Влияние срока хранения на инфекционную активность клеточно-ассоциированного вируса болезни Марека Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

УДК 619:616.98:578.825.1:615.371

Ключевые слова: вирус болезни Марека, вирус герпеса кур, вирус герпеса индеек, инфекционная активность

Key words: Marek's disease virus, chicken herpesvirus, turkey herpesvirus, infectivity

Ханюкова Е. Ю., Шустова М. А., Пяткина А. А., Мельников В. П.

ВЛИЯНИЕ СРОКА ХРАНЕНИЯ НА ИНФЕКЦИОННУЮ АКТИВНОСТЬ КЛЕТОЧНО-АССОЦИИРОВАННОГО ВИРУСА БОЛЕЗНИ МАРЕКА

RELATIONS BETWEEN INFECTIVITY OF CELL-ASSOCIATED MAREK 'S DISEASE VIRUS AND ITS STORAGE PERIOD

ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ») Адрес: 600901, Россия, г. Владимир, мкр. Юрьевец

FGBI "Federal Centre for Animal Health" (FGBI "ARRIAH"). Address: 600901, Russia, Vladimir, Yur'evets

Ханюкова Елена Юрьевна, аспирант, вед. биолог. E-mail: Elena.Urjevna@gmail.com

Hanukova Elena Yu., Postgraduate, Leading Biologist. E-mail: Elena. Urjevna@gmail.com Шустова Мария Алексеевна, аспирант, вед. биолог. E-mail: Shustova@arriah.ru Shustova Maria A., Postgraduate Leading, Biologist. E-mail: Shustova@arriah.ru Пяткина Алла Александровна, к. б. н., ст. научн. сотрудник. E-mail: Pyatkina@arriah.ru Pyatkina Alla A., Ph.D. in Biology Science, Senior Research Scientist. E-mail: Pyatkina@arriah.ru Мельников Владимир Петрович, к. в. н., вед. научн. сотрудник. E-mail: Melnikov@arriah.ru Melnikov Vladimir P., Ph.D. in Veterinary Science, Leading Research Scientist. E-mail: Melnikov@arriah.ru

Аннотация. Установили, что хранение вакцинных штаммов вирусов болезни Марека (ВБМ), герпеса кур (ВГК) и герпеса индеек (ВГИ) в жидком азоте в течение более 24 месяцев приводит к значимым потерям инфекционной активности вирусов. Было подтверждено, что состояние «клеток-хозяев» определяет активность вируса БМ. При гибели клеток, вероятно, происходило повреждение вирусных частиц, в результате чего они теряли инфек-ционность.

Summary. It was found that storing of Marek's disease virus strains as well as chicken and turkey herpesvirus strains in liquid nitrogen within the period exceeding 24 months results in significant decrease of the virus infectivity. It was confirmed that the "host-cells" status determines MDV infectivity. Apparently, when the cells died the viral particles became damaged which resulted in the loss of their infectivity.

Введение

Основной стратегией борьбы с болезнью Марека (БМ) является вакцинопрофи-лактика. В промышленном птицеводстве в основном используются клеточно-ассоци-ированные препараты на основе всех трех серотипов вируса БМ. При этом, несмотря на широкое применение вакцин, в некоторых птицехозяйствах продолжают возникать отдельные вспышки заболевания [2, 3, 5]. Предпосылок для этого может быть множество: иммунодепрессивное состояние птицы, неправильный уход и содержание птицы, некорректные схемы профилактики, а также использование вакцин с недостаточной инфекционной активностью [5, 6].

Целью настоящей работы было изучение изменений инфекционной активности вакцинных штаммов ВБМ, ВГК и ВГИ в процессе хранения.

Материалы и методы

Вирус. Вакцинные производственные штаммы «3004 №» 109-Деп» ВБМ, «SB-1 №№100-Деп» ВГК, «Владимир № 124-Деп» ВГИ.

Культура клеток. Первичную культуру клеток фибробластов эмбрионов кур получали путем трипсинизации 9-суточных SPF-эмбрионов кур фирмы Valo Biomedia (Германия) и выращивали в пластиковых флаконах фирмы Corning (25 см2) при температуре (38,5±1) °С. Образование монослоя происходило в течение 24 ч.

Определение концентрации жизнеспособных клеток. Подсчет проводили в камере Го-ряева. Число клеток в 1 см3 суспензии определяли по формуле:

C = A / n х 2,5 х 105 х в, где С - число клеток в 1 см3 суспензии; А - количество подсчитанных клеток; n - число больших квадратов, участвующих в подсчете;

B - кратность разведения суспензии. Определение инфекционной активности вируса. Инфекционный титр вируса определяли по числу фокусообразующих единиц (ФОЕ) в монослое клеток фибробластов эмбрионов кур, выращенных в пластиковых флаконах. Использовали метод последовательных разведений вируссодержащей суспензии. Для оценки титра вируса устанавливали наименьшее разведение, при котором число ФОЕ было максимальным, без слияния фокусов. Величину титра определяли по следующей формуле:

Т = {[(bj + b2 + ... + bn) / n] x ioa} / V, где Т - титр вируса, ФОЕ/см3; bp b2, ... bn - количество фокусов во флаконе;

n - количество используемых флаконов; V - объем суспензии вируса, внесенный во флакон, см3;

а - показатель степени разведения вирус-содержащего материала.

Растворы и реактивы. Использовали питательную среду, состоящую из равных частей сред 199, Игла и гидролизата лактальбу-мина на солевом растворе Хенкса. К ростовой среде добавляли 10 % сыворотки крови крупного рогатого скота, а для поддерживающей среды концентрация сыворотки составляла 2 %. Величина рН ростовой и поддерживающей сред составляла 6,9-7,2. Для дезагрегации монослоя применяли 0,25 % раствор трипсина на солевом растворе Хенкса.

