CC BY
41
DOI: 10.24411/2074-5036-2019-10022 УДК 619:616.98:578.835.2:615.371
Ключевые слова: вирус ящура, вакцина, иммуногенность in vitro, заражение
Key words: foot-and-mouth disease virus, FMD, vaccine, immunogenicity in vitro, infection
Лозовой Д.А., Михалишин Д.В., Стариков В.А., Доронин М.И., Шишкова А.А., Шарыпов А.С., Борисов А.В.
ЭФФЕКТИВНОСТЬ МОНОВАЛЕНТНОЙ ВАКЦИНЫ «АРРИАХ-ВАК», РАЗРАБОТАННОЙ НА ОСНОВЕ ШТАММА О/KOR/JC02D1/14 (O/JINCHEON/2014)
ВИРУСА ЯЩУРА
EFFECTIVENESS OF MONOVALENT VACCINE «ARRIAH-VAC» FROM STRAIN O/KOR/JC02D1/14 (O/JINCHEON/2014) AGAINST FOOT-AND-MOUTH DISEASE
ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» Адрес: 600901, Россия, г. Владимир, мкр. Юрьевец Federal Centre for Animal Health, Federal Governmental Budgetary Institution Address: 600901, Russia, Vladimir, Yur 'evets
Лозовой Д.А., к.в.н., директор. E-mail: lozovoy@arriah.ru Lozovoy D.A., PhD in Veterinary Science, Director. E-mail: lozovoy@arriah.ru Михалишин Д.В., к.в.н., зав. лабораторией. E-mail: mihalishindv@arriah.ru Michalishin D.V., PhD in Veterinary Science, Head of the Laboratory. E-mail: mihalishindv@arriah.ru Стариков В.А., к.в.н., вед. науч. сотрудник. E-mail: starikov@arriah.ru Starikov V.A., PhD in Veterinary Science, Leading Researcher. E-mail: starikov@arriah.ru Доронин М.И., к.б.н., науч. сотрудник. E-mail: midarriah89@mail.ru Doronin M.I., PhD in Biological Science, Researcher. E-mail: midarriah89@mail.ru Шишкова А.А., к.в.н., главный технолог. E-mail: shishkova@arriah.ru Shishkova A.A., PhD in Veterinary Science, Chief Technologist. E-mail: shishkova@arriah.ru Шарыпов А.С., ведущий ветеринарный врач. E-mail: sharipov@arriah.ru Sharipov A.S., Leader Veterinarian. E-mail: sharipov@arriah.ru Борисов А.В., к.в.н., вед. науч. сотрудник. E-mail: borisov@arriah.ru Borisov A.V., PhD in Veterinary Science, Leading Researcher. E-mail: borisov@arriah.ru
Аннотация. В данное статье описано исследование, посвященное оценке эффективности противоящур-ной вакцины из штамма 0/Jincheon/2014 генетической линии SEA/Mya-98 против гомологичного и ге-терологичного вируса ящура 0/Zabaikalskiy/2/RUS/2016, применяющейся с целью профилактической иммунизации животных в Южной Корее. Разработанная вакцина авирулентна, безвредна и иммуногена. Проведено исследование иммуногенной и протективной активности против гомологичного вируса ящура 0/Jincheon/2014 на свиньях. Протективная активность противоящурной моновалентной эмульсионной вакцины «АРРИАХ-ВАК» из штамма 0/Jincheon/2014 против гомологичного вируса ящура составила 50 PD50 в прививной дозе. Протективная активность той же вакцины против гетерологичного штамма 0/Zabaikalskiy/2/RUS/2016 имела высокое значение и составила у КРС 18 PD50, а у свиней - 15 PD50. Полученные данные свидетельствуют о возможности использования разработанной вакцины для профилактической вакцинации животных и предупреждения возникновения чрезвычайных ситуаций на свободных от ящура территориях, где высоки риски занесения вируса ящура типа О генетической линии SEA/Mya-98, а также ME-SA/Ind-2001d.
Summary. This article describes an analysis to the efficiency ofthefoot-and-mouth (FMD) disease vaccinefrom the strain O/ Jincheon/2014 genetic line SEA/Mya-98 against homologous and heterologous FMD virus O/Zabaikalskiy/2/RUS/2016, usedfor preventive immunization of animals in South Korea. The developedvaccine is avirulent, harmless andimmunogen. The research of immunogenic and protective activity against homologous FMD virus O/Jincheon/2014 in pigs. The protective activity of monovalent emulsion vaccine "ARRIAH-VAC" from strain O/Jincheon/2014 against homologous FMD virus was 50 PD50 in the inoculated dose. The protective activity of the same vaccine against the heterologous strain O/Zabaikalskiy/2/RUS/2016 was high and amounted to 18 PD50 in cattle and 15 PD50 in pigs. The data obtained indicate the possibility of using this vaccine from the strain O/Jincheon/2014 for prophylactic vaccination of animals and preventing emergencies in FMD-free areas where the risks of introducing the genetic isolates ME-SA/Ind-2001d of the FMD virus are high.
