CC BY
23
DOI: 10.24412/2074-5036-2021-2-18-25 УДК 619:578.835.2:615.371.004.12:616-076
Ключевые слова: титр вируса бешенства, антирабическая вакцина, пороговый цикл амплификации РНК, транскрипционная амплификация, Ьеасоп-технология
Key words: rabies virus titer, rabies vaccine, threshold cycle of RNA amplification, transcriptional amplification, beacon technology
Доронин М. И., Михалишин Д. В., Мудрак Н. С.
ОПОСРЕДОВАННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНФЕКЦИОННОГО ТИТРА ВИРУСА БЕШЕНСТВА В СЫРЬЕ ДЛЯ ВАКЦИН С ПРИМЕНЕНИЕМ ТРАНСКРИПЦИОННОЙ АМПЛИФИКАЦИИ И BEACON-ТЕХНОЛОГИИ
MEDIATED DETERMINATION OF INFECTIOUS TITER OF RABIES VIRUS IN RAW MATERIALS FOR VACCINES USING TRANSCRIPTION AMPLIFICATION
AND BEACON-TECHNOLOGY
ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» Адрес: 600901, Россия, г. Владимир, мкр. Юрьевец
Federal Centre for Animal Health, Federal Governmental Budgetary Institution Address: 600901, Russia, Vladimir, Yur 'evets
Доронин Максим Игоревич, к. б. н., вед. науч. сотрудник. E-maiMoronin@arriah.ru
Doronin Maksim Igorevich, PhD in Biological Science, Leading Researcher. E-mail:doronin@arriah.ru Михалишин Дмитрий Валерьевич, к. в. н., зав. лабораторией. E-mail:mihalishindv@arriah.ru Michalishin Dmitry Valerjevich, PhD in Veterinary Science, Head of the Laboratory. E-mail:mihalishindv@arriah.ru Мудрак Наталья Станиславовна, главный научный сотрудник. E-mail: mudrak@arriah.ru
Mudrak Natalja Stanislavovna, Doctor of Biological Sciences, Chief Researcher. E-mail: mudrak@arriah.ru
Аннотация. Бешенство - опасное для людей, а также диких и домашних плотоядных и сельскохозяйственных животных заболевание, характеризующееся признаками энцефаломиелита и абсолютной летальностью. Для профилактики рабической болезни проводят ряд мер, одной из которых является иммунизация животных. В статье представлен новый подход к опосредованному определению инфекционного титра вируса бешенства в неинакти-вированном сырье для вакцин с применением транскрипционной амплификации и beacon-технологии. В отличие от общепринятого метода титрования в клеточной линии с элементами реакции иммунофлуоресценции для определения титра вируса бешенства разработанный способ позволяет сократить время проведения анализа до 2-3 ч; исключить вероятность контаминации и субъективности при оценке результатов анализа; увеличить чистоту РНК вируса бешенства; увеличить специфичность и чувствительность анализа. Между инфекционным титром вируса бешенства и пороговым циклом реакции транскрипционной амплификации вирусной РНК с применением разработанных олигонуклеотидов установлена зависимость, отраженная в виде логарифмической функции lg ТВБ = -0,2997 х Ct РНК + 9,7524 высокими достоверностью аппроксимации (R2 = 0,9997) и эффективностью амплификации 98,41 %. Представленная математическая модель дает возможность определять значение инфекционного титра вируса бешенства в неинактивированном сырье для производства антирабических вакцин. По показателям вариации разработанный способ удовлетворял критериям приемлемости: коэффициент осцилляции составил 0,365-2,224 %, линейный коэффициент вариации - 0,045-0,185 %, коэффициент вариации - 0,0590,179 %, что соответствует общепринятым нормам (C5<3 %).
