Сравнительный анализ активности гидролизатов белков крови Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

DOI: 10.24411/2074-5036-2019-10021 УДК 619: 612.124:57.082.26.

Ключевые слова: биологическая активность гидролизата белков крови, аминный азот, полипептиды, интенсивность прироста клеток

Key words: biological activity of blood protein hydrolysate, amino nitrogen, polypeptides, intensity of cell population growth

М.Н. Гусева, М.А. Шевченко, М.И. Доронин, Д.В. Михалишин, О.Е. Федорова, Н.Д. Клюкина

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ АКТИВНОСТИ ГИДРОЛИЗАТОВ БЕЛКОВ КРОВИ

COMPARATIVE ANALYSIS OF BLOOD PROTEIN HYDROLYSATE ACTIVITY

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), 600901, Россия, г. Владимир, мкр. Юрьевец Federal State-Financed Institution "Federal Centre for Animal Health" (FGBI "ARRIAH"), 600901, Russia, Vladimir, mcr. Yur'evets

Гусева Марина Николаевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, ФГБУ "ВНИИЗЖ". E-mail: [email protected] Guseva Marina Nickolayevna, Candidate of Science (Biology), Senior Researcher, FGBI "ARRIAH".

E-mail: [email protected] Шевченко Максим Александрович, ведущий ветеринарный врач, ФГБУ «ВНИИЗЖ».

E-mail: [email protected] Shevchenko Maxim Alexandrovich, Leading Veterinarian, FGBI "ARRIAH". E-mail: [email protected] Доронин Максим Игоревич, кандидат биологических наук, научный сотрудник ФГБУ "ВНИИЗЖ".

E-mail: [email protected] Doronin Maxim Igoryevich, Candidate of Science (Biology), Researcher, FGBI "ARRIAH".

E-mail: [email protected] Михалишин Дмитрий Валерьевич, кандидат ветеринарных наук, заведующий лабораторией профилактики ящура, ФГБУ "ВНИИЗЖ". E-mail: [email protected] Mikhalishin Dmitry Valeryevich, Candidate of Science (Veterinary Medicine), Head of Laboratory for FMD Prevention,

FGBI "ARRIAH". E-mail: [email protected] Федорова Ольга Евгеньевна, аспирант, технолог 1 категории, ФГБУ «ВНИИЗЖ». E-mail: [email protected] Fedorova Olga Yevgenyevna, PhD Student, Category 1 Technologist, FGBI "ARRIAH". E-mail: [email protected] Клюкина Надежда Дмитриевна, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник, ФГБУ «ВНИИЗЖ».

E-mail: [email protected]

Klyukina Nadezhda Dmitrievna, Candidate of Science (Veterinary Medicine), Senior Researcher, FGBI "ARRIAH".

E-mail: [email protected]

Аннотация. В статье приведен сравнительный анализ биологической активности серий гидролизата белков крови (ГБК), полученных для использования в производстве противоящурных вакцин в 2017-2018 гг. При исследовании активности ГБК в концентрации 0,25% высокоактивными признаны 67 серий (46%), удовлетворительными -79 серий (54%). Всего одна серия (0,7%) была выбракована. Высокая токсичность серий гидролизата не выявлена. Количество аминного азота в исследуемых образцах варьировало от 0,94 до 1,12±0,02%. Было отмечено, что его количество влияло на пролиферацию клеток ВНК-21.

Массовая доля сухого остатка в продуктах гидролиза белков крови колебалась от 9,49 до 10,2±0,07%. Содержание полипептидов находилось в диапазоне от 39,98±1,53 до 48,00. При исследовании влияния данного количества полипептидов на рост клеток линии ВНК-21 существенные различия не обнаружены.

Практически все серии гидролизата белков крови, поступившие для производства противоящурных вакцин, были не токсичны, пригодны для выращивания клеток ВНК-21 и обладали высоким или удовлетворительным уровнем биологической активности.

Summary. The article represents the results of the comparative analysis of biological activity of blood protein hydrolysate (BPH) batches produced for FMD vaccine formulation in 2017-2018. Tests of 0.25% BPH demonstrated high activity in 67 batches (46%) and satisfactory activity in 79 batches (54%). Only one batch (0.7%) was discarded. No high toxicity of hydrolysate batches was identified.

