Молекулярно-генетическая характеристика полевых изолятов вируса бешенства, выявленных на территории Владимирской, Московской, Тверской, Нижегородской и Рязанской областей

Зайкова Ольга Николаевна; Гребенникова Т.В.; Гулюкин А.М.; Шабейкин А.А.; Полякова И.В.; Метлин А.Е.

оригинальные исследования

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Зайкова О.Н.1'3, Гребенникова Т.В.1,3, Гулюкин А.М.2, Шабейкин А.А.2, Полякова И.В.2, Метлин А.Е.4

молекулярно-генетическая характеристика полевых изолятов вируса бешенства, выявленных на территории владимирской, московской, тверской, нижегородской и рязанской областей

1 Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, 123098, г. Москва;

2 ФГБНУ «Всероссийский НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко», 109428, г. Москва;

3 Медицинский институт Российского университета дружбы народов, 117198, г. Москва;

4 ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», 600901, г. Владимир

В статье представлено молекулярно-генетическое исследование геномов полевых изолятов вируса бешенства, выделенных на территории Владимирской, Московской, Тверской, Нижегородской и Рязанской областей, с целью проведения филогенетического анализа. Исследованы 20 образцов очищенных ПЦР-продуктов, содержащих нуклеопротеин вируса бешенства, предоставленных ветеринарной службой г. Владимира. В результате секвенирования и филогенетического анализа фрагментов гена N 12 исследуемых изолятов оказались близкими к Центральной филогенетической группе вирусов бешенства, а именно 5 изолятов из Владимирской области, 2 — из Нижегородского района, 2 — из Московской и 3 — из Тверской области. 8 исследуемых изолятов из Нижегородской и Рязанской областей были отнесены к Евразийской филогенетической группе.

Ключевые слова: бешенство; секвенирование; молекулярно-генетический анализ; филогенетический анализ геномов вируса бешенства.

Для цитирования: Зайкова О.Н., Гребенникова Т.В., Гулюкин А.М., Шабейкин А.А., Полякова И.В., Метлин А.Е. Молекулярно-генетическая характеристика полевых изолятов вируса бешенства, выявленных на территории Владимирской, Московской, Тверской, Нижегородской и Рязанской областей. Вопросы вирусологии. 2017; 62(3): 101-108.

DOI: http://dx.doi.org/ 10.18821/0507-4088-2017-62-3-101-108

Zaykova O.N.13, Grebennikova T.V.13, Gulyukin A.M.2, Shabeykin A.A.2, Polyakova I.V.2, Metlin A.E.4

MOLECULAR-GENETIC CHARACTERIZATION OF FIELD ISOLATES OF RABIES VIRUS IDENTIFIED IN THE TERRITORY OF VLADIMIR, MOSCOW, TVER, NIZHNY NOVGOROD AND RYAZAN REGIONS

1 D.I. Ivanovsky Institute of Virology, Federal State Budgetary Institution «Federal Research Centre for Epidemiology and Microbiology named after the honorary academician N.F. Gamaleya», Moscow, 123098, Russian Federation;

2 Y.R. Kovalenko All-Russian Scientific Research Institute of Experimental Veterinary, Moscow, 109428, Russian Federation;

3 Institute for Medicine, Peoples' Friendship University of Russia, Moscow, 117198, Russian Federation;

4 Federal Center for Animal Health, Vladimir, 600901, Russian Federation

The article presents a molecular genetic study of genomes of field isolates of rabies virus isolated in the Vladimir, Moscow, Tver, Nizhny Novgorod and Ryazan regions, with the aim of carrying out phylogenetic analysis. We studied 20 samples of purified PCR products containing the rabies virus nucleoprotein. The samples were provided by the Vladimir veterinary service. Sequencing and phylogenetic analysis of the gene showed that 12 fragments of isolates under study were close to the Central phylogenetic group of the rabies virus; namely - 5 isolates from the Vladimir region, 2 from the Nizhny Novgorod region, 2 from the Moscow region, and 3 from the Tver region. Eight studied isolates from the Nizhny Novgorod and Ryazan regions were attributed to the Eurasian phylogenetic group.

K e y w o r d s: rabies; .sequencing; molecular genetic analysis; phylogenetic analysis of rabies virus genomes.