Summary. Rabies is a dangerous disease for humans, as well as for wild and domestic carnivores and farm animals, characterized by signs of encephalomyelitis and absolute mortality. A number of measures are carried out for the prevention of slave disease, one of which is the immunization of animals. The article presents a new approach to the indirect determination of the infectious titer of the rabies virus in non-inactivated raw materials for vaccines using transcriptional amplification and beacon technology. In contrast to the generally accepted method of titration in a cell line with elements of the reaction of immunofluorescence for determining the titer of the rabies virus, the developed method allows to reduce the analysis time to 2-3 hours; eliminate the likelihood of contamination and subjectivity when evaluating the results of the analysis; increase the purity ofrabies virus RNA; increase the specificity and sensitivity of the assay. A relationship was established between the infectious titer of the rabies virus and the threshold cycle of the reaction of transcriptional amplification ofviral RNA using the developed oligonucleotides, reflected in the form of the logarithmic function log TRV = -0.2997 x Ct + 9.7524 with high accuracy of approximation (R2 = 0.9997) and the amplification
efficiency is 98.41 %. The presented mathematical model makes it possible to determine the value of the infectious titer of the rabies virus in non-inactivated raw materials for the production of rabies vaccines. In terms of variation indicators, the developed method met the acceptance criteria: the oscillation coefficient was 0.365-2.224 %, the linear coefficient of variation was 0.045-0.185 %, and the coefficient of variation was 0.059-0.179 %, which corresponds to generally accepted standards (Cô <3 %).
Введение
В настоящее время в мире продолжают регистрировать бешенство у людей, а также у домашних и диких плотоядных и сельскохозяйственных животных. Болезнь, характеризующаяся признаками энцефаломиелита и абсолютной летальностью. Классический возбудитель бешенства Rabies virus (RABV) является РНК-содержащим вирусом, принадлежащий реалму Riboviria царству Orthornavirae типу Negarnaviricota классу Monjiviricetes порядку Mononegavirales семейству Rhabdoviridae роду Lyssavirus (Rabies lyssa virus) генотипу Rabies virus (RABV) [4].
Вирионы вируса бешенства имеют пуле-видную форму длиной 100-300 нм, диаметром 45-100 нм. На наружной поверхности вирусной частицы располагаются выступы в виде шипов длиной 10-12 нм, которые прикреплены к двуслойной липидной оболочке [2]. Геном RABV составляет около 12 000 нуклеотидных оснований (н. о.) и включает 5 последовательно расположенных генов 3'-N-P-M-G-L-5', кодирующих 5 белков: N - нуклеопротеин, G - гликопро-теин, P - фосфопротеин, M - матриксный белок, L - РНК-зависимую РНК-полимеразу. Гены разделены некодирующими областями. Наиболее консервативным является N-ген, а наибольшие изменения, происходящие в геноме изолятов и штаммов вируса бешенства, отмечаются в G-гене [1, 4].
Рабическая инфекция приводит к значительным экономическим потерям, которые связаны с гибелью людей, падежом сельскохозяйственных животных, ликвидацией последствий вспышек заболевания, проведением профилактических и карантинных мероприятий, регулированием численности диких плотоядных животных, отловом бродячих кошек и собак и осуществлением ла-бораторно-диагностических исследований. Система мер по борьбе и профилактике бешенства предусматривает иммунизацию
домашних, сельскохозяйственных и диких плотоядных, а также контроль уровня напряженности поствакцинального иммунитета [4].
Иммунизацию домашних и сельскохозяйственных целевых животных проводят с применением инактивированных анти-рабических вакцин. При изготовлении вакцин против бешенства вирусосодержащую суспензию исследуют на определение инфекционного титра вируса для оценки его активности в клетках. В 1,0 см3 суспензии вируса бешенства определяют количество клеточных культуральных инфекционных доз, вызывающих 50 %-ное поражение клеток (ККИД50/см3), что фактически отражает концентрацию полных вирусных частиц, содержащих РНК.
Определение значения инфекционного титра вируса бешенства в соответствии с рекомендациями международного стандарта OIE [4] проводят методом титрования в монослойной клеточной линии почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21 с последующим окрашиванием монослоя конъюгатом (суспензия специфического иммуноглобулина G, меченого флуоресцеи-низотиоцианатом (ФИТЦ)) (Реакция имму-нофлуоресценции - РИФ). Данный метод зарекомендовал себя, однако он имеет некоторые недостатки, а именно: длительная процедура анализа (не менее 3 суток), связанная с репродукцией вируса в клетках; определенная степень субъективности при оценке результатов исследования; высокая стоимость клеточной линии как тест-системы и затраты на ее поддержание; высокая вероятность риска контаминации клеточной линии; качество конъюгата [1].
