CC BY
18
DOI 10.24412/2074-5036-2021-3-19-27 УДК 619:578.835.2:615.371.004.12:616-076
Ключевые слова: концентрация рибонуклеопротеина вируса бешенства, антирабическая вакцина, амплификация, гибридизационно-флуоресцентная детекция ампликонов.
Keywords: rabies virus ribonucleoprotein concentration, rabies vaccine, amplification, hybridization-fluorescent detection of amplicons.
Доронин М. И., Михалишин Д. В., Мудрак Н. С., Борисов А. В., Груздев К. Н.
ОПОСРЕДОВАННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНА ВИРУСА БЕШЕНСТВА В СЫРЬЕ ДЛЯ ВАКЦИН МЕТОДОМ АМПЛИФИКАЦИИ И ГИБРИДИЗАЦИОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ
ДЕТЕКЦИИ АМПЛИКОНОВ
MEDIATED DETERMINATION OF THE RIBONUCLEOPROTEIN CONCENTRATION OF THE RABIES VIRUS IN RAW MATERIALS FOR VACCINES BY AMPLIFICATION AND HYBRIDIZATION-FLUORESCENT DETECTION OF AMPLICONS
ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» Адрес: 600901, Россия, г. Владимир, мкр. Юрьевец Federal Centre for Animal Health, Federal Governmental Budgetary Institution Address: 600901, Russia, Vladimir, Yur 'evets
Доронин М.И., к. б. н., вед. науч. сотрудник. E-mail: doronin@arriah.ru
Doronin M.I., PhD in Biological Science, Leading Researcher. E-mail: doronin@arriah.ru Михалишин Д.В., к. в. н., зав. лабораторией. E-mail: mihalishindv@arriah.ru Michalishin D.V., PhD in Veterinary Science, Head of the Laboratory. E-mail: mihalishindv@arriah.ru Мудрак Н.С., д. б. н., главный научный сотрудник. E-mail: mudrak@arriah.ru Mudrak N.S., Doctor of Biological Sciences, Chief Researcher. E-mail: mudrak@arriah.ru Борисов А.В., к. в. н., вед. науч. сотрудник. E-mail: borisov_av@arriah.ru Borisov A.V., PhD in Veterinary Science, Leading Researcher. E-mail: borisov_av@arriah.ru Груздев К.Н., д. б. н., профессор, Заслуженный ветеринарный врач РФ, трижды Лауреат Премии
Правительства РФ в области науки и техники. E-mail: gruzdev@arriah.ru Gruzdev K.N., Doctor of Biological Science, Professor, Honored Veterinarian of the Russian Federation, three times Laureate of the Prize of the Government of the Russian Federation in the field of science and technology.
E-mail: gruzdev@arriah.ru
Аннотация. В процессе производства антирабических вакцин вируссодержащее сырье исследуют для определения концентрации важного иммуногенного компонента, рибонуклеопротеина вируса бешенства. В статье описана разработка и апробирование нового способа опосредованного определения его концентрации в сырье для вакцин с применением метода амплификации и гибридизационно-флуоресцентной детекции ампликонов. Разработанный способ позволяет сократить время исследования до 3-4 ч; исключить вероятность контаминации; увеличить чувствительность и специфичность за счет применения высокоспецифичных оригинальных олигону-клеотидов. Между концентрацией рибонуклеопротеина вируса бешенства и пороговым циклом амплификации установлена зависимость: CRNP ВБ = -0,3002 х Ct + 8,81, отраженная в виде линейной функции с высокими достоверностью аппроксимации (R2 = 0,9984) и эффективностью амплификации 99,83 %. Аналитическая чувствительность метода составила 10 нг/мл, чувствительность - 99,48 % (n=386), специфичность - 100,00 % (n=386), общая точность - 99,74 % (n=386). Проведено исследование прецизионности представленного способа в условиях воспроизводимости. Определены незначительная степень отклонений индивидуальных значений порогового цикла амплификации от среднего арифметического, а также высокий уровень достоверности данных внутри каждой выборки. Коэффициент осцилляции составил 0,361-2,207 %, линейный коэффициент вариации - 0,041-0,169 %, коэффициент вариации - 0,044-0,169 %, что соответствует общепринятым нормам (C5 < 3 %). Summary. During the production of rabies vaccines, virus-containing raw materials are examined to determine the concentration of such an immunogenic component as the ribonucleoprotein of the rabies virus. The article describes the development and testing of a new method for indirect determination of the concentration of rabies virus ribonucleoprotein in raw materials for vaccines using the amplification method and hybridization-fluorescent detection of amplicons, which reduces the study time to 3-4 hours; eliminate the likelihood of contamination; increase the sensitivity and specificity
through the use of highly specific original oligonucleotides. Between the concentration of ribonucleoprotein of the rabies virus and the threshold amplification cycle, the relationship CRNPRV = -0.3002 x Ct + 8.81 was established, reflected as a linear function with a high accuracy of approximation (R2 = 0.9984) and an amplification efficiency of99.83 %. The analytical sensitivity of the method was 10 ng/ml, the sensitivity of the method was 99.48 % (n = 386), the specificity was 100.00 % (n = 386), and the overall accuracy was 99.74 % (n = 386). A study of the precision of the presented method was carried out under reproducibility conditions, and an insignificant degree of deviation of individual values of the threshold cycle of amplification from the arithmetic mean was determined, as well as a high level of data reliability within each sample. The oscillation coefficient was 0.361-2.207 %, the linear coefficient of variation was 0.041-0.169 %, the coefficient of variation was 0.044-0.169 %, which corresponds to generally accepted norms (CS < 3 %).
