Способ определения концентрации частиц штамма "а/Кути/2013" вируса ящура в сырье для вакцины методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

УДК 619:578.835.2: 616-076

Ключевые слова: вирус ящура, штамм «А/Кути/2013», концентрация «полных» частиц, обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция с гибридизационно-флуоресцентной детекцией

Key words: the foot-and-mouth disease (FMD) virus, strain "A/Kuti/2013", the concentration of "full" particles, reverse transcription-polymerase chain reaction with hybridization-fluorescence detection

Доронин М. И., Медведева Н. Н., Гусева М. Н., Шишкова А. А., Михалишин Д. В.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ «ПОЛНЫХ» ЧАСТИЦ ШТАММА «А/КУТИ/2013» ВИРУСА ЯЩУРА В СЫРЬЕ ДЛЯ ВАКЦИНЫ МЕТОДОМ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ-ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ С ГИБРИДИЗАЦИОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ

THE METHOD FOR DETERMINING OF CONCENTRATION OF "FULL" PARTICLES OF STRAIN "A/KUTI/2013" OF FOOT-AND-MOUTH DISEASE VIRUS INTO RAW MATERIAL FOR VACCINE USING REVERSE TRANSCRIPTION-POLYMERASE CHAIN REACTION WITH

HYBRIDIZATION-FLUORESCENCE DETECTION

ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» Адрес: 600901, Россия, г. Владимир, мкр. Юрьевец

Federal Centre for Animal Health, Federal Governmental Budgetary Institution Address: 600901, Russia, Vladimir, Yur'evets

Доронин М. И., к. б. н., мл. науч. сотрудник. E-mail: doronin@arriah.ru. Тел. (904) 650-34-65.

Doronin М. I., PhD in Biological Sciences, Junior Researcher. E-mail: doronin@arriah.ru. Tel. +7 (904) 650-34-65

Медведева Н. Н., аспирант, биолог. E-mail: medvedeva@arriah.ru

Medvedeva N. N., Post-Graduate Student, Biologist. E-mail: medvedeva@arriah.ru

Гусева М. Н., к. б. н., ст. науч. сотрудник. E -mail: guseva@arriah.ru

Guseva M. N., PhD in Biological Sciences, Senior Researcher. E-mail: guseva@arriah.ru Шишкова А. А., к. в. н., главный технолог. E-mail: shishkova@arriah.ru Shishkova A. A., PhD in Veterinary Sciences. E-mail: shishkova@arriah.ru Михалишин Д. В., к. в. н., зав. лабораторией. E-mail: michalishin_dv@arriah.ru

Michalishin D. V, PhD in Veterinary Sciences, Head of the Laboratory. E-mail: michalishin_dv@arriah.ru

Аннотация. Предложен способ определения концентрации «полных» частиц штамма «А/Кути/2013» вируса ящура в сырье для вакцины методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией. Определена корреляционная зависимость между концентрацией 146S компонента штамма «А/Кути/2013» вируса ящура и пороговым циклом амплификации.

Summary. The method for determining of concentration of "full" particles of strain "A/Kuti/2013" of FMD virus into raw material for vaccines by reverse transcription-polymerase chain reaction with hybridization-fluorescence detection are suggested in the article. The correlation between the concentration 146S component of the "A/Kuti/2013" strain of the foot and mouth disease virus and the threshold amplification cycle was determined.

Введение

Ящур (Aphthae epizooticae) является одним из наиболее опасных, высококонтагиозных и остропротекающих вирусных заболеваний диких и домашних парнокопытных животных, которое наносит большой экономический урон экономике многих стран [5]. Возбудитель ящура относится к порядку Picornavirales, семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus [6]. По молекулярно-биологи-ческим свойствам выделяют 7 типов вируса

ящура: О, А, С, Ама-1, SAT-1, SAT-2, SAT-3, большое количество подтипов и множество штаммов [6]. Генетические различия между вирусами возникают в результате спонтанных мутаций в определенных участках генома из-за ошибок вирусной РНК-полимеразы в процессе репликации вирусной РНК. Из всех участков генома максимальной вариабельностью отличается ген "УР1, кодирующий основной иммуногенный белок вируса [2]. Типы О, А, С представлены в различ-

ных странах мира. Вирусы ящура типа Asia-1 распространены на территории азиатских стран, Ближнего и Среднего Востока, а типов SAT-1,