For citation: Zaykova O.N., Grebennikova T.V., Gulyukin A.M., Shabeykin A.A., Polyakova I.V., Metlin A.E. Molecular-genetic characterization of field isolates of rabies virus identified in the territory of Vladimir, Moscow, Tver, Nizhny Novgorod and Ryazan regions. Voprosy Virusologii (Problems of Virology, Russian journal). 2017; 62(3): 101-108. (In Russ.). DOI: http://dx.doi.org/ 10.18821/0507-4088-2017-62-3-101-108

For correspondence: Ol'ga N. Zaykova, graduate student, researcher at the D.I. Ivanovsky Institute of Virology, Federal State Budgetary Institution «Federal Research Centre for Epidemiology and Microbiology named after the honorary academician N.F. Gamaleya», Moscow, 123098, Russian Federation. E-mail: zaykova_o_n@mail.ru

Для корреспонденции: Ольга Николаевна Зайкова, мл. науч. сотр., аспирант Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, 123098, г. Москва. E-mail: zaykova_o_n@mail.ru

ORIGINAL REsEARcH

Information about authors:

Grebennikova T.V., http://orcid.org/0000-0002-6141-9361 Metlin A.E., http://orcid.org/0000-0002-4283-0171 Gulyukin A.M., http://orcid.org/0000-0001-8730-723X Acknowledgments.This work was supported by the State Budget funding. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Received 01 December 2016 Accepted 13 December 2016

Введение

Бешенство — инфекционное заболевание, возбудителем которого является вирус Rabies virus рода Lyssavirus семейства Rhabdoviridae. Вирус бешенства вызывает специфический энцефалит (воспаление головного мозга) и является единственным из царства Vira, поражающим всех теплокровных животных, в том числе человека, со 100% летальностью. Вирионы вируса бешенства пулевидной формы длиной в среднем 180 нм, диаметром 75 нм и состоят из несегментированного генома, представленного одной молекулой спиралеобразно скрученной негативной РНК и 5 структурных белков: нуклео-протеина (N), фосфопротеина (P), матричного белка (М), гликопротеина (G) и РНК-зависимой РНК-полимеразы, или большого белка (L — large protein). Геномная РНК не инфекционна [1, 2].

По оценке ВОЗ, бешенство входит в пятерку инфекционных болезней, наносящих наибольший социальный и экономический ущерб. Среди зооантропонозных заболеваний, регистрирующихся в настоящее время в нашей стране, бешенство животных занимает лидирующие позиции по числу ежегодно выявляемых неблагополучных пунктов. На протяжении многих лет бешенство в Российской Федерации регистрировалось на стабильно высоком уровне, охватывая значительную часть территории [3, 4].

По данным Россельхознадзора и лаборатории эпизоотологии ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко, в течение 2014 г. зафиксировано 2096 очагов бешенства, заболело 2315 животных. Наибольшее число неблагополучных пунктов зарегистрировано в Белгородской (125), Липецкой (119), Саратовской (124) областях и Республике Татарстан (118) [5]. В 2015 г. по сравнению с 2014 г. количество случаев бешенства животных по стране увеличилось в 1,8 раза. В I квартале 2016 г. зарегистрировано 634 неблагополучных по бешенству пункта, в которых заболело и пало 718 животных; во II квартале 2016 г. зафиксировано 490 очагов бешенства, заболело и пало 551 животное, в том числе 287 (52%) диких животных, 213 (39%) домашних плотоядных, 51 (9%)сельскохо-зяйственное животное . Наибольшее (158) число неблагополучных пунктов за 6 мес 2016 г. зарегистрировано в Московской области. Большую часть заболевших животных составили дикие и домашние плотоядные. По данным исследований, эпизоотии носят циклический, сезонный характер [6].

Основные резервуарные хозяева вируса бешенства в природе — дикие плотоядные, особенно псовые, а также рукокрылые млекопитающие [7, 8]. Лиссавирусы летучих мышей представляют особый интерес для изучения и разработки мер профилактики, так как генетически существенно отличаются от вируса бешенства генотипа 1.

Главную опасность для человека представляет так называемое городское бешенство, поддерживаемое в популяции безнадзорных животных, а также отсутствие вакцинопрофилактики у домашних животных. Вирус передается главным образом со слюной при укусе боль-

ным животным. Диагностика бешенства, как правило, проводится посмертно. Эффективное лечение до сих пор отсутствует.

Предупреждение распространения бешенства включает контроль численности основных носителей вируса в природе и бездомных домашних животных, а также их

иммунизацию с целью создания зоны, свободной от вируса [9].