Введение
Бешенство по своей природе является острым вирусным энцефалитом с почти 100%-ной летальностью, что является очень высоким показателем среди известных инфекционных заболеваний [2]. Возбудителем данной болезни является вирус бешенства порядка Mononegavirales семейства Rhabdoviridae рода Lyssavirus вида Rabies lyssavirus. Геном вируса представлен несегментированной одноцепочечной негативной молекулой РНК длиной около 12 000 н. о. Нуклеиновая кислота кодирует 5 основных белков, расположенных в консервативном линейном порядке: нуклеопро-теин (N-белок), фосфопротеин (P-белок), матриксный белок (М-белок), гликопротеин (G-белок), РНК-зависимую РНК-полимеразу (L-белок) [9]. Вирион вируса бешенства имеет пулевидную форму длиной 130-250 нм и диаметром 60-100 нм. Он состоит из следующих функциональных структур: RNP-комплекс (рибонуклеопротеин), расположенный внутри вириона, и внешняя белко-во-липидная составляющая. RNP-комплекс представляет собой внутренний нуклео-капсид, который включает в себя геномную РНК, прочно связанную с нуклеопротеи-дом и фосфопротеином, а также вирусную полимеразу. Рибонуклеопротеин является важным иммуногенным компонентом вакцинных препаратов против бешенства. В RNP-комплексе содержится 4 % РНК к 96 % белка [2]. Снаружи вириона располагается двухслойная липидная оболочка с «шипами» гликопротеина. Матричный белок находится между RNP-комплексом и внешней составляющей вириона, конденсирует нуклеопротеин и взаимодействует с эндодоменом гликопротеин ом [12]. Единицы транскрипции разделены короткими
нетранслируемыми межгенными областями. Исключение составляет межгенная область G-L, которая состоит из 400-700 нуклео-тидов и может представлять собой остаток гена, который потерял свою функциональность во время эволюции лиссавирусов [10].
Белки вируса бешенства полифункциональны. Нуклеопротеин защищает вирусный геном от активности клеточной РНКазы и взаимодействует с L- и Р-белками во время транскрипции и репликации. Фосфопротеин отвечает за правильное позиционирование L-белка и действует как шаперон во время синтеза нуклеопротеина, образуя №Р-комплекс, который предотвращают самоагрегацию №белка и связывание с клеточной РНК [12]. Матриксный белок является структурным элементом, который связывается с рибонуклеопротеином и цитоплазматиче-ским доменом гликопротеина для облегчения процесса сборки вирусных частиц. Гли-копротеин - единственный вирусный белок, расположенный на поверхности вириона. Он обеспечивает связывание с рецепторами клетки-хозяина, индуцирует эндоцитоз, а также взаимодействуют с М-белком, облегчая морфогенез вирионов. L-белок выполняет функции, необходимые для транскрипции и репликации генома [10].
Постэкспозиционная профилактика может обеспечить практически полное излечение от болезни при своевременном и правильном применении и доступна уже более века. Тем не менее, данное заболевание по-прежнему ежегодно приводит к гибели десятков тысяч людей и животных из-за плохой доступности соответствующих биологических препаратов, особенно в развивающихся странах тропической Азии и Африки [2]. Как и при любом инфекционном заболевании, эффективные программы борьбы с бешенством
20
опираются на строгий лабораторный надзор, надежные диагностические инструменты и высокоэффективные биологические препараты, в том числе антирабические вакцины [4].
