CC BY
58
УДК [577.158:612.111] 547.1' 13
М. Н. Коляда, В. П. Осипова, Н. Т. Пипия*, Е. М. Лагутина*,
Н. Т. Берберова, Ю. Т. Пименов , Е. Р. Милаева
Южный научный центр РАН Ростов-на-Дону Астраханский государственный технический университет Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова
ВЛИЯНИЕ СОЕДИНЕНИЙ РТУТИ И ОЛОВА НА АКТИВНОСТЬ КАТАЛАЗЫ ГЕМОЛИЗАТА ЭРИТРОЦИТОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА IN VITRO
Соединения ртути и олова, в частности их органические производные, относятся к крайне токсичным ксенобиотикам. Липофильные свойства этих соединений определяют их накопление в липидном бислое клеточных мембран [1]. Биотрансформация ртуть- и оловоорганических соединений вызывает образование активных радикалов, в том числе и активных форм кислорода (АФК), обусловливает каскад радикальных процессов в мембранах и клетках живых организмах, приводя к окислительному стрессу организма в целом [2-5]. В связи с этим особое значение для резистентности организма к экстремальному воздействию соединений ртути и олова приобретает антиоксидантная защитная система, способная ингибировать радикальные реакции и образование активных радикалов различной природы [6].
В нормальных метаболических процессах в организме в результате ряда биологических окислительно-восстановительных реакций образуются различные активные формы кислорода, в том числе и пероксид водорода, который разлагается с образованием кислорода и воды при действии внутриклеточного фермента - антиоксиданта каталазы (Н2О2 : Н2О2 -оксидоредуктаза, КФ 1.11.1.6).
По мере накопления Н2О2 содействует образованию в реакциях дис-мутации de novo свободных радикалов, которые снова вступают в различные реакции с образованием Н2О2 и выделением кислорода. Таким образом, поддерживается стационарная цепь образования Н2О2, который определяет соответствующую концентрацию свободных радикалов и ведёт к образованию эндогенного кислорода. Пероксид водорода является сильным клеточным ядом, поскольку в результате его разложения с участием ионов металлов по реакции Фентона образуется реакционноспособный гидроксильный радикал ОН-, который может разрывать любую С-Н или С-С связь. Кроме того, образуются и другие сильные окислители, которые повреждают ДНК и белки [7].
Повышение активности свободнорадикального окисления прежде всего сказывается на эритроцитах, которые первыми исчерпывают свои компенса-
торные возможности. В эритроцитах отсутствует белоксинтезирующий аппарат, в них не происходит обновления белковых молекул, в связи с чем адаптивные свойства этих клеток и их роль в резистентности организма во многом зависят от соотношения прооксидантов и антиоксидантов.
Активация в эритроцитах свободнорадикальных процессов уменьшает текучесть и деформируемость эритроцитарных мембран и морфологию эритроцитов, тем самым изменяя агрегационную и деформационную способность этих клеток [8]. В настоящее время доказана доминирующая роль каталазы в удалении перекиси водорода в эритроцитах человека [9], хотя первоначально эту роль отводили глутатионпероксидазе [10].
Разложение перекиси водорода бактериальной клетки каталазой эритроцитов является причиной неизвестного ранее свойства эритроцитов подавлять рост и размножение патогенных и условно-патогенных микроорганизмов [11].
Таким образом, функционирование ферментной системы каталазы имеет определяющее значение для организма в условиях антропогенной нагрузки, и в особенности при попадании в организм токсичных соединений ртути и олова.
Целью данной работы явилось определение влияния добавок ме-тильных производных ртути и олова СН3Н§1, (СН3)38пС1, а также 3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенилмеркурхлорида и ^С12 на активность каталазы отмытых эритроцитов крови человека.
Материалы и методы исследования
В качестве ртуть- и оловоорганических соединений были выбраны следующие соединения:
Последнее соединение сочетает в молекуле две функции - антиоксиданта (фенольная группа) и прооксиданта (атом ртути). Исследуемые соединения ртути вносили в среду измерения в виде спиртовых растворов, триметилоловохлорид растворяли в воде.
Гемолизат эритроцитов из периферической крови человека выделяли по известному методу [12]. Определение активности каталазы проводили по стандартной методике [13]. Активность каталазы определяли по скорости разложения пероксида водорода спектрофотометрически по изменению оптической плотности раствора при длине волны 240 нм в течение 1 минуты. В кювету вносили 3 мл 0,05 М калийфосфатного буфера (рН 7,4) и добавляли 7 мкл 30 % Н2О2. После этого вносили 50 мкл гемолизата эритроцитов.
^С12 - сулема
СН3^І - иодид метилртути
(СН3)38пС1 - хлорид триметилолова
- 3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенилмеркурхлорид
Результаты исследования и их обсуждение
Известно, что метилртутные соли и оловоорганические соединения способны накапливаться в эритроцитах [14]. Соотношение содержания СН3^Х в красных тельцах и плазме составляет 300:1 [15]. С этим фактом связывают слабую степень выведения метилртутных соединений из организма, поскольку из плазмы они могут быть выведены достаточно легко.