Введение
Ящур - высококонтагиозное вирусное заболевание парнокопытных животных, которое относится к категории трансграничных инфекций, вызывает эпизоотии и причиняет большой экономический ущерб животноводству многих государств. Возбудителем является безоболочечный РНК-содержащий вирус, принадлежащий к порядку Picor-navirales, роду Aphthovirus семейства Pi-cornaviridae [7]. Характерной особенностью вируса ящура является наличие 7 типов: О, А, С, Азия-1, SAT-1, SAT-2, SAT-3 и множества подтипов с различными генетическими и антигенными вариантами. Геном вируса кодирует четыре структурных и восемь неструктурных белков, вызывающих у животных выработку антител [4].
В настоящее время в мире существует семь экосистем (пулов) вируса ящура: 1 - Юго-Восточная Азия и Китай, 2 - Южная Азия, 3 - Ближний и Средний Восток, 4 - Западная и Центральная Африка, 5 -Восточная Африка, 6 - Южная Африка, 7 - Южная Америка. В каждом пуле циркулируют изоляты вируса ящура, отличающиеся друг от друга по своим генетическим и антигенным характеристикам. Сформировавшиеся, устойчивые генетические группы изолятов получили название топотипов (географических типов), в которых различают многочисленные генетические линии вируса [3].
Вспышки ящура в разных странах мира (Великобритания, Франция, Нидерланды, Болгария, Израиль, Тайвань, Северная и Южная Корея, Япония, Монголия и др.) свидетельствуют о постоянной угрозе занесения его возбудителя на территорию соседних государств. Обострение эпизоотической ситуации по ящуру обусловлено множеством факторов: высокой степенью мутационной изменчивости вируса и, как следствие, появлением новых изолятов, множеством путей передачи инфекции и высокой контагиозностью вируса, перемещением животных, в том числе диких, их случайными контактами на пастбищах и водопое, разными хозяйственно-экономическими и культурными связями, возросшим уровнем туризма и паломничества, военны-
ми конфликтами, движением автотранспорта, массовой миграцией людей [5].
Согласно отчетам Европейской комиссии по контролю ящура (EuFMD) и Всемирной справочной лаборатории МЭБ по ящуру (WRLFMD) года ящур типа О был выявлен в Южной Корее в феврале 2017 года у КРС в «Chungcheongbuk-Do» и «Jeollabuk-do» [2]. Полевой изолят Zabai-kalskiy/2/RUS/2016 вируса ящура, выделенный в Забайкальском крае РФ от крупного рогатого скота, относится к генетической линии ME-SA/Ind-2001d. Другой полевой изолят, обнаруженный 06 февраля 2017 года в Jeonbuk (Южная Корея), принадлежит также к линии ME-SA/Ind-2001d и по последовательности нуклеотидов имеет высокую степень родства (99,7%) по отношению к изоляту Zabaikalskiy/2/RUS/2016 [2].
Цель исследования заключалась в определении антигенной и протективной эффективности противоящурной моновалентной вакцины «АРРИАХ-ВАК» из штамма 0/Jincheon/2014 (генетическая линия Mya-98 топотипа SEA) против гетерологичного штамма 0/Zabaikalskiy/2/RUS/2016 (генетическая линия ME-SA/Ind-2001d) вируса ящура.
Материалы и методы
Вирус ящура. В работе применяли культуральный вирус ящура штаммов 0/Jincheon/2014 (генетическая линия Mya-98 топотипа SEA) и 0/Zabaikalskiy/2/RUS/2016 (генетическая линия ME-SA/Ind-2001d). Для контрольного заражения применяли 10%-ную афтозную суспензию штамма 0/Zabaikalskiy/2/RUS/2016 и 0/Jincheon/2014 вируса ящура адаптированного к восприимчивым животным.
Животные. В исследовании использовали крупный рогатый скот (КРС) голшти-но-фризской породы, массой 250-300 кг, в возрасте 9-12 месяцев, в количестве 22 голов. В исследовании использовали свиней породы ландрас, массой 30-40 кг, в количестве 17 голов.
