CC BY
54
УДК 612.26.014.46:547.979.733
Ю. Т. Пименов, В. П. Осипова*, Л. А. Дьякова, Н. Т. Берберова*,
Е. Р. Милаева**, Л. А.Филиппова, И. В. Броцман
Астраханский государственный технический университет *Южный научный центр РАН, Ростов-на-Дону
** Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СКОРОСТИ ПЕРОКСИДНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ В ПЕЧЕНИ РУССКОГО ОСЕТРА (ACIPENSER GÜLDENSTADTIBRANDT) IN VITRO В ПРИСУТСТВИИ СОЕДИНЕНИЙ РТУТИ И ПОРФИРИНОВ
Введение
Липиды - основные компоненты биологических мембран - представляют собой легкоокисляющиеся соединения. Высокий интерес исследователей к процессам пероксидного окисления липидов (ПОЛ) объясняется двумя обстоятельствами: образованием большого числа чрезвычайно реакционноспособных свободных радикалов, оказывающих разрушительное воздействие на биологические структуры, и способностью пероксидного окисления липидов к неконтролируемому развитию по типу цепной реакции.
Свободные радикалы представляют собой чрезвычайно активные образования, возникающие в процессе жизнедеятельности организма, а также при воздействии неблагоприятных факторов окружающей среды (радиация, загрязненная атмосфера, различные химические соединения, в том числе тяжелые металлы, и т. п.). Увеличенное образование свободных радикалов в организме и связанное с этим усиление процессов перок-сидации липидов (которое иногда называют оксидативным стрессом) сопровождается рядом нарушений в свойствах биологических мембран и функционировании клеток. Негативное действие свободных радикалов проявляется в ускорении старения организма, провоцировании воспалительных процессов в мышечных, соединительных и других тканях, неправильном функционировании различных систем организма: циркуляционной, нервной (включая клетки мозга) и иммунной [1].
Известно, что переходные металлы являются инициаторами ПОЛ, однако все работы, посвященные исследованию влияния тяжелых металлов на перекисное окисление липидов, относятся к биологическим системам и, как правило, проводятся на уровне организма. Ранее показано, что токсичность ртутьорганических соединений может быть вызвана свободными органическими радикалами, образующимися в результате разрыва связи C-Hg [2], а не только связыванием SH-групп белков, мембранных ферментов и ионных каналов, вызывающим их инактивацию.
Обычно здоровый организм сам справляется со свободными радикалами, возникающими в процессе естественного метаболизма клеток, за
счет природных веществ, обладающих антиоксидантным действием. Однако неблагоприятные внешние факторы, в частности загрязнение водной среды тяжелыми металлами (ртуть, олово, кадмий и т. д.), приводят к ситуации, когда защитные силы организма уже не в состоянии нейтрализовать избыток агрессивных частиц. Защита клеточных мембран осуществляется системой антиоксидантов: токоферолами, имеющимися в мембранах и плазме крови, глутатионпероксидазой и каталазой, обезвреживающими гидропероксиды липидов, и альбумином плазмы, который связывает пероксиды липидов, и т. д.
В последнее время ведутся интенсивные исследования возможности использования в качестве антиоксидантов синтетически полученных пор-фиринов, обладающих активностью антиоксидантных ферментов [3]. Порфириновые соединения участвуют в глобальном биоэнергетическом механизме - в процессе биологического окисления. Уникальные возможности порфириновой структуры объясняются большой стабильностью, высоким сродством к электрону и низким потенциалом ионизации. Интересно, что обнаружена как антиоксидантная, так и прооксидантная активность порфиринов [4], причем комплексы металлов с порфирином обнаруживают большую токсичность по сравнению с токсичностью самих металлов и порфиринов [5].
Постановка задачи
Методы определения скорости пероксидного окисления липидов биомембран важны для оценки действия на эту систему природных веществ и ксенобиотиков, среди которых могут быть как прооксиданты, так и антиоксиданты. Эти исследования дают возможность практически использовать выявленный эффект различных соединений, в том числе лекарственных средств. Целью данной работы являлось изучение токсического влияния соединений ртути на процессы ПОЛ в печени русского осетра in vitro, а также поиск наиболее эффективного ингибитора радикального процесса окисления.
Материалы исследования и их обсуждение
Нами проведены исследования по влиянию соединений ртути (HgCl2, Hg(NO3)2, CH3HgI, CH3HgNO3) на накопление карбонильных продуктов, определяемых с помощью тиобарбитуровой кислоты (ТБК) в печени самки русского осетра (Acipenser güldenstädti Brandt) второй стадии зрелости (неполовозрелая) in vitro. Определение проводили по стандартной методике [6]. Навеску 0,5 г печени гомогенизировали в 19,5 мл охлажденного до 0-4 °С раствора хлорида калия, поместив стакан гомогенизатора в лед или снег. Полученный гомогенат сливали в стакан.