SAT-2, SAT-3 - в Африке и на Ближнем Востоке. В процессе репродукции в суспензионной перевиваемой культуре клеток из почки новорожденного сирийского хомяка (ВНК-21/2-17) вирус ящура образует 4 варианта специфических антигенов: 1) «полные» вирионы, или 146S компонент, представленный одной молекулой вирусной РНК и 60-ю копиями полипептида VP1-VP2-VP3-VP4; 2) «пустые» капсиды, или 75S частицы, лишенные РНК и включающие в себя 60 копий полипептида VP1-VP3-VP0; 3) 12S частицы, представленные белками УР1, VP2, VP3; 4) Ма-антиген, или 3^ частицы, являющиеся некапсидным полипептидом "УР5 [2, 6].

Мероприятия, направленные на профилактику ящура, предусматривают иммунизацию крупного и мелкого рогатого скота, а также контроль уровня напряженности иммунитета [6]. При изготовлении средств специфической профилактики ящура на территории РФ и в пограничных странах используют преимущественно штаммы типов А, О, Asia-1. Для изготовления противоящурных вакцин в качестве производственных штаммов типа А применяли: «А/Иран/96», «А/Турция/97», «А №1701/Армения/98», «А/Иран/2005», «А/Турция/2006», «А2045/Киргизия/2007» и др. Однако периодически продолжают фиксировать вспышки ящура в тех хозяйствах, в которых проводят иммунизацию с использованием вакцин из указанных штаммов. В связи с этим возникла необходимость получить новый производственный штамм из эпизоотического вируса ящура типа А для обеспечения безопасности территории России и сопредельных государств от этого возбудителя. Указанная задача была решена получением штамма «А/Кути/2013» (2013 г., с. Кути Приаргунского района Забайкальского края) для изготовления биопрепаратов специфической профилактики ящура типа А. По сравнению с известными штаммами «А/Кути/2013» обладает более высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной

активностью и позволяет обеспечить высокое накопление «полных» частиц, или 146S компонента, вируса ящура в сырье для вакцины [8].

В процессе производства вакцин сырье каждой партии анализируют на количественное содержание 146S частиц [5]. Концентрацию данного компонента в сырье для вакцины определяют с применением количественного варианта реакции связывания комплемента (РСК). Однако данный метод является достаточно трудоемким, характеризуется большой продолжительностью анализа (не менее 3-х суток) и невозможностью одновременного исследования большого количества проб [1]. В связи с этим актуально предложить новый подход к определению концентрации «полных» частиц вируса ящура в сырье для вакцины на основе обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) с гибридизацион-но-флуоресцентной детекцией. Данный метод отличается высокой чувствительностью и специфичностью, является более экономичным и экспрессным, что позволяет одновременно исследовать несколько десятков проб сырья и сократить время проведения анализа до 4-х часов [7]. Исходя из этого, актуально применять ПЦР и установить математическую зависимость между содержанием «полных» частиц штамма «А/Кути/2013» вируса ящура и пороговым циклом амплификации (О;) в виде регрессионной модели. Экспериментальное подтверждение корреляционной зависимости результатов ПЦР и РСК позволит разработать быстрый и экономичный способ определения концентрации 146S компонента штамма «А/Кути/2013» вируса ящура в сырье для вакцины.

Цель исследований - провести апробацию способа определения концентрации «полных» частиц штамма «А/Кути/2013» вируса ящура в сырье для производства вакцины на основе метода ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией.

Материалы и методы

Вирус. В работе применяли образцы сырья для вакцины на основе производственного штамма вируса ящура «А/Кути/2013»,

который депонирован в Коллекции штаммов микроорганизмов (КШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Реакция связывания комплемента (РСК). Для оценки содержания «полных» частиц вируса ящура (в мкг/см3) применяли количественный вариант РСК, используя антиген вируса ящура, репродуцированный в клеточной линии BHK-21, а также гипериммунные сыворотки морских свинок штамма «А/Кути/2013» вируса ящура [1].

Выделение РНК вируса ящура из проб сырья для вакцины проводили с использованием набора «РИБО-сорб» («ИнтерЛабСер-вис», РФ) в соответствии с инструкцией производителя.

Обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР) с гибридизаци-онно-флуоресцентной детекцией. Индикацию и количественый анализ генома вируса ящура в неинактивированном материале для вакцины проводили методом ОТ-ПЦР с ги-бридизационно-флуоресцентной детекцией. Количества компонентов для реакции, а также временные и температурные параметры термоциклирования, указаны в методических рекомендациях, разработанных в ФГБУ «ВНИИЗЖ» и утвержденных Россельхознад-зором [4]. Для проведения анализа применяли систему праймеров OIE*3D-F/OIE*3D-R, а также ДНК-зонд TagMan, меченый красителем карбокси-Х-родамином (ROX) (OIE*3D). Отжиг данных структур осуществлялся на высококонсервативный участок 3D-rera вируса ящура [6]. Анализ проводили на ам-плификаторе «Rotor-Gene 6000» («Qiagen»). Полученные данные анализировали с помощью компьютерной программы «Rotor-Gene Series Software 1.8.17.5», определяющей величину порогового цикла амплификации, которая обратно пропорциональна концентрации РНК вируса ящура и, соответственно, содержанию «полных» частиц. Геном вируса ящура считается выявленным, если Ct<37. Величину эффективности реакции амплификации (Е) рассчитывали по формуле:

E = (10-1/k-1)*100 %, где k - угловой коэффициент функции линейного уравнения.

Статистическая обработка данных. Данные, полученные в результате анализа, статистически обрабатывали, вычисляя сред-

ние арифметические значения, величины стандартных отклонений пороговых циклов амплификации и концентраций «полных» частиц вируса ящура, а также коэффициент детерминации (R2). Обработку результатов и построение диаграмм проводили с использованием пакета прикладных программ Microsoft Office [3].

Результаты исследований и обсуждение

В работе исследовали возможность применения метода ОТ-ПЦР с гибридизацион-но-флуоресцентной детекцией для определения концентрации «полных» частиц или 146S компонента штамма «А/Кути/2013» вируса ящура в неинактивированном сырьевом материале для производства вакцин.

Для установления связи между значениями концентраций «полных» частиц и результатами ПЦР составляли стандартную панель контрольных положительных образцов с содержанием РНК штамма «А/Кути/2013» вируса ящура, эквивалентным следующим концентрациям 146S компонента: 0,1, 0,5, 1,0, 2,0, 4,0, 5,0, 10,0, 20,0 мкг/см3. В анализе применяли также отрицательный контроль, представляющий собой суспензию клеток линии BHK-21/2-17, не содержащую геном вирусом ящура. Из каждого полученного разведения положительного образца и от отрицательного контроля отбирали по две пробы: одна проба - для измерения величины Ct методом ОТ-ПЦР с гибридизационно-флу-оресцентной детекцией, вторая проба - для определения содержания 146S частиц (C ) в РСК. Эксперимент проводили в трех повторениях. По итогам исследования получали выборки параллельно установленных значений концентраций «полных» частиц вакцинного штамма «А/Кути/2013» вируса ящура и пороговых циклов амплификации, сведения о которых продемонстрированы в таблице 1 и на рисунке 1.

Как следует из результатов исследования, представленных в таблице 1 и на рисунке 1, значения пороговых циклов амплификации для всех контрольных разведений 146S компонента штамма «А/Кути/2013» вируса ящура с концентрациями от 0,1 до 20,0 мкг/см3 (по данным

Таблица 1.

Взаимосвязь результатов измерения концентраций 146S компонента штамма «А/Кути/2013» вируса ящура в РСК и величины порогового цикла амплификации в ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией (п=3)

Краткая характеристика анализируемого образца Концентрация (С) 1468 компонента в РСК, мкг/см3 Пороговый цикл амплификации в ПЦР

С! С2 С3 С ср (М±т) С ! С 2 С 3 С ср (М±т)

положительные контрольные образцы

концентрация 1468 компонента: 0,1 мкг/см3 0,20 0,10 0,15 0,15±0,04 (р<0,005) 29,25 29,18 29,15 29,19±0,04 (р<0,001)

0,5 мкг/см3 0,60 0,58 0,65 0,61±0,03 (р<0,001) 29,10 29,04 29,07 29,07±0,02 (р<0,001)

1,0 мкг/см3 1,03 1,10 1,15 1,09±0,05 (р<0,001) 28,95 28,90 28,84 28,90±0,04 (р<0,001)

2,0 мкг/см3 1,95 2,05 2,02 2,01±0,04 (р<0,005) 28,55 28,40 28,49 28,48±0,06 (р<0,001)

4,0 мкг/см3 4,08 3,90 4,10 4,03±0,09 (р<0,005) 27,78 27,96 27,76 27,83±0,09 (р<0,001)