В связи с этим целесообразно разработать способ определения инфекционного титра вируса бешенства в неинактивированном сырье для вакцины на основе транскрипционной амплификации и с применением beacon-технологии.
Молекулярно-биологический метод транскрипционной амплификации с применением Ьеасоп-технологии является объективным, высокочувствительным и высокоспецифичным, более дешевым по сравнению с методом титрования в культуре клеток, характеризуется применением стандартизированных компонентов реакции, не создает ситуаций риска контаминации, поскольку пробирки закрыты на этапе детекции результатов анализа, отличается высокими значениями правильности и позволяет определять инфекционный титр вируса бешенства в не-инактивированных вирусосодержащих суспензиях в течение 2-3 часов.
В настоящее время представленный метод применяют только для качественного выявления некоторых инфекционных агентов, в частности, возбудителя аспергиллеза, гриппа птиц А, энтеровирусной инфекции, микобак-териоза КРС, парагриппа-1, 2, 3, 4, сальмо-неллеза животных [10]. Для количественного определения вирусной нагрузки суспензии, в частности, для опосредованного определения титра вируса бешенства ранее данный метод не применялся.
Цель исследования заключалась в разработке высокочувствительного и высокоспецифичного способа опосредованного определения инфекционного титра вируса бешенства в сырье для вакцин с применением транскрипционной амплификации и Ьеасоп-технологии.
Материалы и методы
Вирус. В работе использовали классический вирус бешенства штаммов РВ-97 и ВНИИЗЖ, которые являются производственными и депонированы в Коллекции штаммов микроорганизмов (КШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ».
Титрование вируса бешенства проводили в монослойной перевиваемой культуре клеток ВНК-21 с последующим окрашиванием конъ-югатом по общепринятой методике [1, 4].
Выделение РНК вируса бешенства осуществляли с применением магнитных частиц оксида железа (II, III) диаметром 300-320 нм в присутствии хаотропного денатурирующего агента 4 М раствора гуанидинизотио-
цаната (ГТЦ). Освобождение магнитных частиц от белковых фракций и липопротеинов проводили с использованием 40 и 70 %-ных растворов изопропилового спирта, а также 80 %-ного раствора диметилкетона. Элюи-рование РНК осуществляли с помощью де-ионизированной воды, свободной от РНКаз.
Для оценки степени чистоты элюата РНК проводили измерения спектральной поглощающей способности образцов при длинах волны в диапазоне 205-325 нм. Интерпретация возможных результатов описана ранее [2].
Определение температуры плавления олигонуклеотидов, применяемых для транскрипционной амплификации проводили с использованием двух методов. Первый -метод, учитывающий концентрации ионов К+ и диметилсульфооксида (DMSO) с стандартным применением формулы [6]:
где [К+] - концентрация ионов калия (М), [% DMSO] - количество диметилсульфооксида (%), G - количество остатков рибогуанозин-трифосфата, С - количество остатков рибо-цитидинтрифосфата.
Второй - метод ближайших соседей с применением расчетной формулы [6]:
где dH - дифференциал энтропии (ккал/ моль), dG - дифференциал энергии Гиббса (ккал/моль), dS - дифференциал энтальпии (кал/°К-моль), С - концентрация олигонукле-отида (2-10-7 М), L - длина олигонуклеотида, [К+] - концентрация ионов калия (5-10-2 М), R - газовая постоянная (1,987 кал/К-моль).