Для контроля антирабических мероприятий и профилактики бешенства необходимо исследовать случаи этого заболевания на неблагополучных по нему территориях и на территориях, где проводилась оральная иммунизация, исследовать первичную структуру геномов полевых изолятов вируса бешенства [10, 11].

Целью нашей работы была молекулярно-генетическая характеристика изолятов вируса бешенства, выявленных на территории Владимирской, Московской, Тверской, Нижегородской и Рязанской областей.

Материал и методы

Материалом для исследования послужили очищенные ПЦР-продукты, содержащие ген N вируса бешенства, 20 образцов от животных из Владимирской, Московской, Тверской, Нижегородской и Рязанской областей, любезно предоставленные нам ветеринарной службой г. Владимир (см. таблицу). Для сравнительного анализа были использованы нуклеотидные последовательности гена N штаммов вируса бешенства, содержащиеся в базе данных NCBI.

Для секвенирования ампликонов использовали те же праймеры, что и в ПЦР. В работе применяли набор BigDye Terminator Cycle Sequencing kit («Applied Biosystems», США) и капиллярный ДНК-секвенатор ABI Prism 3100 («Applied Biosystems», США). Для выравнивания нуклеотидных последовательностей и проведения филогенетического анализа применяли пакет программ DNASTAR v 3.12 («Laserge^ Inc.», США) и Bio Edit 7.0.1. Для оценки достоверности топологии филогенетической дендрограммы был проведен bootstrap-анализ с привлечением 1000 псевдореплик.

Результаты

Была определена первичная структура гена N вируса бешенства для 20 изолятов из Московской, Тверской, Нижегородской и Рязанской областей. На основании полученных нуклеотидных последовательностей и материалов, опубликованных в базе данных GenBank, была построена филогенетическая дендрограмма и проведен филогенетический анализ (рис. 1).

Для филогенетического анализа использовали вакцинные штаммы RV-97, ERA, штамм RABV AY95319, выделенный из слюны реципиента после трансплантации органов зараженного (Иран), а также 77 штаммов, выделенных ранее на территории России и Европы.

Размер исследуемого фрагмента составил 1110 нуклеотидных остатков (н. о.) (370 аминокислот), положение в геноме 100—1210. На рис. 2 показаны предсказанные

оригинальные исследования

Описание образцов для молекулярно-генетического анализа

Изолят

Вид животного

Регион

Moscow_(706_2009)

Moscow_(708_2009)

Tver_8_2014

Tver_13_2014

Tver_647_2014

Nizhniy_267_2014

Nizhniy_273_2014

Nizhniy_291_2014

Nizhniy_927_2014

Nizhniy_947_2014 Vladimir_521_2014 Vladimir_522_2014 Vladimir_523_2014 Vladimir_525_2014 Vladimir_524_2014 Ryazan_810_2014 Ryazan_813_2014 Ryazan_814_2014 Ryazan_816_2014 Ryazan_812_2014 Примечание

Лиса

Енотовидная собака

Собака

Енотовидная собака

Лиса Собака Лиса Собака

Лиса

Енотовидная собака

Собака Кот КРС КРС Собака КРС КРС — крупный

Московская обл., Сергиево-Посадский р-н, д. Мехово

Московская обл., Дмитровский р-н, пос. Орехово

Тверская область, Кесовогор-ский р-н, 600 м от д. Столбово

Тверская область, Кесовогор-ский р-н, д. Федцово

Тверская область, Пеновский р-н, ур. Михайловщина

Нижегородская обл., Сергач-ский р-н, с. Пица

Нижегородская обл., Павловский р-н, с. Грудцино

Нижегородская обл., Лысков-ский р-н, с. Юркино

Нижегородская обл., Крас-нооктябрьский р-н, д. Малая Мажарка

Нижегородская обл., Арзамасский р-н, пос. Пешелань

Владимирская обл., Гороховец-кий р-н, с/п Денисовское

Владимирская обл., Вязников-ский р-н, д. Б. Липки

Владимирская обл., Ковров-ский р-н, д. Демино

Владимирская обл., Камешков-ский р-н, д. Сергеиха

Владимирская обл., Вязников-ский р-н, г. Вязники

Рязанская обл., Шиловский р-н, с. Борок

Рязанская обл., Александровский р-н, д. Федцовка

Рязанская обл., Кораблинский р-н, с. Никитино

Рязанская обл., Сасовский р-н, с. Гавриловское

Рязанская обл., Ряжский р-н, г. Ряжск

рогатый скот.