Вакцина. В работе исследовали экспериментальную противоящурную моновалентную инактивированную эмульсион-
29
ную вакцину «АРРИАХ-ВАК» из штамма 0/Jincheon/2014 с содержанием в прививном объеме не менее 6 PD50.
Оценка авирулентности инактивирован-ного антигена вируса ящура. Авирулент-ность суспензии инактивированного вируса ящура контролировали инокуляцией моно-слойной перевиваемой клеточной линии почки свиньи (IB-RS-2).
Тестирование вакцины на авирулент-ность с помощью КРС.
Отобранную пробу экспериментальной моновалентной эмульсионной вакцины «АРРИАХ-ВАК» из штамма 0/Jincheon/2014 вируса ящура каждому из пяти животных вводили в 20 точек слизистой оболочки языка по 0,1 см3 (прививная доза - 2,0 см3). Вакцина считается авирулентной, если все животные, которым был инокулирован препарат, в течение 6 суток оставались клинически здоровыми, без проявления клинических признаков, характерных для ящура.
Оценка безвредности вакцины для КРС.
Для тестирования вакцины на безвредность 5 головам КРС внутримышечно в область верхней трети шеи в дозе 6,0 см3 (трехкратная доза) вводили препарат и наблюдали за клиническим состоянием животного в течение 6 суток. Вакцина признается безвредной в том случае, если все животные по итогам наблюдения остаются клинически здоровыми, и на месте введения препарата не происходит некроза тканей.
Определение антител к неструктурным белкам вируса ящура на КРС.
Для определения серонегативности к неструктурным белкам вируса ящура от животных до иммунизации отбирали кровь и тестировали полученные сыворотки с помощью блокирующего варианта иммуно-ферментного анализа (ИФА) в соответствии с рекомендациями OIE (МЭБ). На 14 день после начала испытаний на авирулентность и безвредность 5 головам КРС вводили усредненную из 3 флаконов пробу моновалентной эмульсионной вакцины «АРРИАХ-ВАК» из штамма 0/Jincheon/2014 вируса ящура в количестве одной прививной дозы в область верхней средней трети шеи внутримышечно. Через 14 суток после последней
вакцинации от животных производили отбор проб крови. Тестирование полученных сывороток проводили с использованием тест-системы для ИФА «PrioCHECK® FMDV NS ELISA for in vitro detection of antibodies against Foot and Mouth Disease Virus in serum of cattle, sheep and pigs» (Prionics Lelystad B.V., Нидерланды). Для контрольных и исследуемых образцов после проведения реакции на спектрофотометре-ридере измеряли значения оптических плотностей (ОП) и преобразовывали их в процент ингибиции, пользуясь формулой:
PI=(1 - ОПКО х 100- где
PI - процент ингибиции (%),
OnS - оптическая плотность исследуемой сыворотки крови;
ОПКО - оптическая плотность отрицательного контроля.
Сыворотки крови КРС в отношении наличия антител к неструктурным белкам вируса ящура следует считать положительными, если значение PI>50%, отрицательными -при PI<50%. При этом значение оптической плотности отрицательного контроля должно быть >1,000. Процент ингибиции слабоположительного контроля должен составлять >50,00%, положительного контроля ->70,00% [6, 7].
Определение титра вируснейтрализую-щих антител (ВНА).
На 0 и 21 сутки после введения моновалентной эмульсионной вакцины «АРРИАХ-ВАК» из штамма O/Jincheon/2014 от животных отбирали кровь и получали сыворотки, которые исследовали на наличие ВНА с применением реакции микронейтрализации (РМН) вируса. Постановку РМН для определения титра нейтрализующих антител против гомологичного штамма 0/Jincheon/2014 и гетерологичного штамма 0/Zabaikalskiy/2/RUS/2016 вируса ящура осуществляли с использованием клеточной линии IB-RS-2 по стандартной процедуре [7].
Оценка иммуногенности вакцины.