Реакция транскрипционной амплификации. Для проведения транскрипционной амплификации использовали разработанные нами оригинальные олигонуклеотидные праймеры и зонд в концентрации 0,20 пМ на реакцию. Для синтеза нуклеотидных цепей РНК-ампликонов применяли дезоксирибо-нуклеозидтрифосфаты (dNTP) и рибонукле-озидтрифосфаты ^ТР) с их концентрацией в реакционной смеси по 2 мМ. Для реакции
также использовали буферный раствор (5х), включающий в свой состав ионы калия (К+) (5-10-2 M) и диметилсульфооксид (DMSO) (1 %). В качестве кофактора применяли 12 мМ хлорида магния. В качестве катализаторов реакции использовали следующие ферменты: AMV-обратную транскриптазу (10 ед.), РНКаза Н E. coli (10 ед.) и Т7 ДНК-зависимую РНК-полимеразу (10 ед.). Данные ферменты добавляли в реакционную смесь после прогревания до 65 °С и снижения температуры до 41 °С, поскольку эти компоненты реакции термолабильны. Элюаты РНК вируса бешенства вносили к реакционной смеси в соотношении 1/5.
Постановку реакции осуществляли в детектирующем амплификаторе. Стадию денатурации РНК проводили при температуре 65 °С в течение 5 мин за 1 цикл. Реакцию транскрипционной амплификации осуществляли в течение 35 циклов в изотермических условиях при температуре 41 °С в течение 105 минут. Каждый условный цикл длится 3 минуты и складывался из 7 подэтапов: отжиг Oligo-RNA-RabV-N-P1 на вирусной РНК, элонгация комплементарной ДНК (кДНК), разрушение гибрида РНК/кДНК, отжиг Downstream-RNA-RabV-N-P2, элонгация второй цепи кДНК, активация промотора Т7 ДНК-зависимой РНК-полимеразы, синтез вирусной РНК, отжиг RNA-RabV-N-FAM/ RHQ1-beacon (рис. 1).
Статистическая обработка данных. Ста -тистическая обработка заключалась в определении средних арифметических значений и достоверности статистической разницы между средними величинами, определенными по разностному методу Стьюдента-Фишера [9]. Различия считали статистически достоверными при уровне значимости p<0,005.
Результаты исследований и обсуждение
На первом этапе исследования проводили расчет олигонуклеотидов для постановки реакции транскрипционной амплификации с Ьеасоп-технологией на основании нуклеотидных последовательностей N-гена вируса бешенства применяемых производственных штаммов РВ-97 и ВНИИЗЖ.
Рис. 1. Этапы реакции транскрипционной амплификации с применением beacon-технологии
В качестве гомологичных N-гену вируса бешенства используют следующие оли-гонуклеотиды: Oligo-RNA-RabV-N-P1
(5'-AAT-TCT-AAT-ACG-ACT-CAC-TAT-AGG-G-CGU-GGA-GCA-CCA-UAC-UCU-AAG-AA-3') (курсивом обозначена 5'-промо-торная часть фермента T7 ДНК-зависимой РНК-полимеразы), Downstream-RNA-RabV-N-P2 (5'-GGC-UGG-UAU-CGU-UUA-CUG-GGU-AA-3') и RNA-RabV-N-FAM/RHQ1-beacon (5'-FAM-GUG-UGC-UAA-UUG-GAG UAC-UAU-ACC-GAA-RHQ1-3'). Олигону-клеотиды были очищены в полиакриламид-ном геле и с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Олигонукле-отиды для РНК-матрицы подбирали в соответствии с рядом общих требований [5]. Длины Oligo-RNA-RabV-N-P1 (гибридной части), Downstream-RNA-RabV-N-P2 и RNA-RabV-N-FAM/RHQ1-beacon составляют 23, 23 и 24 н.о., что соответствует требованиям (20-30 н.о.) [5]. Молекулярный вес прямого, обратного праймеров и beacon равен 7574,5; 7602,4 и 8966,6, соответственно, а процентное содержание G и C в них составляет 48; 48 и 46 %, соответственно, что допустимо (4060%) [5]. На 3'-конце олигонуклеотидных праймеров располагается полиадениловый фрагмент (An). Гибридная часть молекулярного beacon не комплементарна олигонукле-отидным праймерам. Отсутствуют 4 и более подряд одинаковых нуклеотидов в цепи олигонуклеотидов. В beacon располагается по 6 нуклеотидов с двух сторон, комплементарных друг другу, что требуется для формирования «стеблевой» части. В качестве флуоресцентного красителя был выбран N-гидроксисукцинимидный эфир 5/6 FAM
(5/6 карбоксифлуоресцеин, смесь изомеров) с длиной волны с максимальной флуоресценцией 520 нм, который присоединен к beacon с помощью реакционной аминогруппы концевого нуклеотида. Для тушения свечения использовали гаситель флуоресценции RHQ1 с длиной волны максимального поглощения при 520 нм и возможном диапазоне гашения 470-570 нм. Таким образом, была предложена подходящая пара «флуорофор-гаситель». Флуорофор присоединен к 5'-концу, а гаситель флуоресценции - к 3'-концу.