5,0 мкг/см3 4,88 5,02 5,06 4,98±0,07 (р<0,005) 27,72 27,63 27,61 27,65±0,05 (р<0,001)

10,0 мкг/см3 9,92 10,15 10,01 10,02±0,09 (р<0,005) 26,35 26,25 26,28 26,29±0,04 (р<0,001)

20,0 мкг/см3 19,75 19,94 20,05 19,91±0,12 (р<0,005) 23,52 23,48 23,21 23,40±0,14 (р<0,005)

отрицательный контрольный образец

отсутствие генома вируса ящура н/в* н/в н/в н/в н/о** н/о н/о н/о

вируссодержащие образцы сырья для вакцины

сырье для сорбированной вакцины против ящура штамма «А/Кути/2013» (образец 1) 1,65 1,54 1,70 1,63±0,07 (р<0,005) 28,67 28,71 28,68 28,69±0,02 (р<0,001)

сырье для сорбированной вакцины против ящура штамма «А/Кути/2013» (образец 2) 1,86 1,80 1,94 1,87±0,06 (р<0,005) 28,57 28,62 28,6 28,60±0,02 (р<0,001)

сырье для сорбированной вакцины против ящура штамма «А/Кути/2013» (образец 3) 1,35 1,46 1,50 1,44±0,06 (р<0,005) 28,76 28,72 28,75 28,74±0,02 (р<0,001)

сырье для эмульсионной вакцины против ящура штамма «А/Кути/2013» (образец 4) 1,26 1,35 1,20 1,27±0,06 (р<0,005) 28,84 28,76 28,78 28,79±0,03 (р<0,001)

сырье для эмульсионной вакцины против ящура штамма «А/Кути/2013» (образец 5) 1,78 1,55 1,65 1,66±0,09 (р<0,005) 28,65 28,75 28,66 28,69±0,05 (р<0,001)

сырье для эмульсионной вакцины против ящура штамма «А/Кути/2013» (образец 6) 1,55 1,59 1,71 1,62±0,07 (р<0,005) 28,68 28,63 28,72 28,68±0,04 (р<0,001)

«*» - 1468 компонент вируса ящура не выявлен, «**» - геном вируса ящура не обнаружен.

РСК) находились в диапазоне от 29,19 до 23,40, соответственно. В отрицательном контроле «полные» частицы и геном вируса ящура не были выявлены. На основе полученных данных была установлена линейная математическая зависимость между С1468 и С в виде регрессионной модели:

С1468 = (-3,439)С + 100,270, представленной линейным графиком на рисунке. Коэффициент детерминации ^2) для данной зависимости стремился к 1 и составлял 0,997, что подтверждало высокую степень достоверности полученных результатов в ПЦР. Эффективность реакции амплификации (Е) имела высокое значение и составляла 95,34 %.

На следующем этапе работы проводили апробирование разработанного способа с применением предложенной регрессионной модели для определения концентрации «полных» частиц штамма «А/ Кути/2013» вируса ящура в сырье для вакцин. Методом ОТ-ПЦР с гибридизаци-онно-флуоресцентной детекцией и в РСК исследовали неинактивированные материалы (образцы № 1, 2, 3) для производства сорбированной вакцины против ящура из штамма «А/Кути/2013». Результаты исследования представлены в таблице, из которой видно, что значение С для образца № 1 составило 28,69±0,02. В соответствии с разработанной регрессионной моделью значение концентрации 1468 компонента в данном образце составило 1,60 мкг/см3, что не противоречит данным РСК (1,63±0,07 мкг/см3). Значение порогового цикла амплификации для образца № 2 - 28,60±0,02. Пользуясь предложенной моделью, было рассчитано содержание 1468 частиц в данном образце, соответствующее 1,90 мкг/см3, что сочетается с результатами РСК (1,87±0,06 мкг/см3). Величина С для образца № 3 равна 28,74±0,02, следовательно, значение С1468 -1,42 мкг/см3, что вновь коррелирует с данными РСК (1,44±0,06 мкг/см3).

