.158:612.111] 547.1 13
М. Н. Коляда, В. П. Осипова, Н. Т. Лимонова*,
Е. М. Лагутина , Н. Т. Берберова
Южный научный центр РАН Ростов-на-Дону Астраханский государственный технический университет
ВЛИЯНИЕ СОЕДИНЕНИЙ РТУТИ И ОЛОВА НА ФЕРМЕНТЫ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ ГЕМОЛИЗАТА ЭРИТРОЦИТОВ КРОВИ
Введение
Органические производные ртути и олова относятся к крайне токсичным ксенобиотикам, которые, однако, продолжают достаточно широко использоваться и вследствие этого поступают в окружающую среду. Ме-тильные производные данных металлов могут достаточно легко образовываться в окружающей среде из неорганических производных в результате реакций биохимического метилирования [1].
Согласно последним исследованиям, определенный вклад в токсичность ртуть-, оловоорганических соединений вносит развитие неконтролируемого окислительного стресса [2-5].
Избыточная активация реакций свободнорадикального окисления представляет собой типичный патологический процесс, присущий самым различным заболеваниям и повреждающим воздействиям на организм. В то же время эндогенная генерация активных форм кислорода (АФК) и модификация «редокс-состояния» клеток являются важным механизмом ауторегуляции клеточного и тканевого гомеостаза.
Главную роль в инициации АФК различных жизненно важных или патологических процессов играет супероксидный анион-радикал как первоначальный продукт одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода. Этот вид АФК в своей гидратированной форме содержится в незначительных количествах в воздухе в виде так называемых отрицательных аэроинов и является важным фактором окружающей среды, без которого невозможна жизнедеятельность [6].
Важная роль в сохранении оксидантного баланса клеток и тканей принадлежит фенольным соединениям - медиаторам: производным пирокатехина (адреналин, норадреналин, дофамин). Аутоокисление катехоламинов в щелочной среде идет с образованием семихинона, который может сбрасывать электрон на кислород, образуя супероксидный анион-радикал, что является удобным методом их генерации in vitro. Супероксидный анион-радикал участвует в реакциях, приводящих к различным повреждениям: перекисном окислении ненасыщенных жирных кислот, окислении SH-групп белков, повреждении ДНК и др. Токсичность супероксидных анионов может увеличиваться за счет вторичных реакций, ведущих к образованию гидроксильных радикалов (OH) и синглетного кислорода (*O2).
Установлено, что супероксид-анионы in vitro взаимодействуют и инактивируют катехоламины [7]. Удаление свободных радикалов приводит к защите эндогенных и экзогенных катехоламинов от аутоокисления. В результате ликвидируются как гипореактивность, так и выработка потенциально токсичных аденохромов, а в итоге повышается выживаемость. Ионы O2- весьма опасны, т. к. время их «жизни» в водной среде продолжительнее, чем у остальных 02-производных радикалов. Поэтому экзогенно возникшие 02- могут проникать в клетку и (наряду с эндогенными) оказывать токсическое действие.
Повышение активности свободнорадикального окисления в первую очередь сказывается на эритроцитах, которые первыми исчерпывают свои компенсаторные возможности. Эритроциты содержат мощный катализатор перекисного окисления - гемоглобин, а в омывающей их плазме находится транспортируемое негемовое железо и липиды. В эритроцитах отсутствует белоксинтезирующий аппарат, в них не происходит обновления белковых молекул, в связи с чем адаптивные свойства этих клеток и их роль в резистентности организма во многом зависят от соотношения прооксидантов и антиоксидантов. Под действием супероксидного анион-радикала происходит деструкция эритроцитов крови человека [8].
Важнейшим ферментом системы антиоксидантной защиты является супероксиддисмутаза (СОД; КФ 1.15.1.1), которая катализирует превращение супероксидного анион-радикала в относительно менее активную перекись водорода и молекулярный кислород:
О2 . + О2 . + 2 Н+ = Н2О2 + О2
В условиях нормального обмена этот фермент поддерживает стационарную концентрацию О2-. на определенном уровне, тем самым защищая клеточные структуры от его повреждающего действия.
Очень важным для жизнеспособности клетки является баланс между активностями СОД и еще одного антиоксидантного фермента - каталазы (Н2О2 : Н2О2 - оксидоредуктаза, КФ 1.11.1.6), ускоряющей реакцию разложения перекиси водорода до Н2О и О2:
2Н2О2 = 2Н2О + О2Т
Резкое повышение в клетке активности СОД (путем специфической активации или сверхэкспрессии) без соответствующей активации каталазы является цитотоксичным [9].
Постановка задачи
Целью данной работы явилось определение влияния добавок наиболее токсичных в ряду метильных производных олова и ртути - триметило-ловохлорида (CH3)3SnCl и иодида метилртути, а также неорганического соединения ртути HgCl2 (сулемы) на способность гемолизата крови утилизировать супероксидный анион-радикал и на активность каталазы.