В процессе производства антирабических вакцин вируссодержащее сырье исследуют для определения концентрации такого им-муногенного компонента, как рибонукле-опротеина вируса бешенства [2, 11]. В настоящее время для этих целей применяют прямой сэндвич-вариант иммунофермент-ного анализа (ИФА) [5]. Однако он может иметь ряд недостатков: возможности увеличения чувствительности метода ограничиваются фоном анализируемого соединения, субстратной специфичностью фермента и аффинностью антител; наличие в тестируемых образцах кофакторов, ингибиторов и стимуляторов активности ферментов; ИФА не позволяет разделять нативные белки и их биологические неактивные фрагменты, сохранившие антигенные детерминанты; возможное изменение каталитической активности фермента при его конъюгировании с антигеном [3].
В связи с этим целесообразно разработать способ опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина вируса бешенства в сырье для вакцин с применением метода амплификации и гибридизационно-флуоресцентной детекции ампликонов.
Данный метод позволяет опосредованно определять концентрацию рибонуклеопро-теина в течение 3-4 часов, не предполагает контаминации исследуемых образцов, предполагает удаление кофакторов и ингибиторов реакции амплификации, характеризуется отсутствием изменения каталитической активности фермента, имеет высокую аналитическую чувствительность и специфичность.
В настоящее время представленный метод применяют только для качественного анализа вируссодержащего материала на наличие генома вируса бешенства [13, 14]. Для определения концентрации рибонуклеопротеина вируса бешенства в сырье для вакцин ранее данный метод не применялся.
Цель исследования заключалась в разработке и апробировании способа опосредованного определения концентрации рибону-
клеопротеина вируса бешенства в сырье для вакцин с применением метода амплификации и гибридизационно-флуоресцентной детекции ампликонов.
Материалы и методы
Получение очищенного препарата рибо-нуклеопротеина вируса бешенства. Суспензионные клетки почки новорожденного сирийского хомячка BHK-21 с концентрацией 4,0 млн кл./мл инфицировали вирусом бешенства штамма РВ-97 в дозе 0,1 ККИД50/мл и инкубировали при температуре 37±0,5 °С до получения 95-100 % поражения клеток в течение 48 ч. Полученную суспензию вируса бешенства подвергали центрифугированию при 1500 g в течение 10 мин и получали осажденные клетки, в которых содержится рибонуклеопротеин. Инфицированные клетки подвергали лизированию, добавляя ледяной раствор апротинина с концентрацией активного вещества 25 мкл/мл. Суспензию инкубировали в течение 1 ч при температуре 4,0±0,5 °С и осветляли центрифугированием при 1 000 g при той же температуре в течение 20 минут. Супернатант собирали, и процедуру повторяли дважды. Полученные надосадки из каждого раунда смешивали и центрифугировали при 12 000 g и температуре 4,0±0,5 °С в течение 8 минут. Суперна-тант собирали в другую пробирку.
Суспензию рибонуклеопротеина очищали ультрацентрифугированием в ступенчатом градиенте хлорида цезия (CsCl) с концентрациями 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26 % в соответствии с протоколом, описанным Dietzschold [7]. Центрифугирование проводили при 65 000 g в течение 2 ч и температуре 15 °С. Опалесцирующий слой RNP-комплекса вируса бешенства в области 19-21 % хлористого цезия (соответствует плавучей плотности рибонуклеопротеина) отбирали в отдельный флакон. Полученный раствор вносили в центрифужные пробирки, доливали объем пробирок с помощью фос-фатно-солевого буферного раствора (ФСБ). Для очищения от остатков хлористого цезия суспензию рибонуклеопротеина осаждали с помощью центрифугирования при 60 000 g в течение 1 ч при 15 °С. Полученный осадок ресуспендировали в 5 мл ФСБ.
21
Определение концентрации рибонукле-опротеина вируса бешенства в прямом количественном сэндвич-варианте ИФА. Для определения концентрации (в мкг/мл) рибо-нуклеопротеина вируса бешенства применяли твердофазный прямой сэндвич-вариант ИФА в соответствии с рекомендациями автора [5].
Белковый электрофорез проводили в соответствии с общепринятыми рекомендациями [4].