Иммуногенность вакцины исследовали на 17 головах КРС и 34 головах свиней количественным методом с контрольным за-
30
ражением против гомологичного штамма 0/Jincheon/2014 (генетическая линия Mya-98 топотипа SEA) и гетерологичного штамма 0/Zabaikalskiy/2/RUS/2016 вируса ящура (генетическая линия 0/ME-SA/Ind-2001d). Для вакцинации животных готовили 3 образца: 1) моновалентную эмульсионную вакцину «АРРИАХ-ВАК» из штамма O/Jin-cheon/2014 вируса ящура без разведения,
2) вакцину, разбавленную «Плацебо» в соотношении 1:4 для КРС и 1:5 для свиней,
3) вакцину, разбавленную «Плацебо» в соотношении 1:16 для КРС и 1:25 для свиней. Приготовленные образцы вводили внутримышечно в верхнюю треть шеи в дозе 2,0 см3. Для тестирования каждого образца брали по 5 голов КРС и свиней и 2 головы оставляли в качестве контроля без иммунизации. КРС с порядковыми номерами с 1 по 5 инокули-ровали вакциной без разведения, животным с номерами с 6 по 10 вводили вакцину, разведенную 1:4, животным с номерами с 11 по 15 - вакцину, разведенную 1:16, животных с номерами 16 и 17 - не иммунизировали (контроль). Свиней с порядковыми номерами с 1 по 5 инокулировали вакциной без разведения, животным с номерами с 6 по 10 вводили вакцину, разведенную 1:5, животным с номерами с 11 по 15 - вакцину, разведенную 1:25, животных с номерами 16 и 17 - не иммунизировали (контроль).
Спустя 21 суток после иммунизации от вакцинированных животных отбирали кровь и полученные сыворотки анализировали в РМН с целью определения уровня вируснейтрализующих антител (ВНА). Затем КРС и свиней заражали гетерологичным штаммом вируса ящура O/Zabaikalskiy/2/ RUS/2016 в слизистую оболочку языка в дозе 104,0 ИД50/0,20 см3 (в две точки по 0,10±0,05 см3). КРС и свиньи друг с другом не контактировали. В течение 7 суток после заражения за животными вели наблюдение и ежедневно измеряли температуру. Через 7 суток после заражения всех животных подвергли эвтаназии и проводили патологоанатомический осмотр. Защищенными от ящура считали животных, у которых на конечностях отсутствовали поражения, характерные для ящура. Первичные афты не учитывали. Иммуно-
генную дозу (ИмД50) вакцины определяли по общепринятой методике Рида и Менча, в модификации И.П. Ашмарина [1].
Количество протективных доз (PD50) вычисляли путем деления прививной дозы (2,0 см3) на ИмД50.
Статистическая обработка данных. Статистическая обработка заключалась в определении средних арифметических значений и достоверности статистической разницы между средними величинами, определенными по разностному методу Стьюдента-Фишера [1]. Различия считали статистически достоверными при уровне значимости p<0,005.
Результаты исследований и обсуждение
На первом этапе работы экспериментальную моновалентную эмульсионную вакцину «АРРИАХ-ВАК» из штамма 0/Jincheon/2014 вируса ящура тестировали на авирулент-ность и безвредность в процессе наблюдения за состоянием здоровья КРС после инокуляции. По результатам исследования изготовленный препарат признан авирулентным и безвредным, поскольку все животные, которые были иммунизированы, в течение всего срока наблюдения оставались клинически здоровыми и без формирования некроза тканей на месте введения вакцины.
На следующем этапе работы сыворотки крови животных до и после введения моновалентной эмульсионной вакцины «АРРИАХ-ВАК» из штамма 0/Jincheon/2014 исследовали на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура. До иммунизации в сыворотках крови КРС и свиней антитела, специфичные к 3АВС полипротеину, не были обнаружены. Результаты исследования в блокирующем варианте ИФА сывороток крови после вакцинации, отобранных в соответствии с рекомендациями OIE (МЭБ), представлены в таблицах 1, 2.
Из данных таблиц 1, 2 следует, что PI слабоположительного контроля был выше 50%, положительного контроля - больше 70%, что соответствует требованиям теста. Сыворотки крови, полученные от 5 голов КРС и 5 голов свиней после введения 4 доз (тест на авиру-лентность, безвредность) и 1 дозы вакцины
з!
Таблица 1
Определение в ИФА антител к неструктурным белкам вируса ящура в сыворотках крови КРС, иммунизированного моновалентной эмульсионной вакциной «АРРИАХ-ВАК» из штамма О/Jincheon/2014
Исследуемые сыворотки Значение оптической плотности Процент ингибиции (Р1), %
слабоположительный контроль 0,555 61,46
положительный контроль 0,290 79,86
отрицательный контроль 1,780 0,00
1 1,019 29,24
2 1,027 28,68
3 1,015 29,51
4 0,999 30,63
5 0,923 35,90
Примечание: номер исследуемой сыворотки соответствует порядковому номеру животного
через 14 дней, имели процент ингибиции менее 50%. Иными словами, моновалентная эмульсионная вакцина «АРРИАХ-ВАК» из штамма О/ЛпсЬеоп/2014 не индуцирует у КРС и свиней выработку антител к неструктурным белкам вируса ящура.