Согласно литературным данным, соединения олова вызывают гемолиз эритроцитов [16, 17].
Результаты исследований по влиянию добавок данных соединений на активность каталазы гемолизата отмытых эритроцитов крови человека представлены на рисунке. Приведены результаты серии опытов, проводившихся в одинаковых условиях.
2.5 2
1.5 1
0,5
0
-0,5
-1
-1,5
1
A B C
D
-E
Серии опытов
Н202/мин
Влияние добавок соединений ртути и олова на активность каталазы гемолизата отмытых эритроцитов крови человека in vitro: A - контроль; B - HgCl2;
C - 3,5-ди-трет-бутил-4-оксифенилмеркурхлорид; D - CH3HgI; E - (CH3)3SnCl.
Концентрации Н2О2 в среде измерения -19,5 ммоль, токсикантов - 2,2 • 10-4 моль/л
Как видно из диаграммы, добавка всех токсикантов приводит к изменению скорости разложения пероксида водорода в присутствии гемолизата эритроцитов. При добавлении хлорида ртути, 3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенилмеркурхлорида, триметилоловохлорида наблюдается снижение скорости расхода Н2О2 в 15, 5 и 2 раза соответственно. Видно, что наибольшее снижение активности каталазы наблюдается при добавлении сулемы. Однако необходимо учитывать, что в эритроцитах способны накапливаться именно органические производные ртути и олова.
При добавлении CH3HgI наблюдается увеличение оптической плотности при длине волны 240 нм.
Для однозначной интерпретации полученных результатов в данной работе изучалась возможность взаимодействия добавляемых соединений непосредственно с субстратом каталазы - пероксидом водорода. С этой целью исследовали спектры поглощения Н2О2 в присутствии добавок, фиксировали изменение концентрации Н2О2 при его инкубировании с соединениями ртути и олова без гемолизата эритроцитов. Спектр поглоще-
ния раствора, содержащего Н2О2 и сулему или хлоридтриметилолова, не изменялся, что свидетельствовало об отсутствии взаимодействия данных соединений с субстратом каталазы.
В присутствии СН3^1 и 3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенилмер-курхлорида наблюдали изменение спектров растворов Н2О2. Добавка этих соединений к Н2О2 в буфере приводила к увеличению оптической плотности растворов, что, вероятно, можно объяснить их влиянием на пероксид водорода. Известно, что металлоорганические соединения могут реагировать с Н2О2 с образованием соответствующих пероксидов [18].
Я„МХИ + НООН ® Я„М(ООН)Хи-1 + НХ
С другой стороны, известно, что при разложении металлоорганических пероксидов возможно образование пероксидных радикалов ЯО2-, поглощающих в УФ-области в области 237-242 нм [19]. Таким образом, возрастание оптической плотности при длине волны 240 нм в течение 1 минуты при добавлении иодида метилртути к пероксиду водорода в присутствии гемолизата свидетельствует, вероятно, о взаимодействии данного соединения с Н2О2 с последующим образованием пероксидных радикалов, поглощающих при данной длине волны. В случае же 3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенилмеркурхлорида в аналогичных условиях наблюдается незначительное уменьшение оптической плотности, что свидетельствует о протекании реакции разложения пероксида водорода каталазой.
Влияние данного соединения на антиоксидантный фермент представляет особый интерес, поскольку в его молекуле сочетаются антиоксидантная группа (фенольный фрагмент) и токсичная ртутьсодержащая группа. Ранее показано [20], что данное соединение обладает слабым ингибирующим эффектом в реакции окисления олеиновой кислоты, что объясняли более высокими скоростями отрыва атома водорода от фенольной группы пероксильными радикалами в стадии обрыва цепи по сравнению со скоростями реакций радикального замещения у атома Н§ в ртутьорга-ническом фрагменте.
Заключение
Таким образом, все соединения ртути и олова, исследованные в роли токсикантов, снижали скорость разложения пероксида водорода каталазой гемолизата эритроцитов крови человека. Показано, что в случае добавок метилмеркуриодида и 3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенилмеркурхлорида данное влияние может быть связано с действием на субстрат - Н2О2, что также может способствовать увеличению концентрации радикальных частиц в эритроцитах и развитию окислительного стресса.
Работа выполнена при поддержке программы ОБН РАН «Фундаментальные основы управления биологическими ресурсами» по теме № 00-04-21 «Исследование влияния соединений ртути и олова на рыбоводнобиологические и биохимические показатели молоди русского осетра и повышение резистентности осетровых при промышленном выращивании», РФФИ
(грант № 05-03-96504), программы ОНЗ РАН «Развитие технологий мониторинга, экосистемное моделирование и прогнозирование при изучении природных ресурсов в условиях аридного климата» по теме «Каспийское море как объект мониторинга и моделирования региональных и глобальных биосферных процессов».
СПИСОК ЛИТЕРА ТУРЫ
1. Crompton T. R. Occurrence and analysis of organometallic compounds in the environment. John Wiley, New York, 1998.
2. Organic derivatives of mercury and tin as promoters of membrane lipid peroxidation / E. Milaeva, V. Petrosyan, N. Berberova et al. // Bioinorg. Chem. - 2004. -Vol. 2. - P. 10.
