CC BY
109
УДК 619:576.858:57.086.83 И.Я. Строганова, К.В. Войтова
МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ РЕСПИРАТОРНО-СИНЦИТИАЛЬНОГО ВИРУСА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК
Представлены обобщенные результаты исследования методов обнаружения и идентификации респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота в культурах клеток.
Ключевые слова: крупный рогатый скот, респираторно-синцитиальный вирус, культура клетки,
метод.
I.Ya. Stroganova, K.V. Voitova
THE TECHNIQUES FOR REVEALING AND IDENTIFICATION OF THE RESPIRATORY AND SYNCYTIAL VIRUS OF CATTLE IN CELL CULTURE
The generalized research results of the techniques for revealing and identification of the respiratory and syncytial virus of cattle in cell cultures are given.
Key words: cattle, respiratory and syncytial virus, cell culture, technique.
Респираторные болезни молодняка крупного рогатого скота (КРС) являются одной из наиболее важных причин экономического ущерба в индустрии молочного скотоводства, приводят к падежу или снижению скорости роста больных животных, затратам на лечение, диагностические и профилактические мероприятия.
По данным отечественных исследователей, в целом болезни этой группы в РФ могут приводить к снижению экономической эффективности скотоводства на 20—30%[1].
В хозяйствах мясо-молочного направления они чаще протекают по типу энзоотической бронхопневмонии. В связи с тем, что многие их возбудители убиквитарны, а взрослые животные чаще имеют иммунитет, респираторные болезни чаще возникают у телят в период снижения пассивного иммунитета и выработкой активного [2, 3].
Одним из многих этиологических агентов респираторных болезней, наряду с вирусами инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи - болезни слизистых оболочек, парагриппа-3 и другими, является вирус респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота (РСИ КРС).
Респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота - оболочечный РНК-содержащий, относящийся к роду Pneumovirus, подсемейству Pneumovirinae, семейству Paramyxoviridae [4, 5].
В некоторых случаях инфекция протекает субклинически, могут возникать поражения верхнего либо верхнего и нижнего респираторного тракта.
Поражение верхних дыхательных путей сопровождается кашлем с серозно-слизистыми выделениями из носа и глаз. Отмечают брюшной тип дыхания, повышение температуры тела и выделение обильной слюны из ротовой полости.
Болезнь может проявляться в виде отдышки и разрушения паренхимы легких, приводящих к кислородному голоданию, цианозу и летальному исходу [4-6].
В нашей стране сведения о болезни были впервые опубликованы в 1975 году [7]. Изучение ее длительное время сдерживалось из-за трудностей, связанных с высокой лабильностью вируса и очень слабой его способностью к размножению в культурах клеток. Развитие новых иммунологических и молекулярнобиологических методов способствовало более глубокому изучению возбудителя. В лабораторных и производственных условиях необходимо наличие штаммов РСВ КРС для разработки диагностических тест-систем и производства вакцин, культивируют вирус исключительно только в культуре клеток.
Целью данной работы явилось изучение методов обнаружения и идентификации респираторносинцитиального вируса крупного рогатого скота в культуре клеток.
Материалы и методы исследования
В опытах использовали следующие штаммы респираторно-синцитиального вируса КРС: "РС-Б", "РС-Р" и "Nomi".
Объектами исследований были монослойные первично-трипсинизированные культуры клеток: почки, легкие, эмбриона коровы (ПЭК, ЛЭК), тестикулы бычков (ТБ) и их субкультуры; диплоидные культуры клеток легких эмбриона коровы (Л3Э), почки эмбриона коровы (П3Э); перевиваемые линии почки теленка (Т-1), почки теленка (ПТ), почки эмбриона овцы (FLK).
Для культивирования клеток и вируса использовали питательные среды ГЛА, 199, Игла (с добавлением 3% глютамина), Игла MEM, 10*Игла MEM, RPMI-1640 с добавлением 10, 5 и 2% сыворотки крови КРС, телят, северных оленей, фетальной КРС, цыплят. Для отмывания монослойных культур клеток использовали раствор Хенкса. В среды и растворы добавляли антибиотики по 100 ЕД/мл. При выращивании культур клеток и для культивирования вируса использовали 0,25% раствор трипсина, 0,01% раствор химопсина в
0,02% растворе версена, 7,5% раствор бикарбоната натрия.
Инфекционную активность PC-вируса в культуре клеток определяли титрованием в соответствующей или чувствительной культуре клеток по цитопатическому действию (ЦПД): пробирочным или микрометодом, расчет инфекционного титра вируса проводили по методу L. Reed и H. Muench [8] и выражали в ТЦД 50/мл (50% тканевая цитопатическая доза).