На следующем этапе работы провели исследования иммуногенной и протективной активности эмульсионной моновалентной вакцины «АРРИАХ-ВАК» на свиньях против гомологичного штамма. Результаты исследований сывороток крови свиней до вакцинации в РМН показали, что животные не содержали противоящурных антител.
По результатам исследования гуморального и протективного иммунитета, представленным в таблице 3, видно, что вакцина стимулировала выработку ВНА против гомологичного штамма ОЯтсИеоп/2014 в группе
животных, иммунизированных вакциной без разведения на уровне 1,83±0,10 1,52±0,03 ^ - в группе животных, привитых препаратом в разведении 1:5, 1,13±0,13 ^ - в группе животных, вакцинированных препаратом в разведении 1:25.
Сыворотки также анализировали в РМН против гетерологичного штамма О^аЪаь каШу/2/йШ/2016. Титры ВНА в группе животных, инокулированных вакциной без разведения, составили 1,44±0,10 в группе с разведением 1:5, - 0,99±0,10 а в группе с разведением 1:25 - 0,54±0,10
В результате контрольного заражения вакцинированных свиней гомологичным штаммом О/ЛпсИеоп/2014 не наблюдали генерализованную форму ящура. Протективная активность против гомологичного вируса ящура составила 50 PD50 в прививном объёме.
Таблица 2
Определение в ИФА антител к неструктурным белкам вируса ящура в сыворотках крови свиней, иммунизированного моновалентной эмульсионной вакциной «АРРИАХ-ВАК» из штамма О/Jincheon/2014
Исследуемые сыворотки Значение оптической плотности Процент ингибиции (Р1), %
слабоположительный контроль 0,719 61,46
положительный контроль 0,259 79,86
отрицательный контроль 1,787 0,00
1 1,436 19,64
2 1,676 6,211
3 1,330 25,57
4 1,525 14,66
5 1,491 16,56
Примечание: номер исследуемой сыворотки соответствует порядковому номеру животного
Следующий этап работы посвящен изучению эффективности противо-ящурной моновалентной эмульсионной вакцины «АРРИАХ-ВАК» из штамма 0/ЛпсЬеоп/2014. Результаты тестирования сывороток крови КРС до вакцинации в РМН показали, что животные не содержали противоящурных антител. Результаты исследований гуморального и протективного иммунитета, сформированного у КРС после введения противоящурной моновалентной эмульсионной вакцины «АРРИАХ-ВАК» из штамма О/ЛпсИеоп/2014, против гетероло-гичного штамма 0^аЬа1ка18к1у/2^^/2016 отражены в таблице 4.
Из данных таблицы 4 следует, что разработанная вакцина стимулировала выработку высокого уровня антител у привитых животных. Спустя 21 сутки после иммунизации при исследовании сывороток крови в РМН титры ВНА против гомологичного штамма О/ЛпсИеоп/2014 составили 2,34±0,10 ^ в группе животных, иммунизированных вакциной без разведения, 2,16±0,10 ^ -в группе животных, привитых препаратом в разведении 1:4, и 1,74±0,04 ^ - в группе особей, инокулированных вакциной в разведении 1:16. Полученные сыворотки также анализировали в РМН против гетерологич-ного штамма 0^аЬа1ка^к1у/2^^/2016.
33
Таблица 3
Гуморальный и протективный иммунитет у свиней на эмульсионную вакцину «АРрИАХ-ВАК» из штамма О/Jincheon/2014 против гомологичного вируса ящура
Разведение вакцины № п/п животных Развитие генерализации Титры вируснейтрализующих антител в сыворотках крови КРС, иммунизированных противоящурной моновалентной эмульсионной вакциной «АРРИАХ-ВАК» из штамма 0/ЛпсЬеоп/2014 в РМН против штаммов ИмД50,см3 ^50
О/ЛпсЪеоп/2014 0/2аЬа1каШу/2/КШ/2016
до вакцинации 21 сутки после вакцинации до вакцинации 21 сутки после вакцинации
без разведения 1 - <0,45 2,10 <0,45 1,58 0,04/50
2 - <0,45 1,95 <0,45 1,35
3 - <0,45 1,88 <0,45 1,58
4 - <0,45 1,58 <0,45 1,50
5 - <0,45 1,65 <0,45 1,20
М±т 1,83±0,10 1,44±0,10
1-5 6 - <0,45 1,43 <0,45 1,05
7 - <0,45 1,50 <0,45 1,13
8 - <0,45 1,58 <0,45 1,13
9 - <0,45 1,58 <0,45 0,60
10 - <0,45 1,50 <0,45 1,05
М±т 1,52±0,03 0,99±0,10
1-25 11 - <0,45 1,28 <0,45 0,75
12 - <0,45 1,50 <0,45 0,45
13 - <0,45 0,75 <0,45 0,53
14 - <0,45 1,13 <0,45 0,53
15 - <0,45 0,98 <0,45 0,45
М±т 1,13±0,13 0,54±0,10
16 + <0,45 н/и н/и
17 + <0,45 н/и н/и
Примечание: «-» - отсутствие генерализованной формы ящура, «+» - наличие генерализованной формы ящура, «н/и» - не исследовали
Титры ВНА в группе животных, инокулиро-ванных вакциной без разведения, составили 2,01±0,04 в группе особей, привитых вакциной с разведением 1:4, - 1,74±0,10 а в группе животных, иммунизированных вакцинным препаратом в разведении 1:16 -1,22±0,12 В сыворотках крови животных №11 и 15 титры ВНА составили 0,90 ^ и 0,80
соответственно.