Экспериментальная часть
Способность гемолизата крови утилизировать супероксидный анион-радикал определяли по способности гемолизата эритроцитов ингибировать аутоокисление адреналина (1-(3,4-диоксифенил)-2-метиламиноэтанол)
в щелочной среде [10]. В данной работе использовалась следующая модельная система:
1) химическая система генерации супероксидного анион-радикала О2" - аутоокисление аптечного адреналина 0,1 % в щелочной среде;
2) компонент селективной элиминации О2-. - СОД (в составе гемолизата эритроцитов крови).
В качестве системы индикации был использован спектрофотометр 8реко1-211, СФ-103.
Был использован новый метод, основанный на измерении количества продукта окисления адреналина, имеющего максимум поглощения при 347 нм. Возникновение этого соединения предшествует появлению адре-нохрома. Необходимо отметить, что этот продукт образуется в отсутствие дополнительных источников О2--. Используется аптечный раствор 0,1 % адреналина и 0,2 М бикарбонатный буфер, рН 10,65. Биологический объект исследования - отмытые эритроциты крови человека. Процент ингибирования аутоокисления адреналина вычисляли по формуле
[1 - (ЛАШт/ЛДгантр)]-100 %.
Гемолизат эритроцитов из периферической крови человека выделяли по известной методике [11].
Определение активности каталазы определяли по скорости разложения пероксида водорода спектрофотометрически по изменению оптической плотности раствора при длине волны 240 нм в течение 1 минуты [12]. В кювету вносили 3 мл 0,05 М калийфосфатного буфера (рН 7,4) и добавляли 7 мкл 30 % Н2О2. После этого вносили 50 мкл гемолизата эритроцитов.
Исследуемые соединения ртути вносили в среду измерения в виде спиртовых растворов, предварительно показав отсутствие влияния спирта. Триметилоловохлорид растворяли в воде. Концентрация Н2О2 в среде измерения - 19,5 ммоль, токсикантов - 2,2-10"4 моль/л.
Результаты исследования и их обсуждение
Известно, что соединения ртути и олова способны накапливаться в эритроцитах и вызывать их гемолиз [13]. Это может приводить к инициированию свободнорадикального окисления, нарушению окислительновосстановительного равновесия и возможности наступления окислительного стресса.
Предварительно было показано, что в щелочной среде в условиях комнатной температуры происходит интенсивный процесс аутоокисления адреналина (рис. 1).
о
0,14
0,13
0,12
0,11
0,1
0,09 -
0,08
50 п ЮО
Время, С
150
Рис. 1. Кинетическая зависимость аутоокисления адреналина: концентрация адреналина - 230 мкМ; рН = 10,65;
0,2 М бикарбонатный буфер; Т = 20 С
Добавка гемолизата отмытых эритроцитов человека приводила к ингибированию аутоокисления адреналина на 42 %. Константа скорости окисления адреналина с добавкой гемолизата эритроцитов практически на порядок ниже аналогичной величины для окисления адреналина без добавки гемолизата эритроцитов. На рис. 2 представлены логарифмические анаморфозы кинетических кривых аутоокисления адреналина без добавки и с добавкой гемолизата эритроцитов, а также в присутствии токсикантов. Линеаризация опытных данных в координатах ЬпО/Дз = ДВремя) в случае аутоокисления адреналина в присутствии гемолизата эритроцитов свидетельствует о первом порядке процесса с коэффициентами корреляции близкими к 1.
Рис. 2. Логарифмические анаморфозы кинетических кривых аутоокисления адреналина: I - в присутствии гемолизата эритроцитов; II - контроль;
III - в присутствии СЫзЫ§1; IV - в присутствии Н^С^; V - в присутствии (СЫз)з8пС1
-ні
Время, с
При добавлении к гемолизату эритроцитов всех исследованных соединений ртути и олова скорость окисления адреналина возрастала, что свидетельствует не только о подавлении супероксид-анион-перехватывающей активности гемолизата эритроцитов, но и об инициировании окисления адреналина токсикантом в присутствии гемолизата эритроцитов. Наибольшее увеличение скорости окисления адреналина обнаружено при добавлении к гемолизату эритроцитов триметилоловохлорида.
Как известно, оловоорганические соединения, являясь кислотами Льюиса, образуют комплекс с супероксидным анион-радикалом О2--, выступая в качестве промотора переноса электрона на О2 [14].
Согласно [15], активность СОД снижалась под действием дибутило-ловодихлорида (С4Ы9)28пС12. При этом усиливалось образование АФК, что приводило к повышению уровня перекисного окисления липидов.
Влияние соединений ртути и олова на скорость аутоокисления адреналина и активность каталазы гемолизата эритроцитов крови
Добавка Влияние на скорость аутоокисления адреналина Активность каталазы, мМ Н2О2/мин
Контроль (с добавкой гемолизата крови) 42 % ингибирования 0,0447
Добавка (СЩзЯпСІ 38 % активирования 0,0223
Добавка СНз^І 11 % активирования 0,0336
Добавка Н§СІ2 14 % активирования 0,0406
Из данных таблицы видно, что наиболее токсичным является (CH3)3SnCl, снижающий активность каталазы в два раза и активирующий на 38 % процесс аутоокисления адреналина в щелочной среде в присутствии гемолизата эритроцитов крови.