Исходный титр вируса при заражении составлял 1,5-3,0 lg ТЦД 50/мл. Культивировали вирус при температуре 37°С в стационарных условиях.
Препараты для цитоморфологического исследования окрашивали гемотоксилин-эозином по методу
О.В. Волковой [9].
Расчет инфекционной активности РС-вируса проводили методом бляшек по К. Прингл [10] и окрашенных фокусов по B. Calnek et al. [11], титр вируса выражали в БОЕ/мл и ФОЕ/мл.
Очищали и концентрировали вирус по M. Trudel [12], готовили препараты для электронной микроскопии по S. Brenner [13].
Реакцию агглютинации целлюлозы с антительным диагностикумом РС-вируса ставили по Э.А. Мака-рян и др. [14].
Выделение РНК-вируса и обратную транскрипцию и амплификацию (ОТ-ПЦР) проводили согласно наставлению по применению тест-системы для выявления вируса РСИ КРС методом ПЦР Т.И. Глотовой и др. [15].
Результаты исследований
Одним из важных этапов в работе с разными штаммами РС-вируса КРС являются изыскание и подбор наиболее продуктивных клеточных систем, обеспечивающих высокое накопление вируса.
С этой целью необходимо изучить спектр чувствительности имеющихся культур клеток к определенному штамму РСВ КРС и отобрать культуры, которые бы обеспечивали максимальное накопление РС-вируса при использовании доступных питательных сред и сывороток, то есть отработать оптимальные условия его культивирования.
При выборе чувствительной системы для РС-вируса КРС штамма «РС-Б» обнаружение и определение инфекционной активности вируса в культуре клеток проводили по цитопатическому действию. Исследовали 27 видов культур клеток, с учетом времени проявления ЦПД и накопления вируса в пяти серийных пассажах.
Наиболее чувствительными к штамму «РС-Б» РСВ КРС оказались диплоидные культуры клеток легкого (Л5Э) и почки (П5Э) эмбриона коровы, перевиваемые линии почки эмбриона овцы (FLK), почки теленка (Т-1), почки теленка (ПТ) и первично-трипсинизированная культура клеток легкого эмбриона коровы (ЛЭК). ЦПД в данных культурах клеток в основном проявлялось на 3-5 сутки после заражения. Титр вируса в культурах составил: 3,98±0,38; 3,96±0,33; 3,74±0,12; 3,63±0,11; 3,43±0,09; 3,36±0,17 lg ТЦДб0/мл соответственно.
Результаты наших исследований по культивированию штамма «РС-Б» РСВ КРС показали, что из зараженных первично-трипсинизированных культур клеток: 27 серий ЛЭК; 30 серий БТ; 26 серий ПЭК, видимое ЦПД вируса не проявлялось в 3 (11,11%); 5 (16,67%); 5 (19,23%) сериях соответственно.
Штамм респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота «РС-Р» проявил большую активность, репродуцируясь в первично-трипсинизированных культурах клеток с первого пассажа. Титр вируса составил: в почке эмбриона коровы 3,51±0,09 lg ТЦДб0/мл; тестикулах бычка 3,43±0,09 lg ТЦДб0/мл; легких эмбриона коровы 3,61±0,05 lg ТЦДб0/мл.
ЦПД вируса проявлялось на 2-4 сутки после заражения культуры клеток и было лучше выражено, чем у штамма «РС-Б».
Было отмечено, что пассирование различных штаммов РСВ КРС даже в чувствительных культурах клеток не в каждом пассаже сопровождалось видимым ЦПД, поэтому цитопатическое действие РС-вируса в культуре клеток носит неперманентный характер, что и осложняет его культивирование.
Поэтому при культивировании РС-вируса КРС в культурах клеток необходимо использовать и другие методы контроля его размножения, определения инфекционной активности и его идентификации.
Для изучения характера цитопатического действия, вызванного РС-вирусом крупного рогатого скота в культуре клеток, и определения его специфичности необходимо проведение цитоморфологических исследований.
Готовили препараты путем выращивания клеточных культур на покрывных стеклах в пробирках, а затем во флаконах из под антибиотиков. После заражения культуры клеток вирусом наблюдали за проявлением цитопатического действия (ЦПД) путем светового микроскопирования, а затем окрашивали препараты гемоксилин-эозином. Размещали высушенные препараты на предметных стеклах и заключали в канадский бальзам. Подготовленные препараты изучали при помощи светового микроскопирования.