The amino nitrogen content in the tested samples varied from 0.94 to 1.12±0.02%. Its amount was demonstrated to have an effect on BHK-21 cell proliferation. The dry residue mass fraction in blood protein hydrolysate products ranged from

9.49 to 10.2±0.07%. The polypeptide content ranged from 39.98±1.53 to 48.00. Studies of the effect of such polypeptide amount on BHK-21 cell growth did not demonstrate any significant differences.

Nearly all batches of blood protein hydrolysate supplied for FMD vaccine production were non-toxic and suitable for BHK-21 cell growth. They also demonstrated high or satisfactory level of biological activity.

Введение

В последнее время в клеточной биотехнологии четко определено и интенсивно развивается направление, связанное с конструированием питательных сред, содержащих в качестве ростовой аминокислотной пептидной составляющей гидролизаты белкового сырья [3, 8, 9].

Белковые гидролизаты представляют собой продукты расщепления белка до аминокислот, ди- и трипептидов. Гидролизаты обычно содержат 16-20 аминокислот в вариабельной концентрации, а также пептиды разной молекулярной массы [3].

Предложено много препаратов этой группы. Большинство из них получено путем глубокого расщепления протеина до аминокислот при воздействии на сырье концентрированных кислот. Известны три метода гидролиза белков — кислотный, щелочной, энзимный (ферментативный). При всех этих видах гидролизации полипептиды расщепляется на составные части, однако продукты гидролиза различны.

Кислотный и щелочной гидролиз осуществляется в процессе кипячения белка с концентрированными растворами кислот и щелочей. Эти способы гидролиза являются грубыми и часто вызывают рацемизацию аминокислот (превращение природных L-форм в неусваиваемые организмом D-формы), разрушение ароматических аминокислот, их частичное дезаминирование (отщепление NH2-группы от аминокислоты) и, как следствие, ослабление или потерю биологической и физиологической ценности, а также снижение фармакологической активности аминокислот [5, 7].

В отличие от кислотного и щелочного ферментативный гидролиз, протекающий при умеренной температуре (37-55°С), мягко воздействует на белок, не вызывая рацемизацию аминокислот и разрушение триптофана. Кроме того, он обеспечивает сохранность биологически активных веществ (витаминов,

нуклеиновых и желчных кислот). Учитывая, что ферментативный гидролиз протекает медленно, требуется гораздо больше времени для получения препарата, лишенного нативного белка, полипептидов и пептидов. Ферментативные гидролизаты получают, инкубируя белковое сырье (казеин, кровь, фибрин) с протеолитическими ферментами. При этом не всегда удается полностью расщепить протеины в этих условиях. По этой причине введение во внутреннюю среду организма в медицинских целях ферментных гидролизатов часто сопровождается анафилактическими реакциями, а также развитием микрофлоры и выделением токсических продуктов при использовании в области биотехнологии [4, 7].

В нашей стране широко используются ги-дролизаты из белков крови животных, главным образом, крупного рогатого скота (КРС). Кровь является лучшим сырьем, поскольку содержит 18 % полноценного белка, а также минеральные вещества, которые остаются в готовом препарате [3].

Ферментативный гидролиз белков крови включает в себя несколько критических этапов, которые могут достаточно сильно влиять на химические и биологические свойства конечного продукта:

- точность расчета необходимого количества железы и ее свежесть;

- использование при остановке процесса концентрированного раствора соляной кислоты;

- внесение хлористого кальция для коагуляции и осаждения крупномолекулярных продуктов гидролиза и гемовых пигментов;

- удаление избытка СаС12 путем введения в гидролизат двузамещенного фосфата натрия;

- применение хлороформа в качестве бак-териостатика.

Малейшие отклонения в силу различных причин от технологического процесса могут привести к появлению токсичности гидро-

23

лизата белков крови, снижению ростовых свойств питательных сред, в составе которых используется ГБК вплоть до гибели клеток [1, 6]. По этим причинам в биотехнологическом производстве важен контроль входящего сырья, в данном случае, оценка качества серий ГБК.

Целью исследования был сравнительный анализ химической и биологической активности серий гидролизата белков крови, полученных в 2017-2018 гг.