В пробирки наливали 2,0 мл гомогената и по 0,1 мл растворов аскорбиновой кислоты и соли Мора, добавляли 1 мл раствора трихлоруксус-ной кислоты. Одновременно в пробирки добавляли ртутьсодержащие соединения и порфирины, растворенные в капле хлороформа. Конечная кон-
центрация исследуемых соединений в пробирках составила 0,002 М, а 2,6-ди-трет-бутилфенол - 0,008 М. Соотношение соединений ртути и исследуемых антиоксидантов 1:1.
Далее все пробирки помещали на 10 минут в водяную баню при 37 °С, затем центрифугировали 10 минут при 3 000 об/мин. После этого отбирали в чистые пробирки по 2 мл надосадочной жидкости, приливали по 1 мл раствора тиобарбитуровой кислоты, помещали пробы в кипящую водяную баню на 10 минут и затем охлаждали их в ледяной воде до комнатной температуры.
После того как проба охладилась, в нее добавляли 1,0 мл хлороформа для получения прозрачного раствора и ставили центрифугировать на 15 минут при частоте оборотов 3 000 об/мин. Параллельно готовили контрольную пробу. Для этого в пробирку наливали 2 мл раствора хлорида калия, 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты и 1 мл раствора тиобарби-туровой кислоты, выдержав его предварительно 10 минут на кипящей водяной бане и охладив в ледяной воде до комнатной температуры.
Затем отбирали верхнюю фазу и измеряли экстинкцию пробы против контрольного раствора на ФЭК (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1,0 см.
Расчет проводили по формуле
х = (£х3х3,2)/(0,156х2),
где х - содержание малонового диальдегида (МДА) в исходном гомогенате, нмоль; Е - экстинкция проб; 3,2 - общий объем исследуемых проб, мл; 2 - объем надосадочной жидкости, взятой на определение малонового диальдегида, мл; 3 - объем проб, взятых на фотометрию, мл; 0,156 - экс-тинкция 1 нмоль малонового диальдегида в 1 мл при 532 им.
Скорость ПОЛ определяли по количеству накопленных в образце продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой. Результаты действия соединений ртути на скорость накопления ТБК-активных продуктов в печени русского осетра представлены на рис. 1.
На диаграмме приведены средние значения серии опытов, проводимых в одинаковых условиях, но с разными пробами рыб. Как видно из диаграммы, в гомогенатах печени с добавлением ^(N0^2, СН3^1, СН3НК03 отмечено увеличение содержания вторичных продуктов окисления, таких как МДА, в среднем на 50 %, а в случае с сулемой перекис-ное окисление липидов возрастает в 3 раза. Так как все исследуемые вещества вносили в гомогенат печени в виде хлороформенного раствора, отдельно было рассмотрено влияние самого хлороформа на процесс накопления ТБК-активных продуктов в печени русского осетра. Скорость накопления малонового диальдегида в присутствии хлороформа сравнима с контрольным опытом.
2,5
1,5
0,5
МДА, нмоль
Ш Контроль
^ Соединения ртути
Номер серии опытов
Рис. 1. Изменение скорости накопления ТБК-активных продуктов в печени русского осетра in vitro в присутствии исследуемых веществ:
1 - сулема; 2 - нитрат ртути; 3 - иодид метилртути; 4 - нитрат метилртути
Эффективность применения ингибиторов в цепных радикальных процессах окисления обусловлена тем, что эти соединения способны непосредственно взаимодействовать с радикалами, разрушать перекиси без образования свободных радикалов или связывать ионы металлов переменной валентности. В качестве антидотов в данной работе были исследованы тетрафенилпорфирин (ТРР), 3,5-ди-трет-бутил-4-
гидроксифенилпорфирин (ТРР-ОН) и 2,6-ди-трет-бутилфенол.
3,5-ди-трет-бутил-4-
гидроксифенилпорфирин
тетрафенилпорфирин
3
2
0
На рис. 2 приведены средние значения серии опытов изменения скорости накопления малонового диальдегида в присутствии антидотов и при совместном действии соединений ртути и антиоксидантов относительно контроля, т. е. в отсутствие различных добавок. Как видно из диаграммы, тетрафенилпорфирин проявляет прооксидантную активность, увеличивая накопление в печени осетра вторичных продуктов перекисного окисления липидов примерно на 10 %, в то время как 3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенилпорфирин проявляет антиоксидантное действие, снижая накопление малонового диальдегида в среднем на 30 %. Добавление 2,6-ди-трет-бутилфенола в гомогенат печени русского осетра приводит к уменьшению накопления ТБК-активных продуктов примерно на 12-19 %.