Выделение нуклеиновой кислоты. Экстракцию РНК проводили методом твердофазной экстракции с применением частиц гидроокиси кремния диаметром 250-300 нм, обработанных 4 М раствором гидроксида натрия. Денатурацию белковых составляющих осуществляли с помощью 4 М гуанидинизо-тиоцианата (ГТЦ). Промывание частиц сорбента от ингибиторов реакции амплификации проводили с использованием 80 %-ного раствора пропанола-2. Для элюции РНК использовали ТЕ-буфер (рН 7,3), свободный от РНКаз и ионов Mg2+.
Обратная транскрипция. В качестве основы для реакции использовали 10х буферный раствор для обратной транскрипции, хлорид магния (2 мМ на реакцию), дезок-сирибонуклеозидтрифосфаты (ёЭТР) (по 0,25 мкл на реакцию), гексамерные олиго-нуклеотиды произвольного состава (1,25 пМ на реакцию). Для ингибирования РНК-аз в реакционную смесь добавляли РНазин (10 ед./реакцию). В качестве фермента применяли АМ^ревертазу (10 ед./реакцию). Объем вносимого элюата РНК - 2 мкл, общий объем реакционной смеси - 20 мкл. Обратную транскрипцию проводили при температуре 42 °С в течение 15 мин.
Реакция амплификации. Для проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией ДНК-ампликонов составляли реакционную смесь, в состав которой входили гомологичные участку №гена вакцинных штаммов вируса бешенства олигонуклео-тиды: F-RabV-RNP-праймер, R-RabV-RNP-праймер и P-RabV-RNP-FAM/RTQ 1 -зонд (дизайн представлен в таблице) в концентрации по 5 пМ на реакцию, дезоксирибону-клеозид-трифосфаты - 2 мМ, 5х буферный раствор, диметилсульфооксид (1 %) (для све-
дения к минимуму неспецифического связывания олигонуклеотидов), хлорид магния -2 мМ. В качестве катализатора реакции амплификации применяли Ругоеосеш /игот Pfu-Plus-ДНК-зависимую ДНК-полимеразу (10 ед.). Элюаты РНК каждого образца добавляли к реакционной смеси по 5 мкл. Итоговый объем смеси для проведения одной реакции составляет 25 мкл. Амплификация включала в себя 3 подэтапа: денатурацию, отжиг олигонуклеотидов, элонгацию. Денатурацию проводят при температуре 94 °С в течение 10 с, отжиг праймеров и зонда -при температуре 53 °С в течение 30 с, элонгацию - при температуре 74 °С в течение 60 с.
Статистическая обработка данных. Статистическая обработка заключалась в определении средних арифметических значений и достоверности статистической разницы между средними величинами, определенными по разностному методу Стьюдента-Фи-шера. Различия считали статистически достоверными при уровне значимости р<0,005. Чувствительность, специфичность и другие валидационные параметры представленной методики определяли в соответствии с международными рекомендациями [1, 15].
Результаты исследований и обсуждение
На первом этапе исследования проводили разработку способа опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина вируса бешенства в сырье для вакцин с применением метода амплификации и гибриди-зационно-флуоресцентной детекции ампли-конов.
Изначально получали положительный контрольный образец для выявления зависимости концентрации рибонуклеопроте-ина вируса бешенства и порогового цикла амплификации в соответствии с методикой, представленной в разделе «Материалы и методы». В готовой суспензии определяли концентрацию RNP-комплекса вируса бешенства в прямом количественном сэндвич-варианте ИФА [5]. Для оценки степени чистоты положительного контрольного препарата проводили вертикальный белковый электрофорез в полиакриламидном геле, содержащем додецилсульфат натрия. По результатам
22
исследования концентрация RNP-комплекса составляла 4880 мкг/мл. Результаты вертикального электрофореза отражены на рис. 1, из которого видно, что получен чистый препарат рибонуклеопротеина, включающий в свой состав нуклеопротеин, фосфопротеин и L-белок вируса бешенства с молекулярным весом 57, 260 и 190 кСа, соответственно. В отрицательном контроле данные белки не обнаружены. Из данного препарата с помощью 1/15 М раствора ФСБ приготовили положительный контрольный образец с концентрацией RNP-комплекса 5,0 мкг/мл.
Составляли контрольную панель положительных стандартов рибонуклеопротеина вируса бешенства штамма РВ-97, в качестве которых использовали очищенные препараты с концентрациями RNP-комплекса: 0,1; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 мкг/мл. В качестве отрицательного контроля применяли суспензию клеток ВНК-21, не зараженную вирусом бешенства.