последовательности аминокислот всех исследуемых изолятов в сравнении с некоторыми ранее охарактеризованными и референсными штаммами вируса бешенства.

При анализе предсказанной аминокислотной последовательности было установлено, что 12 изолятов в позиции 217 содержат остаток валина, в то время как у представителей других групп в этой позиции имеется остаток изолейцина. Кроме того, изоляты Центральной группы, включая исследуемые, в позиции 95 содержат триптофан вместо лейцина.

У изолята УМтп"_525_2014 в позиции 50 — аминокислота серин вместо аспарагина. В позиции 106 содержится аспарагиновая кислота вместо аспарагина у представителей Северо-восточно-европейской, Арктической

групп, а также у всех представителей Евразийской " группы, кроме изолятов из Омска, у 4 представителей - Центральной группы и у изолята RABV AY95319.

Исследуемые изоляты из Нижегородской и Рязанской областей близки по аминокислотному составу к изолятам из Липецка и Воронежа, друг к другу. В позиции 101 у этих изолятов присутствует треонин вместо аспарагиновой кислоты, а в позиции 106 аспа-рагиновая кислота вместо аспарагина, как и у всех представителей Евразийской группы.

В позиции 135 отмечена замена пролина на серин у представителей Северо-восточно-европейской группы, Евразийской и некоторых изолятов Центральной группы, в том числе Tever_13, Tver_8, Moscow_706, Nizhniy_267, Nizhniy_947, Vladimir 521—524. Изолят Nizhniy_927 в позиции 158 содержит аланин вместо треонина.

В позициях 172 и 179 образцы из Нижегородской и Рязанской областей содержат изолейцин и валин соответственно, как и все представители Северо-восточно-европейской и Евразийской групп. Представители Арктической группы совпадают с вышеописанными изолятами лишь в позиции 172.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

В позициях 218 и 246 наблюдаем глютаминовую кислоту и изолейцин соответственно у всех исследуемых изолятов и вакцинных штаммов, кроме RV-97, который в данных позициях содержит аспарагиновую кислоту и валин.

В позиции 295 изолят Ryazan_814 содержит глицин вместо серина. В позиции 270 изолят Vladimir_523 имеет лизин вместо аргинина, а в позиции 319 — изолейцин вместо метионина. В позиции 320 изолят Nizhniy_947 содержит цистин вместо глицина. В позиции 332 изолят Tver_647 содержит треонин вместо аланина, а в позиции 347 изолят Tver_13 содержит глютамин вместо глютаминовой кислоты.

В позициях 364 и 388 образцы из Нижегородской и Рязанской областей содержат лизин и гистидин, при этом лизин в позиции 364 имеется у всех изолятов, а гистидин — только у Евразийской группы. В позиции 377 изоляты Tver_7574 и 7575 (последовательности взяты из базы данных NCBI) содержат аланин вместо треонина, что отличает их от других образцов, выделенных в России и Эстонии. В позиции 379 образцы из Тверской (кроме Tver_7574 и 7575), Московской и Нижегородской областей, а также один изолят из Владимирской области имеют аланин вместо валина. Другие изоляты из Владимирской области и один из Нижегородской содержат треонин в этой позиции, как и представители Арктической группы. Изолят Vladimir_525 в позиции 399 содержит пролин вместо треонина.

Согласно полученным данным, 12 изолятов были отнесены к Центральной группе. Внутри группы исследуемые образцы отличаются друг от друга и от ранее выделенных изолятов не более чем на 3—4% в последовательности нуклеотидов.

К Евразийской группе было отнесено 8 изолятов на основании генетической близости к ранее описанным изолятам этой группы. По первичной нуклеотидной последовательности исследуемые изоляты отличаются друг от друга не более чем на 0,9%, а от других изолятов этой группы — примерно на 8%. Друг от друга все исследуемые изоляты отличаются примерно на 9,3%.

ORIGINAL REsEARcH

Рис. 1. Филогенетическая дендрограмма штаммов и изолятов вируса бешенства, построенная на основании нуклеотидных последовательностей гена N. Рамками показаны исследуемые изо-ляты. К названиям штаммов и изолятов добавлен регион происхождения.