Исследования морфологических изменений зараженной вирусом культуры клеток FLK проводили на примере двух штаммов «РС-Б» и «Nomi» PC-вируса крупного рогатого скота.
Результаты изучения цитоморфологии показали, что размножение штаммов «РС-Б» и «Nomi» PC-вируса крупного рогатого скота сопровождалось образованием ацидофильных цитоплазматических телец-включений, а так же симпластов различного размера. При этом у штамма «Nomi» PC-вируса крупного рогатого скота процесс симпластообразования в данной культуре клеток был выражен ярче (от 10-20 ядер), чем у штамма «РС-Б» (до 5 ядер).
Поражения ядер клеток или ядерные включения не наблюдали. В контрольных препаратах из незара-женной культуры клеток обнаруживали только мононуклеарные клетки, в которых не находили цитоплазматических или ядерных включений.
Кроме определения инфекционной активности РС-вируса КРС штамма «РС-Б» в клеточных культурах титрованием по ЦПД пробирочным и микрометодом, количество вируса подсчитывали по единичному эффекту, то есть по бляшко- и фокусообразующим единицам.
Разработку классического метода постановки бляшек под агаровым покрытием проводили также с целью селекционной работы в дальнейшем с PC-вирусом крупного рогатого скота.
Учет результатов проводили на 5-7 сутки культивирования вируса.
Наиболее точным методом титрования явился метод бляшек по сравнению с титрованием по ЦПД в пробирках. Однако он более трудоемок, требует тщательного подбора ингредиентов и определенного навыка в постановке.
Давно была известна возможность количественного определения вируса герпеса индеек (ВГИ), подсчетом фокусов (ФОЕ) в инфицированных культурах клеток. Поскольку размножение ВГИ в культурах клеток сопровождалось развитием цитопатологии синцитиального типа, характерного и для PC-вируса, мы изучили воспроизводимость и чувствительность этого метода для PC-вируса крупного рогатого скота.
Фокусы цитопатического действия вируса в культуре, различаемые микроскопически как скопления клеток, образовывались на З-4 сутки после заражения культуры. На 5-8 день, вследствие увеличения размеров и лизиса клеток, фокусы становились более видимыми. Однако, если деструкция в центре фокусов слабо выражена, их учет без предварительной окраски был затруднен. Поэтому для выявления фокусов визуально, воспользовались способом окраски инфицированных клеточных культур 0,5%-м раствором ами-дового черного на 0,5% уксусной кислоте.
В фиксированных и окрашенных клеточных культурах фокусы ЦПД PC-вируса отчетливо были видны и визуально.
Окраска их не изменяется при длительном хранении, что значительно облегчает учет и анализ полученных результатов.
На основании полученных результатов метод титрования по ФОЕ несколько чувствительнее метода титрования по ЦПД в пробирках и прост в учете.
Методам электронной микроскопии можно обнаруживать РС-вирус КРС в культуре клеток.
Для обнаружения вируса использовали зараженную культуру клеток РСВ, после замораживания и оттаивания. Культуральную жидкость с вирусом концентрировали. Препараты для электронной микроскопии готовили по методу негативного контрастирования с применением 2%-го водного раствора фосфорновольфрамовой кислоты (рН 7,0). При электронной микроскопии обнаруживали характерные вирионы респираторно-синцитиального вируса. Морфологически они представляли собой округлые, плеоморфные частицы (80-150-300 нм), наружная мембрана которых покрыта отростками (рис. 1.). Вирионы и нуклеокапсиды виру-
са были нестабильны и легко повреждались даже при обычных способах концентрации, поэтому подсчет вирусных частиц осуществить не удавалось.
Рис. 1. Поврежденный вирион штамма «РС-Б» вируса крупного рогатого скота. Культура клеток Л5Э.
Негативное контрастирование (* 125000)
Электронную микроскопию использовали как качественный метод для обнаружения РСВ КРС в культуре клеток и для исключения контаминации, в том числе и другими вирусами (ВД, ИРТ), которые обладают лучшей репродуктивной активностью в культуре клеток.
В настоящее время имеются сообщения о разработке и оценке методов агглютинации латекса для выявления антител к вирусу СПИД, вирусных антигенов вируса чумы крупного рогатого скота. Использование полимерных суспензий для создания тест-систем диагностики респираторно-кишечных заболеваний крупного рогатого скота вирусной этиологии рассматривается в работах [16,17].
В медицине на основе порошковой целлюлозы разработаны антительные диагностикумы для определения вирусов гриппа, парагриппа, аденовирусов, РС-вируса.
Диагностикумы рекомендованы для определения антигена в клеточно-культуральной среде, содержащей вирус, носовых секретах и смывах.
