CC BY
77
в помощь вирусологу
В ПОМОЩЬ ВИРУСОЛОГУ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 578.824.11.083.2
Дедков В.Г.1'2, Девяткин А.А.1-3, Полещук Е.М.4, Сафонова М.В.1'3, Маркелов М.Л.2, Шипулин Г.А.1
РАЗРАБОТКА И АПРОБАЦИЯ НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РНК КЛАССИЧЕСКОГО ВИРУСА БЕШЕНСТВА МЕТОДОМ ОТ-ПЦР В РЕАЛЬНОМ
ВРЕМЕНИ
1ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, 111123, г. Москва; 2ФГБНУ «НИИ медицины труда», 105275, г. Москва;
3ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова», 142783, г. Москва; 4 ФБУН «Омский НИИ природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора, 644080, г. Омск
С целью повышения эффективности лабораторной диагностики бешенства и оптимизации надзорных мероприятий разработан набор реагентов для выявления РНК вируса бешенства методом обратнотран-скриптазной полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флюоресцентной детекцией. Аналитическая чувствительность разработанного набора составила 4-103 копий РНК в 1 мл. Высокая специфичность набора реагентов показана на репрезентативной выборке образцов, содержащих генетический материал родственных вирусов, и на образцах, содержащих мозговую ткань разных видов млекопитающих.
Ключевые слова: вирус бешенства; диагностика; ОТ-ПЦР в реальном времени.
Для цитирования: Дедков В.Г., Девяткин А.А., Полещук Е.М., Сафонова М.В., Маркелов М.Л., Шипулин Г.А. Разработка и апробация набора реагентов для определения РНК классического вируса бешенства методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Вопросы вирусологии. 2016; 61(4): 235-240.
DOI: 10.18821/0507-4088-2016-61-4-235-240
Dedkov V.G12, Deviatkin A.A.123, Poleschuk Е.М.4, Safonova M.V.13, Markelov M.L.2, Shipulin G.A.1 DEVELOPMENT AND EVALUATION OF THE RT-PCR KIT FOR THE RABIES VIRUS DIAGNOSIS
1 Central Research Institute for Epidemiology, Moscow, 111123, Russian Federation;
2 Institute of Occupational Health, Moscow, 105275, Russian Federation;
3 Chumakov Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitides, Moscow, 142783, Russian Federation;
4 Omsk Research Institute of Natural Foci Infections, Omsk, 644080, Russian Federation
To improve the diagnosis, surveillance, and control for the rabies virus, a kit for hybridization-triggered fluorescence detection of rabies virus DNA by the RT-PCR technique was developed and evaluated. The analytical sensitivity of the kit was 4-103 GE per ml. High specificity of the kit was shown using representative sampling of viral, bacterial, and human nucleic acids.
Keywords: Rabies virus; diagnosis; RT-PCR.
For citation: Dedkov V.G., Deviatkin A.A., Poleschuk Е.М., Safonova M.V., Markelov M.L., Shipulin G.A. Development and evaluation of the RT-PCR kit for the rabies virus diagnosis. Voprosy Virusologii (Problems of Virology, Russian journal). 2016; 61(5): 235-240. (In Russ.).
DOI: 10.18821/0507-4088-2016-61-5-235-240
For correspondence: Vladimir G. Dedkov, Scientific researcher, Branch of genetic engineering and biotechnology, Central
Research Institute for Epidemiology, Moscow, Russian Federation. E-mail: [email protected]
Funding. The study had no sponsorship.
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Received 04 November 2015 Accepted 26 January 2016
Введение
Классический вирус бешенства Rabies virus (RABV) — нейротропный РНК-(-) содержащий вирус, принадлежит к роду Lyssavirus семейства Rhabdoviridae. Помимо классического вируса бешенства род Lyssavirus включает следующие виды: лиссавирус австралийских летучих мышей (ABLV), лиссавирусы европейских летучих мышей типов 1 и 2 (EBL1, 2), вирус Худжанд (KHUV), вирус
Араван (ARAV), вирус Иркут (IRKV), вирус Дувенхаге (DUVV), вирус летучих мышей Лагос (LBV), вирус Мо-кола (MOKV), западнокавказский вирус летучих мышей (WCBV), вирус летучих мышей Шимони (SHIBV) [1].