При анализе нуклеотидных последовательностей гибридизационной части установили, что для олигонуклеотидов не характерно образование «шпилек» (за исключением «стеблевой» части бикона), а также не выявлено З'-комплементарности и сайтов, отжигающих сами на себя при условии, когда минимальное количество пар оснований, необходимое для димеризации праймера и минимальное количество пар оснований, необходимое для образования шпильки - 4 [8].
Проведено определение температур плавления (Tm) для гибридизационной части оли-гонуклеотидов. Точное определение температуры плавления играет очень важную роль в молекулярно-биологических исследованиях, в том числе при подборе РНК-праймеров и бикона для реакции транскрипционной амплификации РНК вируса бешенства. В соответствии с требованиями к реакции амплификации с последующей детекцией РНК-ампликонов с помощью Ьеасоп-технологии температура плавления олигонуклеотидов (гибридной их части) должна быть выше температуры реакции (41 °С) не менее чем на 7-10 °С.
Определены физические, термодинамические константы и проведен расчет температур плавления разработанных олиго-нуклеотидных РНК-праймеров и beacon. Выявлено, что энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для Oligo-RNA-RabV-N-P1 составили 235,42 ккал/моль, 29,5 ккал/моль, 609,8 кал/(°К-моль), соответственно. Энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для Downstream-RNA-RabV-N-P2 составили 231,81 ккал/ моль, 29,6 ккал/моль, 598,1 кал/(°К-моль). Энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для
RNA-RabV-N-FAM/RHQ1-beacon составили 232,98 ккал/моль, 31,8 ккал/моль, 606,1 кал/ (°К-моль), соответственно. Данные значения были необходимы для расчета температур плавления представленных олигонуклеоти-дов. Tm при использовании алгоритма ближайших соседей для Oligo-RNA-RabV-N-P1, Downstream-RNA-RabV-N-P2 и RNA-RabV-N-FAM/RHQ1-beacon составили 66, 67 и 64 °С, соответственно, что ниже более чем на 7-10 °С, чем температура амплификации РНК, (41 °С) и соответствует общепринятым требованиям, предъявляемым к олигонуклео-тидам, используемым для данной реакции [6].
При использовании более простого метода, учитывающего концентрации ионов K+ и диметилсульфооксида (DMSO) [5] Tm для Oligo-RNA-RabV-N-P1, Downstream-RNA-RabV-N-P2 и RNA-RabV-N-FAM/RHQ1-beacon составили 51 °С для всех олигонукле-отидов, что на 10 °С выше, чем температура амплификации РНК (41 °С) и также соответствует общепринятым требованиям, предъявляемым к олигонуклеотидам, используемым для данной реакции [5].
Последовательности разработанных оригинальных олигонуклеотидов были исследованы на наличие нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот с использованием Банка данных последовательности РНК [3]. Последовательности праймеров также проанализировали на наличие внутренних вторичных структур с помощью программы сворачивания нуклеиновых кислот с помощью программы Mfold [11]. Было выявлено, что для разработанных олигонуклеотидов нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот, а также наличия внутренних вторичных структур не обнаружено.
Таким образом, определены дизайн и температура плавления олигонуклеотидных праймеров и молекулярного beacon на основании нуклеотидных последовательностей N-гена вируса бешенства вакцинных штаммов РВ-97 и ВНИИЗЖ.