В результате контрольного заражения ге-терологичным штаммом 0^аЬа1ка18Иу/2/ RUS/2016 у животных №16 и №17, не подвергнутых иммунизации, наблюдали развитие генерализованной формы ящура. У двух
голов КРС (№ 11, №15) из группы, привитых вакциной в разведении 1:16, были выявлены клинические признаки, характерные для ящура. Животные остальных групп были защищены от генерализованной формы ящура.
По результатам РМН титры антител сывороток крови испытуемых животных против гомологичного штамма 0/ЛпсЬеоп/2014 вируса ящура были выше, чем против гетероло-гичного штамма 0^аЬа1ка18Иу/2^^/2016. Так, значения титров антител у КРС, иммунизированного вакциной без разведения, против гомологичного штамма превышали данный показатель против гетерологичного
Таблица 4
Гуморальный и протективный иммунитет у КРС на эмульсионную вакцину «АРРИАХ-ВАК» из штамма О/Jincheon/2014 против гетерологичного вируса
О/Zabaikalskiy/2/RUS/2016
Разведение вакцины № п/п животных Развитие генерализации Титры вируснейтрализующих антител в сыворотках крови КРС, иммунизированных противоящурной моновалентной эмульсионной вакциной «АРРИАХ-ВАК» из штамма 0/ЛпсЪеоп/2014 в РМН против штаммов ИмД50,см3 ^50
О/ЛпсЪеоп/2014 0/2аЬа1каШу/2/КШ/2016
до вакцинации 21 сутки после вакцинации до вакцинации 21 сутки после вакцинации
без разведения 1 - <0,45 2,25 <0,45 1,95 0,11/18
2 - <0,45 2,40 <0,45 2,10
3 - <0,45 2,55 <0,45 2,10
4 - <0,45 2,25 <0,45 1,95
5 - <0,45 2,25 <0,45 1,95
М±т 2,34±0,10 2,01±0,04
1-4 6 - <0,45 2,25 <0,45 1,95
7 - <0,45 1,80 <0,45 1,65
8 - <0,45 2,25 <0,45 1,65
9 - <0,45 2,25 <0,45 1,80
10 - <0,45 2,25 <0,45 1,65
М±т 2,16±0,10 1,74±0,10
1-16 11 + <0,45 1,65 <0,45 0,90
12 - <0,45 1,80 <0,45 1,50
13 - <0,45 1,80 <0,45 1,50
14 - <0,45 1,80 <0,45 1,40
15 + <0,45 1,65 <0,45 0,80
М±т 1,74±0,04 1,22±0,12
16 + <0,45 н/и н/и
17 + <0,45 н/и н/и
Примечание: «-» - отсутствие генерализованной формы ящура, «+» - наличие генерализованной формы ящура, «н/и» - не исследовали
штамма в 2,14 раза, в группе животных, подвергнутых введению данной вакцины с разведением 1:4 - в 2,63 раза, а в группе КРС, которым вводили вакцинный препарат с разведением 1:16 - в 3,31 раза.
После проведения контрольного заражения в течение 7 суток вели наблюдение за состоянием здоровья животных и регистрировали температуру их тела. Результаты исследования продемонстрированы на рисунке 1.
Как следует из сведений, отраженных на рисунке, у всех животных в ходе наблюдений после контрольного заражения наблюдалась пирексия. Только у 2 из 15 вакцинированных голов КРС отмечали развитие генерализованной формы поражения конечностей. Иными словами, полученные результаты свидетельствуют о том, что лихорадка не является предвестником генерализованных поражений у животных.