Все лиссавирусы являются нейротропными инфекционными агентами, вызывающими необратимые поражения головного мозга человека и теплокровных животных — бешенство. Однако наибольшее эпиде-
Для корреспонденции: Дедков Владимир Георгиевич, науч. сотр. группы генной инженерии и биотехнологии ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, 111123, г. Москва. E-mail: [email protected]
to virologist's AID
миологическое и эпизоотологическое значение имеет классический вирус RABV, поскольку является этиологическим агентом подавляющего большинства случаев бешенства, зарегистрированных у животных и человека. Прочие лиссавирусы имеют ограниченные ареалы распространения и ограниченный круг хозяев, в большинстве случаев это летучие мыши. Поэтому инфицирование человека происходит очень редко.
Бешенство относится к зоонозным заболеваниям с контактным механизмом передачи возбудителя. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в сфере эпидемиологического надзора и профилактики [2], случаи заболевания бешенством ежегодно регистрируются на всех континентах за исключением Антарктиды [3]. Так, на территории Российской Федерации в период 2007—2011 гг. зарегистрировали 22 264 случая бешенства животных и 67 случаев бешенства людей [4, 5].
В настоящее время в РФ при лабораторной диагностике бешенства исследуют аутопсийный материал, преимущественно методом флуоресцирующих антител (МФА). В случае отрицательного или сомнительного результата МФА используют вспомогательные способы диагностики заболевания: метод выделения вируса бешенства на животных (белые мыши) или в культуре клеток, иммуноферментный анализ (ИФА), реакцию диффузионной преципитации [6, 7]. Прижизненная диагностика бешенства не практикуется. Данный подход находится в полном соответствии с существующими рекомендациями ВОЗ по лабораторной диагностике бешенства [8]. В рамках данных рекомендаций молекулярные методы диагностики играют вспомогательную роль. Однако использование этих методов, на наш взгляд, имеет большие перспективы, что обусловлено их высокой чувствительностью и специфичностью, а также простотой выполнения и интерпретации результатов в сравнении с большинством применяемых в настоящее время методов. Основанием для такого утверждения является и наш собственный опыт ретроспективной диагностики двух случаев бешенства у пациентов из Астраханской области, погибших в 2003 г. от энцефалита неясной этиологии [9].
Цель работы — создание набора реагентов для выявления РНК RABV методом обратнотранскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) в реальном времени.
Материал и методы
Биологический материал. В работе использован материал 31 штамма RABV, 8 из них были охарактеризованы количественно. Штаммы изолированы из источников, собранных в период 2008—2012 гг., в том числе от диких (n = 17), домашних (n = 4) и сельскохозяйственных (n = 10) животных на территориях Ненецкого автономного округа (n = 3), Республики Дагестан (n = 4), Республики Тыва (n = 4), Республики Хакасия (n = 2), Воронежской (n = 1), Тверской (n = 2), Омской (n = 6), Новосибирской (n = 3), Липецкой (n = 2) областей, Алтайского края (n = 2), Красноярского края (n = 2). Также использованы 25 образцов первичного положительного по бешенству материала, 23 образца первичного отрицательного по бешенству материала, а также нуклеиновые кислоты следующих вирусов и млекопитающих: семейства Rhabdoviridae (вирус Араван, вирус Худ-жанд), семейства Bunyaviridae (вирус Тягиня, вирус Батаи, вирус Дхори, вирус крымской геморрагической лихорадки, вирус Инкоо), семейства Reoviridae (вирус Кемерово,
ротавирус), семейства Togaviridae (вирус Чикунгунья, вирус Синдбис, вирус краснухи), семейства Flaviviridae (вирус желтой лихорадки, вирус лихорадки Западного Нила, вирус клещевого энцефалита), семейства Picornaviridae (энтеровирус ECHO-71), семейства Retroviridae (вирус иммунодефицита человека), ДНК из тканей головного мозга мыши, собаки, кошки, человека. Штаммы RABV, РНК вирусов семейства Rhabdoviridae и первичный материал являются частью рабочей коллекции лиссавиру-сов ФБУН «Омский НИИ природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора, прочие образцы вирусной РНК, а также образцы мозговой ткани различных животных — частью коллекции ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспо-требнадзора.
Дизайн олигонуклеотидов. Геном RABV составляет около 12 000 нуклеотидных оснований (н. о.) и включает 5 последовательно расположенных генов 3'-N-P-M-G-L-5'(N — нуклеопротеин, G — гликопротеин, P — фосфо-протеин, M — матриксный белок, L — РНК-зависимая РНК-полимераза), кодирующих соответственно 5 белков и лидерную РНК длиной 50 н. о. Гены разделены некодирующими областями [1]. При этом ген N является наиболее консервативной частью генома RABV [10]. В связи с этим обстоятельством выбор таргетной области для амплификации и детекции RABV осуществляли в пределах последовательности N-гена.
Дизайн праймеров и зонда осуществляли с учетом общих требований, предъявляемых к олигонуклеотидным праймерам и зондам типа TaqMan при проектировании тест-систем в формате ПЦР в реальном времени [11— 13]. Оценку температуры плавления праймеров рассчитывали при помощи программы Oligonucleotide Properties Calculator [14]. Термодинамические характеристики зонда и возможность образования вторичных структур оценивали с помощью программ Oligonucleotide Properties Calculator и MFOLD [16].
Выделение РНК и обратная транскрипция. Вирусную РНК выделяли с использованием набора РИБО-золь С (ЦНИИЭ, Москва) в соответствии с рекомендациями производителя.
Реакцию обратной транскрипции проводили при помощи набора реагентов для обратной транскрипции Реверта-L (ЦнИИЭ, Москва) в соответствии с рекомендациями производителя.
Определение нуклеотидных последовательностей N-гена. Для определения первичных нуклеотидных последовательностей N-гена амплифицировали по 2 перекрывающихся фрагмента (область перекрытия 76 пар оснований (п. о.)), полученных с помощью двух пар праймеров (табл. 1), в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 10 мкл ПЦР-смеси-2-blue (ЦНИИЭ, Москва), по 0,4 мкМ прямого и обратного праймеров, 2,5 мкл дНТФ (1,76 мМ; ЦНИИЭ, Москва), 2 мкл кДНК RABV.
ПЦР выполняли с использованием «горячего старта» на приборе Терцик («ДНК-технология», Россия) в следующем режиме: 95 °C — 2 мин, 95 °C — 15 с, 57 °C — 25 с, 72 °C — 10 с — 40 циклов; 72 °C — 3 мин.
Наличие ПЦР-продукта необходимой длины контролировали электрофоретическим методом в 1,5% агароз-ном геле с добавлением бромистого этидия. Очистку ампликонов проводили с помощью набора реагентов QIAquick PCR Purification Kit («Qiagen», Германия). Очищенный ПЦР-продукт секвенировали на приборе для автоматического капиллярного секвенирования ABI PRISM 3500 («Applied Biosystems», США).
вопросы вирусологии. 2016; 61 (S)
DOI 10.18821/0507-4088-2016-61-5-235-240
в помощь вирусологу
Таблица
Олигонуклеотиды, использованные для амплификации и последующего секвенирования фрагментов генома RABV
Rablf ACGCTTAACAACAAAATCATAGAAG
Rablr AACATGTCGTAGGTTCCGGC
Rab2f ATGACAACTCACAAAATGTGYGC
Rab2r GGATTGACGAAGATCTTGCTCAT
Позиция рефе-ренсного сиквен-са, н. т. JQ944704 (GenеBank NCBI)
1—25
689—708
632—653
1514—1536
Построения выравнивания первичных нуклеотид-ных последовательностей N-гена 23 штаммов RABV осуществляли с помощью пакета программ CLC Main Workbench 5 («Qiagen», Германия).