Из всех стандартных положительных и отрицательного контролей выделяли нуклеиновую кислоту. Для этого применяли метод твердофазной экстракции с применением частиц гидроокиси кремния диаметром 250-300 нм, обработанных 4 М раствором гидрокси-дом натрия. Принцип очистки РНК вируса бешенства с помощью гидроокиси кремния базируется на высокой степени аффинности отрицательно заряженного остова РНК к положительно заряженным частицам сорбента. Фосфатные группы при физиологическом рН отрицательно заряжены, поэтому РНК является полианионом и может взаимодействовать с гидроокисью кремния. Катионы натрия на поверхности частиц сорбента выступают в качестве «мостика», который притягивает анионы кислорода в составе остатка фосфорной кислоты РНК. При высоком значении ионной силы (рН 5,0-5,5) происходит разрушение водородных связей между протоном воды и отрицательно заряженными ионами кислорода в частицах сорбента. В результате молекулы нуклеиновых кислот связываются с носителем, а интенсивное промывание позволяет удалить все ингибиторы реакции амплификации [14]. Элюирование РНК проводили с применением ТЕ-буфера.
.М 12 3 4
260 кДа 190 кДа
57кДа
Рис. 1. Электрофореграмма очищенного RNP-комплекса вируса бешенства (М - маркер, 1, 2, 3 -образец препаратов рибонуклеопротеина вируса бешенства, исследовали в трех повторностях, 4 - отрицательный контроль).
Полученные элюаты РНК, выделенных из контрольных образцов с разной концентрацией рибонуклеопротеина использовали для проведения обратной транскрипции и реакции амплификации с гибридизационно-флу-оресцентной детекцией ДНК-ампликонов. Постановку реакций осуществляли при температурных и временных параметрах, сведения о которых представлены в разделе «Материалы и методы». Для ПЦР применяли Pyrococcus furiosus Pfu-Plus-ДНК-зависимую ДНК-полимеразу, поскольку она является термостабильным рекомбинантным ферментом. Фермент осуществляет синтез ДНК в направлении 5'->3' в присутствии ионов Mg2+ и при соответствующем значении рН, а также обладает 3'->5'-экзонуклеазной активностью («проверочной активностью» -«proofreading activity»). Наличие 3'->5'- эк-зонуклеазной активности делает фермент пригодным для реакции амплификации, где необходимо получение продукта с высокой точностью синтеза. При работе в оптимальных условиях Pfu-plus-ДНК-полимераза допускает минимальное количество ошибок по сравнения с другими термостабильными по-лимеразами.
23
Таблица 1
Дизайн оригинальных олигонуклеотидов для амплификации кДНК вируса бешенства при определении концентрации рибонуклеопротеина в сырье для антирабических вакцин
Наименование олигонуклеотидов Дизайн олигонуклеотидов (5'.. .3') Позиции в геноме, н.о. Размер фрагмента, п.н.
F-RabV-RNP-праймер ACTCTAATGACAACTCACAA 626.645 444
R-RabV-RNP-праймер ACATGCGGCAATAACTGT 1052.1069
P-RabV-RNP-FAM/RTQ1- зонд FAM-TTGGAGTACTATACCGAA-RTQ1 658.675
В качестве гомологичных участку №гена вируса бешенства для проведения реакции амплификации использовали следующие оли-гонуклеотиды: F-RabV-RNP-праймер, R-RabV-RNP-праймер и P-RabV-RNP-FAM/RTQ1-зонд, дизайн которых представлен в таблице. Олиго-нуклеотиды подбирали в соответствии с рядом общих правил, которые отражены в работе В. Deiman [6]. Длины F-RabV-RNP-праймера, R-RabV-RNP-праймера и P-RabV-RNP-FAM/ RTQ1-зонда составляют 20, 18 и 18 н.о., что соответствует требованиям (18-30 н.о.) [6]. Ну-клеотидная последовательность зонда не комплементарна олигонуклеотидным праймерам. Отсутствуют 4 и более подряд одинаковых нуклеотидов в цепи праймеров и зонда. Флуо-рофор FAM присоединен к 5'-концу, а гаситель флуоресценции RHQ1 - к З'-концу. В качестве флуоресцентного красителя был выбран FAM с длиной волны максимальной флуоресценцией 520 нм. Для тушения свечения использовали гаситель флуоресценции RHQ1 с длиной волны максимального поглощения при 520 нм и возможном диапазоне гашения 470-570 нм. Иными словами, была выбрана подходящая пара «флуорофор-гаситель». Размер амплифи-цируемого продукта составляет 444 п.н.