оригинальные исследования

'КУ-97_Н.зед' 'ЕКА_И.зед' 111АВ У_А У 95631.вед' ' Уогопег11_7514Г_2008_Ы.вед' ' Ттгег_13_2014. веч' 'Тгег_647_2014. веч'

' 5 73с1_2 О О 8_Ы. вед'

"Г«;г_7574:Е_2008_И.зед1 1 Туег_7579:£_2008_Н. вед' ' Ттгег_8_2014. веч' 'Мозсо№_ (706_2009) . веч' 'Мовсо«_ (708_2009) . веч' •тхЬп±у_267_2014. веч' •Ы±гЬп1у_94 7_2014. веч' ' У1а<11пиг_521_2014. веч' ' У1а<Ит1г_522_2014. веч' ' У1а<Ит±г_523_2014. веч' ' У1аеИт±г_524_2014. вед' ' У1а<Ит1г_525_2014. вед'

60 70 80 90 100 ----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|

КАУКБУЪБСШААКЪ0РВ0УСБУЪАААМдЕЕЕСТСРЕ01/\ГТБУС1Ъ1АККС ..........Б.................................V.....

.........ъ........................................

№. №.

1Й. и.

V. №. №. №. №. №. №. №. №. №. №.

'КУ-97_Н.зед' ' ЕНА_Ы. Бея1 111АВУ_АУ95 6319_Ы.веч' ' 9142ЕБТ_Ез^п1а. Бед' 1КУ245.вед'

1КУНК_Кгазпоуагзк_Ы.вед1 'Бвг 3_Yakutia_N.вед1 12072£_Уо1додгас1_Ы. эед' 1 А^ал._7564_ссж_2 0 0 8_Ы .вед1 1Astrakhan_8 33 0Н_2 0 03_Н.эед' ' Ве1догос1_7 54 8:Е_2 0 0 8_Ы. эед1 ' Lipetsk_8057f_2011_N. эед' ЧЧхЬп1у_273_2014. вед' 'N1 хЬп±у_291_2014.вед' '№гЬп1у_927_2014. веч' '0шзк_7444£_2008_ы.эед' ' RVHN_Novosibirsk_N. эед' 'В.уагап_810_2014. веч' ' Яуагап_812_2014. веч' 'В.уахап_813_2014. веч' ' Яуагап_814_2014. веч' 'В.уагап_816_2014. веч' ' Т\^а_8060с_2011_М. вед1 ' УогопегЬ_7514£_2 008_Ы .Бед' ' Тгег_13_2014. веч' 'Ттгег_647_2014. веч' ' 1^ег_7 5 73с1_2 0 О 8_Ы. эед1 '^ег_7574£_2008_Ы.зед' 'Туег_7579:Е_2008_Н.зед' ' Ттгег_В_2014. веч' 'Мовсо»_ (706_2009) . веч' 'Мовсо№_ (708_2009) . веч' 'ШгЬп1у_267_2014. веч' 'ШгЬп1у_94 7_2014. веч' ' У1а<1±т±г_521_2014. веч' ' У1аеИт±г_522_2014. веч' ' У1а<Ит1г_523_2014. веч' ' У1а<Нпйг_524_2014. веч' ' У1а<Ит±г_525_2014. веч'

110 120 130 140 150

БК1ТРЫБЬУЕ1ККТОУЕСЫтаЪТССМЕЬТКОРТУРЕНАБЬУСЪЪЪБЪУЕЪ

. .к.. . .

.....п............................................

. .0____ ____в.......... ..........э...............

..о.. . . ....с..........

т. . ..Б... . ..........Б...............

N ..Б... . ..........Б...............

Ч . .О.. . . ..........Б...............

т. . ..э... . ..........Б...............

т ..о.. . . ..........Б...............

Т . .о.. . . ..........Я...............

т . .о.. . . ..........Я...............

т ..о... . ..........Я...............

Б. . ..0.... ..........Б...............

ч ..0.... ..........Б...............

т ..о.... ..........Я...............

т.. . .о.... ..........5...............

т . .о.. . . ..........5...............

т . .с.. . . ..........Я...............

т . .V. . . . ..........Я...............

N. . ..Б.... ..........Б...............

т ..Б.... ..........Б...............

. .в____ ..........Я...............

.....Б............................................

.....а............................................

..Б.... ..........Б...............

..в.... V........................

. .в. . . . ..........я...............

. .С____ ..........я...............

.....с............................................

.. в.... ..........я...............

..........я...............

. .е.... ..........я...............

.. в.... ..........я...............

. .о.... ..........я...............