В дальнейшей работе проводили тестирование неинактивированых образцов № 4, 5, 6, содержащих штамм «А/Кути/2013» и полученных для изготовления эмульсионной вакцины против ящура типов А, О,

C146S (-3,439)Ct 0(1,11

—W к- - o,vv

\ 1 Г И'34 "

>

\

\

\

\

1 1 1 5 2 1 25 J 1 J

k'uм|ц и 11и|иIч 146S частиц штамма "А/Кути/2013" вирус;) ящура в сырье вакцины, мкг/смЗ

Рис. 1. Калибровочный график зависимости порогового цикла амплификации от концентрации 146S частиц штамма «А/Кути/2013» вируса ящура (n=3)

Asia-1. Результаты анализа отражены в таблице 1, из которой видно, что значение порогового цикла амплификации для образца № 4 - 28,79±0,03. В соответствии с предложенной математической моделью концентрация «полных» частиц вируса составила 1,25 мкг/см3, что сочетается с результатами РСК (1,27±0,06 мкг/см3). При исследовании образца № 5 значение Ct было равно 28,69±0,05, следовательно, содержание

146S компонента - 1,60 мкг/см3, что не противоречит данным РСК (1,66±0,09 мкг/см3). Величина Ct для образца № 6 составила 28,68±0,04. Применяя разработанную регрессионную модель, было определено, что содержание 146S частиц вируса ящура равно 1,62 мкг/см3. Данное значение концентрации сочетается с итогами РСК - 1,62±0,07 мкг/см3. Таким образом, разработанная математическая модель с помощью результатов ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией позволяет оценивать содержание «полных» частиц штамма «А/Кути/2013» вируса ящура в сырье для вакцины.

Заключение

Предложен новый способ оценки содержания 146S частиц штамма «А/Кути/2013» вируса ящура в сырье для производства вакцины, применяя ОТ-ПЦР с гибридиза-ционно-флуоресцентной детекцией и разработанную на его основе математическую модель. По итогам РСК и ПЦР между концентрацией «полных» частиц и поро-

говым циклом амплификации выявлена отрицательная корреляционная зависимость в виде регрессионной модели, представленной графиком линейной функции С1468=(-3,439)С+100,270. Предложенный способ дает возможность быстро и с высокой степенью достоверности определять концентрацию «полных» частиц штамма «А/Кути/2013» вируса ящура в сырье для вакцины.

Список литературы

1. Бондаренко, А. Ф. Качественный и количественный иммунохимический анализ вирусных белков [Текст] / А. Ф. Бондаренко // Суздаль, 1994. - 92 с.

2. Вирусные болезни животных [Текст] / В. Н. Сю-рин [и др.] // М. : ВНИИТИБП, 1998. - С. 532-548.

3. Гланц, С. Медико-биологическая статистика [Текст] / С. Гланц // Пер. с англ. - М. : Практика, 1999. -459 с.

4. Методические указания по обнаружению вируса ящура методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. - ФГБУ «ВНИИЗЖ», 2011 г. - 13 с.

5. Пономарев, А. П. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства [Текст] / А. П. Пономарев, В. Л. Узюмов // Владимир : Фолиант, 2006. - 250 с.

6. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. - 7th еd. - Paris, 2012. - Vol. 1. -Chap. 2.1.5. - Р. 166-169.

7. Wernike, K. Rapid detection of foot-and-mouth disease virus, influenza A virus and classical swine fever virus byhigh-speedreal-timeRT-PCR [Текст] / K. Wernike, M. Beer, B. Hoffmann // Journal of Virolo-gical Methods. - 2013. - Vol. 193. - № 1. - Р. 50-54.

^^.v* ■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■

КАК ОФОРМИТЬ ПОДПИСКУ НА ЖУРНАЛ?

А. Через подписной каталог

Индекс в каталоге «Газеты. Журналы» Агентства «Роспечать» - 33184

Б. Через редакцию журнала

Банковские реквизиты для оплаты подписки по безналичному расчету для юридических лиц:

ЧОУДПО «Институт Ветеринарной Биологии» ИНН 7802196720 КПП 781301001 Р/с 40703810400000000022 в АО «Горбанк», г. Санкт-Петербург К/с 30101810200000000814 БИК 044030814

В поле «Назначение платежа» указать: «Предоплата за подписку на журнал «Актуальные вопросы ветеринарной биологии» на 2017 г. согласно инф. письму б/н от 20.09.16 г. НДС не облагается. Адрес доставки: ...»

Стоимость редакционной подписки на 2017 год: 1600 рублей.

е Адрес редакции: Санкт-Петербург, ул. Ораниенбаумская, 3-Б. =

| Т./ф. (812) 232-55-92, т. 927-55-92. |

| E-mail: virclin@mail.ru; www.invetbio.spb.ru |

^/IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIM