CC BY
77
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА
УДК 619:578.835.2:57.082.26
Исследование репродукции вируса ящура в клетках ВНК-21/2-17, культивируемых в среде с пониженным содержанием цистина
М.Н. Гусева, кандидат биол. наук, В.В. Михалишин, доктор вет. наук, БЛ. Манин, кандидат биол. наук,
В.Д. Юрчишин (starikov@arriah.ru)
Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных (Владимир)
В статье приведены результаты исследования пролиферации клеток ВНК-21/2-17 в питательной ростовой среде с пониженным содержанием аминокислоты цистин, а также данные по репродукции вируса ящура в этих клетках.
Ключевые слова: аминокилоты, вирус ящура, гидролизат белков крови, клетки ВНК-21, цистин Сокращения: АМК — аминокислоты, ВНИЯИ — Всесоюзный научно-исследовательский ящурный институт, ГБК — гидролизат белков крови, ИП — индекс пролиферации, КМ — культиваторы металлические, КС — культиваторы стеклянные, РСК — реакция связывания комплемента, ТЦД — тканевая цитопа-тическая доза
Введение
В последнее время клетки млекопитающих все больше используются в промышленных технологиях, а различным аспектам культивирования уделяется значительное внимание.
В своих исследованиях Игл и соавт. установили, что для роста и деления клеток позвоночных вне организма необходимы 13 АМК (изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, треонин, триптофан, валин, аргинин, глютамин, гистидин, тирозин, цистин) [4, 9], а для роста клеток в живых организмах — первые 8 АМК. Все АМК участвуют в биосинтезе разнообразных белков, в том числе ферментов, а также нуклеиновых кислот. Выполнение АМК той или иной функции in vitro во многом зависит от условий культивирования. Одна из причин, по которой в среду для культивирования необходимо дополнительно вводить пять АМК, которые не требуются для целостного организма, — это ограниченный их синтез в культуре [3].
Почти все белки включают в себя серосодержащие АМК. Последние участвуют не только в биосинтезе полипептидов, но и в формировании вторичных и третичных белковых структур, поэтому полное их отсутствие ведет к дегенеративным изменениям клеток. Содержат серу три АМК: цистин, цистеин и метионин [4, 8].
В питательную среду серу обычно добавляют в форме одного из неорганических веществ, в частности сульфата, или в виде цистеина либо метионина. При аэробных условиях цистеин почти целиком превращается в цистин, который способен заменять цис-теин [1, 5].
Суспензионные клеточные культуры проходят характерные стадии роста, или фазы: лаг-фазу, фазу логариф-
мического роста, стационарную и логарифмического отмирания. В первой стадии, как правило, количество клеток уменьшается, во второй популяция клеток увеличивается (стадия логарифмического роста), в третьей количество клеток не увеличивается (стационарная). Если культивирование продолжить, то обнаружится уменьшение численности клеток — фаза логарифмического отмирания (фаза разрушения) [4, 8].
Вирус ящура хорошо репродуцируется в клетках, находящихся в стационарной фазе, то есть в суспензии, в которой отсутствуют митозы [1, 6]. Так как культивируемые клетки нуждаются в большом количестве таких АМК, как цистин и глутамин, то, вероятно, изменение их концентрации в ростовой питательной среде может повлиять на сроки наступления стационарной фазы, следовательно, ослабить клетки и улучшить репродукцию в них вируса. По «Промышленному регламенту» в питательную среду для роста клеток добавляют АМК, витамины, соли и до 0,25 % по сухому остатку ГБК, который содержит различные АМК, в том числе цистин 1,0...4,8 мг/л в зависимости от серии изготовления ГБК. Сухой цистин вносят дополнительно из расчета 0,032 г/л.
Цель исследования
Изучить пролиферацию клеток ВНК-21/2-17 в питательной ростовой среде с пониженным содержанием цис-тина, а также репродукцию вируса ящура в них.
Материалы и методы
В работе использовали: клетки ВНК-21/2-17; КС рабочим объемом до 30 л; КМ рабочим объемом до 1800 л; стандартную питательную среду для выращивания клеток (рН 7,2), изготовленную согласно «Промышленному регламенту на производство вакцины против ящура различных типов», с пониженным содержанием цистина, который поступал только из ГБК (опыт); стандартную питательную среду для выращивания клеток (рН 7,2), изготовленную согласно «Промышленному регламенту на производство вакцины против ящура различных типов» (контроль).
Исследование репродукции вируса ящура в клетках ВНК-21/2-17, культивируемых в среде с пониженным содержанием цистина
Рис. 1. Клетки ВНК-21/2-17, выращенные Рис. 2. Клетки ВНК-21/2-17, выращенные в среде с пониженным содержанием цистина, в среде со стандартным количеством цистина, объектив х 40 объектив х 40
Суспензионную культуру клеток выращивали и заражали вирусом также согласно «Промышленному регламенту». Для заражения клеток использовали культуральный вирус ящура штаммов: «A №2045/Киргизия/2007», «Азия-1 Шамир/Израиль 3/89», «О/Пан Азия-2», «0/№2102 Забайкальский/2010».
Количество общего вирусного белка и компонентный состав устанавливали согласно «Методике определения содержания вирусспе-цифического белка и компонентного состава вируса ящура с помощью количественной РСК», утвержденной директором ВНИЯИ в 1987 г
ИП рассчитывали как отношение конечной концентрации клеток к исходной в одном пассаже.
Цитохимическую морфологию клеток ВНК-21/2-17 изучали с помощью люминесцентного микроскопа МЛ-2Б. Нативные препараты окрашивали 0,001%-м раствором акридинового оранжевого. Фотографировали камерой Leica на микроскопах Zeiss, Olimpus, Leica.
Результаты
На первых этапах работы выращивали клетки ВНК-21/2-17 (два пассажа) в КС. ИП в контрольной среде составил 3,78±0,325, в опытной — 2,75±0,233, что существенно ниже (р< 0,05, при n=6). Выращенные в различных средах клетки охлаждали и отстаивали согласно Регламенту Заражали штаммом вируса ящура «0/№2102 Забайкальский/2010» в дозе 0,2 ТЦД50/ клетка.
Результаты репродукции вируса приведены в таблице 1. Количество иммуногенных компонентов с 1 млн клеток в опыте в среднем составило
0,37±0,015 мкг/мл, в контроле — 0,23±0,015 мкг/мл, что существенно ниже (р < 0,005), причем определяли только 1468-компонент.
На следующем этапе эксперимента выращивали клетки ВНК-21/2-17 на двух средах (с добавлением цистина и без него) в КМ (один и два пассажа). Установили, что на протяжении одного пассажа при дефиците цистина клетки росли менее интенсивно. Так, ИП клеток в контрольной среде (число опытов 18) составил 5,50±0,234, в опытной (n=4) — 3,44±0,235, что ниже в 1,6 раза, то есть различия существенны (р < 0,01).
Вирус ящура разных штаммов, выращенный в полученных клетках, различался по количеству им-
муногенных компонентов на 1 млн клеток (табл. 2). Количество вирусспецифического белка с 1 млн клеток было выше в 1,2.. .1,6 раза в клетках, выросших в опытной среде, чем в клетках на среде со стандартным количеством цистина (р < 0,01).
При выращивании клеток ВНК-21/2-17 в КМ на среде с дефицитом цистина уже на протяжении двух пассажей ИП составил 2,96±0,511, в контрольной среде — 5,96±0,240, что выше в 2 раза, различия существенны (р < 0,01). Таким образом, чем больше число пассажей в среде с ограниченным количеством цистина, тем ИП ниже: различие по ИП с контролем в одном пассаже с низким количеством цистина составило 1,5 раза, в двух — уже 2 раза.
При репродукции вируса ящура в клетках на протяжении двух пассажей в среде с дефицитом цисти-на количество вирусспецифического белка с 1 млн клеток было выше в 1,8 раза, чем в контроле (табл. 3). При репродукции вируса в клетках, выросших с пониженным содержанием цистина, количество иммуногенных компонентов с 1 млн клеток составило 0,72±0,04 мкг/мл, в контрольных — 0,40±0,037 мкг/мл.
При цитохимическом исследовании клеток выявили, что отношение объема клетки к объему ядра (в данном случае мы ориентировались на площадь) изменилось. При уменьшении количества цистина при культивировании клеток объем цитоплазмы увеличился в среднем на 1/3 (рис. 1, 2).
Обсуждение и выводы
В результате проведенных исследований установлено, что при дефиците цистина клетки ВНК-21/2-17 растут менее интенсивно, ИП отличается от контроля в 1,37; 1,50 и 2,00 раза в зависимости от системы культивирования и числа пассажей в средах с пониженным содержанием цистина; однако количество иммуно-генных компонентов с 1 млн клеток в них гораздо выше (в 1,2.1,8 раза).
1. Влияние состава ростовых питательных сред на репродукцию вируса ящура в КС
Количество вирусного белка, мкг/мл
Среда № опыта клеток, млн/мл После инакт. и очистки 146 S 146 S с 1 млн клеток пораженных клеток, % вируса, ч
1 2,54 0,98 0,88 0,35 87 11
2 2,10 1,00 0,85 0,40 85 12
Опытная 3 3,16 1,38 1,14 0,36 76 18
Среднее значение, M±m 2,60±0,307 p < 0,05 1,12±0,10 p < 0,05 0,96±0,092 p < 0,05 0,37±0,015 p < 0,005 83±3,388 p < 0,005 13,7±2,19 p < 0,05
1 2,19 0,82 0,57 0,26 91 11
2 2,3 0,67 0,51 0,22 87 12
Контрольная 3 3,4 1 0,73 0,21 77 18
Среднее значение, M±m 2,63±0,386 p < 0,05 0,83±0,095 p < 0,05 0,60±0,066 p < 0,05 0,23±0,015 p < 0,005 85±4,163 p < 0,005 13,7±2,19 p < 0,05
М.Н. Гусева, В.В. Михалишин, Б.Л. Манин, В.Д. Юрчишин
2. Влияние состава ростовых питательных сред на репродукцию вируса ящура в КМ
Количество вирусного белка, мкг/мл Количество
Среда Концентрация клеток млн/мл После инактивации 146+75 S и очистки 5 146+75Sс 1 млн.клеток пораженных клеток, % Время репродукции вируса, ч
A №2045/Киргизия/2007
Опытная 3,2±0,27 2,95±0,038 2,54±0,043 0,81±0,052 90,8±0,75 10,6±0,63
n=4 р< 0,005 р< 0,001 р< 0, 001 р< 0,001 р< 0,001 р< 0,001
Контрольная 4,2±0,14 3,16±0,125 2,72±0,117 0,66±0,035 85,5±2,88 12,3±0,48
n=8 р< 0,001 р< 0,001 р< 0,001 р< 0,001 р< 0,001 р< 0,001
Азия-1 Шамир/Израиль 3/89
Опытная 3,1±0,26 2,55±0,245 2,30±0,236 0,84±0,035 90,4±0,40 10,8±0,37
n=5 р< 0,001 р< 0,001 р< 0,001 р< 0,001 р< 0,001 р< 0,001
Контрольная 4,6±0,05 2,93±0,640 2,42±0,436 0,53±0,094 91±1,0 10,3±0,25
n=4 р< 0,001 р< 0,05 р< 0,05 р< 0,05 р< 0,001 р< 0,001
О Пан-Азия-2
Опытная 3,4±0,113 2,69±0,087 2,21±0,084 0,66±0,049 87,5±1,31 12,8±0,57
n=8 р< 0,001 р< 0,001 р< 0,001 р< 0,001 р< 0,001 р< 0,001
Контрольная 3,8±0,20 2,17±0,157 1,91±0,135 0,51±0,022 90,7±0,45 11,2±0,29
n=10 р< 0,001 р< 0,001 р< 0,001 р< 0,001 р< 0,001 р< 0,001
3. Репродукция вируса ящура в клетках ВНК-21/2-17, выращиваемых в КМ в среде с пониженным содержанием цистина на протяжении двух пассажей
Опытная
Концентрация клеток, млн/мл Количество вирусного белка, мкг/мл Время репродукции вируса, ч
№ После инактивации и очистки 146+75S 146+75S с 1 млн. клеток пораженных клеток, %
1 2,9 3,14 2,59 0,89 90 10
2 2,9 2,15 1,94 0,67 92 10
3 2,9 2,15 1,94 0,67 90 11,5
4 2,6 2,15 1,94 0,75 90 11
5 3,1 2,55 2,27 0,73 90 11
6 3,6 2,55 2,27 0,63 90 11
Среднее значение, M±m 3,0±0,26 р < 0,001 2,45±0,159 р < 0,001 2,16±0,109 р < 0,001 0,72±0,04 р < 0,001 90,3±0,33 р < 0,001 10,75±0,25 р < 0,001
1 4,5 1,6 1,45 0,32 90 10
2 4,5 2,07 1,93 0,43 94 11
3 3,8 2,04 1,42 0,37 90 10
4 3,5 1,94 1,71 0,49 92 13
Среднее значение, M±m 4,1±0,25 р < 0,001 1,91±0,108 р < 0,001 1,63±0,120 р < 0,001 0,40±0,037 р < 0,005 91,5±0,96 р < 0,001 11±0,71 р < 0,001
Контрольная
Среда
При цитохимическом исследовании клеток выявлено, что отношение объема клетки к объему ядра изменилось. При уменьшении количества цистина при культивировании клеток объем цитоплазмы был увеличен в среднем на 1/3. Из этих наблюдений можно сделать вывод: так как основная биосинтетическая активность данной клеточной культуры направлена на синтез нуклеиновых кислот и ядерных мембран, то, вероятно, синтез цитоплазматических белков замедлен, и в интерфазе он не набирает необходимого объема для репродукции вирусов [4].
Таким образом, клеточная линия ВНК-21/2-17 при оптимальных условиях культивирования, согласно «Промышленному регламенту на производство вакцины против ящура различных типов», обладает высокой пролиферативной активностью. Очевидно, динамика пролиферации настолько высока, что синтез ДНК клеток опережает синтез структурных белков [4, 6]. Вероятно, этим объясняется тот факт, что накопление вирусспецифических компонентов с 1 млн клеток при репродукции ящура активнее происходит в клетках, выросших в среде с пониженным содержанием цистина.
Библиография
1. Адамс, Р. Методы культуры клеток для биохимиков / Р. Адамс. — М.: Мир, 1983. — 263 с.
2. Голубев, Д.Б. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. / Д.Б. Голубев, А.А. Соминина, М.Н. Медведева. — Л.: Медицина, 1976. — 224 с.
3. Дьяконов, Л.П. Культивирование клеток и тканей животных / Л.П. Дьяконов, В.Ф. Глухов, А.А. Поздняков, Г.Ф. Денисенко, Т.П. Калмыкова. — Ставрополь: Ставроп. Правда, 1988. — Ч.2. — 91 с.
4. Животная клетка в культуре / Под. ред. Л.П. Дьяконова. — М.: Спутник +, 2009. — 652 с.
5. Культура животных клеток. Методы. / Под ред. Р. Фрешни. — М.: Мир, 1989. — 333 с.
6. Манин, Б.Л. Параметры биологической толерантности производственной клеточной культуры ВНК-21/01 / Б.Л. Манин, В.В. Михалишин, Т.И. Корпусова и др. // Ветеринарна медицина. — 2002. — Віп. 80. — С. 404-408.
7. Сергеев, В.А. Культуры клеток в ветеринарии и биотехнологии / В.А. Сергеев, Ю.А. Собко. — Киев: Урожай, 1990. — 150 с.
8. Ченцов, Ю.С. Введение в клеточную биологию / Ю.С. Ченцов. — М.: Академкнига, 2004. — 495 с.
9. Eagle, H. Nutrition needs of mammalian cells in tissue culture / H. Eagle // Sciens.. — 1955 — Т. 122. — N. 3168. — Р. 501-514.
SUMMARY
M.N. Guseva, V.V. Mikhalishin, B.L. Manin, V.D. Yurchishin
Federal Centre for Animal Health (Vladimir)
Study of FMD Virus Reproduction in ВНК-21/2-17 Cells Cultured in Low Cystine Medium. The results of study of ВНК-21/2-17 cell proliferation in nutrient growth medium with low cystine content and data on FMDV reproduction in such cells are presented.