. ____ ..........я...............

.....в............................................

160 170 180 190 200 ----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|

'БЭТ-97_Н.зед' БК1БСаНТСМУКТЫ1АПК1ЕдУЕЕТАРЕ1К1УЕННТЬМТТНКМСАШБТ1

' Е1*А_Ы. вед1 .....................I......V.....................

1КАВУ_АУ956319_Ы.вед' .....................I............................

1 Э^гЕБ^Ез^г^а.вед' .....................I......V.....................

'БЭТ245.зед' .....................I......V.....................

1 КУНК_Кгазпоуагзк_Ы. вед' .....................I..........К.....Р...........

' БС23_Уаки^а_М. эед' .....................I............................

,2072£_Уо1додгас1_Ы.зед1 .....................1......V.....................

' А^а1_7564_ссж_2 0 0 8_М. эед' .....................I......V.....................

,Аз'ЬгакЬап_8330Н_2003_Н.зед1 .....................1......V.....................

1 Ве1догос1_7548:Е_2008_Ы. вед' .....................I......V.....................

,Lipetsk_8057f_2011_N.segI .....................I......V.....................

'тхЬп1у_273_2014.веч' .....................I......V..........................................Рис. 2.

problems of virology. 2017; 62 (3)

DOI: http://dx.doi.org/ 10.18821/0507-4088-2017-62-3-101-108 ORIGINAL REsEARcH

' RV-97_N. seq' 'Nizhniy_291_2014. seq' '№zhniy_927_2014. seq' 'C>msk_7444f_2008_N.seq' 'RVHN_Novosibirsk_N.seq* 'Ryazan_810_2014. seq' 'Ryazan_812_2014. seq' •Ryazan_813_2014. seq' 'Ryazan_814_2014. seq' 'Ryazan_816_2014. seq' ' Tuva_8 060c_2 011_N. seq' 'Voronezh_7514f_2008_N.seq' ' Tver_13_2014. seq' • Tver_641_2014. seq' 'Tver_7573d_2008_N.seq1 1 Tver_7574f_2008_N. seq' 1 Tver_757 9f_2008_N. seq' ' Tver_8_2014. seq' •Moscow_ (706_2009) . seq' 'Moscow_ (708_2009) . seq' '№zhn±y_267_2014. seq' •Nizhnly_947_2014. seq' 'Vladinlr_521_2014.seq' 'Vladimir_522_2014.seq' •Vladimir_523_2014. seq' •Vladimlr_524_2014. seq' •Vladimir_525_2014.seq'

' RV-97_N. seq1 1ERA_N.seq1 'RABV_AY956319_N.seq' '9142EST_Estonia.seq' 'RV245.seq'

' RVHK_Krasnoyarsk_N. seq1 1SG23_Yakutia_N.seq' '2072f_Volgograd_N.seq* ' Altai_7 5 64_cow_2 0 0 8_N. seq' ' Astrakhan_8330H_2003_N. seq' 'Belgorod_7548f_2008_N.seq' 'Lipetsk_80 57 f_2 011_N.seq' 'Nizhniy_273_2014. seq' •№zhniy_291_2014. seq' 'Nizhniy_927_2014. seq' 'C)msk_7444f_2008_N.seq' 'RVHN_Novosibirsk_N.seq' 'Ryazan_810_2014. seq' ' Ryazan_812_2014.seq' 'Ryazan_813_2014. seq' 'Ryazan_814_2014. seq' 'Ryazan_816_2014. seq' 'Tuva_8060 c_2 011_N.seq' ' Voronezh_7514f_2008_N. seq' ' Tver_13_2014. seq' • Tver_647_2014. seq' 'Tver_7573d_2008_N.seq' ' Tver_7574f_2008_N. seq' ' Tver_757 9f_2008_N. seq' ' Tver_8_2014. seq' 'Moscow_ (706_2009) . seq' •Moscow_ (708_2009) . seq' '№zhniy_267_2014. seq' 'Sizhniy_947_2014. seq' •Vladimir_521_2014.seq< •Vladimir_522_2014. seq' •Vlad±mir_523_2014. seq' •Vladimir_524_2014.seq' •Vladimir_525_2014. seq'

160 170 180 190 200

SKISGQNTGNYKTNIADRIEQVFETAPFIKIVEHHTLMTTHKMCANWSTI .....................I......V.....................

.......A.............I. . . . . . V.....................

.....................I. . . . . .V.....................