На следующем этапе исследования проводили выражение функции зависимости инфекционного титра вируса бешенства в неинактивированном сырье для антираби-
ческих вакцин и порогового цикла реакции транскрипционной амплификации вирусной РНК в виде математической модели.
Для определения значения инфекционного титра вируса бешенства штамма РВ-97 подготавливали серию разведений положительных стандартных образцов вируса бешенства, в качестве которых применяли неинактивированные суспензии вируса бешенства с титрами: 0,0; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 ^ ККИД50/см3. Репродукция вируса проводилась в суспензионной клеточной линии почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21. Отрицательным контролем служила суспензия клеток ВНК-21, не зараженная вирусом бешенства, с концентрацией 2,5-3,0 млн кл./см3.
На следующем этапе исследования с помощью спектрального сканирования в излучении ультрафиолетового света проводили оценку степени чистоты полученных элю-атов РНК вируса бешенства штамма РВ-97 из разведений стандарта. Образцы РНК сканировали в кварцевых кюветах (1=10 мм) при температуре 23-25 °С и регистрировали значения экстинкции в диапазоне от 205 до 325 нм через каждые 2 нм, производя запись спектра поглощения РНК с помощью сервиса Specrtrum V. 5.0.
Обнаружили, что значения OD205-259 и OD261-325 не превышают OD260, что является признаком высокой степени чистоты полученных элюатов РНК (п=3). Из данных спектрального исследования положительных стандартов отмечали отсутствие выраженных пиков на графиках (рис. 2) при длинах волны 205, 235, 270, 280 и 320 нм, что свидетельствовало о практически полном отсутствии загрязнения элюатов РНК примесями фосфолипидов, полисахаридов и остатков ГТЦ, полипептидов и крупных конгломератов, соответственно. Значения коэффициента экстинкции R1 для положительных стандартов составляли норму 2,000, что подтверждало отсутствие ДНК и наличие лишь следовых количеств примесей полипептидов. Деградации нуклеиновой кислоты и наличия свободных нуклеотидов в элюатах не отмечалось. Экстракты вирусной РНК не загрязнены полисахаридами и остатками ГТЦ,
Рис. 2. Спектральный анализ элюатов РНК, выделенных из стандартов суспензий вируса бешенства с разными титрами
так как значения коэффициента экстинкции R2 приближены к норме 2,000 и соответствовали 2,000-2,005. С помощью спектрального анализа разрушения РНК в экстрактах не обнаружено [7]. Таким образом, экстракты РНК вируса ящура, выделенные из стандартов, характеризовались высокой степенью чистоты.
После оценки степени чистоты элюатов проводили реакцию транскрипционной амплификации РНК вируса бешенства как описано выше. Получены данные реакции амплификации РНК, которые анализировали, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям пороговых циклов амплификации РНК С РНК, определенных с помощью пересечения пороговой линии и логарифмическим отображением функции F1 = f (С1 РНК). Устанавливали зависимость между пороговым циклом амплификации РНК и инфекционным титром вируса бешенства в неинактивированном сырье для антирабических вакцин. Полученные результаты отражены на рис. 3 и выражены в виде логарифмической функции: ^ ТВБ = -0,2997 х с РНК + 9,7524. Оценивали величину эффективности реакции амплификации (Е) по формуле: Е=1-10-1/к (к из функции С1 РНК = -3,3361 х ^ твб + 32,51), а также достоверность аппроксимации ^2). Эффективность реакции транскрипционной амплификации РНК составила 99,41 %, достоверность аппроксимации - 0,9997, что соответствовало общепринятым требованиям, предъявляемым к реакциям амплификации [5, 11].