3. Ganther H. E. Modification of methylmercury toxicity and metabolism by selenium, and vitamin E: possible mechanisms. Environm // Health Perspect. - 1978. -Vol. 25. - P. 71.
4. Ali S. F., Lebel C. P., Bondy S. C. Reactive Oxygen Species Formation as a Biomarker of Methylmercury and Trimethylin Neurotoxicity // Neurotoxicology. -1992. - Vol. 13, N 3. - P. 637-648.
5. Mizuhashi S., Ikegaya Y., Matsuki N. Cytotoxicity of tributyltin in rat hippocampal slice cultures // Neuroscience Research. - 2000. - Vol. 38. - P. 35-42.
6. Sergen, O., Morel I., Cillard J. In: Sigel A., Sigel H. (eds) Metal Ions in Biological Systems; Marcel Dekker: New York, 1999, 36, 251-287.
7. Kasprzak K. S. Oxidative DNA and protein damage in metal-induced toxicity and carcinogenesis // Free Radical Biology & Medicine. - 2002. - Vol. 32, N 10. -P. 958-967.
8. Alterations of human erythrocytes membrane fluidity by oxygen-derived free radicals and calcium / H. Watanabe, A. Kobayashi, T. Yamamoto et. al. // Free Radic. Biol. Med. - 1990. - 8 (6). Р. 507-514.
9. Predominant role of catalase in the disposal of hydrogen peroxide within human erythrocytes / G. F. Gaetani, A. M. Ferraris, M. Rolfo // Вlood. - 1996. - ^l. 87, N 4. - P. 1595-1599.
10. Importance of catalase in the disposal of hydrogen peroxide within human erythrocytes / G. F. Gaetani, H. N. Kirkman, R. Mangerini, A. M. Ferraris // Blood. -1994. - 84. - P. 325-330.
11. Сторожук П. Г. Ферменты прямой и косвенной антирадикальной защиты эритроцитов и их роль в инициации процессов оксигенации гемоглобина, антибактериальной защите и делении клеток // Вестн. интенсивной терапии. -2000. - № 3. - С. 8-13.
12. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования / Под общ. ред. проф. Е. А. Кост. - М.: Медицина, 1975.
13. Beers R. F., Jr. and I. W. Sizer. A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase // J. Biol. Chem. - 1952. - Vol. 195. -P. 133-140.
14. Interaction of organotins with biological system / М. T. Musmeci, Grazia Mado-nia, M. Teresa Lo Giudice et al // Appl. Organomet. chem. - 1992. - Vol. 6. - P. 127138.
15. Norseth T., Clarkson T.W. Studies on the biotransformation pf 203Hg-labeled methyl mercury chloride in rats // Arch Environ Health. - 1970. - 21. - 717-727.
16. Erythrocyte hemolysis by organic tin and leach compounds / H. Kleszczynska,
S. ladyszowski, H. Pruchnic, S. Przestalski // Z. Naturforsch C. - 1997. - Vol. 52. -P. 65-69.
17. Ellectrostatic inhibition of hemolysis induced by organotin compounds / H. Kleszczynska, H. Pruchnik, S. Przestalski // Biochem. Mol. Biol. Int. - 1998. -Vol. 44. - P. 305-313.
18. Антоновский В. Л., Хурсан С. Л. Физическая химия органических пероксидов. - М.: ИКЦ «Академкнига», 2003.
19. Мельников М. Я. Фотохимия пероксидных радикалов в твёрдой фазе и на активированной поверхности твёрдых тел // Вестн. Москов. ун-та. Сер. 2. Химия. - 2001. - Т. 42, № 3. - С. 188-193.
20. Пути снижения окислительного стресса, промотированного ртутьорганиче-скими соединениями / Е. Р. Милаева, Ю. Т. Пименов, Н. Т. Берберова и др. // Докл. АН. - 2001. - Т. 379, № 5. - С. 631-635.
Получено 1.11.05
THE CHANGE OF ACTIVITY OF BLOOD'S ERYTHROCYTE'S CATALASE IN PRESENCE OF HG AND SN COMPOUNDS
M. N. Kolyada, V. P. Osipova, N. T. Pipiya, E. M. Lagutina,
N. T. Berberova, Yu. T. Pimenov, E. R. Milaeva
The effect of HgCl2, CH3HgI, 3,5-di-tert-butyl-4-hydroxyphenylmercury chloride, (CH3)3SnCl on the initial rate of the hydrogen peroxide oxidation with catalase of washed blood’s erythrocytes was studied. It was stated that with addition of studying mercury and tin compounds the reduction of hydrogen peroxide flow rate exists with HgCl2 (in 15 times), 3,5-di-tert-butyl-4-hydroxyphenylmercury chloride (in 5 times), (CH3)3SnCl (in 2 times). The introduction of CH3HgI and 3,5-di-tert-butyl-4-hydroxyphenylmercury chloride in washed blood’s erythrocytes rads increases of absorbance and can influence on this toxicant directly to reactions substrate - the hydrogen peroxide (it was stated the change of H2O2 spectrum in presence of these compounds).