Заключение
Таким образом, добавка триметилоловохлорида, иодида метилртути и сулемы к гемолизату эритроцитов не только полностью ингибировала антиоксидантную активность отмытых эритроцитов крови человека, но и активировала окисление адреналина в щелочной среде, а также снижала активность каталазы. В ряду исследуемых соединений наибольшее токсическое действие проявляет (CH3)3SnCl.
Следовательно, можно сказать, что соединения ртути и олова снижают активность антиоксидантной защиты гемолизата эритроцитов крови in vitro.
Работа выполнена при поддержке программы ОНЗ РАН «Развитие технологий мониторинга, экосистемное моделирование и прогнозирование при изучении природных ресурсов в условиях аридного климата» программы ОБН РАН «Биологические ресурсы России: Фундаментальные основы рационального использования» РФФИ (грант № 05-03-96504).
СПИСОК ЛИТЕРА ТУРЫ
1. Craig P. J. The Biological Alckylation of Heavy Elements // Royal. Soc. Chem. London. - 1988. - P. 294.
2. Ali S. F., Lebel C. P., Bondy S. C. Reactive Oxygen Species Formation as a Biomarker of Methylmercury and Trimethylin Neurotoxicity // Neurotoxicology. -1992. - Vol. 13, N 3. - P. 637-648.
3. Organic derivatives of mercury and tin as promoters of membrane lipid peroxidation / E. Milaeva, V. Petrosyan, N. Berberova et al. // Bioinorg. Chem. - 2004. - Vol. 2. - P. 10.
4. Ganther H. E. Modification of methylmercury toxicity and metabolism by selenium, and vitamin E: possible mechanisms // Environm. Health Perspect. - 1978. - Vol. 25. - P. 71.
5. Mizuhashi S., Ikegaya Y., Matsuki N. Cytotoxicity of tributyltin in rat hippocampal slice cultures // Neuroscience Research. - 2000. - Vol. 38. - P. 35-42.
6. ^ajuria A. Lipid peroxidation // Eneryman,s Sci. - 1997. - Vol. 32. - P. 109-113.
7. NatlInactivation of cathecholamines by superoxide gives new insights on the pathogenesis of septic shock / H. Macarthur, T. C. Westfall, D. P. Riley et al. // Acad. Sci. USA. - 2000. - Vol. 97, issue 17. - P. 9753-9758.
8. Stephen J. Weiss.The role of superoxide in the destruction of erythocyte targets by human neutrophils // The Joural of biological chemistry. - 1980. - Vol. 255, N 20, issue of Octorber 25. - P. 9912-9917.
9. Peskin A. V. Cu,Zn-superoxide dismutase gene dosage and cell resistance to oxidative stress: a review // Bioscience Reports. - 1977. - Vol. 17, N 1. - P. 85-89.
10. Сирота Т. В. Новый подход в исследовании процесса аутоокисления адреналина и использование его для измерения активности супероксиддисмутазы // Вопросы медицинской химии. - 1999. - № 3. - С. 263-272.
11. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования под общей ред. проф. Е. А. Кост. - М.: Медицина, 1975. - С. 384.
12. Beers, R. F., Jr., and I. W. Sizer. A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase // J. Biol. Chem. - 1952. - Vol. 195. -P. 133-140.
13. Interaction of organotins with biological system / М. T. Musmeci, Grazia Madonia, M. T. Lo Giudice et al. // Appl. Organomet. chem. - 1992. - Vol. 6. - P. 127-138.
14. Fukuzumi Sh. New perspective of electron transfer chemistry // Org. Biomol. Chem. - 2003. - N 1. - P. 609-620.
15. Oxygen radical generation and acute pancreatitis: effects of dibutyltin dichloride / ethanol and ethanol on rat pancreas / H. Weler, S. Mercord, L. Sonas et al. // Da-creas. - 1995. - Vol. 11, N 4. - P. 382-388.
Получено 1.11.2006
THE INFLUENCE OF MERCURY AND TIN COMPOUNDS UPON THE ENZYMES OF THE ANTIOXIDANT HEMOLYSATE DEFENCE SYSTEM OF BLOOD RED CORPUSCLES
M. N. Kolyada, V. P. Osipova, E. M. Lagutina,
N. T. Limonova, N. T. Berberova
The influence of mercury and tin compounds (HgCl2, CH3HgI, (CH3)3SnCl) on antioxidant state of hemolysate of blood red corpuscles in vitro is studied in the article. It is stated that the addition of these compounds decreases the speed of enzymatic decomposition reaction of hydrogen peroxide by catalase; moreover it activates the oxidation of adrenaline in alkaline media. (CH3)3SnCl shows the most toxic action. Thereby, the toxic action of mercury and tin compounds can be conditioned by decreasing of antioxidant hemolysate defence system of blood red corpuscles in vitro, and it assists the development of antioxidant stress in a living organism.