На заключительном этапе анализа проводили тестирование разработанного способа
для определения титра вируса бешенства вакцинных штаммов РВ-97 и ВНИИЗЖ в 400 не-инактивированных суспензиях с инфекционными титрами от 8,00 до 1,00 ^ ККИД50/см3. Исследования параллельно проводили в РИФ [4] в трех повторениях. Выявили, что данные, полученные с помощью разработанного способа, коррелировали с методом РИФ на 99,6-100 % для 8,00-7,00 ^ ККИД50/ см3 (п=80), на 98,0-99,6 % для 6,99-4,00 ^ ККИД50/см3 (п=80), на 97,0-98,0 % для 3,99-3,00 ^ ККИД50/см3 (п=80), на 95,897,0 % для 2,99-2,00 ^ ККИД50/см3 (п=80), на 93,0-95,8 % для 1,99-1,00 ^ ККИД50/см3 (п=80). При сравнении с данными метода РИФ совпадение фактических и ожидаемых результатов соответствовало значениям 93,0-100,0 %. Для положительного контроля совпадение фактических и ожидаемых результатов составило 99,8 %. В отрицательном контрольном образце геном и полные частицы вируса бешенства не обнаружены, что также соответствовало ожиданиям.
Чувствительность способа составила 99,31 % (п=422), специфичность - 100,00 % (п=422), общая точность - 99,66 % (п=422). Для определения прецизионности представленного способа в условиях воспроизводимости суспензии вируса бешенства исследовали два оператора в разное время в 25 повторностях. Для генеральной совокупности значений С размах вариации составил 0,06-0,44, среднее линейное отклонение находилось в диапазоне 0,008-0,052, т.е. степень колеблемости в выборках относительно среднего уровня признака низкая. Дисперсия
III 1ё1в б = -0,2997 х СЧрнк + К2 = П-9997 9,7524
Чж Е = 99,41%
11 I
! I ,
л
0 1 0 1 5 2 0 5 3 II ^ и 0 3 5 40
Пороговый цикл транскрипционной амплификации
Рис. 3. Математическая модель для опосредованного расчета титра инфекционной активности вируса бешенства в сырье для вакцин
составила 0,001-0,006, среднее квадратичное отклонение - 0,011-0,089, что подтверждает незначительную степень отклонений индивидуальных значений С от среднего арифметического и высокий уровень достоверности данных внутри каждой выборки. Коэффициент осцилляции составил 0,3652,224 %, линейный коэффициент вариации -0,045-0,185 %, коэффициент вариации -0,059-0,179 %, что соответствует общепринятым нормам (С5<3 %) [9]. Относительное изменение крайних значений С и доля среднего показателя абсолютных отклонений в сравнении со средним внутри каждой совокупности незначительна. По показателям вариации разработанный способ удовлетворял критериям приемлемости [9].
Заключение
Предложен новый подход к опосредованному определению инфекционного титра вируса бешенства в сырье для вакцин с применением транскрипционной амплификации и Ьеасоп-технологии, который позволяет сократить время проведения анализа неинакти-вированных вирусосодержащих суспензий до 2-3 ч; исключить вероятность контаминации и субъективности при оценке результатов анализа; увеличить чистоту РНК вируса бешенства; увеличить специфичность и чувствительность анализа.
Выявлено, что чувствительность способа составила 99,31 % (п=422), специфичность - 100,00 % (п=422), общая точность -99,66 % (п=422). Проведено исследование прецизионности представленного способа в условиях воспроизводимости и определены незначительная степень отклонений индивидуальных значений порогового цикла амплификации РНК от среднего арифметического, а также высокий уровень достоверности данных внутри каждой выборки. Относительное изменение крайних значений С1 и доля среднего показателя абсолютных отклонений в сравнении со средним внутри каждой совокупности незначительна. Таким образом, подтверждена высокая степень прецизионности в условиях воспроизводимости, что позволяет применять разработанный способ для опосредованного определения инфекци-
онного титра вируса бешенства в сырье для вакцин.
Исследование выполнено в рамках научного направления ФГБУ «ВНИИЗЖ» «Ветеринарное благополучие». Исследование выполнено без использования животных и без привлечения людей в качестве испытуемых. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Список литературы
1. Груздев К. Н. Бешенство животных. / К. Н. Груздев, А. Е. Метлин. Владимир: ФГБУ «ВНИИЗЖ», 2019. 394 с.