При анализе нуклеотидных последовательностей олигонуклеотидов установили, что для праймеров и зонда нехарактерно образование «шпилек», а также не выявлено 3'-комплементарности и сайтов, отжигающих сами на себя при условии, когда минимальное количество пар оснований, необходимое для димеризации праймера и минимальное количество пар оснований, необходимое для образования шпильки - 4.
Экспериментально температуру отжига определяли по кривым плавления гетеро-
димера олигонуклеотида и матрицы с помощью модели фолдинга с использованием программного обеспечения Hybrid. В результате проведения эксперимента было выявлено, что температура отжига рассматриваемых олигонуклеотидов составляет 52, 53, 55 °С. Для проведения реакции амплификации было решено проводить гибридизацию праймеров и зонда с участком N-гена вируса бешенства при температуре 53 °С.
Последовательности оригинальных оли-гонуклеотидов проверили на наличие нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот с использованием Банка данных последовательности нуклеиновых кислот вируса бешенства [8]. Последовательности праймеров и зонда также проанализировали на наличие внутренних вторичных структур с помощью программы сворачивания нуклеиновых кислот с помощью программы Mfold. Выявлено, что для разработанных олигонуклеотидов нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот, а также наличия внутренних вторичных структур не обнаружено.
Результаты реакции амплификации анализировали, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям пороговых циклов амплификации Ct, определенных с помощью пересечения пороговой линии и логистической функции вида Fl = f (Ct) методом гибридизационно-флуоресцентной детекции ДНК-ампликонов. Учет результатов реакции производили на каждом цикле. Детектирующий амплифи-катор определял уровень флуоресценции и строил кинетическую кривую в координатах: уровень флуоресценции - цикл реакции ам-
24
плификации. Для положительных контрольных образцов были сформированы логистические графики, полученные при анализе флуоресценции красителя FAM, входящего в состав молекулярного зонда. Для отрицательного контрольного образца график не выходил за пределы пороговой линии и не имел экспоненциальной зависимости.
Устанавливали зависимость между пороговым циклом амплификации и концентрацией RNP-комплекса вируса бешенства в сырье для антирабической вакцины. Полученные данные отражены на рисунке 2 и выражены в виде функции: СЯОТ ВБ = -0,3002 х С4 + 8,81, где С^ ВБ - концентрация рибонуклео-протеина вируса бешенства, С4 - пороговый цикл амплификации. Оценивали величину эффективности реакции амплификации (Е) по формуле: Е=(10-1/к-1) (к брали из функции С = -3,3263 х СRNP ВБ + 29,38) (рисунок 3), а также достоверность аппроксимации (Я2). Эффективность реакции амплификации составила 99,83 %, достоверность аппроксимации - 0,9984, что соответствовало общепринятым требованиям, предъявляемым к моле-кулярно-биологическим тест-системам [15].
На следующем этапе исследования проводили апробирование разработанного способа и определили степень его достоверности. Для анализа использовали 304 суспензии культурального вируса бешенства производственных штаммов РВ-97 и ВНИИЗЖ со следующими концентрациями RNP-комплекса: 2,0-5,0 мкг/мл (76 образцов), 0,5-2,0 мкг/мл (76 образцов), 0,1-0,5 мкг/мл (76 образцов), 0,01-0,10 мкг/мл (76 образцов). В качестве положительного контроля применяли суспензию культурального вируса бешенства штамма РВ-97 с концентрацией рибонуклео-протеина 1,0 мкг/мл. В качестве отрицательного контроля применяли суспензию клеток ВНК-21, не зараженную вирусом бешенства.
Испытуемые пробы и контрольные образцы исследовали в трех повторностях. Элю-ирование нуклеиновой кислоты, проведение обратной транскрипции и реакции амплификации с гибридизационно-флуоресцентной детекцией ампликонов проводили, как указано выше. Данные, полученные с помощью разработанного способа, коррелировали
Сю,ТВБ--1 тг2 ),3002С1+ 8,81 = 0.9984
о ; ; 10 15 2 0 25 0 35
Пороговый цикл амплификации
Рис. 2. Зависимость концентрации рибонуклеопроте-ина вируса бешенства и величины порогового цикла амплификации (п=3, отмечены точки, отображающие средние значения пороговых циклов реакции амплификации).