На следующем этапе провели исследования по изучению эффективности противоящур-ной моновалентной эмульсионной вакцины «АРРИАХ-ВАК» из штамма 0/ЛпсЬеоп/2014 на свиньях. Результаты контроля на присутствие антител к вирусу ящура сывороток крови свиней до вакцинации в РМН показали, что животные не содержали противоящурных антител. Антитела ни к гомологичному штамму О/ЛпеИеоп/2014, ни к гетерологичному штамму 0^аЪа1какк1у/2Ж^/2016 вируса ящура не были выявлены. Результаты исследований гуморального и протективного иммунитета, сформированного у свиней после введения противоящурной моновалентной эмульсионной вакцины «АРРИАХ-ВАК» из штамма О/ЛпеИеоп/2014, против гетерологичного штамма 0^аЪа1ка18Ну/2/К^/2016 продемонстрированы в таблице 5.
Из данных таблицы 5 видно, что моновалентная эмульсионная вакцина «АРРИАХ-ВАК» из штамма О/ЛпеИеоп/2014 вируса ящура индуцировала выработку высокого уровня антител у привитых животных. Спустя 21 сутки после иммунизации при исследовании сывороток крови в РМН титры ВНА против гомологичного штамма О/ЛпеИеоп/2014 составили 2,31±0,10 ^ в группе из 5 животных, привитых вакциной без разведения, 1,83±0,10 ^ - в группе жи-
01234 5 678
Дни после вакцинации ^^без разведения ^ разведение 1 4 ^^разведенне 116 -»^животное.N"2 11_животное № I _контроль_
Рис. 1. Температура тела КРС, привитого противо-ящурной моновалентной эмульсионной вакциной «АРРИАХ-ВАК» из штамма 0/Jincheon/2014 без разведения, с разведениями 1:4, 1:16 и не вакцинированного, после контрольного заражения гетерологичным штаммом 0/Zabaikalskiy/2/RUS/2016
вотных, привитых препаратом в разведении 1:5, и 1,35±0,03 lg - в группе, инокулирован-ной вакциной в разведении 1:25. Сыворотки крови также тестировали в РМН против гетерологичного штамма O/Zabaikalskiy/2/ RUS/2016. Уровень ВНА на 21 сутки после вакцинации в группе животных, иммунизированных вакциной без разведения, составил 1,65±0,02 lg, в группе свиней, привитых вакциной с разведением 1:5, - 1,45±0,10 lg, а в группе животных, иммунизированных вакцинным препаратом в разведении 1:25 -0,86±0,11 lg.
В результате заражения гетерологич-ным штаммом 0/Zabaikalskiy/2/RUS/2016 у контрольных животных (№16 и №17) наблюдали развитие генерализованной формы ящура. В группе свиней, получивших дозу вакцины в разведении 1:25, у 4 животных (№ 11, №13, №14, №15) наблюдали генерализованную форму ящура, титры вирусней-трализующих антител составили 0,90, 0,75, 0,67, 0,80 lg, соответственно. Животные остальных групп были защищены от генерализованной формы ящура.
По результатам РМН титры антител сывороток крови испытуемых животных против гомологичного штамма 0/Jincheon/2014 вируса ящура были выше, чем против гетероло-гичного штамма 0/Zabaikalskiy/2/RUS/2016.
35
Таблица 5
Гуморальный и протективный иммунитет у свиней на эмульсионную вакцину «АРРИАХ-ВАК» из штамма О/Jincheon/2014 против гетерологичного вируса
О/Zabaikalskiy/2/RUS/2016
Разведение вакцины № п/п животных Развитие генерализации Титры вируснейтрализующих антител в сыворотках крови свиней, иммунизированных противоящурной моновалентной эмульсионной вакциной «АРРИАХ-ВАК» из штамма 0/ЛпсЪеоп/2014 в РМН против штаммов ИмД50,см3 /PD50
O/Jincheon/2014 0/Zabaikalskiy/2/RUS/2016
до вакцинации 21 сутки после вакцинации до вакцинации 21 сутки после вакцинации
без разведения 1 - <0,45 2,17 <0,45 1,65 0,11/18
2 - <0,45 2,62 <0,45 1,72
3 - <0,45 2,17 <0,45 1,65
4 - <0,45 2,32 <0,45 1,57
5 - <0,45 2,25 <0,45 1,65
M±m 2,31±0,10 1,65±0,02
1-5 6 - <0,45 1,65 <0,45 1,20
7 - <0,45 2,10 <0,45 1,27
8 - <0,45 1,65 <0,45 1,57
9 - <0,45 1,95 <0,45 1,57
10 - <0,45 1,80 <0,45 1,65
M±m 1,83±0,10 1,45±0,10
1-25 11 + <0,45 1,42 <0,45 0,90
12 - <0,45 1,42 <0,45 1,20
13 + <0,45 1,27 <0,45 0,75
14 + <0,45 1,27 <0,45 0,67
15 + <0,45 1,35 <0,45 0,80
M±m 1,35±0,03 0,86±0,11
16 + <0,45 н/и н/и
17 + <0,45 н/и н/и
Примечание: «-» - отсутствие генерализованной формы ящура, «+» - наличие генерализованной формы ящура, «н/и» - не исследовали
Так, значения титров антител у свиней, иммунизированных вакциной без разведения, против гомологичного штамма превышали данный показатель против гетерологичного штамма в 4,60 раза, в группе животных, подвергнутых введению данной вакцины с разведением 1:5 - в 2,40 раза, а в группе свиней, которым вводили вакцинный препарат с разведением 1:25 - в 3,10 раза.