Обработка результатов экспериментов. Использовали общепринятые методы статистической обработки варьирующих переменных [4]. Вычислительные операции и построение графиков производили с помощью приложения Microsoft Excel.

Результаты исследований

Были взяты образцы клеточно-ассоци-ированных ВБМ, ВГК и ВГИ с различной концентрацией жизнеспособных вируссо-держащих клеток (С0, млн/см3) и инфекционной активностью (Т ^ФОЕ/см3). Пробы хранили в жидком азоте при температуре минус 196 °С в герметично запаянных ампулах. Через заданные интервалы времени (], мес.) в образцах вирусных материалов определяли концентрацию живых клеток (С]) и инфекционный титр вируса (Т]). Наблюдение продолжали в течение 36 месяцев.

Для установления изменений концентрации живых вируссодержащих клеток в продолжение эксперимента в исследуемых материалах определяли величину контраста по типу Д] = С] - С0, где С] - интервальная оценка концентрации живых клеток в исследуемом образце. На основании повторных измерений (п = 4) определяли среднюю оценку контраста ("Д) и соответствующую стандартную ошибку (тД). По результатам отношения типа "Д / тД устанавливали статистическую достоверность средней оценки. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Далее изучали динамику снижения инфекционной активности ВБМ, ВГК и ВГИ. Определяли оценки контраста инфекционного титра ^Т] = Т] - Т0), где Т] - интервальная оценка инфекционного титра вируса. Строили регрессионные модели, отражающие связь величин dТj и продолжительности хранения вируссодержащего образца (]). Полученные результаты представлены на рисунке.

Обсуждение результатов

Приведенные в таблице результаты демонстрируют, что в течение первых 12 месяцев

Таблица 1.

Изменение концентрации живых вируссодержащих клеток в течение 36 месяцев хранения (п = 4)

Вирус А„ = С,2 - С0 А24 = С24 - С А36 = С36 - С

ВБМ -0,08±0,05 -0,53±0,02* -0,95±0,03

ВГК -0,05±0,03 -0,60±0,04 -1,00±0,06

ВГИ -0,02±0,02 -0,58±0,02 -1,05±0,09

Примечание: * - жирным шрифтом выделены значимые оценки "А (р < 0,05).

хранения в жидком азоте концентрация живых вируссодержащих клеток во всех изученных образцах статистически не изменялась (р > 0,05). Достоверное снижение концентрации (р < 0,001) отметили лишь через 24 месяца хранения.

Представленная на рисунке хронология снижения инфекционной активности у всех трех типов вируса была схожей (при данных условиях оценивания соответствующие регрессионные коэффициенты не имели существенных различий). Установили, что инфекционные титры в образцах через 12 и 24 месяцев хранения по отношению к исходным титрам были статистически тождественны (р > 0,05). Достоверное снижение инфекционной активности исследуемых материалов отмечено только через 36 месяцев хранения (р < 0,001).

Заключение

Хранение вакцинных штаммов ВБМ, ВГК и ВГИ в жидком азоте в течение более 24 месяцев приводит к значимым потерям инфекционной активности вирусов. Было подтверждено, что состояние «клеток-хозяев» определяет активность вируса БМ. При гибели клеток, вероятно, происходит повреждение вирусных частиц, в результате чего они теряют инфекционность [4, 5]. Данное обстоятельство следует учитывать как при производстве вакцин против болезни Марека, так и при применении данных препаратов на птицефабриках, обращая внимание на дату их выпуска.

Список литературы

1. Закс, Л. Статистическое оценивание / Л. Закс. - М. : Статистика, 1976. - 598 с.

2. Куляшбекова, Ш. К. Меры борьбы с болезнью Марека с помощью вакцино-

о

ат, ig -0,02

-0,04 -0,С6 -0,08 -0,1

0

dTJg ■0,02

0,04 -0,0« -0,08

-ОД

о

0,02

-0,04

-0,06

-0,08

C

Рис. Диаграммы снижения инфекционной активности трех типов внутриклеточного вируса болезни Марека при хранении в жидком азоте. Распределение оценок контраста инфекционного титра (dTj = Tj - T0) соответственно времени хранения (j, мес.) материалов ВБМ (А), ВГК (B), ВГИ (C). Представлены линейные регрессионные модели (коэффициент детерминации K > 0,75), где 'dT - ожидаемая величина относительного снижения титра соответственно времени хранения вируса (j).

профилактики / Ш. К. Куляшбекова, А. В. Борисов // Сб. науч. тр. «III международный ветеринарный конгресс по птицеводству». -М., 2007. - С. 126-131.

3. Самуйленко, А. Я. Инфекционная патология животных / А. Я. Самуйленко, Б. В. Соловьев, Е. А. Непоклонов, Е. С. Воронин. - М. : ИКЦ Академкнига, 2006. - С. 719-759.

4. Сергеев, В. А. Вирусы и вирусные вакцины / В. А. Сергеев, Е. А. Непоклонов, Т. И. Алипер. - М. : Библионика, 2007. - 523 с.

5. Calnek, B. W. Marek's disease / B. W. Calnek, R. L.Witter // Diseases of Poultry. - Ames, Iowa. - 1997. - P. 369-413.

6. Marek's disease. An evolving problem / Ed. by F. Davison and V. Nair. - London : Elsevier Acad. Press., 2004. - 212 p.

А

B

Ф

Архивы номеров журнала: www.invetbio.spb.ru/journal/vp_main.htm