35 а = -з 3263 С ютвб + 29,38 И2 = 0,9984
Е = 99,83%
10 5
-1 0 1 2 3 4 5 6
Концентрация 1*?чТ-комплекеа вируса бешенства, мкг/мл
Рис. 3. Зависимость величины порогового цикла амплификации от концентрации RNP-комплекса вируса бешенства (п=3, отмечены точки, отображающие средние значения пороговых циклов реакции амплификации).
с методом прямого количественного варианта ИФА на 97,2-100,0% для 2,00-5,00 мкг/мл (п=76), на 96,7-97,2% для 2,00-0,50 мкг/мл (п=76) на 95,9-96,7% для 0,10-0,50 мкг/мл (п=76) на 94,3-95,6% для 0,10-0,01 мкг/мл (п=76). Полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанного способа по сравнению с методом ИФА.
Проводили определение аналитической чувствительности метода определения концентрации иммуногенного ЯОТ-комплекса вируса бешенства в сырье для антирабиче-ских вакцин методом амплификации и ги-бридизационно-флуоресцентной детекции ДНК-ампликонов. Для определения аналитической чувствительности подготавливали панель положительных стандартов вируса бешенства со следующими концентрациями
25
рибонуклеопротеина вируса бешенства: 0,0001; 0,001; 0,005; 0,01; 0,1; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0 мкг/мл. Испытуемые контрольные образцы исследовали в 7 повторностях. Все этапы работы осуществляли, как описано выше. Проведен сравнительный анализ концентраций RNP-комплекса вируса бешенства с помощью разработанного способа в сравнении с данными прямого количественного сэндвич-варианта ИФА. Выявлено, что аналитическая чувствительность метода составила 0,001 мкг/мл (10 нг/мл).
Для определения чувствительности разработанного теста исследовали 386 образцов суспензий, которые являлись заведомо положительными по данным исследования в ИФА. Постановку теста проводили, как отражено выше. В результате анализа с помощью разработанного способа определили, что количество достоверно положительных - 384, а ложноотрицательных - 2. Таким образом, чувствительность теста составила 99,48 %.
Для исследования специфичности метода тестировали 384 образцов суспензий, которые являлись отрицательными по данным исследования в ИФА. В результате исследования разработанным способом определили, что количество достоверно отрицательных -384. Таким образом, специфичность разработанного теста составила 100,00 %. Учитывая полученные данные, рассчитали общую точность метода, которая соответствовала 99,74 %.
Для определения прецизионности представленного способа в условиях воспроизводимости суспензии вируса бешенства исследовали два оператора в разное время в 20 повторностях. Для генеральной совокупности значений С размах вариации составил 0,05-0,39, среднее линейное отклонение находилось в диапазоне 0,007-0,048, т. е. степень колеблемости в выборках относительно среднего уровня признака низкая. Дисперсия составила 0,001-0,005, среднее квадратичное отклонение — 0,010-0,086, что подтверждает незначительную степень отклонений индивидуальных значений С( от среднего арифметического и высокий уровень достоверности данных внутри каждой выборки. Коэффициент осцилляции соста-
вил 0,361-2,207 %, линейный коэффициент вариации - 0,041-0,169 %, коэффициент вариации - 0,044-0,169 %, что соответствует общепринятым нормам (C8<3%) [1, 15]. Таким образом, по показателям вариации разработанный способ удовлетворял критериям приемлемости.
Заключение
Предложен новый подход к опосредованному определению концентрации рибо-нуклеопротеина вируса бешенства в сырье для вакцин с применением метода амплификации и гибридизационно-флуоресцентной детекции ампликонов, который позволяет сократить время исследования до 3-4 ч; исключить вероятность контаминации; увеличить чувствительность и специфичность за счет применения высокоспецифичных оригинальных олигонуклеотидов.
Выявлено, что между концентрацией ри-бонуклеопротеина вируса бешенства и пороговым циклом амплификации установлена зависимость С_хгош= = -0,3002 х C + 8,81, от-
RNP ВБ ' t ' '
раженная в виде линейной функции с высокими достоверностью аппроксимации (R2 = 0,9984) и эффективностью амплификации 99,83 %. Разработанная математическая модель дает возможность опосредованно определять концентрацию RNP-комплекса вируса бешенства в сырье для производства антира-бических вакцин.