В данных исследованиях использовали РС-вирус КРС для создания целлюлозного антительного ди-агностикума для реакции агглютинации целлюлозы (РАЦ).
Механизм реакции РАЦ основан на непрямой реакции агглютинации частиц целлюлозы, сенсибилизированных иммуноглобулинами к РС-вирусу КРС.
РАЦ применяли в качественной и количественной постановке.
РАЦ была специфичной, но недостаточно чувствительной реакцией. В вируссодержащей культуральной жидкости антиген РС-вируса в РАЦ выявлялся в титре на 1,5 1д ниже, чем при титровании по ЦПД.
Качественная РАЦ. На обезжиренное сухожаром предметное стекло наносят 40-50 мкл исследуемого и контрольного образцов с последующим добавлением антительного диагностикума в равном объеме. Результаты РАЦ учитывали через 3-5 мин в крестах:
+++ - крупнозернистая агглютинация;
++ - мелкозернистая агглютинация;
+ - мелкозернистая агглютинация в незначительных количествах;
- - кучкование диагностикума в центре или его равномерное распределение в исследуемом образце.
Антительный диагностикум можно использовать для быстрого качественного обнаружения РС-вирусного антигена (особенно при отсутствии видимого ЦПД) в культуральной вируссодержащей жидкости в процессе культивирования РС-вируса КРС в культуре клеток.
Рис. 2. Положительная (слева) и отрицательная (справа) РАЦ
Разработка ОТ-ПЦР для выявления респираторно-синцитиального вируса во многих странах началась в конце прошлого столетия. Чаще мишенями для амплификации являются участки генов, кодирующих протеины F- и G-вируса.
Во всех случаях ПЦР показала большую чувствительность и специфичность по сравнению с вирусологическими исследованиями. Выявление вируса в ПЦР коррелировало с наличием клинических признаков у животных. Многие авторы считают, что в связи с трудностями выделения вируса в культурах клеток, ПЦР может служить эффективным методом для его идентификации при респираторных болезнях телят.
Более высокая чувствительность ПЦР на протеин F рекомендована в качестве альтернативного стандартным вирусологическим методикам метода анализа клинических образцов [18].
Сотрудниками ГНУ ИЭВСиДВ СО Россельхозакадемии разработана тест-система для выявления вируса респираторно-синцитиальной инфекции методом ПЦР. Авторы использовали праймеры на высоконсер-вативный ген протеина F-вируса. В данном варианте тест-система является универсальной, чувствительной, специфичной и выявляет РНК тестированных штаммов и изолятов вируса, выделенных от животных в культурах клеток, а также на ранних стадиях размножения вируса в них, т.е. до наступления видимого цитопати-ческого действия. В лабораторных испытаниях чувствительность ПЦР составила 10 ТЦЦб0/мл. Тест-система показала высокую эффективность при диагностике болезни в производственных условиях [19].
Тест-система для выявления вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции является перспективной в диагностике данной болезни, учитывая слабую способность вируса к размножению в культурах клеток.
Контроль выделения, накопления и типирования РСВ КРС в зараженных культурах клеток можно осуществлять при помощи ПЦР путем исследования вируссодержащей суспензии каждого пассажа.
Выводы
1. Цитопатическое действие респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота в культуре клеток носит неперманентный характер, что и осложняет его культивирование. В связи с этим необходимы другие методы обнаружения и идентификации РСВ КРС в культуре клеток.
2. Цитоморфологический метод исследования позволяет обнаруживать вирус в культуре клеток до проявления видимого ЦПД и подтверждать его специфичность. А так же определять штаммы РСВ КРС, обладающие лучшей способностью репродуцироваться в культуре клеток и проявлять ЦПД.
3. Методы определения инфекционной активности вируса по БОЕ и ФОЕ в культуре клеток оказались наиболее точными по сравнению с титрованием по ЦПД. Метод бляшек можно использовать для селекционной работы со штаммами РС-вируса, а метод подсчета окрашенных фокусов для определения инфекционной активности.
4. Электронная микроскопия может служить для контроля размножения вируса в культуре клеток и для исключения контаминации.
5. Реакция агглютинации целлюлозы с антительным диагностикумом РСВ КРС пригодна для быстрого качественного обнаружения вирусного антигена, особенно при отсутствии видимого ЦПД, в культуральной вируссодержащей жидкости в процессе культивирования.
6. Полимеразная цепная реакция проста по технике исполнения, информативна, экономически целесообразна, наиболее эффективна по сравнению со всеми вышеперечисленными методами исследования и позволяет выявлять РНК РСВ КРС до проявления ЦПД в культуре клеток в короткие сроки.