10 -
4 -
МДА, нмоль
Ш Контроль
|—| Исследуемые вещества
Номер серии опытов
Рис. 2. Изменение скорости накопления ТБК-активных продуктов в печени русского осетра in vitro в присутствии исследуемых веществ:
1 - ТРР; 2 - ТРР-ОН; 3 - 2,6-ди-трет-бутилфенол; 4 - сулема + ТРР-ОН;
5 - сулема + ТРР; 6 - нитрат метилртути + ТРР; 7 - нитрат метилртути + ТРР-ОН
Учитывая наличие четырех феноксильных групп в молекуле ТРР-ОН, в работе использовали концентрацию фенола в 4 раза больше. Исходя из того, что ТРР не оказывает антиоксидантного действия, а ТРР-ОН является ингибитором радикального процесса перекисного окисления липидов, можно предположить, что эффективность данного соединения проявляется за счет наличия фенольных фрагментов. Это означает, что 3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенилпорфирин является ловушкой активных радикалов, участвующих в процессе ПОЛ, благодаря образованию стабильной структуры.
Заключение
Полученные результаты показали, что наиболее эффективным антидотом является 3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенилпорфирин, снижающий накопление МДА без токсикантов примерно на 30 %, в присутствии сулемы - на 60 %, при введении остальных соединений ртути содержание карбонильных соединений сравнимо с контрольным опытом (без добавок). Предполагается, что эффективность данного соединения проявляется благодаря стабильности образующегося радикала.
8
6
2
0
СПИСОК ЛИТЕРА ТУРЫ
1. Владимиров Ю. А., Арчаков А. И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. - М.: Наука, 1972.
2. Пименов Ю. Т., Давыдова С. Л., Милаева Е. Р. Ртуть, олово, свинец и их органические производные в окружающей среде: Моногр. Астрахань: Изд-во АГТУ, 2001. - 147 с.
3. Effects of metalloporphyrin catalytic antioxidants in experimental brain ischemia / H. Sheno, J. J. Enghild, R. Bowler, еt al. // Free Radical Biology & Medicine. -Vol. 33, No 7. - 2002. - Р. 947-961.
4. Perez M. J., Cederbaum A. I. Antioxidant and pro-oxidant effects of a manganese porphyrin complex against CYP2E1-dependent toxicity // Free Radical Biology & Medicine. - Vol. 33, No 1. - 2002. - Р. 111-127.
5. Toxic effects of mercury(II), cadmium (II) and lead(II) porphyrins on Trypanosoma brucei brucei growth / Tatsuru Hara, Dennis J. Grab, Masaaki Tabata, Toshihide Fukuma // Chemico-Biological Interactions. - 2002. - 139. - Р. 177-185.
6. Строев Е. Н., Макарова В. Г. Практикум по биологической химии. - М.: Высш. шк., 1986. - 279 с.
Работа выполнена при поддержке Программы фундаментальных исследований ОБН РАН «Фундаментальные основы управления биологическими ресурсами» по теме «Исследование влияния соединений ртути и олова на рыбоводно-биологические и биохимические показатели молоди русского осетра и повышение резистентности осетровых при промышленном выращивании»
Получено 11.11.04
MEASURING VELOCITY OF PEROXIDE OXIDATION OF LIPIDS IN THE LIVER OF RUSSIAN STURGEON (ACIPENSER GULDENSTADTIBRANDT) IN VITRO AT PRESENCE OF MERCURY COMPOUNDS AND PORPHYRINS
U. T. Pimenov, V. P. Osipova, L. A. Dyakova, N. T. Berberova,
E. P. Milayeva, L. A. Filippova, I. V. Brozman
There has been investigated influence of HgCl2, Hg(NO3)2,
CH3HgI, CH3HgNO3 on accumulation of carbonyl products determined with the help of thiobabitural acid in the liver of Russian Sturgeon (Acipenser guldenstadti Brandt) in vitro. In homogenates of the liver with addition mercury salts it is noticed that the content of malon dialdehyde (MDA) has increased in average on 50 %, in case with sublime the peroxide oxidation being 3 times greater. There were investigated 2,6-di-tert-butylphenol, tetraphenylporphyrin and 3,5-di-tert-butyl-4-hydroxiphenylporhpyrin (TPP-OH) as antidotes. The most effective proved to be TPP-OH, decreasing accumulation of MDA without toxicants for about 30 %, at presence of sublime - for 60 %, with introducing the rest mercury compounds the content of carbonyl compounds being compatible with the check test (without additives).The effectiveness of the given compound is supposed to display due to stability of the radical which is being formed.