Определено, что аналитическая чувствительность метода составила 10 нг/мл, чувствительность способа - 99,48 % (n=386), специфичность - 100,00 % (n=386), общая точность - 99,74 % (n=386). Проведено исследование прецизионности представленного способа в условиях воспроизводимости и определены незначительная степень отклонений индивидуальных значений порогового цикла амплификации от среднего арифметического, а также высокий уровень достоверности данных внутри каждой выборки. Относительное изменение крайних значений Ct и доля среднего показателя абсолютных отклонений в сравнении со средним внутри каждой совокупности незначительна. Подтверждена высокая степень прецизионности в условиях воспроизводимости, что позво-
26
ляет применять разработанный способ для опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина вируса бешенства в сырье для вакцин.
Список литературы
1. Васильева, Л. А. Статистические методы в биологии, медицине и сельском хозяйстве: учеб. пособие / Л. А. Васильева. Новосибирск.: Институт цитологии и генетики СО РАН, 2007. 124 с.
2. Груздев К. Н. Бешенство животных. / К. Н. Груздев, А. Е. Метлин. Владимир: ФГБУ «ВНИИЗЖ», 2019. 394 с.
3. Масяго А. В. Некоторые ошибки при постановке ИФА. / А. В. Масяго. Кольцово, 2002. 31 с.
4. Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. / Л. А. Остерман. М.: МЦНМО, 2002, 248 с.
5. Сухарьков А. Ю. Разработка методов оценки оральной антирабической вакцинации животных: автореферат дис. ... к. б. н.: 03.02.02 / А. Ю. Сухарьков. Владимир, 2014. 25 с.
6. Deiman B. Characteristics and applications of nucleic acid sequence based amplification / B. Deiman, P. van Aarle, P. Sillekens // Mol. Biotech. 2002. Vol. 20. P. 163-179.
7. Dietzschold B. Induction of protective immunity against rabies by immunization with rabies virus ribonucleoprotein / B. Dietzschold, H. H. Wang,
C. E. Rupprecht, E. Celis, M. Tollis, E. Heber-Katz, H. Koprowski // Proc. Natl. Acad Sci USA. 1987. V. 84. P. 9165-9169.
8. GenBank. [Электронный ресурс] / URL: http:// www.ncbi.nlm.nih.gov. (Дата обращения: 02.02.2021).
9. Horton D. L. Quantifying antigen relationsships among the lyssaviruses. / D. L. Horton, L. M. McElhinney // J. Virol. 2010. V. 84. P. 11841-11848.
10. Levin S. N. Infections of the nervous system / S. N. Levin, J. L. Lyons // Am J. Med. 2018. V. 131. P. 25-32.
11. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2019 (OIE). Rabies. 2019. Ch. 3.1.17. P. 578-612.
12. Okumura A. Rabies virus assembly and budding Adv / А. Okumura, R. N. Harty // Virus Res. 2011. V. 79. P. 23-32.
13. Schnee M. An mRNA Vaccine Encoding Rabies Virus Glycoprotein Induces Protection against Lethal Infection in Mice and Correlates of Protection in Adult and Newborn Pigs / M. Schnee, A. B. Vogel // PLoS Negl Trop Dis. 2016 Jun 23;10(6):e0004746. doi: 10.1371/ journal.pntd.0004746.
14. Okumura A., Harty R.N. Rabies virus assembly and budding Adv // Virus Res. - 2011. - V. 79. - P. 23-32.
15. PCR. Methods and Protocols / ed. L. Dominques. 2017. 283 p. DOI 10.1007/978-1-4939-7060-5.
16. Vallat B. OIE Quality Standard and Guidelines for Veterinary Laboratories: Infectious Diseases. / B. Vallat. 2nd ed. Paris, France, 2008. 67 p.
Объективная проверка слуха у животных. BAER-тест
С 2018 года ЧОУ ДПО «Институт Ветеринарной Биологии» проводит обучающий курс по объективной проверке слуха у животных (BAER-тест) у собак, кошек и других видов животных. В теоретической части занятий слушатели знакомятся с теорией процесса регистрации вызванных слуховых потенциалов и основами нейрофизиологии. За время практических занятий каждый слушатель обучается самостоятельно проводить осмотр животного перед проведением BAER-теста, проверять племенные документы (для выписки сертификата допуска в разведение), непосредственно выполнять BAER-тест, фиксировать данные тестирования, интерпретировать данные тестирования, выписывать экспертное заключение о результатах BAER-теста. По окончании курса слушатели получают СЕРТИФИКАТ СПЕЦИАЛИСТА по проведению BAER-теста.
Подробнее: http://invetbio.spb.ru/seminar_baer.htm
Записаться на курс, приобрести прибор для проверки слуха у животных: ivb-info@mail.ru
27