Заключение
Осуществлена оценка антигенной и про-тективной эффективности противоящур-ной моновалентной эмульсионной вакцины
36
«АРРИАХ-ВАК» из штамма 0/ЛпсИеоп/2014 против гетерологичного штамма О/^аЬаь ка18Ыу/2/К^/2016 вируса ящура. Разработанная вакцина авирулентна, безвредна, иммуногенна, при этом не индуцирует формирование антител к неструктурным 3АВС белкам вируса ящура у привитых животных.
Проведено исследование иммуногенной и протективной активности против гомологичного вируса ящура 0/ЛпсИеоп/2014 на свиньях. Выявлено, что протективная активность противоящурной моновалентной эмульсионной вакцины «АРРИАХ-ВАК» из штамма 0/ЛпсИеоп/2014 против гомологич-
ного вируса ящура составила 50 PD50 в прививной дозе.
Проведено исследование гуморального и протективного иммунитета, сформированного у КРС и свиней после введения данной вакцины, против гетерологичного штамма 0/Zabaikalskiy/2/RUS/2016 (линия ME-SA/ Ind-2001d). Выявлено, что протективная активность противоящурной моновалентной эмульсионной вакцины «АРРИАХ-ВАК» из штамма 0/Jincheon/2014 против гетерологичного штамма 0/Zabaikalskiy/2/RUS/2016 имела высокое значение и составила у КРС 18 PD50, а у свиней - 15 PD50.
Список литературы
1. Ашмарин И.П., Воробьёв А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. - Л.: Медицина, 1962. - 179 с.
2. Официальный сайт The FAO World Reference Laboratory for Foot-and-Mouth Disease - URL: http://
www.fao.org/fileadmin/user_upload/eufmd/Pirbright_ reports/JM20170IE-FA0_FMD_Ref_Lab_Report_ January-March_2017.pdf (дата обращения 19.05.2017).
3. Щербаков А.В. Молекулярная эпизоотология ящура в России (Филогенетический анализ Российских изолятов вируса ящура) // Ветеринария сегодня. - 2015. - №3 (14). - С. 30-36.
4. Щербаков А.В., Тимина А.М., Зиняков Н.Г. Филогенетический анализ изолятов вируса ящура, вызвавших вспышки болезни в России в 2013 году // Ветеринария. - 2014. - №7. - С. 22-25.
5. Мищенко А.В. Эпизоотологические особенности ящура типа А, вызванного гетерологичными штаммами вируса / А. В. Мищенко, В.А. Мищенко, В.В. Дры-гин [и др.] // Ветеринария. - 2014. - №11. - С. 20-24.
6. Sharma G.K. Comparative evaluation of nonstructural protein-antibody detecting ELISAs for foot-and-mouth disease sero-surveillance under intensive vaccination / G.K. Sharma, J.K. Mohapatra, S. Mahajan [et al] // J. Virol. Methods. - 2014. - V. 207. -P. 22-28.
7. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 7th еd. Paris, 2017.
ro S ro Щ Ci ЧОУДПО«ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ БИОЛОГИИ» г. Санкт-Петербург Курсы повышения квалификации
Ш • Ветеринарная кардиология - 4 ступени • Л абораторная диагностика • Ветеринарная офтальмология • Ветеринарная рентгенология - 2 ступени • [Ветеринарная ультразвуковая диагностика -4 ступени • [Ветеринарная фармация
Предварительная регистрация обязательна! Справки по тел. (812) 612-13-334 или (812) 232-55-92 доб. 208 График проведения и информация на сайте: www.invetbio.spb.ru/seminars.html Лицензия Комитета по образованию Санкт-Петербурга на осуществление образовательной деятельности по образовательным программам дополнительного профессионального образования № 1093 от 04.08.2014 г.