Положительные контрольные образцы. В качестве положительного контрольного образца (ПКО) ПЦР (К+) использовали участок кДНК N-гена RABV (штамм 8202л_0мская_2013) (905 п. о.), включающий фрагмент, являющийся мишенью для праймеров и зонда. Для этого соответствующий ПЦР-продукт очищали с помощью набора MiniElute Gel Extraction Kit («Qia-gen», Германия), лигировали в плазмидный вектор pGEM-T («Promega», США) под контролем промотора T7 РНК-полимеразы и трансформировали им Escherichia coli (штамм XL1 blue) [15]. Рекомбинантные плаз-миды из индивидуальных клонов очищали с помощью набора Plasmid Miniprep Kit («Axygen») и проверяли их на наличие и отсутствие мутаций в области посадки праймеров и зонда. Проверку осуществляли методом Сэнгера с помощью прибора автоматического капиллярного секвенирования ABl-Prism 3500 XL («Applied Biosystems», США).
Плазмиды после измерения концентрации и разведения использовали в качестве ПКО ПЦР (К+), а также
Длина ампли-кона, п. о.
709
905
1 для получения рекомбинантной РНК на основе MS2^ara в защитной белковой оболочке [16, 17]. Полученный продукт обрабатывали ДНКазой-I («Fermentas», Латвия) для удаления остатков ДНК, измеряли концентрацию, разбавляли в стабилизирующем растворе RNA Later («Life Technologies», США) и использовали далее в качестве положительного защищенного РНК-контроля (ПКО). Отсутствие в препарате ПКО остаточной ДНК после обработки контролировали с помощью специфических прайме-ров и зонда в ходе проведения ПЦР в реальном времени (без стадии обратной транскрипции). Концентрацию положительного контроля ПЦР (К+) и рекомбинантного контроля (ПКО) измеряли на приборе QX100 system («Bio-Rad») с помощью наборов PCR Supermix for Probes Kit («Bio-Rad»), One-step ddPCR Supermix for Probes Kit («Bio-Rad») и специфических праймеров и зонда (табл. 2).
Внутренний контрольный образец. Для оценки эффективности выделения РНК из биологического материала в состав набора реагентов включили экзогенный внутренний контрольный образец (ВКО) STI-87rec (ЦНИ-ИЭ, Москва), представляющий собой искусственную последовательность РНК в защитной белковой оболочке на основе MS2^ara длиной 150 н. т. с GC-составом около 50%.
Состав реакционной смеси и режим амплификации. ОТ-ПЦР в реальном времени проводили в объеме 25 мкл. Реакционная смесь содержала следующие компоненты: 10 мкл РНК-пробы, по 0,2 мМ праймеров и зонда Rt_ Rab-2f_Neuer, Rt_Rab-2r_Neu, Rt_Rab-z2_neu, по 0,2 мМ праймеров и зонда для детекции STI-87rec, 2,5 мкл дНТФ (1,76 мМ; ЦНИИЭ, Москва), 5 мкл смеси RT-PCR mix2 FEP/FRT (ЦНИИЭ, Москва), 0,25 мкл MMLV-ревертазы (ЦНИИЭ, Москва), 0,25 мкл RTG-mix2 (ЦНИИЭ, Москва) и 0,5 мкл TaqF-полимеразы (ЦНИИЭ, Москва). Реакцию выполняли в приборе для ПЦР в реальном вре-
Таблица 2
Структура и основные характеристики праймеров и зонда, используемых в наборе реагентов для диагностики бешенства
Название праймера
Нуклеотидная последовательность, 5'-3'
Позиция референсного сиквенса, н. т. JQ944704 (Ge^Bank NCBI)
Длина ампликона, п. о.
Rt_Rab-2f_Neuer AAGAACTTTGAGGAAGAGATAAGAAG Rt_Rab-z2_neu R6G-AGGAGACAGCTGTTCCTCACTCCTAT-BHQ1 Rt Rab-2r Neu AACACATGACCAACRGCATTCGAT
857—882 900—925 973—997
140
Таблица 3
Характеристика штаммов RABV, использованных для определения аналитической чувствительности
Штамм Год изоляции Регион изоляции Источник Количество частиц в 1 LD^/мл Аналитическая чувствительность, LD^/мл Аналитическая чувствительно сть, копии ПКО в 1 мл
8202л _Омская _2013 2013 Омская область Лисица 43 165 0,1 4317
8247ен.соб. Омская 2013 2013 То же Енотовидная собака 2760 1,0 2760
8300ен.соб._Омская_2013 2013 " " То же 32150 0,1 3215
8313л_Омская_2013 2013 " " Лисица 11515 0,1 1152
8315крс Новосибирская 2013 2013 Новосибирская область Крупный рогатый скот 5960 0,1 596
8317л Новосибирская 2013 2013 То же Лисица 2970 1,0 2970
8318л Новосибирская 2013 2013 " " " " 58945 0,1 5895
1п8202л_Омская_2013 2013 Омская область " " 41595 0,1 4160
to virologist's aid
Таблица 4
Образцы биологического материала, содержащего RABV
Изолят Год изоляции Регион изоляции Источник изоляции Пороговый уровень, Ct
7985 2011 Республика Якутия Северный олень 22,0
8202 2013 Омская область Лисица 23,5
7496 2008 НАО Северный олень 22,6
7511 2008 Воронежская область Лисица 17,8
7551 2008 Белгородская область " " 15,4
7555 2008 Тюменская область Северный олень 18,7
7557 2008 То же Песец 19,1
7558 2008 Республика Дагестан КРС 16,5
7559 2008 То же Собака 17,5
7560 2008 "" Кошка 12,2
7561 2008 " " Собака 17,7
7576 2008 Тверская область Енотовидная собака 17,8
7941 2008 Красноярский край Лисица 15,3
7990 2011 Республика Якутия Песец 28,3
8093 2011 Республика Тыва Верблюд 15,8
8300 2013 Омская область Енотовидная собака 26,6
828 Л 816 1989 Воронежская область Лисица 22,4
8247 2013 Омская область Енотовидная собака 14,0
8313 2013 То же Лисица 16,6
8315 2013 Новосибирская область КРС 23,4
8317 2013 То же Лисица 22,3
8318 2013 " " " " 21,2
1п8202 2013 Омская область " " 13,3
8229Н 2003 Астраханская область Человек 33,9
8330Н 2003 То же " " 29,4
Примечание. НАО — Ненецкий автономный округ; КРС — крупный рогатый скот.
мени Rotor Gene 6000 («Qiagen», Germany) в следующем режиме: 50°C — 15 мин; 95 °C — 15 мин; 95 °C — 10 с, 57 °C — 25 с, 72 °C — 10 с; n = 45. Детекцию проводили при 57 °C на канале Yellow (для специфического сигнала) и Green (для сигнала внутреннего контроля). Пороговую линию флуоресценции устанавливали в середине линейного участка прироста значения флуоресценции положительного контроля, выраженного в логарифмических единицах. Результаты амплификации интерпретировали как положительные, если наблюдали пересечение кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией.
Аналитическая чувствительность и специфичность. Для оценки аналитической чувствительности готовили с 10-кратным шагом разведения ПКО известной концентрации на плазме от здоровых людей, выделяли и исследовали с помощью разработанной диагностической системы для выявления минимального порогового разведения, при котором образец детектируется как положительный. Порог чувствительности устанавливали по минимальному разведению, детектированному в трех повторах.
Аналитическую чувствительность оценивали с помощью 8 штаммов RABV с известной концентрацией, рассчитанной по методу Рида и Менча в единицах LD^/мл [18]. Порог чувствительности устанавливали по минимальному разведению, детектированному в трех повторах. Соответствие LD^/мл количеству копий защищенного контроля устанавливали в количественной ОТ-ПЦР (табл. 3). В качестве калибраторов использовали разведения препарата ПКО известной концентрации.
Аналитическую специфичность диагностической системы оценивали с помощью РНК 23 штаммов RABV, РНК из высокотитражных культур 17 видов других вирусов, а также ДНК из мозговой ткани животных и человека.