Материалы и методы

Клеточная линия. В работе использовали суспензионную клеточную линию из почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21) с 1 и 2 пассажей и концентрацией не ниже 3,0х106 кл/см3.

Среда для культивирования клеток. Для выращивания клеток линии BHK-21 применяли культуральную среду на основе раствора Хэнкса, содержащую необходимый для роста клеток набор солей, аминокислот, витаминов, в сочетании с 5 % фетальной сыворотки крови КРС фирмы SERANA, инактивированной при температуре 56°С в течение 30 минут, а также исследуемый ГБК. Стерилизацию ГБК проводили паровоздушным методом путем автоклавирования при температуре (132±2)°С, при давлении 0,2 МПа в течение 1 ч.

Определение биологической активности гидролизатов белков крови.

Выращивание клеток осуществляли в куль-туральных флаконах с приготовленным раствором питательной среды и посевной концентрацией клеток 0,4-0,7х106 кл/см3. Для оценки биологической активности ГБК тестировали в двух концентрациях: 0,25 и 0,50% по сухому веществу. Инкубацию клеток осуществляли в стеклянных культиваторах, помещенных в термостатируемый шейкер Incubation Schuttelschrank BS 4 со скоростью перемешивания суспензии 150±5 об/мин и при температуре 37,0±0,5°С. Показатель кислотности клеточной суспензии поддерживали в диапазоне 7,0-7,2 с использованием стерильного 7,5%-ого раствора гидрокарбоната натрия. Пересев клеток проводили через каждые 48 ч в течение 5 последовательных пассажей.

Оценка интенсивности прироста клеток. Концентрацию клеток ВНК-21 в суспензии определяли с помощью камеры Горяева для счета форменных элементов крови. Количество клеток в 1 см3 суспензии рассчитывали по формуле [2]:

Х=

АВ-4000 3 600

х1000, где

Х - количество клеток в 1 см3,

А - общее количество клеток в камере,

В - разведение суспензии.

Увеличение концентрации клеток оценивали по интенсивности прироста (ИП), пользуясь формулой:

ИП= а/Ь, где

а - концентрация клеток через 48 ч после посева,

Ь - посевная концентрация клеток.

Интерпретация результата исследования биологической активности ГБК. Оценка качества гидролизата белков крови по значению ИП проводилась следующим образом:

- если среднее значение ИП за пять пассажей составляло 4,5-5,0, то ГБК считали биологически активным;

- если ИП находилось в диапазоне от 3,0 до 4,5, то гидролизат считали удовлетворительным;

- если ИПср ниже 3,0, то ГБК выбраковывался.

Токсичность гидролизата белков крови оценивали следующим образом: если на протяжении пяти последовательных пассажей клетки ВНК-21 оставались живыми (в 4 и 5 пассаже допускалось не менее 60%), то такой ГБК считался нетоксичным.

В противном случае ГБК выбраковывали.

Исследование химической активности ГБК. Массовые доли сухого остатка, амин-ного азота и полипептидов определяли согласно ТУ 100913791 от 1991 г.

Статистическая обработка данных. Для статистической обработки полученных результатов вычисляли значение средней арифметической и ее ошибку. Степень различия между средними значениями двух выборок оценивали с помощью критерия Стьюд ента (1). Уровень значимости отражал степень достоверности полученных данных и показы-

24

вал вероятность случайного возникновения исследуемых показателей [2]. Цифровой материал статистически обрабатывали на персональном компьютере общепринятыми методами вариационной статистики с использованием программы Microsoft Excel.

Таблица 1

Биологическая активность различных серий ГБК

в течепле гида было исследовано 146 серий глдроллзатов белков кровл. При анализе биологической активности ГБК в концентрации 0,25% интенсивность прироста клеток в пяти последовательных пассажах, равную 4,5-5,0, имели 67 серий (46%), ИП 3,0-4,5 -79 серий (54%). Всего одна серия (0,7%) ГБК имела среднюю интенсивность прироста, равную 3,0. При исследовании ГБК в концентрации 0,50% ИП свыше 4,5 имели 95 серий (65%), ИП 3,0-4,5 - 46 серий (31,5%), ИП ниже 3,05 (3,5%) - 5 серий. Результаты исследований отражены на рисунке 1 и в таблице 1.

Содержание ГБК, % Количество серий

ИП

свыше 4,5 3,0-4,5 ниже 3

0,25 67 (46%) 79 (54%) 1 (0,7)

0,50 95 (65%) 46 (31,5%) 5 (3,5%)

Рис. 1. Биологическая активность 146 серий гидролизата белков крови

илице 1.

В более ранних исследованиях был проведен анализ различных серий ГБК согласно ТУ 100913791 от 1991 г. [9]. Серии ГБК

проверяли на количество сухого остатка

ГО/Л а.„„т,,^ ппато ГО/Л „А|„„,л,|., „ ГО/

%), аминного азота (%), полипептидов Было отмечено, что количество аминного

азота влияло на пролиферацию клеток линии ВНК-21. Так, при концентрации аминно-го азота до 1,0 % индекс пролиферации составлял 4,88±0,13 (п=166), свыше 1,0 % -4,45±0,13 (п=134). Для всех указанных групп различия существенны (р<0,001). При иссле-

Рис. 2. Зависимость интенсивности прироста клеток ВНК-21 от концентрации сухого остатка в ГБК

Таблица 2

Зависимость интенсивности прироста клеток линии ВНК-21 от химических показателей ГБК (сухого остатка, аминного азота, количества полипептидов)

Концентрация ГБК, % Интенсивность прироста

свыше 4,5 3,0-4,5 ниже 3

показатели химического анализа

Сухой остаток (%) Амин- ный азот (/%) % полипептидов Сухой остаток (%) Амин-ный азот (/%) % полипептидов Сухой остаток (%) Амин-ный азот (/%) % полипептидов

0,25 M 10,20 1,12 41,32 9,92 1,08 42,29 9,49 0,94 48

m 0,07 0,02 1,21 0,09 0,08 0,96 0 0 0

N 67 67 67 79 79 79 1 1 1

0,50 M 9,90 1,12 39,98 9,92 0,98 42,73 9,66 0,96 41,8

m 0,23 0,02 1,53 0,1 0,02 0,84 0,15 0,04 3,44

N 46 46 46 95 95 95 5 5 5

довании влияния количества полипептидов на рост клеток линии ВНК - 21, существенные различия обнаружены не были [9].

Аминный азот в ГБК (%) - азот, входящий в свободные аминогруппы -ЫН2 аминокислот и других продуктов гидролиза белков. Его определяют при изучении активности протеолитических ферментов, состава форм азотистых соединений в сырье, полупродуктах и готовой продукции [3].

Аминокислоты служат донорами аминно-го азота при синтезе всех азотсодержащих небелковых соединений: нуклеотидов, гема, креатина, холина и других веществ [3].

При сравнении биологической активности ГБК и его химических показателей также выявили зависимость между количеством аминного азота и интенсивностью прироста клеток. Так, при ИП свыше 4,5 количество аминного азота было 1,12±0,02 %, а при ИП ниже 3,0 - 0,94-0,96 % (различия существенны, р<0,001). Результаты анализа представлены в таблице 2 и на рисунке 3.

Таким образом, можно предположить, что азот, входящий в свободные аминогруппы -МН2 аминокислот и других продуктов гидролиза белков, является важным элементом для питания и роста клеточной популяции.

Полипептиды в ГБК (%) - полимеры, состоящие из остатков аминокислот, связанных между собой пептидными связями. Условно считается, что полипептиды - это полимеры, содержащие от 50 аминокислотных остатков с молекулярной массой более 5000-10000 Да [3].

В исследуемых сериях ГБК количество полипептидов колебалось от 39,98±1,53 до 48 % (таблица 2, рисунок 4), данное содержание пептидов не влияло на интенсивность прироста клеточной популяции.

Сухой остаток в ГБК (%) — высушенные компоненты, остающиеся после выпаривания 1 дм3 гидролизата белков крови. Данный показатель характеризует общее содержание примесей, как растворенных, так и взвешенных, без газов и летучих веществ [3].