Литература
1. Эффективность инактивированной вакцины при факторных респираторных болезнях телят / Ю.А. Костыркин, В.А. Мищенко, В.В. Думова [и др.] // Вет. патология. - 2005. - № (14). - С. 72-75.
2. Система ветеринарно-санитарных, профилактических и лечебных мероприятий против инфекционных болезней крупного рогатого скота в хозяйствах Российской Федерации / М.И. Гулюкин, К.П. Юров, Ю.Д. Караваев [и др.]. ГНУ ВИЭВ, ФГУ «Центр ветеринарии». - М., 2007.
3. Крюков Н.Н., Зудилина З.Ф., Евдокимов С.И. Вирусные респираторные болезни крупного рогатого скота // Ветеринария. -1976. - №6, - С. 111-113.
4. Baker J.C. Bovine respiratory syncytial virus // Veterinary Clinics of North America Food Animal Practice. -1997. - Vol.13. - P.425-454.
5. Larsen L.E. Bovine Respiratory Syncytial Virus (BRSV): A review // Acta vet.scand. - 2000. -Vol. 41. - P. 1-24.
6. Valarcher J.F., Taylor G. Bovine respiratory syncytial virus infection // Vet.Res. - 2007. - Vol.8. - P. 153-180.
7. Гуненков В.В., Халенев А.Г., Сюрин В.Н. Респираторно-синцитиальная вирусная инфекция // Животноводство и ветеринария. - М., 1975. - Т.8. - С.70-76.
8. Reed L.J., Muench H.A. A simple method of estimating 50 percent endpoints // Am.J.Hug. -1938. - Vol. 27. -P.439-497.
9. Волкова О.В., Клецкий Ю.К. Основы гистологии с гистологической техникой. - М.:Медицина, 1971. -С.201-205.
10. Прингл К. Пневмовирусы // Вирусология. Методы. - М.: Мир, 1988. - С.131-159.
11. In vitro methods for assay of turkey herpes virus / B.W. Calnec, E. Ljarrido, W. Okazaki[et. al]. V Avian Dis. -
1972. - V.16. - P.52-56.
12. Immunovirological studies on human respiratory syncytial virus structural proteins / M. Trudel, F. Nadon, C. Sequin [et al.] // Can. J. microbid. -1986. -V.32. - №1. - P.12-15.
13. Brenner S., Horne R.W. A negative Staining Method for high Resolution Electron Microscopy of viruses // Biochim. Et Diophs. Acta. - 1959. - V.34. - P.103-110.
14. Экспресс-диагностика респираторно-синцитиальной инфекции у крупного рогатого скота / Э.А. Мака-рян, И.Я. Строганова, И.В.Красильников [и др.] // Интенсификация сельскохозяйственного производства в условиях радикальной экономической реформы: тез. докл. Всесоюз. науч.-практ. конф. - Сумы, 1989. - С. 173-174.
15. Выделение и типирование респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота при помощи ОТ-ПЦР / Т.И. Глотова, О.В. Кунгурцева, А.Г. Глотов [и др.] // Сиб. вестн. с.-х. науки. - 2010. - С.59-63.
16. Синтез полистирольных латексов в присутствии смеси ПАВ для иммунодиагностических тест-систем / С.Б. Марченко, Е.В. Рогова, И.А. Грицкова [и др.] // Вопросы физ.-хим. биол. в ветеринарии. - М., 2002. - С.28-31.
17. Использование полимерных суспензий в качестве сорбента вирусов для детекции антител в сыворотках крови крупного рогатого скота (создание диагностических тест-систем для диагностики респираторно-кишечных заболеваний вирусной этиологии) / Я.М. Станишевский, Т.П. Лобова, И.А. Грицкова [и др.] // Вопр. вирусолог. - 2006. - Т.51. - №4. - С.45-48.
18. Elerahy N.Z., Kania S.A., Potgieter Z.N.D. The ovine respiratory syncytial virus F gene sequence and its diagnostic application // J.veter.diagnostig inrectig. - 2001. - Vol.13. - №6. - Р.455-461.
19. Особенности диагностики респираторных болезней крупного рогатого скота, вызываемых РНК-содержащими вирусами / А.Г. Глотов, Т. И. Глотова, И.Я. Строганова [и др.] // Актуальные вопросы ветеринарной медицины Сибири: мат-лы междунар. конф., посвящ. 70-летию со дня основания ИЭВ-СидВ. - п. Краснообск, 2010. - С.33-39.