2. Патент РФ № 2712769, 27.05.2019. Способ спектрометрического определения концентрации 146S частиц вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины по оценке количества молекул вирусной РНК, выделенной после иммунного захвата вирионов // Заявка № 2019116272. 2019, авт. Лозовой Д. А., Михали-шин Д. В., Доронин М. И., Щербаков А. В., Тимина А. М., Шишкова А. А., Борисов А. В., Стариков В. А.
3. GenBank. [Электронный ресурс] / URL: http:// www.ncbi.nlm.nih.gov. (Дата обращения: 02.12.2020).
4. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2019 (OIE). Rabies. 2019. Ch. 3.1.17. P. 578-612.
5. Adams M. S. Thermodynamic characterization and nearest neighbor parameters for RNA duplexes
under molecular crowding conditions / M. S. Adams, B. M. Znosko // Nucleic Acids Res. 2019. N. 23; 47(7). P. 3658-3666. doi: 10.1093/nar/gkz019.
6. SantaLucia J. Jr. The thermodynamics of DNA structural motifs / J. SantaLucia Jr., D. Hicks // Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure: journal. 2004. Vol. 33. P. 11-14. doi: 10.1146/annurev. biophys.32.110601.141800
7. The Analysis of DNA or RNA using Its Wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm. Bioteachnology.com [Электронный ресурс] / URL: http://bioteachnology.com/dna/ analysis-dna-rna-wavelengths-230-260-280-nm. (Дата обращения 04.12.2020).
8. The RNA Institute college of arts and science university at Albany. The mfold Web Server. RNA Folding Form. [Электронный ресурс] / URL: http:// bioinfo.math.rpi.edu/~mfold/dna/form1.cgi (Дата обращения: 21.12.2020).
9. Vallat B. OIE Quality Standard and Guidelines for Veterinary Laboratories: Infectious Diseases. 2nd ed. Paris, France, 2008. 67 p.
10. Yue Y. Application of NASBA and RPA in detection of pathogenic bacteria / Y. Yue, J. Z. Zhang, M. J. Zhang // Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 2019. N. 10; 40(8). P. 1018-1022. doi: 10.3760/cma.j.is sn.0254-6450.2019.08.027.
11. Wang Y. The nearest neighbor and next nearest neighbor effects on the thermodynamic and kinetic properties of RNA base pair / Y. Wang, Z. Wang, Y. Wang, T. Liu, W. Zhang // J. Chem Phys. 2018. N. 28;148(4):045101. doi: 10.1063/1.5013282.
DOI: 10.24412/2074-5036-2021-2-25-34 УДК 619:578.824.11:615.371:573.6
Ключевые слова: вирус бешенства, антирабическая вакцина, полнота инактивации антигена, полимеразная цепная реакция.
Key words: rabies virus, rabies vaccine, completeness of antigen inactivation, polymerase chain reaction. Доронин М. И., Михалишин Д. В., Борисов А. В., Мудрак Н. С., Михалишин В. В.
ОПОСРЕДОВАННЫЙ КОНТРОЛЬ ПОЛНОТЫ ИНАКТИВАЦИИ АНТИГЕНА ВИРУСА БЕШЕНСТВА ДЛЯ АНТИРАБИЧЕСКИХ ВАКЦИН С ПРИМЕНЕНИЕМ
ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
MEDIATED CONTROL OF THE COMPLETENESS OF INACTIVATION OF ANTIGEN OF THE RABIES VIRUS FOR RABIES VACCINES USING A POLYMERASE CHAIN REACTION
ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» Адрес: 600901, Россия, г. Владимир, мкр. Юрьевец
Federal Centre for Animal Health, Federal Governmental Budgetary Institution Address: 600901, Russia, Vladimir, Yur 'evets
Доронин Максим Игоревич, к. б. н., вед. науч. сотрудник. E-mail:doronin@arriah.ru
Doronin Maksim Igorevich, PhD in Biological Science, Leading Researcher. E-mail:doronin@arriah.ru Михалишин Дмитрий Валерьевич, к. в. н., зав. лабораторией. E-mail:mihalishindv@arriah.ru
Michalishin Dmitry Valerjevich, PhD in Veterinary Science, Head of the Laboratory. E-mail:mihalishindv@arriah.ru