Диагностическая чувствительность и специфичность. Диагностическую чувствительность и специфичность оценивали на выборке первичного материала (мозговые суспензии) от инфицированных вирусом
Таблица 5
Образцы биологического материала, отрицательного по RABV
Образец Год получения материала Регион изоляции Источник выделения
8215 2013 Омская область Норка
8217 2013 То же
8218 2013 и и
8220 2013 и и
8221 2013 и и
8222 2013 и и
8224 2013 и и Енотовидная собака
8225 2013 и и Лисица
8226 2013 и и " "
8229 2013 и и Енотовидная собака
8230 2013 и и " "
8233 2013 и и Лисица
8234 2013 и и " "
8235 2013 и и " "
8236 2013 и и " "
8237 2013 и и " "
8238 2013 и и " "
8239 2013 и и " "
8241 2013 и и " "
8270 2013 и и Соболь
8271 2013 и и Куница
8316 2013 Новосибирск Собака
в помощь вирусологу
Таблица 6
Определение аналитической чувствительности с помощью штаммов известной
концентрации
Штамм
8202л_0мская_2013 8247ен.соб._0мская_2013 8300ен.соб._0мская_2013 8313л_ 0мская_2013 8315крс_Новосибирская_2013 8317л_Новосибирская_2013 8318л_Новосибирскя_2013 1п8202л Омская 2013
бешенства животных и человека (n = 25; табл. 4) и от животных, у которых вирус бешенства не был обнаружен (n = 22; табл. 5). Все образцы предварительно были исследованы при помощи МФА.
Результаты
В результате секвенирования получены первичные нуклеотидные последовательности N-гена 23 штаммов RABV, выделенных на различных территориях РФ. На основании полученных сиквенсов, а также данных о последовательностях N-гена, представленных в GenеBank ранее, построено выравнивание, для которого определены участки наибольшей консервативности, и осуществлен дизайн олигонуклеотидных праймеров и зонда для выявления РНК RABV (см. табл. 2). Аналитическая чувствительность, оцененная при помощи разведений ПКО, составила 4103 копий ПКО в 1 мл. Чувствительность, измеренная с помощью 8 охарактеризованных штаммов, представлена в табл. 3, 6.
При исследовании аналитической специфичности ложноположительных и ложноотрицательных результатов зафиксировано не было.
Обсуждение
Как упоминалось выше, общепринятым методом диагностики бешенства является МФА. Однако данный метод имеет ряд недостатков, основной из которых — зависимость его чувствительности от времени, прошедшего между забором материала и проведением анализа. Кроме того, на результаты МФА влияют профессиональные навыки исследователя, качество конъ-югата и люминесцентного микроскопа. По данным сравнительного анализа диагностическая чувствительность МФА и ОТ-ПЦР в реальном времени сравнимы только в случае проведения анализа ex tempore. В противном случае диагностическая чувствительность ОТ-ПЦР в реальном времени существенно выше и составляет от 102 до 104 копий в 1 мл для разных штаммов [19]. Исследования зарубежных ученых, направленные на оценку молекулярных методов для диагностики бешенства, неоднократно демонстрировали их перспективность, особенно в формате ОТ-ПЦР в реальном времени. В частности, продемонстрирована способность выявлять РНК 67 изолятов RABV, циркулировавших на территории Северной Америки. При этом среднее пороговое значение флуоресценции Ct для тестируемых образцов составило 16,4 [19].
Совпадение данных, получаемых при помощи МФА, и данных ОТ-ПЦР в реальном времени показано на примере
—07ъ^Лмл- исследования 5 образцов от больных
—--50- бешенством животных в Бразилии [20].
+ + + В то же время в сравнительных испы-+ - - таниях 14 тест-систем для выявления + + + РНК RABV и других лиссавирусов, проведенных в 16 европейских лабо-+ + + раториях на панели образцов, разрабо-+ + + танной в институте Фридриха Лефлера (Германия), показано, что ни одна тест-система не способна выявлять все ге-+ + + нетические варианты RABV, представ-+ + + ленные в панели [21].
Таким образом, внедрению метода ОТ-ПЦР в реальном времени в качестве основного мешает как отсутствие зарегистрированных наборов реагентов, так и нерешенные вопросы диагностической чувствительности при использовании такого подхода. В частности, отсутствуют данные о диагностических характеристиках тестов при выявлении различных штаммов RABV. В последние годы на отечественном рынке появился ряд наборов в формате ОТ-ПЦР в реальном времени, позволяющих выявлять РНК RABV. Однако данные системы не имеют удостоверений о государственной регистрации, и их диагностическая ценность не определена.
В результате проделанной работы была создана диагностическая система в формате ОТ-ПЦР в реальном времени для выявления классического RABV, предназначенная для выявления штаммов, циркулирующих на территории РФ. При оценке аналитической чувствительности на выборке из 8 штаммов известной концентрации установлено, что ее значение составляет от 6103 до 6102 копий в 1 мл для различных штаммов. Таким образом, аналитическая чувствительность для различных штаммов различается в 10 раз. Однако данное обстоятельство, по нашему мнению, не является существенным, так как концентрация вирусных частиц в мозговой ткани, используемой в качестве исследуемого материала, существенно выше пороговых значений для любого из исследованных штаммов (см. табл. 4).
Таким образом, в рамках данного исследования система продемонстрировала высокие показатели аналитической и диагностической чувствительности, что делает перспективным ее использование в качестве скринингового теста при исследовании животных в рамках эпизоотологическо-го надзора, а также с целью лабораторной диагностики бешенства у людей. Однако окончательное подтверждение диагноза бешенства должно осуществляться на основании МФА или метода биологической пробы до тех пор, пока не будут накоплены данные о диагностической ценности молекулярных методов при выявлении КАВУ
Выводы
1. Разработана диагностическая система в формате ОТ-ПЦР в реальном времени для выявления РНК штаммов классического КАВУ
2. Аналитические характеристики разработанной системы позволяют успешно проводить выявление РНК штаммов ЯАВХ циркулирующих на территории РФ, что было показано на широкой выборке первичного материала от инфицированных бешенством животных и людей, полученного в различных регионах.
10 LD50/1 мл
1 LD50/1 мл
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
to virologist's aid
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА (п.п. 1, 2, 8, 10—21 см. REFERENCES)
3. Информационный бюллетень ВОЗ № 99, сентябрь 2015 года. Available at: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs099/ru/.
4. Полещук Е.М., Сидоров Г.Н., Березина Е.С. Бешенство в Российской Федерации. Информационно-аналитический бюллетень. Омск: полиграфический центр Кан; 2013.
5. Полещук Е.М., Сидоров Г.Н., Березина Е.С. Бешенство животных в России в 2007—2011 гг. Российский ветеринарный журнал. Мелкие домашние и дикие животные. 2012; (6): 8—12.
6. ГОСТ 26075—2013. Животные. Методы лабораторной диагностики бешенства. М.: Стандартинформ; 2013.
7. Хисматуллина Н.А. Методические указания по лабораторной диагностике бешенства животных. Утверждены Департаментом Ветеренарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации 14 мая 1997 г. М.; 1997.
9. Дедков В.Г., Бекова М.В., Девяткин А.А., Кулешов К.В., Полещук Е.М., Маркелов М.Л. и др. Ретроспективная диагностика двух случаев бешенства у пациентов из Астраханской области. В кн.: Материалы VIIIВсероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика — 2014». М.; 2014: 453—4.
REFERENCES
1. King M.Q., Michael A.J., Carstens B.E., Lefkowitz J.E. Virus taxonomy, classification and nomenclature of viruses. In: Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Amsterdam: Elsevier, Academic Press; 2012: 95—111.
2. Dietzschold B., Faber M., Schnell M.J. New approaches to the prevention and eradication of rabies. Expert. Rev. Vaccines. 2003; 2(3): 399—406.
3. WHO Fact Sheet № 99 Updated September 2015. Available at: http:// www.who.int/mediacentre/factsheets/fs099/ru/. (in Russian)
4. Poleshchuk E.M., Sidorov G.N., Berezina E.S. Rabies in the Russian Federation. Information-analytical Bulletin [Beshenstvo v Rossi-yskoy Federatsii. Informatsionno-analiticheskiy byulleten']. Omsk: poligraficheskiy tsentr Kan; 2013. (in Russian)
5. Poleshchuk E.M., Sidorov G.N., Berezina E.S. Rabies of animals in the Russian Federation in 2007—2011. Rossiyskiy veterinarnyy zhurnal. Melkie domashnie i dikie zhivotnye. 2012; (6): 8—12. (in Russian)
6. GOST 26075—2013. Animals. Methods of laboratory diagnostics of rabies. Moscow: Standartinform; 2013. (in Russian)
7. Khismatullina N.A. Methodological guideline for laboratory diag-
nostics of rabies in animals. Approved by the Veterinary Department of the Ministry of Agriculture and Food of the Russian Federation May 14, 1997. Moscow; 1997. (in Russian)
8. WHO. Expert Consultation on Rabies. Second report. WHO Technical Report Series 982. Geneva: WHO Press; 2013.
9. Dedkov V.G., Bekova M.V., Devyatkin A.A., Kuleshov K.V., Poleshchuk E.M., Markelov M.L. et al. Retrospective diagnosis of two cases of rabies in patients from the Astrakhan region. In: Proceedings of VIII All-Russian Scientific-Practical Conference with International Participation «Molecular Diagnostics — 2014» [Materialy VIII Vse-rossiyskoy nauchno-prakticheskoy konferentsii s mezhdunarodnym uchastiem «Molekulyarnaya diagnostika — 2014»]. Moscow; 2014: 453—4. (in Russian)
10. Delmas O., Holmes E.C., Talbi C., Larrous F., Dacheux L., Bouchier C. et al. Genomic diversity and evolution of the lyssaviruses. PLoS One. 2008; 3(4): e2057.
11. Tyagi S., Kramer F.R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nat. Biotechnol.1996; 14(3): 303—8.
12. Van Pelt-Verkuil E., van Belkum A., Hays J.P. Principles and Technical Aspects of PCR Amplification. NY: Springer; 2008.
13. Yuryev A., ed. Methods in Molecular Biology. Vol. 402: PCR Primer Design. Totowa, New Jersey: Humana Press; 2007.
14. Kibbe W.A. OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator. Nucleic. Acids Res. 2007; 35(Web Server issue): W43-6.
15. Maniatis T., Fritsch E.E., Sambrook J. Molecular Cloning. A laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory; 2003.
16. Pasloske B.L., Walkerpeach C.R., Obermoeller R.D., Winkler M., Du Bois D.B. Armored RNA technology for production of ribonu-clease-resistant viral RNA controls and standards. J. Clin. Microbiol. 1998; 36(12): 3590—4.
17. Cheng Y., Niu J., Zhang Y., Huang J., Li Q. Preparation of His-tagged armored RNA phage particles as a control for real-time reverse tran-scription-PCR detection of severe acute respiratory syndrome coro-navirus. J. Clin. Microbiol. 2006; 44(10): 3557—62.
18. Reed L.J., Muench H. A simple method of estimation of fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 1938; 27: 493—7.
19. Dupuis M., Brunt S., Appler K., Davis A., Rudd R. Comparison of Automated qRT-PCR and Direct Fluorescent Antibody Detection for Routine Rabies Diagnosis in the United States. J. Clin. Microbiol. 2015; 53(9): 2983—9.
20. Appolinario C., Allendorf S.D., Vicente A.F., Ribeiro B.D., Fonseca C.R., Antunes J.M. et al. Fluorescent antibody test, quantitative PCR pattern and clinical aspects of rabies virus strains isolatedfrom main reservoirs in Brazil. Braz. J. Infect. Dis. 2015; 19(5): 479—85.
21. Fischer M., Wernike K., Freuling C.M., Müller T., Aylan O., Brochi-er B. et al. A step forward in molecular diagnostics of lyssaviruses-results of a ring trial among European laboratories. PLoS One. 2013; 8(3): e58372.
Поступила 04.11.15 Принята в печать 26.01.16