При сухом остатке свыше 10% интенсивность прироста возрастала при использовании ГБК в концентрации 0,25%. Так, при ИП свыше 4,5 сухой остаток составлял 10,20%,

Рис. 3. Зависимость интенсивности прироста клеток ВНК-21 от количества аминного азота в ГБК

Рис. 4. Зависимость интенсивности прироста клеток ВНК-21 от содержания полипептидов в ГБК

а при ИП 4,5 и ниже - 9,49-9,90% (таблица 2, рисунок 2).

При использовании ГБК в концентрации 0,50% существенные различия не были обнаружены. Вероятно, при использовании ГБК в большей концентрации влияние на рост и развитие клеток оказывала небольшая токсичность препарата. Токсичность ГБК при использовании в концентрации 0,50% проявлялась в увеличении числа мертвых клеток (иногда до 20%) на этапе 4-5 пассажей. В методических рекомендациях по оценке биологической активности гидролизата белков крови допускается присутствие на этих пассажах до 40% мертвых клеток. В этом случае серию гидролизата можно использовать в производственных целях.

Заключение

Провели исследование 146 серий ги-дролизата белков крови. Установили, что при оценке биологической активности ГБК

26

в концентрации 0,25% высокоактивными были признаны 67 серий (46%), удовлетворительными - 79 серий (54%). Всего одна серия (0,7%) была выбракована. Высокая токсичность серий гидролизата не была выявлена.

Количество аминного азота варьировало от 0,94 до 1,12±0,02%. Выявили зависимость между количеством аминного азота в ГБК и интенсивностью прироста клеток линии ВНК-21.

Процент сухого остатка в ГБК колебался от 9,49 до 10,2±0,07%. Было замечено, что при количестве сухого остатка свыше 10% интенсивность прироста клеток возрастала при использовании ГБК в концентрации 0,25%. При содержании ГБК в питательной среде с концентрацией 0,5% существенные различия не были обнаружены.

В исследуемых сериях ГБК процент полипептидов колебался от 39,98±1,53 до 48%. Данное количество пептидов не влияло на интенсивность прироста клеточной популяции.

Таким образом, серии ГБК, поступившие для производства противоящурных вакцин, практически все были пригодными

(Л 1 (Л

ц ф

а

для использования в питательных средах, не токсичны и обладали высоким или удовлетворительным уровнем биологической активности.

Список литературы

1. Гидролизат белков крови ферментативный. Технические условия. / СТО 63462173-0002-2010. - Владимир, 2010.

2. Гланц С. Медико-биологическая статистика. -М.: Практика, 1999. - 459 с.

3. Животная клетка в культуре (Методы и применение в биотехнологии) / под ред. Л.П. Дьяконова. -М.: Компания Спутник+, 2009. - 656 с.

4. Нельсон Д., Кокс М. Основы биохимии Ленин-джера. Т. 1. Основы биохимии, строение и катализ. -М.: Бином, 2011. - 633 с.

5. Нельсон Д., Кокс М. Основы биохимии Ленин-джера. Т. 2. Биоэнергетика и метаболизм. - М.: Бином, 2011. - 694 с.

6. Технологический Регламент на производство ги-дролизатов белков крови. - Владимир, 1991. - 124 с.

7. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии: Учеб. для хим. и биол. спец. пед.ун-тов. - М.: Агар, 1999. - 512 с.

8. Фрешни Р.Я. Культура животных клеток. Практическое руководство. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2011. - 691 с.

9. Юрчишин В.Д., Михалишин В.В., Гусева М.Н. Влияние сроков хранения гидролизатов белков крови на пролиферативную активность ВНК-21/2-17 и репродукцию вируса ящура // Ветеринария и кормление. -2011. - № 6. - С. 51-53.

ВЕТЕРИНАР,

Всё о ветеринарии для врачей и владельцев животных

форум

последние новости подборка статей справочники

каталог лекарственных средств адреса ветклиник и зоомагазинов информация о выставках и конференциях анонсы ветеринарных журналов

Заходите на www.veteriпаr.ru, и Вы найдёте много интересной и полезной информации!

Приглашаем к сотрудничеству ветеринарных врачей и организации, e-mail: invet(a>inbox.ru boldvreva(a>mai[.ru тел.: 8 (909) 646-76-43, 8 (916) 181-95-58